Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-систем для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей микоплазмоза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей микоплазмоза"

На правах рукописи

РОКА ВИЛЬЧЕС Вашингтон

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОПЛАЗМОЗА: Mycoplasma hominis И Ureaplasma wrealyticum

03.00.23 - биотехнология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Санкт-Петербургский государственный Технологический институт (Технический университет) и Федеральном государственном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»

Научные руководители:

доктор химических наук профессор Гинак Анатолий Иосифович кандидат химических наук Вербов Вячеслав Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Шугалей Ирина Владимировна кандидат биологических наук Железнова Нина Всеволодовна

Ведущее учреждение:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (Санкт-Петербург).

Защита диссертации состоится » С'к 7Лир А 2005 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 212.230.04 при Санкт-Петербургском государственном Технологическом институте (Техническом университете) (190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного Технологического института (Технического университета). Замечания и отзывы по работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26, Ученый Совет.

Автореферат разослан «» СШТЛЁ^ 2005 г. Ученый секретарь диссертационного совета

к.т.н.

Т.Б.Лисицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Урогенитальные микоплазмы Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum вызывают такие распространенные инфекции, как негонококковые уретриты, воспаления органов малого таза, эндометриты и бактериальные вагинозы. Они могут также вызывать преждевременные роды, рождения детей с малым весом и клиническими проявлениями заражения крови, болезнями респираторного тракта и неврологическими расстройствами. У микоплазм также как и у других микроорганизмов может проявляться аптибиотикорезистентность за счет генетических мутаций или путем приобретения нового генетического материала. Поэтому при назначении антибиотикотерапии важным является проведение тестов на сравнительную чувствительность антибиотиков различных групп. Стандартизированными методами для определения аптибиотикочувствительности микоплазм являются только методы серийных разведений в агаре или в жидкой питательной среде. Диффузионный метод на дисках не может использоваться для Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, так как эти культуры расту! очень медленно и антибиотики успевают раньше распределиться в слое агара прежде чем колонии вырастут и дадут определенную зону ингибирования роста.

Предварительное определение антибиотикочувствительности при назначении лечения микоплазменных и уреаллазменных инфекций позволяет снизить удельный вес положительных результатов при повторном обследовании после курса антибиотикотерапии с 37 % до 7-8 %.

Таким образом, цель настоящего исследования заключалась в разработке Тест-системы для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Тест-система должна удовлетворять следующим условиям: чувствии-тельность, селективность, надежность, быстрота и простота исполнения.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие

задачи:

• Поиск подходящей системы индикаторов, улучшающей наглядное определение результатов качественной реакции на рост Mycoplasma hominis.

• Поиск и определение концентрации антибиотиков для подавления посторонней бактериальной и грибной микрофлоры.

• Изучение чувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyti

исспытаниях in vitro.

• Изучение сравнительной активное!и антибиотиков разных групп к Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

• Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков: 2-х гетрацикдинов (тетрациклин, доксициклин), 2-х фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин), 2-х макролидов (эритромицин, кларитромицин), линкозамида (клиндамицин), аминогликозида (гентамицин) - для ингибирования роста урогенитальных микоплазм Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

• Проведение оценки результатов разработанной Тест-системы для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum при сравнении с зарубежным аналогом.

Научная новизна работы.

1. Впервые разработана в России диагностическая экспресс-тест-система для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей урогешггальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, с использованием лиофильно-высушенной питательной среды и сорбированных антибиотиков в одноразовых полистироловых стрипах от разборных планшетов.

2. Впервые создана смесь индикаторов для усовершенствования питательной среды на основе плацентарного бульона, позволяющая визуально определить качественные реакции с помощью микрометодов при идентификации Mycoplasma hominis.

3. Впервые получены данные по МПК антибиотиков, соответствуйте условиям, проведения разработанного экспресс-диагностикума по определению антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов.

Практическая значимость.

Полученные биотехнологические показатели могут быть использованы при проведении дальнейших научных исследований в области микоплазмологии, а также для создания различных вариантов Тест-систем по определению антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов.

Разработанная методика для определения МПК может служить модельным объектом для быстрого определения МПК различных антибиотиков для широкого спектра микроорганизмов, при мониторинге (и определение индивидуальной дозировки антибиотиков) тяжелобольных пациентов или пациентов с пониженной функцией печени или почек. Апробация результатов исследования.

Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на раз-

личных конференциях: научной конференции и VIII съезде Российско-Итальянского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» (Санкт-Петербург, 2002), XXXVIII Всероссийской научно-практической конференции дерматологов и врачей смежных специальностей «Актуальные проблемы дерматовенерологию) («Роль интеграции смежных специалистов в решении проблем социально-значимых болезней») (Санкт-Петербург, 2003), Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2003), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 60-летию бактериологической лаборатории и 10-летию службы госпитального эпидемиолога Челябинской областной клинической больницы «Микробиологический мониторинг и инфекционный контроль: взаимодействие, пути развития, роль для практического здравоохранения» (Челябинск, 2005 г.).

Результаты исследования внедрены в линию производства диагностических препаратов Отдела яовых технологий НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Положения, выносимые на зящиту

1. Усовершенствование питательной среды для идентификации Mycoplasma hominis путем подбора смеси красителей для облегчения наглядного определения качественной реакции при определении Mycoplasma hominis и повышения селективности питательной среды добавлением антибиотиков для подавления роста сопутствующих бактериальных и грибных микрофлор.

2. Определение минимальной подавляющей концентрации антибиотиков разных групп к возбудителям урогенитального микоплазмоза, а также создание Тест-системы на основе полученных данных по МПК.

3. Проведение оценки результатов разработанной Тест-системы для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum при сравнении с зарубежным аналогом.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и включает введение, 5 глав, выводы, 1 приложение, благодарность, а также список использованной литературы, содержащий 65 источников на русском языке и 79 источников на иностранных языках. В текст включены 19 таблиц и 12 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Для выполнения поставленных цели и задач использовались следующие материалы:

♦ Лиофильно-высушенная жидкая питательная среда МИКОПЛАЗМА-50, выпускаемая отделом новых технологий ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г. Санкт-Петербурга, приготовлена на основе плацентарного бульона, с добавлением фенолового красного в качестве индикатора.

♦ Антибиотики разных групп:

■ Тетрациклины: тетрациклин (субстанция порошок 0,5-10 Кг; фирма АСФАРМА (Россия); серия: 741331111); доксицяклив (Доксициклина гидрохлорид; фирма ФЕРЕЙН; серия: 181003; Годен до: 10.05.).

• Фторхинолоны: офлоксацин (фирма РАНБАКСИ (INDIA); серия: 9042451; Годен до: 10.05.); ципрофлоксацин (фирма WOCKHARDT (INDIA); серия: 102042; Годен до: 03.05.).

■ Макролиды: эритромицин (фирма СИНТЕЗ (КУРГАН); серия: 2001103; Годен до: 12.07.); кларитромицин (КЛАЦИД; фирма АВВОТ (Франция); серия: 07980ТВ24; Годен до: 07.07.).

■ Линкозамид: клиндамицин (фирма Hemofarm (Югославия); серия: 0680703; Годен до: 07.05.).

■ Аминогликозид: геитамицин (фирма ДАЛЬХИМФАРМ (Хабаровск); серия: 7009031; Годен до: 10.05.).

♦ Возбудители урогенитальных микоплазмозов:

■ Положительные изоляты Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealylicum, полученные из ГУЗ городского диагностического центра при городской инфекционной больнице № 30 им. С. П. Боткина, г. Санкт-Петербург.

• Эталонные штаммы Mycoplasma hominis Т 34 и Ureaplasma urealyticum Т 960, используемые в ходе работы для сравнения, которые были получены от ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва.

Для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) методом серийных микроразведений в работе использовали жидкие питательные среды МИКОПЛАЗМА-50 и УРЕАПЛАЗМА-50, выпускаемые отделом новых технологий НИИЭМ им. Пастера. Жидкая питательная среда МИКОПЛАЗМА-50 приготовлена на основе плацентарного бульона, с добавлением 20% лошадиной сыворотки, 10% дрожжевого экстракта, 1% аргинина. В качестве индикатора использовали феноло-

вый красный. pH питательной среды был установлен 7,3. Жидкая питательная среда УРЕАПЛАЗМА-50 приготовлена на основе плацентарного бульона, с добавлением 20% лошадиной сыворотки, 10% дрожжевого экстракта, 0,01% мочевины. В качестве индикатора также использовался феноловый красный. pH питательной среды был установлен 6,2. Для селективности этих питательных сред было предусмотрено добавление смеси антибиотиков, которые контролировали подавление посторонней микрофлоры.

Также в работе использовали плотную питательную среду MYCOPLASMA-A7 (Bio-Merieux; Франция) для подсчета КОЕ М. hominis и U. urealyticum.

Определение МПК проводилось методом серийных микроразведений в жидкой питательной среде. Этот метод основывается на последовательном двукратном разведении антибиотиков в жидкой питательной среде МИКОПЛАЗМА-50 для М. hominis или УРЕАПЛАЗМА-50 для U. urealyticum на 96-ти лунковых планшетах. Подсчет КОЕ проводился методом последовательных десятикратных разведений в жидкой питательной среде.

Учет результатов производился с помощью наблюдения за изменением цвета индикатора в жидкой питательной среде с оранжевого до малинового при условии сохранения цвета стабильным после 72 часов инкубации М. hominis. Учитывались только те результаты, которые находились в пределах 104-105 КОЕ/мл, обнаруженные при проведении их подсчета. Выращивание культур М. hominis и U. urealyticum. проводили в термостате MEMERT-22, Германия.

С целью достоверного описания цветовых переходов, при культивировании М. hominis на среде, содержащей смесь индикаторов №3 (состоящая из фенолового красного (0.1% в 20% спирте) и брильянтового синего (0.02% вода.) в соотношении 1:2), использовали спектрофотометр для измерения интенсивности окрашивания (оптической плотности) в зависимости от pH. Для этого приготовили ряд питательных сред с различными значениями pH, имитируя процесс роста микоплазм. Оптическую плотность при длине волны >,=730 нм измеряли на спектрофотометре СФ-46, JIOMO, Россия.

Осветление питательной среды проводили в фильтровальной установке БНШ 600 15, Россия. В качестве фильтров использовались мембраны ВЛАДИПОР МФА А № 2 (350 нм диаметр пор).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные результаты исследования и обсуждения.

В данном качественном и количественном составе среды было определено опти-

мальное значение pH среды, составляющее 7,3. В результате поиска системы индикаюров, было найдено, что смесь индикаторов №3 является наиболее подходящей. Эта смесь обеспечивает четкий переход окраски и достаточную для визуальной оценки интенсивность, не смотря на большое количество переходных оттенков, таких как: зеленый, бледно-зеленый, сине-зеленый, сине-фиолетовый и фиолетовый. Градацию оттенков зафиксировали количественно в значениях оптической плотности (табл. 1).

В результате обработки экспериментальных данных, представленных в таблице 1 и на рисунке 1, найдена точка эквивалентности, то есть точка перехода окраски индикаторов, составляющая рН=7,63. Это говорит о том, что выбранная система индикаторов является подходящей для данных условий выращивания М. j hominis, так как точка перехода окраски находится выше, чем исходный рН=7,3, но ниже, чем pH, который достигается в конце процесса выращивания, составляющий 7,8-8,0.

Таблица 1 - Интенсивность окрашивания пита-телыгой среды со смесью индикаторов №3 в завися-мости от pH {Ь=Ш нм)*

РН среды Оптическая плотность Соответствующие оттенки

7,0 0,845 Зеленый

7Д 0,730

7,2 0,613

7,3 0,496 Бледно-зеленый

7,4 0,381

7,5 0,266 Сине-зеленый

Ъ6 0,149

7,7 0,133 Сине-фиолетовый

7,8 0,161

7,9 0,187 Фиолетовый

8,0 0,216

8,1 0,242

8,2 0,268

* В качестве контроля использовали питательную среду без индикаторов.

Рисунок 1 - Зависимость оптической плотности от pH питательной среды при 1 = 730 нм (в качестве контроля служила питательная среда без индикаторов)

Результаты распределения чувствительностей к восьми лекарственным препаратам 101 изолята Mycoplasma hominis и 59 изоляга Ureaplasma urealyticum представлены в таблице 2.

Проведенное исследование показало, что Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum обладают различной чувствительностью к одним и тем же группам антибиотиков, исключение составляют только тетрациклины и фторхинолоны (рисунки 2 и 3). Однако эти антибиотики оказались немного активнее по отношению к Mycoplasma hominis, чем к Ureaplasma urealyticum. Следует отметить, что группа тетрациклиновых антибиотиков обладает большей активностью, чем группа фторхинолонов. Наряду с этим, встретились культуры, которые обладают резистентностью к тетрациклинам и фторхинолонам.

Таблица 2 - Результаты распределения чувствительностей штаммов М. hominis и U. urealyticum к восьми лекарственным препаратам

АНТИ БИОТИК Концентрации антибиотиков, мкг/мл

0 1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 11 12

>64,0 64,0 32,0 16,0 8,0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03

М. hominis

ТВТ 2 2 1 1 6 56 26 6 1

ДОК 4 1 33 41 19 3

ЭРИ 99 1 1

КТМ 100 1

ЦИП 1 3 34 54 8 1

ОФ 2 9 15 27 37 9 1 1

КЛ 4 1 11 8 7 34 26 9 1

ГЕН 8 46 40 в 1

U. Urealyticum

ТЕТ 4 4 6 1 25 16 2 1

ДОК 4 4 3 22 3 23

ЭРИ 4 1 2 4 2 14 10 18 4

КТМ 5 2 4 3 6 39

ЦИП 2 9 28 17 3

ОФ 11 12 28 8

КЛ 10 4 6 8 8 15 1 3 4

ГЕН 4 6 2 16 15 3 13

Примечание: ТЕТ - тетрациклин, ДОК - доксициклин, ЭРИ - эритромицин, КТМ - кл эритромицин, ЦИП - ципрофлоксацин, ОФ -офлокса-цин, КЛ - клиндамицин, ГЕН - гентамицин.

и

Причем большее проявление резистентности, как видно из рисунка 2, отмечается к офлоксацину, чем к тетрациклинам для Mycoplasma hominis, а для Ureaplasma urealyticum (рисунок 3) большая резистентность отмечена к тетрациклинам.

Также и действие антибиотиков одного ряда различно. Это объясняется тем, что, например, доксициклин является антибиотиком второго поколения в отличие от тетрациклина и он, как показывают полученные данные, работает лучше, то есть появление устойчивых к нему штаммов меньше, чем к тетрациклину.

Из рисунков также видно, что из фторхинолонов на Mycoplasma hominis лучше действует ципрофлоксацин, а на Ureaplasma urealyticum оба антибиотика оказывают одинаковое действие.

а? 120

УЧ

Категория чувствительности

□ТЕГ

■док

□ ЭРИ

□кш

■ ЦП

□ ОФ

■кп : □гвн

J

Примечание: ТЕТ - тетрациклин, ДОК - доксициклин, ЭРИ -эритромицин, КТМ - кларитромицин, ЦИП -ципрофлоксацин, ОФ - офло-ксацин, КЛ клиндамицин, ГЕН - гентамицин.

Р - резистентные штаммы, УЧ - умеренно-чувствитель-ные штаммы, Ч - чувствительные штаммы.

Рисунок 2 - Уровень чувствительности Mycoplasma hominis к восьми антибиотикам

Как и следовало ожидать, 100% штаммов Mycoplasma hominis оказались устойчивы к макролидам, что хорошо согласуется с литературными данными. В то время как около 75% штаммов Ureaplasma urealyticum были чувствительны к макролидам, что подтверждает обоснованность применения этих антибиотиков для лечения уреаплазменных инфекций.

Р УЧ ч

Кийцм^всппсшши

Примечание: ТЕТ - тетрациклин, ДОК - доксициклин, ЭРИ -эритромицин, КТМ - кларитромицин, ЦИП -ципрофлоксацин, ОФ - офло-ксацин, КЛ - клиндамицин, ГЕН - гентамицин.

Р - резистентные штаммы, УЧ - умеренно-чувствитель-ные штаммы, Ч - чувствительные штаммы.

Рисунок 3 - Уровень чувствительности Ureaplasma urealyticum к восьми

антибиотикам

Как следует из полученных данных, антибиотик клиндамицин проявил высокую активность по отношению к большинству штаммов Mycoplasma hominis. Клиндамицин (МПК50 = 0,5) оказался в 16 раз активпее гентамицина (МПК5о = 8,0). В то же время наблюдается появление резистентных штаммов, что также свидетельствует о привыкании культур к этому антибиотику. По отношению к Ureaplasma urealyticum клиндамицин оказался гораздо менее активным, поскольку

47,46% штаммов Ureaplasma urealyticum были к нему устойчивы.

Антибиотик гентамицин (МПК50 - 2,0) показал относительно хорошую активность (52,54% чувствительных штаммов) к Ureaplasma urealyticum, в то же время обнаружено много резистентных штаммов (16,95%). По отношению к штаммам Mycoplasma hominis гентамицин (МПК50 = 8,0) оказался в 8 раз менее активным, чем тетрациклин (МПК5о = 1,0), чем доксициклин (МГОС50 = 0,125) в 64 раза, чем ципрофлоксацин (МПК50 = 1,0) в 8 раз, а чем офлоксацин (МПК50 = 2,0) в 4 раза. По отношению к Ureaplasma urealyticum гентамицин (МПК50 = 2,0) оказался менее активным, чем тетрациклин (МПК50 = 0,5) в 4 раза, доксициклин (МГЖ50 = 0,25) в 8 раз, и офлоксацин (МПК50 = 1,0) в 2 раза.

Таким образом, можно сказать, что наиболее активными в отношении как Mycoplasma hominis, так и Ureaplasma urealyticum является группа тетрацнклилов и фторхинолонов. В отношении Mycoplasma hominis наиболее активным является «слиндамицин, а наименее активным проявил себя гентамицин. В отношении Ureaplasma urealyticum активность макролидов сравнима с активностью тетрациклинов и фторхинолонов. Также наиболее активным является генгамицин, а наименее активным проявил себя клиндамицин. Однако нужно отметить, что процент появления устойчивых штаммов для макролидов, клиндамицина и гентамицина высок.

Полученные данные по МПК антибиотиков, без учета резистентных штаммов, позволили нам приступить к разработке Тест-системы для определения антибиотикочу нствите льности.

При разработке Тест-системы учитывались две концентрации: одна-минимальная, которая совпадает с МПК50, без учета резистентных штаммов, и другая - максимальная, которая сравнима со значением МГПС90, также без учета резистентных штаммов.

Использование двух концентраций в Тест-системе позволит оценивать результаты исследований по влиянию антибиотиков на урогенитальных возбудителей как чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые (резистентные).

Поскольку разработанная Тест-система должна была применяться как для определения антибиотикочувствительности Mycoplasma hominis, так и для Ureaplasma urealyticum, то использовалось следующее условие по подбору минимальной и максимальной концентраций для каждого антибиотика, входящего в состав Тест-системы. Бели для определенного антибиотика минимальные подавляющие коцентрации, подбираемые из значений МШС30, к Mycoplasma hominis и Ureaplasma

игеа1уНсит оказывались разными, то из них выбиралось наибольшее. Таким же способом подбиралась и максимальная концентрация каждого антибиотика из значений МПКдо Сочетание таких концентраций показано на рисунке 4.

О О ^

ТЕГ ТЕТ

mill max

ДОК ДОК

mm max

ЭРИ ЭРИ

min max

Ш Ш

min max

ОФ ОФ

mm max

цип цип

min max

КЛ ГЕН

ТЕТ Ют/ил тп ТЕТ 2,0 шг/иг max

ДОК 0,12 мкг/мл mn ДОК 0,25 мкг/мл max

ЭРИ 0,5 мкг/мл min ЭРИ 2,0 мкг/мл max

КТМ 0,06 мкг/мл ЛТП КТМ 0,25 инг/ш max

ЦИП 2,0 ми/мл min цИП 40 мкг/мл max

ОФ 1,0 мкг/мл пил ОФ 4,0 мкг/мл max

КЛ 4,0 м кг/мл ГЕН 4,0 мкг/мл

КМ К И

Примечание: ТЕТ - тетрациклин, ДОК - доксициклин, ЭРИ - эритромицин, КТМ - кларитромицин, ЦИП - ципрофлоксацин, ОФ - офлоксацин, KJI - клиндамицин. ГЕН - гентамицин; min - минимальная концентрация, шах - максимальная концентрация

Рисунок 4 - Схема расположения антибиотиков и их концентрации в лунках стропов

Была проведена апробация разработанной Тест-системы при сравнении с принятой за стандарт итальянский диагностический набор GENITAL SYSTEM.

Только шесть одинаковых антибиотиков из восьми в Тест-системе МИКОПЛАЗМА-АЧ присутствуют в GENITAL SYSTEM. Поэтому при сравнении двух Тест-систем ограничивались только результатами активностей следующих антибиотиков: тетрациклина, доксициклина, эритромицина, клэритромицина, офлоксацина и клиндамицина. Все результаты активностей остальных антибиотиков не учитывались при оценке эффективности разработанной нами Тест-системе МИКОПЛАЗМА-АЧ.

Сравнение результатов по чувствительности Mycoplasma hominis к шести антибиотикам в рассмотренных Тест-системах представлены в таблице 3, а чувствительности Ureaplasma urealyticum в таблице 4.

Как видно из таблиц 3 и 4 результаты по идентификации урогенитальных микоплазм в исследуемых образцах с помощью 2-х тест-систем во всех случаях совпадали между собой и с данными контрольных исследований.

Все исследуемые пробы содержали Mycoplasma hominis и/или Ureaplasma urealyticum, что было подтверждено результатами культуральных исследований на плотных питательных средах.

Анализ чувствительности выделенных микоплазм к антибиотикам показал некоторое расхождение результатов между тест-системами МИКОПЛАЗМА-АЧ и GENITAL SYSTEM.

Результаты таблицы 3 показывают, что небольшое расхождение по чувствительности Mycoplasma hominis встречается только в случае клиндамицина и офлоксацина (87,5 % совпадения). Ко всем остальным антибиотикам отмечается высокое совпадение результатов. Надо отметить, что набор GENITAL SYSTEM показал три случая обнаружения чувствительных штаммов к кларитромиципу и один к эритромицину, наряду с тем, что в результатах МИКОПЛАЗМА-АЧ все штаммы оказались резистентными. Это можно объяснить тем, что чувствительные штаммы к эритромицину и кларитромицину обнаружились в образцах со смесью Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, и именно присутствие Ureaplasma urealyticum может объяснить этот факт.

Как видно из таблицы 4 по чувствительности Ureaplasma urealyticum исследуемые Тест-системы показали высокий процент совпадения кроме антибиотиков эритромицина (52,94 %) и клиндамицина (35,71 %), но если учесть случаи появления умеренно-чувствительных штаммов в МИКОПЛАЗМА-АЧ, то процент совпадения возрастет (до 100 % и 85,71 % соответственно). Надо отметить, что МИКОПЛАЗМА-АЧ показала меньшее количество резистентных штаммов, чем

GENITAL SYSTEM к кларитромицину. Это можно объяснить теперь уже влиянием Mycoplasma hominis в смешанных образцах.

Таблица 3 - Сравнение результатов по чувствительности Mycoplasma hominis в двух Тест-системах

АНТИ БИОТИК Уровень чувствительности М. hominis, кол.штаммов (%)

МИКОПЛАЗМА-А Ч GENITAL SYSTEM

Р УЧ ч Р УЧ ч

ТЕТ 0 0 8(100) 0 0 8

док 0 0 8(100) 0 0 8

ЭРИ 8 0 0 7 0 1

КТМ 8 0 0 5 0 3

ОФ 1 0 7(87 5) 0 0 8

КЛ 1 0 7(87.5) 0 0 8

Примечание: ТЕТ - тетрациклин, ДОК - доксициклии, ЭРИ - эритромицин, КТМ - клэритромицин, ЦИП - ципрофлоксацин, ОФ -офлокса-цин, КЛ - клиндамицин, ГЕН - гентамицин. Р - резистентные штаммы, УЧ - умеренно-чувствительные штаммы, Ч - чувствительные штаммы.

Таблица 4 — Сравнение результатов по чувствительности Ureaplasma urealyticum в двух Тест-системах

Уровень чувствительности U. urealyticum, кол.штаммов (%)

АНТИ БИОТИК МИКОПЛАЗМА-АЧ GENITAL SYSTEM

Р УЧ Ч Р УЧ ч

ТЕТ 0 2 20(95.24) 1 0 21

док 0 0 22(100) 0 0 22

ЭРИ 5 8 9(52.94) 5 0 17

КТМ 2 0 20 4 0 18

ОФ 0 1 21(95.45) 0 0 22

КЛ 10 7 5(35.71) 8 0 14

Примечание- ТЕТ - тетрациклин, ДОК - доксициклин, ЭРИ - эритромицин, КТМ - клэритромицин, ЦИП - ципрофлоксацин, ОФ -офлокса-цин, KJI - клиндамицин, ГЕН - гентамицин. Р - резистентные штаммы, УЧ - умеренно-чувствительные штаммы, Ч - чувствительные штаммы.

ВЫВОДЫ

1. Разработана усовершенствованная питательная среда для идентификации Mycoplasma hominis, имеющая следующие преимущества:

• оптимальное значение pH для роста Mycoplasma hominis;

• новая система индикаторов, обуславливающая четкий цветовой переход для облегчения визуального наблюдения результатов;

• более высокая селективность питательной среды, обеспеченная добавлением антибиотиков.

2. Изучение активности антибиотиков и чувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов показали, что наиболее активными в отношении как Mycoplasma hominis, так и Ureaplasma urealyticum является группа тетрациклинов и фторхинолонов. В отношении Mycoplasma hominis наиболее активным является клиндамицин, а наименее активным - гентамицин. В отношении Ureaplasma urealyticum активность макролидов сравнима с активностью тетрациклинов и фторхинолонов, а наиболее активным проявил себя гентамицин, в то время как наименее активным оказался клиндамицин. Однако нужно отметить, что процент появления штаммов устойчивых к макролидам, клиндамицину и гентамицину высок.

3. Обработка полученных данных по МПК антибиотиков позволила нам создать диагностическую тест-систему для идентификации и определения антибиотико-чувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в виде экспресс-диагностикума с использо-ванием тиофильно-высушенной питательной среды и сорбированных анти-биоггиков в одноразовых полистироловых стрипах от разборных планшетов.

4. По проведенной оценке эффективности разработанной нами тест-системы МИКОПЛАЗМА-АЧ, при сравнении с итальянским набором GENITAL SYSTEM можно сказать, что наша Тест-система по чувствительности и специфичности вполне соответствуют общепринятым в практике микробио-логических исследований стандартам и с успехом может применяться для обнаружения, идентификации и определения чувствительности к антибиотикам урогенитальных микоплазм - Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

5. Результаты исследования и разработанная тест-система «МИКОПЛАЗМА-АЧ» внедрены в линию производства диагностических препаратов Отдела новых технологий ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Волков И.И , Вербов В.Н., Семенов Н.В , Иванов А.М , Рока Вильчес В., Теличко И.Н. Антибиотикорезистентность микоплазм, выделенных из урогенитального тракта// Материалы научной конференции и VIII съезда Российско-Итальянского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине», 3-5 декабря 2002 г.- Санкт-Петербург, 2002.- С. 70-71.

2. Семенов Н.В., Рока В.В., Пудовкина И.Ф., Вербов В.Н. Применение эрнтроцитарного диагностикума для серологической диагностики Mycoplasma hominis/! Материалы XXXVITI Всероссийской научно-практической конференции дерматологов и врачей смежных специальностей «Актуальные проблемы дерматовенерологии» («Роль интеграции смежных специалистов в решении проблем социально-значемых болезней»), 15-17 апреля, 2003 г.- Санкт-Петербург, 2003.- С. 8-9.

3. Рока В.В., Березина Л.А., Вербов В.Н., Куляшова Л.Б. Диагностическая значимость питательной среды «УРЕАПЛАЗМА-50» при выделении и идентификации Ureaptasma urealyticumll Материалы третьей международный конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 4-5 сентября 2003.- Санкт-Петербург, 2003 г.- С. 62.

4. Roca Vilchez W., Zarucheynova О. V., Verbov V. N., Ginak A. I., Semenov N. V. Actividad in vitro de antibióticos de diversos grupos contra los agentes etiológicos de la micoplasmosis urogenital Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticumll Analisando, Revista Institucional del Colégio Químico-Farmacéutico del Perú.- 2005.- AÑO II, № 1 -P. 32-36.

5. Рока B.B., Заручейнова O.B., Вербов B.H., Гинак А.И., Семенов Н.В. Чувствительность урогениталькых микоплазм Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам разных групп в испытаниях in vitro/J Альманах «Инфекционные болезни - 2004»/ Под общей редакцией А.Г. Рахмановой, А.А Яковлева, Е.Н. Виноградовой,- СПб.: Изд-во НИИХ СПбГУ, 2005.- С. 169-171.

20.09.05r. Зак. 131-75 РТП ИК «Синтез» Московский пр., 26

1*18 13Û

РНБ Русский фонд

2006-4 16781

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рока Вильчес Вашингтон

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1 Систематика Микоплазм.

1.2 Семейство Mycoplasmataceae.

1.2.1 Морфология микоплазм.

1.2.2 Чувствительность микоплазм к физическим и химическим факторам.

1.2.3 Биохимические свойства урогенитальных микоплазм

1.2.4 Культуральные свойства.

1.2.5 Антигенная структура.

1.3 Микоплазмозы человека.

1.3.1 Микоплазмы, инфицирующие человека.'.

1.3.1.1 Mycoplasma pneumoniae.

1.3.1.2 Mycoplasma fermentans.

1.3.1.3 Mycoplasma hominis.

1.3.1.4 Ureaplasma urealyticum.

1.3.2 Факторы патогенности.

1.3.3 Патогенез.

1.3.4 Эпидемиология.

1.3.5 Клинические проявления.

1.3.5.1 Здоровых женщин.

1.3.5.2 Микоплазмоз беременных.

1.3.6 Лечение.

1.4 Чувствительность микоплазм к антибиотикам. Резистентность

1.4.1 Критерии для определения чувствительности Чп vivo\

1.4.1.1 Клиническая эффективность.

1.4.1.2 Уровень антибиотика в сыворотке крови.

1.4.1.3 Изменение чувствительности у микроорганизмов одного вида.

1.4.2 Механизмы резистентности.

1.4.3 Методы определения чувствительности Чп vitro'.

1.4.3.1 Методы диффузии.

1.4.3.2 Методы разведения.

1.5 Классификация антибиотиков.

1.5.1 Группа тетрациклинов.

1.5.2 Группа макролидов.

1.5.3 Группа хинолонов/фторхинолонов.

1.5.4 Группа линкозамидов.

1.5.5 Группа аминогликозидов.

1.5.6 Чувствительность антибиотиков разных классов к урогенитальным микоплазмам.

1.6 Лабораторная диагностика.

1.6.1 Бактериологические методы диагностики.

1.6.2 Серологические методы.

1.6.3 Методы молекулярной биологии.

1.7 Сравнение методов анализа.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВAI1ИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Микробиологические методы исследования.

2.3 Физико-химические методы исследования.

2.4 Вспомогательные материалы, используемые при исследовании.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Усовершенствование жидкой питательной среды «МИКО-ПЛАЗМА-50».

3.1.1 Подбор системы индикаторов.

3.1.2 Определение точки эквивалентности выбранной смеси индикаторов.

3.1.3 Поиск и определение антибиотиков для подавления роста посторонней микрофлоры.

3.2 Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

3.2.1 Приготовление жидких питательных сред МИКОПЛАЗМА-50 и УРЕАПЛАЗМА-50.

3.2.2 Определение МПК для М. hominis.

3.2.3 Определение МПК для U.urealyticum.

3.2.4 Разработка Тест-системы для определения антибиоти-кочувствительности к возбудителям урогенительных мико-плазмозов.

3.3 Сравнительная оценка эффективности разработанной Тест-системы

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1 Результаты по усовершенствованию жидкой питательной среды «МИКОПЛАЗМА-50».

4.2 Результаты по определению минимальной подавляющей концентрации (МПК).

4.3 Результаты по апробации разработанной Тест-Системы.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-систем для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей микоплазмоза"

Микоплазмы, более раннее название - организмы подобные возбудителю плевропневмонии (Pleuropneumonia like organism PPLO) были впервые выделены от животных в 1898 году, а от человека в 1937 году. В 1937 году Dienes и Edsall описали случай инфицированности человека. Речь шла о генитальной инфекции, абсцессе Бартолиевой железы, вызванной микоплазмой, которая, вероятнее всего являлась Mycoplasma hominis. В 1954 году, при диагностике уретрита Shepard впервые, кроме Mycoplasma hominis, изолировал Ureaplasma urealyticum или Т-штаммы (от английского - "tiny-form PPLO colonies"). Микоплазмы давно известны в качестве возбудителей заболеваний многих видов животных, птиц и растений, однако их роль в инфекционной патологии человека стала предметом интенсивных исследований только с 1962 года, когда было доказано, что этиологическим агентом первичной пневмонии является микоплазма. В дальнейшем была установлена этиологическая связь нескольких видов микоплазм с различными заболеваниями дыхательных и мочеполовых путей.

Заболевания человека, вызываемые микоплазмами, объединяют в группу микоплазмозов, большая часть которых относится к заболеваниям урогениталь-ного тракта. В последнее время резко возросла частота хламидийной, вирусной, микоплазменной и смешанной инфекции, передающиеся главным образом половым путем, борьба с которыми представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма.

Высокая инфицированность населения микоплазмами, широкий спектр заболеваний, вызываемый ими, заставляет исследователей все более внимательно изучать эту группу микроорганизмов. Лабораторная и клиническая диагностика, лечение и профилактика этих инфекций в настоящее время приобретает все более важное значение в современном здравоохранении.

Урогенитальные микоплазмы Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealy-ticum вызывают такие распространенные инфекции, как негонококковые уретриты, воспаления органов малого таза, эндометриты и бактериальные вагинозы. Они могут также вызывать преждевременные роды, рождения детей с малым весом и клиническими проявлениями заражения крови, болезнями респираторного тракта и неврологическими расстройствами. У микоплазм также как и у других микроорганизмов может проявляться антибиотикорезис-тентность за счет генетических мутаций или путем приобретения нового генетического материала. Поэтому при назначении антибиотикотерапии важным является проведение тестов на сравнительную чувствительность антибиотиков различных групп. Стандартизированными методами для определения антибио-тикочувствительности микоплазм являются только методы серийных разведений в агаре или в жидкой питательной среде. Диффузионный метод на дисках не может использоваться для Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, так как эти культуры растут очень медленно и антибиотики успевают раньше распределиться в слое агара прежде чем колонии вырастут и дадут определенную зону ингибирования роста.

Предварительное определение антибиотикочувствительности при назначении лечения микоплазменных и уреаплазменных инфекций позволяет снизить удельный вес положительных результатов при повторном обследовании после курса антибиотикотерапии с 37 % до 7-8 %.

Целью лабораторной диагностики является идентификация возбудителей, вызывающих различные микоплазмозы, а также установление их чувствительности или устойчивости к антибактериальным средствам, используемым по общепринятым схемам терапии.

Разработка Тест-системы для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum и послужило объектом данного исследования.

Таким образом, цель настоящего исследования состоит в разработке тест-системы для идентификации и определения антибиотикочувствительности , возбудителей урогенитальных микоплазмозов: Mycoplasma hominis и Urea-plasma urealyticum. Тест-система должна удовлетворять следующим условиям: чувствительность селективность, надежность, быстрота и простота исполнения.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• Поиск подходящей системы индикаторов, улучшающей наглядное определение результатов качественной реакции на рост Mycoplasma hominis.

• Поиск и определение концентрации антибиотиков для подавления роста посторонней бактериальной и грибной микрофлоры.

• Изучение чувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам разных групп в исспытаниях in vitro.

• Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков: 2-х тетрациклинов (тетрациклин, доксициклин), 2-х фтор-хинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин), 2-х макролидов (эритромицин, кларитромицин), линкозамида (клиндамицин), аминогли-козида (гентамицин) - для ингибирования роста урогенитальных микоплазм Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

• Изучение сравнительной активности антибиотиков разных групп к Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

• Проведение сравнительной оценки эффективности разработанной Тест-системы для идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum при сравнении с зарубежным аналогам.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рока Вильчес Вашингтон

5 ВЫВОДЫ

1. Разработана усовершенствованная питательная среда для идентификации Mycoplasma hominis, имеющая следующие преимущества:

• оптимальное значение рН для роста Mycoplasma hominis;

• новая система индикаторов, обуславливающая четкий цветовой переход для облегчения визуального наблюдения результатов;

• более высокая селективность питательной среды, обеспеченная добавлением антибиотиков.

2. Изучение активности антибиотиков и чувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов показали, что наиболее активными в отношении как Mycoplasma hominis, так и Ureaplasma urealyticum является группа тетрациклинов и фторхинолонов. В отношении Mycoplasma hominis наиболее активным является клиндамицин, а наименее активным - гентамицин. В отношении Ureaplasma urealyticum активность макролидов сравнима с активностью тетрациклинов и фторхинолонов, а наиболее активным проявил себя гентамицин, в то время как наименее активным оказался клиндамицин. Однако нужно отметить, что процент появления штаммов устойчивых к макролидам, клиндамицину и гентамицину высок.

3. Обработка полученных данных по МПК антибиотиков позволила нам создать диагностическую тест-систему для идентификации и определения антибиотико-чувствительности возбудителей урогенитальных микоплазмозов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в виде экспресс-диагностикума с использованием лиофильно-высушенной питательной среды и сорбированных антибиотиков в одноразовых полистироловых стрипах от разборных планшетов.

4. По проведенной оценке эффективности разработанной нами тест-системы МИКОПЛАЗМА-АЧ, при сравнении с итальянским набором GENITAL SYSTEM можно сказать, что наша Тест-система по чувствительности и специфичности вполне соответствуют общепринятым в практике микробиологических исследований стандартам и с успехом может применяться для обнаружения, идентификации и определения чувствительности к антибиотикам урогенитальных микоплазм - Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. 5. Результаты исследования и разработанная тест-система «МИКОПЛАЗМА-АЧ» внедрены в линию производства диагностических препаратов Отдела новых технологий ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (Приложение А).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рока Вильчес Вашингтон, Санкт-Петербург

1. Автушенко С.С. Идентификация микоплазм, выделенных из мочеполового тракта женщин// Лабораторное дело.- 1975.- № 5.- С. 310-312.

2. Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путем: Руководство для врачей М.: Мед. кн.; Н.Новгород: НГМА, 1999.-416 с.

3. Антибактериальная терапия: практическое руководство/ Под ред. Л.С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова- М.: Медицина, 2000192 с.

4. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии — М.: Агропромиздат, 1988.155 с.

5. Асратян А.А. Распространение М. hominis инфекции и ее значене в патологии респираторного тракта: Автореф. дис. . канд. мед. наук/ М.-1977.- 20 с.

6. Асратян А.А., Козлова О. В. Серо-эпидемиологическая характеристика инфекции, вызванной М. hominis// Микоплазмы и микоплазмозы: Сб. науч. тр./ М.- 1985.- С. 31-35.

7. Башмакова М.А., Кошелева Н.Г., Калашникова Е.П. Инфекция и бактериальная колонизация урогениталий у беременных, влияние на течение беременности, плод и новорожденного ребенка// Акушерство и гинекология.- 1995.- №1 С. 15-18.

8. Бойцов А.Г., Ластовка О.Н., Горин А.А. Вопросы качества при лабораторной диагностике урогенитальных инфекций// Клиническая лабораторная диагностика.- 2000.-№2 С. 37-38.

9. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химио-препаратам,- М.: Медицина, 1984.- 274 с.

10. Венерические болезни: Руководство/ А.А. Антоньев, Р.С. Бабаянц, Т.В. Васильев и др.; Под пед. O.K. Шапошникова.- М.: Медицина, 1991.- 544 с.

11. Возбудители инфекций урогенитального тракта и их чувствительности к различным группам антибактериальных препаратов/ А.Ф. Мороз, В.А. Макарова, Е.Е. Бабаева и др.// Клиническая лабораторная диагностика-2001.-№ П.-С. 37-38.

12. Выявление тетрациклин и эритромицинустойчивых штаммов микоплазм с помощью ПЦР/ С.В. Соловьева, Е.Г. Цой, Н.А. Зигангирова и др.// Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 1998.- № 6 - С. 3-7.

13. Гамова Н.А. Чувствительность к лекарственным препаратам U. urealyticum, персистирующих в организме больных при хронических воспалительных заболеваниях урогенитального тракта// Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2003.- №4 - С. 81-85.

14. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Игумнов А.В. Лабораторная диагностика микоплазмозов человека// Вестник АМН СССР.- 1991.- № 6.- С. 44-47.

15. Диагностика хламидийной и гарднерезной инфекции у больных с острыми гинекологическими заболеваниями/ Е.Б. Лазарева, С.С. Селицкая, Н.И. Тихомирова и др.// Клиническая лабораторная диагностика 1997.-№3.-С. 21-23.

16. Дмитреев Г.А. Урогенитальные бактериальные инфекции: диагностика// Инфекции и антимикробная терапия — 2003— Т.5, №1— С.5-11.

17. Дюскалиева Д.У. Экспресс-индикация Mycopasma pneumoniae с помощью антительных эритроцитарных диагностикумов// Лабораторное дело.-1987.-№7.- С. 325-327.

18. Ефремова И.И., Козлова О.В., Якоби Г.В. Сравнительная характеристика инфекции, вызванной М. hominis// Микоплазмы и микоплазмозы: Сб. науч. тр./ М.- 1985.- С. 35-43.

19. Злыдников Д.М., Казанцев А.П., Шаламова М.Г. Микоплазмоз человека.-Л.: Медицина, 1975.- 232 с

20. Индикаторы: В 2 т.- Т. 1; Под ред. Э. Бишоп; Пер с англ. Под ред. И.А. Марова.- М.: Мир, 1976.- 496 с.

21. Информативность методов лабораторной диагностики инфекций урогенитального тракта микоплазменной этиологии/ В.Е. Маликов, А.А. Бурова, О.Н. Зайцева и др.// Кремлевская медицина. Клинический вестник.- 2001.- №1.- С. 53-55.

22. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий: Руководство для врача.- М.: Авицена ЮНИТИ, 1995.-317с.

23. Кругликов В.Т. Использование реакции непрямой иммунофлюорес-ценции в диагностике инфекции, вызванной Mycoplasma pneumoniae// Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1989.- № 2.- С. 75-79.

24. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований.- М.: Медицина, 1978 394 с.

25. Лабораторная диагностика микоплазмоза и уреаплазмоза у урологических и гинекологических больных/ Ю.В. Вульфович, И.В. Раковская, Н.А. Гамова и др.// Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1995.-№5.- С. 97-100.

26. Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функций клетки/ Пер с англ. Под ред. А.А. Баева, Я.М. Варшавского.- М.: Мир, 1974.- 1236 с.

27. Лечение вильпрафеном и доксициклином микоплазменных и уреаплаз-менных инфекций/ Н.Н. Захаревич, Л.Н. Новикова, Е.А. Михнина и дрю// Акушерство и гинекология — 2002.- №2 С. 55-56.

28. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии: 5-е изд., перераб. И доп.-М.: Химия, 1979.-489 с.

29. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник/ Под ред. А.И. Карпищенко. — Спб.: Интермедика. — 1997. -304с.

30. Медицинская лабораторная диагностика (програмы и алгоритмы). Справочник/ под ред. А.И. Карпищенко.- Санкт-Петербург: Интермедика, 1997.-304 с.

31. Медицинская микрбиология/ Под пед. В.И. Покровкого, В.А. Поздеева.-М.: ГЭОТАР Медицина,- 1999.- 1200 с.:ил.

32. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология (Теория и практика)/ Под ред. А.С. Кривиского, В.Ю. Урбаха.- М.: Мир- 1967348 с.

33. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) новое слово в диагностике инфекционных заболеваний/ А.А. Бонецкий, P.P. Тухватшин, А.И. Филипченко, A.M. Митина// Здравоохранение Кыргыстана - 1999.- №1-С. 42-45.

34. Механизмы персистенции урогенитальных микоплазм и методы их выявления/ И.В. Раковская, Л.Г. Горина, Н.А. Зигангирова и др.// Ж-лмикробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2000.- № 4 (прил.).-С. 47-52.

35. Микоплазмы./ Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вонский М.С.- СПб.: Наука, 2002.- 320 с.

36. Определитель бактерий Берджи в 2т./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.; Пер с англ. Под ред. Г.А. Заварзина.- М.: Мир, 1997.-800с.:ил.

37. Опыт применения различных методов диагностики респираторного микоплазмоза/ И.В. Раковская, Л.Г. Горина, Н.А. Зигангирова и др.// Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2002.- № 5.— С. 5762.

38. Перламутров Ю.Н., Чернова Н.И., Савостьянова Н.Ю. Опыт применения Спафло при лечении урогенитального микоплазмоза и уреаплзамоза// Антибиотики и химиотерапия.- 2002 — Т.47, № 9.— С. 22-23.

39. Персистенция микоплазм в инфицированном организме: наблюдения, причины и механизмы, диагностика/ С.В. Прозоровский, И.В. Раковская, Л.Г. Горина и др.// Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1997.- № 4.- С. 47-51.

40. Покровский В.Н. Антибиотики и бактерии. М.: Знание, 1990. - 66с.

41. Применение ПЦР для выявления тетрациклинустойчивых штаммов урогенитальных микоплазм/ С.В. Соловьева, Е.Г. Цой, Н.А. Зигангирова и др.// Клиническая лабораторная диагностика.- 2000.- № 1.- С. 43-46.

42. Прозоровский Н.С. Микоплазмозы, М.: Медицина.- 1978.- 74 с.

43. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Васильева В.И. Микоплазма пневмонии. Инфекция.-М.: Медицина, 1978.-312 с.

44. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология.- М.: Медицина, 1995.- 288 с.

45. Профилактика невынашивания беременности при урогенитальной инфекции у супругов/ Н.В. Башмакова, Л.П. Заварзина, Л.К. Глазкова, В.Д. Головко// Акушерство и гинекология.- 1998.- №4- С. 15-17.

46. Раковская И.В., Горина Л.Г. Лабораторная диагностика микоплазмозов человека// Клиническая лабораторная диагностика 2000.- № 8- С. 5053.

47. Ремпель Е.Г., Шаманин В.А. Сравнение методов разных ПЦР-тестов для выявления Clamytia trachomatis, U. urealyticum и M. hominis у женщин с нарушениями репродуктивной функции// Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2000.- № 6 — С. 76-78.

48. Роль микоплазмы пневмонии при менингитах и менингоэнцефалитах/ В.В. Кононенко, А.А. Руденко, В.Т. Кругликов, Л.Д. Жаркова// Врачеб. дело.- 1987,- №3.- С. 108-111.

49. Саламова Р.Э. Разработка и сравнительная оценка микрометодов лабораторной диагностики микоплазмозов человека: Автореф. дис. . канд. мед. наук/ М. 1986.- 20 с.

50. Семенова В.А., Стеценко О.Г., Баймуратова М.А. Экспресс-диагностика инфекции Mycoplasma pneumoniae с помощью реакции встречного иммуноэлектрофореза.// Лабораторное дело 1986.- № 5.- С. 291-293.

51. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования/ Под ред. М.О. Биргера М.: Медицина, 1982.- 464 с.

52. Тимаков В.Д., Каган ГЯ. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в потологиию- М.: Медицина, 1973.- 392 с.

53. Ускоренная лабораторная диагностика микоплазмы гоминис с помощью антительного эритроцитарного диагностикума/ М.С. Байжомартов, Г.У. Дюскалиева, М.Г. Булегенова, О.Г. Андрусева// Здравоохранение Казахстана.- 1991.-№8.- С. 37-39.

54. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б.,Бельская Н.А. Микробиология/ Под ред. Ф.К. Черкес-М.: Медицина, 1986.- 512 с.

55. Чувствительность к антибиотикам урогенитальных микоплазм и уреа-плазм/ И.Л. Жилина, Н.М. Шустрова, Е.Н. Денисова, Л.И. Зыкина// Клиническая лабораторная диагностика.- 1998.- №9- С. 12.

56. Экспресс-диагностика инфекции Mycoplasma pneumoniae с помощью реакции встречного иммуноэлектрофореза/ В.А. Семенова, О.Г. Стецен-ко, М.А. Баймуратова, М.С. Байжомартов// Лабораторное дело.- 1986.- № 5.-С. 291-293.

57. Экспресс-индикация Mycoplasma pneumoniae с помощью антительных диагностикумов/ М.С. Байжомартов, В.А. Шамардин, Г.У. Дюскалиева и др.// Лабораторное дело.- 1982,- № 6.- С. 49-51.

58. Юцковская Я.А., Юцковский А.Д., Беседнова Н.Н. Чувствительность к антибиотикам штаммов U. urealyticum, выделенных на территории Приморского края.// Антибиотики и химиотерапия 2002,— Т. 47 № 3 - С. 14-17.

59. Afecciones genitourinarias у micoplasmas/ J. A. Sanchez Hernandez, J. A. Rivera Tapia, S. A. Cortez Martinez у col.// Rev. Мех. Patol. Clin.- 2003.- V. 50, №2.- P. 71-76.

60. Barry A.L., Thornberry C. Susceptibility Tests: Diffusion Test Procedures// Manual of clinical microbiology. 5th. ed.-Washington D. C.: American Society for Microbiology, 1991-P. 1117-1125.

61. Bebear C., Bouanchaud D. H. A review of the in-vitro activity of quinupristin/dalfopristin against intracellular pathogens and mycoplasmas// Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 1997.- № 39.- Suppl. A.- P. 59-62.

62. Bebear C., Robertson J. Determination of minimal inhibitory concentration// Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology.- Volume II: Diagnostic Procedures / J. G. Tully, S. Razin. Eds.- CALIFORNIA: Academic Press, 1996.- P. 189-199.

63. Bygdeman S. M., Mardh P. A. (1983). Antimicrobial susceptibility and susceptibility testing of Mycoplasma hominis: a review// Sexually transmited diseases.- 1983.- № 10, Suppl. 4.- P. 366-370.

64. Cassel G. H., Gambill G., Duffy L. ELISA in respiratory infections of humans// Molecular and diagnostic procedures in Mycoplasmology.- New York: ACADEMIC PRESS, 1996.- P. 123-136.

65. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones/ С. M. Bebear, J. M. Bove, C. Bebear, J. Renaudin.// Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 1997.- № 41.-P. 269-273.

66. Cohen M. A., Huband M. D. In vitro susceptibilities of Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, and Ureaplasma urealyticum to clinafloxacin, PD 131628, ciprofloxacin and comparator drugs// J. Antimicrob. Chemother.-1997.- №40.- P. 308-309.

67. Color Test for the Measurement of Antibody to T-Strain Mycoplasmas/ R. H. Purcell, D. Taylor-Robinson, D. Wong, R. M. Chanock// Journal of Bacteriology.-1966.- V. 92, № 1.- P 6-12.

68. Comparative Activities of Telithromycin (HMR 3647), Levofloxacin and Other Antimicrobial Agents against Human Mycoplasmas/ C.M. Bebear, H. Renaudin, A. Bryskier, C. Bebear// Antimicrobial agents and Chemotherapy.— 2000.-V. 44, № 7.-P. 1980-1982.

69. Comparison of Commercially Available Media for Detection and Isolation of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis/ N. L. Broitman, C.M. Floyd, C. A. Johnson, E.M. Peterson// Journal of Clinical Microbiology.-1992.- V. 30, №> 5.- P. 1335-1337.

70. Comparison of methods for the isolation of genital mycoplasmas from men/ P. I. Tarr, Y. H. Lee, S. Alpert et al. //J. Infect. Dis.-1976.- № 133.- P. 419-423.

71. Cooksey R.C. Mechanisms of Resistance to Antimicrobial Agents.// Manual of clinical microbiology. 5th. ed.-Washington D. C.: American Society for Microbiology, 1991.- P. 1099-1104.

72. Detection of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in women sexually active or not/ C. Gil-Juarez, B. A. Calderon, J. Montero et al.// Rev. Latinoam. Microbiol.- 1996.- V. 38, № 2.- P. 81-88.

73. Evaluation of the E-test for susceptibility testing of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum/ E. Dosa, E. Nady, W. Falk et al.// Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 1999.- № 43 P.575-578.

74. Falk, L., Fredlund H., Jensen, J. S. Tetracycline treatment does not eradicate Mycoplasma genitalium!I Sex. Transm. Infect.- 2003.- V. 79.- P. 318-319.

75. Freudt E. A., Edward D. G. Classification and Taxonomy// The Mycoplasmas Vol. 1.- London: ACADEMIC PRESS LTD., 1979.- P. 23-28.

76. In vitro activity of BAY 12-8039, a new fluoroquinolone, against Mycoplasmas/ С. M. Bebear, H. Renaudin, A. Boudjadja, C. Bebear// Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 1998.- V. 42, № 3.-P. 703-704.

77. In vitro activity of grepafloxacin, a new fluoroquinolone, against mycoplasmas/ C.M. Bebear, H. Renaudin, T. Schaeverbeke et al.// Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 1999.- № 43- P. 711-714.

78. In vitro Susceptibilities of Mycoplasmas and Ureaplasmas to New Macrolides and Aryl-Fluoroquinolones/ К. B. Waites, G. H. Cassel, К. C. Canupp, P. B. Fernandes// Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 1988.- V. 32, № 10.- P. 1500-1502.

79. Is genital colonization with Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum associated with prematurity or low birth weight?/ R. Romero, M. Mazor, E. Oyarzun et al.// Obstetrics and Ginecology.- 1989.- № 73.- P. 532-536.

80. Isolation of genital mycoplasmas from blood obtained shortly after vaginal delivery/ W. M. McCormack, B. Rosner, Y. H. Lee et al.// Lancet.-1975.- № 1.- P. 596-599.

81. Isolation of Mycoplasma hominis from blood cultures in patients with post partum fever/ R. J. Wallace, S. Alpert, K. Browne et al.// Obst. Gynecol.-1978.- № 51.-P. 181-185.

82. Isolation of Mycoplasma pneumoniae from the human urogenital tract/ M. Goulet, R. Dular, J.G. Tully et al.// J. Clin. Microbiol.- 1995.- V. 33.- P. 2823-2825.

83. Jensen J. S., Borre M. В., Dohn B. Detection of Mycoplasma genitalium by PCR Amplification of the 16S rRNA Gene// Journal of Clinical Microbiology.-2003.-V. 41, № l.-P. 261-266.

84. Kenny G. E., Cartwright F. D. Effect of pH, inoculum size, and incubation time on the susceptibility of Ureaplasma urealyticum to erythromycin in vitro!I Clinical Infectous Diseases.- 1993.-№ 17-P. 215-218.

85. Kitson K., Wright К. C. The in vitro simulation of Mycoplasma hominis isolation using supplemented culture media in the BACTEC 9000 series blood culture system// British J. Of Biomedical Science.- 1998.- V. 55, № 1.- P. 9-12.

86. Krausse D. C., Taylor-Robinson D. Mycoplasmas which infect humans// Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis! 417-445.

87. Manchee R. J., Taylor-robinson D. Enhanced Growth of T-Strain Mycoplasmas with N-2- Hydroxyethylpiperazine-N' -2-Ethanesulfonic Acid Buffer// Journal of Bacteriology.- 1969.- V. 100, №> l.-P. 78-85.

88. McCormack W.M. Susceptibility of mycoplasma to antimicrobial agents. Clinical Implications.// Clin. Infect. Dis.- 1993.- № l.-P. 200-201.

89. McCoy R.E., Caudwell A., Chang C.J. Plant diseases associated with mycoplasma-like organisms// The Mycoplasmas./ Eds R.F. Whitcomb, J.G. Tully.- New York: ACADEMIC PRES, 1989.- Vol.5.- P. 545-560.

90. Mechanisms of Macrolide resistance in Ureaplasma urealyticum: a study on collection and clinical strains// G. Palu, S. Valisena, M. F. Barile, G. A. Melony// European Journal of Epidemiology.- 1989.- № 5.- P. 146-153.

91. Merino L. A., Ronconi M. C., Bojanich M. V. Presencia de micoplasmas urogenitales en mujeres en edad fertil// Enfermedades Infecciosas у Microbio-logia Clinica.- 1997.- V. 15, № 10.- P. 566-567.

92. Methodologic investigations and prevalence of genital mycoplasmas in pregnancy/ P. Braun, J. O. Klein, Y. H. Lee, E. H. Kass// J. Infect. Dis.- 1970.- № 121.-P. 391-400.

93. Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis./ J. Maniloff, R.N. McElhaney, L.R. Finch, J.B. Baseman.- Washington: ACADEMIC PRESS, 1992.- 654 p.

94. Persistence of Mycoplasma hominis after therapy: importance of tetracycline resistance and of coexisting vaginal flora/ L. A. Koutsky, W. E. Stamm, R. C. Brunham et al.ll Sexually transmited diseases.- 1983.- № 10, Suppl. 4.-P. 374381.

95. Renaudin H., Bebear С. Evaluation des SYSTEMES Mycoplasma Plus et SIR Mycoplasma pour la detection quantitative et l'etude de la sensibilite aux antibiotiques des mycoplasmes genitaux// Patol. Biol. (Paris).- 1990.- V. 38, № 5.- P. 431-435.

96. Renaudin H., Tully J. G., Bebear C. In Vitro Susceptibilities of Mycoplasma genitalium to Antibiotics// Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 1992.-V. 36, № 4.- P. 870-872.

97. Roberts M. C. Antibiotic resistance// Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis/ J. Maniloff Ed.- Washington D. C.: American Society for Microbiology, 1992.- P. 513-523.

98. Roberts, M. C., Hillier, S. L. (1990). Genetic basis of tetracycline resistance in urogenital bacteria// Antimicrobial Agents and Chemoterapy.- 1990.- № 34.- P. 261-264.

99. Robertson J. A. Bromothymol blue Broth: Improved Medium for Detection of Ureaplasma urealyticum (T-Strain Mycoplasma)// Journal of Clinical Microbiology.- 1978.- V. 7, № 2. P. 127-132.

100. Robertson J. A., Alfa M., Boatman E. S. Morphology of the cells and colonies of Mycoplasma hominis// Sex. Transmit. Dis- 1983.- V. 10- P. 232-239.

101. Rodwell A. W., Mitchell A. Nutrition, Growth and reproduction Mycoplasmas// The Mycoplasmas Vol. 1.- London: ACADEMIC PRESS LTD., 1979.-P. 67-78.

102. Rosengarten R., Wise K. Phenotypic switching in mycoplasmas phase variation of diverse surface lipoproteins// Science.- 1990.- Vol. 247 P. 316-318.

103. Sahm D.F., Washington J.A. Antibacterial Susceptibility Tests: dilution Methods// Manual of clinical microbiology. 5th. ed. .-Washington D. C.: American Society for Microbiology, 1991P. 1105-1116.

104. Senterfit Lawrence B. Antibiotic sensitivity testing of Mycoplasmas// Methods in Mycoplasmology Vol. 2.- New York: ACADEMIC PRESS, 1983.- P. 397401.

105. Shepard M. С., Masover G. К. Special features of Ureaplasmas// The Mycoplasmas Vol. 1.- London: ACADEMIC PRESS LTD., 1979.- P. 583-589.

106. Small repeating units within the Ureaplasma urealyticum MB antigen gene encode serovar specificity and are associated with antigen size variation/ X. Zheng, L.J. Teng, H.L. Watson et al.// Infect. Immun.- 1995.- V. 63.- P. 891898.

107. Susceptibilities of genital mycoplasmas to the newer quinolones as determined by the agar dilution method/ G. E. Kenny, Т. M. Hooton, M. C. Roberts et al.// Antimicrobial Agents and Chemoterapy.- 1989.- № 33.- P. 103-107.

108. Susceptibility of genital mycoplasmas to antimicrobial agents/ P. Braun, J. O. Klein, E. H. Kass et al.// Appl. Microbiol.- 1970.- № 19.- P. 67-70.

109. Taylor-Robinson D. and Furr P. M. Clinical antibiotic resistance of Ureaplasma urealyticum!/Pediatric Infectious diseases.- 1986.- № 5, Suppl. 6.-P. 335-337.

110. Taylor-Robinson D. Metabolism inhibition tests// Methods in Mycoplasmology: Mycoplasma characterization Vol. I/ S. Razin, J. G. Tully Eds.- London: Academic Press, 1983.- P. 411-417.

111. Taylor-Robinson D., Addey J. P., Goodwin C. S. Comparison of techniques for the isolation of T-strain mycoplasmas// Nature (London).- 1969.- № 222.- P. 274-275.

112. Taylor-Robinson D., Bebear C. Antibiotic susceptibilities of mycoplasmas and treament of mycoplasmal infections// Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 1997.- № 40.- P. 622-630.

113. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Recovery and identification of human genital tract mycoplasmas// Isr. J. Med. Sc.- 1981.- № \ p. 648-653.

114. Taylor-Robinson D., Horner P. J. The role of Mycoplasma genitalium in nongonococcal urethritis// Sex. Transm. Inf.- 2001.-V. 77.- P. 229-231.

115. Taylor-Robinson D., McCornack W.M. Mycoplasmas in Genitourinary Infections// The Mycoplasmas Vol. 2.- London ACADEMIC PRESS LTD., 1979.- P. 307-366.

116. Taylor-Robinson D., Sobeslavsk O., Chanock R. M. Relationship of Mycoplasma pneumoniae to Other Human Mycoplasma Species Studied by Gel Diffusion//Journal of Bacteriology.- 1965.- V. 90, № 5,- P. 1432-1437.

117. Taylor-Robinson D., Somerson N. L., Turner H. C. Serological relationships among human mycoplasmas as shown by complement-fixation and gel diffusion// J. Bacterid.- 1965.- V. 85, № 1.- P. 1261-1273.

118. Tetracycline-resistant Mycoplasma hominis strains contain streptococcal tetM sequences/ M.C. Roberts, L.A. Koutsky, K.K. Holmes et al.// Antimicrob Agents Chemother.- 1985.- № 28.-P. 141-143.

119. The association of Mycoplasma hominis with arthritis/ D. Taylor-Robinson, B. J. Thomas, P. M. Furr, A. C. KeatII Sexually transmited diseases.-1983.- № 10, Suppl. 4.- P. 341-344.

120. The Mycoplasmas: In 3 volumes.- Vol. 1: Cell Biology.- 560 p.- Vol. 2: Human and Animal Mycoplasmas.- 494 р./ M. F. Barile, S. Razin, J. G. Tully, R. F. Whitcomb.- London: ACADEMIC PRESS LTD., 1979.

121. Thornberry C. Antimicrobial Susceptibility Testing: General Considerations.// Manual of clinical microbiology. 5th. ed.-Washington D. C.: American Society for Microbiology, 1991.- P. 1059-1064.

122. Tully Joseph G. Molecular and diagnostic procedures in Mycoplasmology: diagnostic procedures.- New York: ACADEMIC PRESS, 1996.- 427 p.

123. Tully Joseph G., Razin Shmuel Methods in Mycoplasmology: In 2 Volumes.-Vol. 1: Mycoplasma Characterization.- 504 p.- Vol. 2: Diagnostic Mycoplasmology.- 440 p.- New York: ACADEMIC PRESS, 1983.

124. Ureaplasma urealyticum role in prematurity and disease in newborns/ G.H. Cassell, K.B. Waites, H.L. Watson et al.// Clin. Microbiol. Rev.- 1993- V. 6.-P. 69-87.

125. Viabilidad de micoplasmas de interes medico en presencia de diferentes antibioticos/ J. A. Rivera Tapia, O. Romero Arenas, M. del R. Santellan Olea у col.// Rev. Fac. Med. UNAM.- 2001.- V. 46, № 3.- P. 97-100.

126. Waites K.B., Canupp K.C., Kenny G. E. In Vitro Susceptibilities of Mycoplasma hominis to Six Fluoroquinolones as Determined by E TestII Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 1999.- V. 43, № 10.- P. 2571-2573.

127. Whitfield C. Bacterial extracellular polysaccharides.// Canad. J. Microbiol-1988.-V. 34.-P. 415-420.

128. Yao J. D., Moellering R. C. Antibacterial Agents.// Manual of clinical microbiology. 5th. ed.-Washington D. C.: American Society for Microbiology, 1991.-P. 1065-1098.