Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и использование амплификационных тест-систем для выявления возбудителей урогенитальных микоплазмозов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и использование амплификационных тест-систем для выявления возбудителей урогенитальных микоплазмозов"

Ба правах рукописи

я*

Ч1М

СОЛОВЬЕВА "СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА й ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АШЛШВДНОНШ ТЕСТ-СйСТИй Ш ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГШТАЛШХ ШСШАЗМСВОВ.

•03.00.07. - микробиология

АВТОРЕЖРАГ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАШ.

Научай руководители:. академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор С.В.Прозоровский кандидат биологических наук Н-А.3иганщюва

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Е. А. Ведьмина доктор биологических наук,

профессор А. Ф. Пороз

Бедуащ организация: Московская медицинскаа академия им.U.M. Сеченова

Зашита диссертации состоится ". _1997г.

в "__" часов на заседании Диссертационного Совета

К CGi.G7.Gl. в научно-исследовательском институте, эпидемиологии и микробиологии имени. Н. Ф.Гамалеи РАМН ;123098 г.Москва. ул.Гамалеи, 18). С диссертацией можно ознакомиться' в библиотеке НЖМ им.К.Ф.Гамалеи РАМЕ.

Автореферат разослан^_" _1397г.

Ученый секретарь Диссертационного

Совета, доктор медицинских наук Е.И.Коптедовс.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Урогенитальные микоплаамозы относятся к группе широко распространенных и социально значимых инфекций. По данным ведущих исследователей в последние годы наблюдается тенденция к возрастанию роли микоплазм и уреашшм в заболеваниях урогенитального тракта (JTT) и даже к некоторому преобладанию инфекций, обусловленных ими, над "классическими" венерическими заболеваниями (Okamoto 3.1989). В настоящее время данные о распространенности U.urealyticu!v и Ai. hominis среди различных групп населения немногочисленны и противоречивы. Показатели инфицированное™ по данным разных авторов варьируют для М.hominis - от 10 до 50Х, для U.urealuticw от 16 до 807.. Большинство исследователей рассматривают виды М. hominis и U.urealyticum как патогенные в полном соответствии с постулатами Коха. Генитальные микоплазмы могут явиться причиной воспалительных заболеваний мочеполовой системы ( Hay Р., 1994; Horner Р., 1994; Прозоровский C.B., 1995;), бесплодия у мужчин и женщин (Copin Е., 1991), преждевременных' родов и абортов (Robertson J., 1990, Анкирская A.C. 1991;), а также генирализованных инфекции плода и новорожденных (Cassel G 1988; Horowitz S., 1992). Урогенитальные микоплаамозы могут протекать остро, но чаще всего они имеют хроническое рецидивирующее течение. При этом не всегда удается предвидеть продолжительность и последствия микоплазменных инфекций.

Широкое распространение микоплазменных инфекций, трудность установления диагноза урогенитального микоплазмоза только по клиническим симптомам, возможность микоплазмоносительства и длитель-

3

ное перснстиравание возбудителя определяют неоходимость применения новш высокочувствительных и специфичных методов для диагностики мшзшгазмогов.

3 настоящее время для диагностики мишшзменных инфекций используются, разработанные несколько десятилетий назад, микробиологические и серологические методы. Однако микоплаамы, как правило оказывается слсоно или почти невозможно выделить и культивировать в лабораторных условиях. Эффективность микробиологического метода ограничена главный образом ввиду широкого спектра питательных потребностей микоплазм, обусловленного их минимальными баоеинтетичеекими возможностями. Слабая иммуногеность микоплазм, наличие у них поверхностных антигенов, идентичных антигенам клеток тканей хозяина, высокий уровень антигенной изменчивости, циркуляция микоплазменных антигенов в периферической крови и в тканях в составе иммунных комплексов осложняет обнаружение микоплазм серологическими методами. Кроме того, анализ зачастую приходится проводить в образцах с крайне низкой концентрацией инфекционного агента.

Б связи с этим необходим поиск новых методических подходов для эффективной диагностики микоплазменных инфекций.

Целью нашего исследования явилась разработка амплификацион-ных тест-систем для экспресс-диагностики урогенитальных микоп-лазмозов и изучение роли персистирувщих форм микоплазм при хронических микошшмозах.

Основными задачами исследования были:

1. Разработка ашшфикациннных тест-системы для выявления патогенных микоплазм: U.urealytlcm, М. hominis, M.fermentans.

2. Подбор надежных и эффективных методов обработки клинического материала для анализа в полиыеразной ценной реакции (ПЦР)•

3. Применение ПЦР-анализа для изучения персистентной инфекции, обусловленной M.fermentans, у экспериментальных животных.

4. Оценка достоверности ЩР-анализа в сравнении с методами серологического и микробиологического тестирования при диагностике острых и хронических микоплазмозов.

5. Использование разработанных тест-систем для исследования- этиологической роли микоплазм и уреаллазм при хронических инфекциях урогенитального тракта, бесплодии и патологии плода.

Научная новизна работы. -

- Разработан.метод экспресс-диагностики на основе ПЦР, позволяющий с высокой чувствительностью (до 500 клеток микоплазм в мл) и строгой видовой специфичностью выявлять U.urealyticum, М.hominis и M.fermentans в клиническом и патологическом материале.

- При изучении экспериментальной персистентной инфекции метод ПЦР дал возможность оценить продолжительность и динамику развития инфекционного процесса, выявить очаги локализации микоплазм.

- Показаны преимущества метода ПЦР перед методами серологического и микробиологического анализа при диагностике хронических форм микоплазмозов.

- При использовании разработанных тест-систем установлена

более частая инфицированность U.urealytlcm и 'м.hominis лиц с

5

хроническими воспалительными заболеваниями УГТ и бесплодней у женщин по сравнению с контрольной группой, что позволяет говорить о причастности этих микроорганизмов к раэвитж) ряда . заболеваний УГТ и бесплодна.

Научно-практическая ценность работы.

Определены оптимальные условия проведения ПЦР-анализа для надежного и быстрого обнаружения в клиническом и патологическом материале U.urealytlcum, И. hominis, и hi.fermntans. Разработанные тест-систеш могут быть рекомендованы при лабораторном обследовании разных контингентов урологических и гинекологических больных, беременных, женщин страдающих бесплодием, больных СВДоы. Возможность ранней диагностики позволит клиницистам своевременно проводить этиотропную терапию.

Апробация, диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела Медицинской Микробиологии ШИЗУ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН С 4 июля 1996 г). Материалы диссертации доложены на 8-ой конференции микробиологов в Болгарии (1993 г., Варна) и на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции (1996 г., Сочи).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 2 тезисов в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, включающих результаты экспериментального исследования, обсуждения результатов, выводов, библиографии. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 16 таблиц, 8 рисунков, и 243 цитированных источников, б

лАТБгИАЛа А МЕТОДЫ.

Использованные штаммы и ДЕК. Б работе использовали следующие штаммы микоплазм: A.axanthum PG-10, A.iaidlawvi PG-8, M.arthrlti-dis PG-G, M.fermntans K-7, M.gallisepticm PG-31, M.hominis ri-34, m.inycoidis subsp. mycoidis YS, M.orale, /¿.pneumoniae FA, а таюке штамм U.urealyticum 8 серотипа из коллекции лаборатории микоплазм и L-форм бактерий НИИБМ им. Н.Ф.Гамалеи РЖ.

Для проверки таксономической специфичности амплификационккх тест-систем использовали ДНК и лизаты различных видов микроорганизмов любезно предоставленные научными' сотрудниками НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.

Среды. Микоплазмы и уреаплазмы культизировали в среде на основе триптического гидролизата мышцы говяжьего сердца. Микоплазмы Еыраашвали при температуре 37°С в течение 3-6 дней до концентрации 107-108 КОЕ в мл, U.urealyticum - в течение 18 часов до концентрации 103-104 КСЕ в мл. ■

Выделение хромосомной ДЕК из культуры микоплазм. Выделение ДНК из культуры микоплазм (M.hominis, U.ferwentans, и U.urealyticum) проводили методом P.Hempstead (1990).

Лизаты чистых культур микоплазм. Приготовление лизатов чистых культур микоплазм для использования в ШР осуществляли кипячением на водяной бане в течение 5 мин. .

Лабораторные животные. В качестве лабораторных животных для воспроизведения модели микоплазменной ифекции использовали мышей линии BALB/C, массой 20 г.

Клинический материал. Для приготовления модельных обрёзцов клинического материала в биологические пробы, полученные от здоровых доноров, вносили известные количества ДНК либо клеток ми-коплазм. Б качестве отрицательных контролен исследовали материал от здоровых доноров, в котором отсутствие антигенов микоплазм было иоказано серологически.

Б качестве клинического материала для выявления ДНК U. игеа-Ivtícdiri a И.hominis в ШР исследовали соскобы эпителиальных поверхностей из уретры, со стенок влагалища и цервикального канала. При выявлении U.urearyticum было исследовано 84 пробы, при обнаружений U. hominis - 89 проб от лиц с урогенитальной патологией.

Кроме того, при выявлении U.urealyticwn и М. hominis было исследовано 200 эпителиальных соскобов: 48 от женщин с хроническими воспалительными заболеваниями гениталий, 45 от женщин, страдающих бесплодием, 21 от "практически здоровых женщин, 47 от мужчин страдающих простатитом, 29 от мужчин с неспецифическим уретритом, 10 от практически здоровых мужчин.

Образцы тканей легкого и печени получены от новорожденных, умерших ь возрасте до двух недель и имевших диагноз врожденная пневмония.

До использования в ЩР все образцы хранились при -20°С.

Методы подготовки клинического материала для анализа в ПДР.

В предварительных опытах обработку модельных образцов клинического материала для исследования в БЦР проводили несколькими

методами и их модификациями. В качестве оптимального способа об-8

работки сыворотки крови была выбрана методика R. Boom et al (1989), основанная на адсорбции ДНК на частицах двуокиси кремния ь присутствии гуанидина тиоцианата натрия. ДНК микоплаэм из цельной крови выделяли модифицированным методом R. Hawkins et al (1992). включающим в себя фенольнув депротеинизацию. В качестве оптимальной методики обработки суспензий тканей органов была выбрана безфенольная обработка, включающая в себя осаждение центрифугированием грубых частиц ткани при 1,5 тыс.об./мин 5 мин., осаждение микоплазм из еупернатанта центрифугированием при 12 тыс.об./мин 15 мин., проведение лизиса кипячением в течение 5 мин., осаждение ДНК этанолом. Для выделения ДНК микоплазм из сос-kgôûb эпителиальных поверхностей урогенитального тракта оптимальным оказался следующий метод материал соскобов помещали в 500 мкл буфера (10 шМ триеа-HCI pH 8,0, 1 пиМ ЗДТА). Образцы кипятили в течение 5 мин. К лизату добавляли 2 мкг тРНК. ДНК осаждали 96% этанолом.

Праймеры для проведения ППР,

Праймеры для ПЕР были синтезированы фосфоамидитным методом на олигонуклеотидном синтезаторе ДНК LKB "Pharmacia", в лаборатории генной инженерии патогенных микоорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Олигонуклеотидные последовательности праймеров для U.urealyticum заимствованы из работы A. Blanchard t' 1990). Олигонуклеотидные последовательности праймеров для М. hominis были отобраны из работы A. Blanchard с соавторами (1993). Для M. fermentais нами были выбраны оригинальные праймеры.

Щр проводим в амшшфикаторе марки "Perkin Elmer" по следующим программам: для праймеров U-301, U-757 - 93°С - 1 мин., 55°С -1 мин., 72°С - 1 мин. в течение 30 циклов; для праймеров РНК-149, FHK-48S - 93°С - 1 мин., 63°С - 1 мин., 72°С - 1 мин., в течение 30 ЦИКЛОВ; для праймеров рРНЕ-206, рРБК-629 93°С - 1 мин., 60°С -1 мин., 72°С - 1 мин. - 5 циклов, 93°С - 1 мин., 57°С - 1 мин., 72°С - 1 мин. - 5 циклов, 93°С - 1 мин., 55°С - 1 мин., 72°С - 1 мин. -25 циклов.

Регистрацию результатов ЩР осуществляли путем анализа продуктов реакции методом электрофореза в агарозном геле и последующей окраской бромистым этидием.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЩЕШЕ.

Разработка амплификационных тест-систем для выявления патогенных микоплазм человека.

'Разработка амплификационных тест-систем включала в себя 3 основных этапа: выбор праймеров, оценка видоспецифичностй-и достижение максимальной чувствительности тестирования.

Для обнаружения U.urealytlcum использовали праймеры отобранные на основе известной нуклеотидной последовательности оперона, детерминирующего синтез уреазы этого микроорганизма (A. Blanchard 1990). Основным достоинством выбранных праймеров была строгая видоепецифичность в отношении U.urealyticm. Для оценки видоспе-

цифичноети тест-системы на основе ПНР использовали ДНК микроорга-

iQ

низмов имеющих, ген уреазь как Bacillus pasteurll, Cryptococcus r&oformans, Escherichia coll, Helicobacter pllorl, Leptospira ln-terroearts, Proteus vulgaris, Providentia stuartii. Кроме того, были исследованы ДНК различил видов микоплазм. Было показано, что Фрагмент ДБК необходимого размера синтезировался только в присутствии ДНК U.urealytlcum. "

По даннш A. Blanchard (1990) с помощью праимеров U-301 и U-757 удавалось выявлять 13 из 14 анализируемых серотипов U.urealytiсит: 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14. Нами были исследованы 3, 5, 7 и 8 серотипы уреаплазм, причем все тестированные серотипы дали положительный результат в ПЦР.

Показано, что чувствительность амплификационной тест-системы составляла по ДНК 100 фг,а по клеткам - 120 клеток в пробе, что соответствует 4,8-103 клеткам в 1 мл, так как объем реакционной смеси ПЦР в наших экспериментах - 25 мкл.

размер амшшфицированного фрагмента ДНК составляет 456 и.о. (рисунок 1).

При выборе праймеров для hf. hominis не было данных о последовательностях генов еидоспецифических белков, поэтому использовали последовательность оперона 16S рРНК (А.Blanchard 1993).

Благодаря использованию высокой температуры отжига праймеров - 53°С удалось достичь строгой видоспецифичности реакции. При анализе в ПЦР других видов микоплазм и бактерии амплификации ДНК не происходило.

Амшшкон размером 334 п. о. синтезировался при наличии 100

П

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 1314

21.09 ТП»-

4.19 ТПИ—

2.29 ТИН— 1.71 ТПН^-

0.64 ТПН_' 0.53 ТПН— 0.47 ТШК 0.34 ТШГ'

456. Ш1

рисунок 1. Эдекгрофореграша продуктов ПЦР при определении чувствительности тест-снстеш для выявления и.игеа1уИст. 1- маркеры мол. массы ( Руи), 2- ДЕК и.игеа1уИст Юнг в пробе, 3- 1 нг, 4- 100 пг, 5- 10 пг, б- 1 пг," 7- 100 фг, 8- 50 фг, 9- 10 фг.Ю- 5 фг, 11- 1 фг, 12- 0.

й

фг ДНК з пробе, что соответствует приблизительно ICD клеткам М.hominis (рисунок 2).

При создании тест-системы для M.fermentans стояла задача выбора оригинальных праймеров. Основным критерием при выборе праймеров являлась наименьшая степень гомологии с другими видами микоплазм и бактерий. Нами был проведен сравнительный компьютерный анализ вариабельных участков гена, кодирующего синтез 163 оРНК 32 видов микоплазм и 12 видов бактерий, который позволил подобрать праймеры, специфичные только в отношении M.fermentans.

При постановке ЩР с минимальной расчетной температурой отжига 55°С наблюдали неспецифическую амплификацию в присутствии некоторых видов микоплазм и бактерии (таблица 1). С целью повышения специфичности ПДР была разработана оригинальная ступенча-. •тая программа амплификации. Благодаря использованию на начальных этапах амплификации несколько более высоких, по сравнит® с расчетной температур удалось достигнуть видоснецичности реакции. Синтез фрагметнов ДНК происходил в этом случае только в присутствии M.fermentans.

Зидоспецифическии фрагмент, размером 423 п.о. синтезировался в присутствии 100 фг ДНК M.fermentans в пробе, что соответствует приблизительно 100 клеткам микоплазм (рисунок 3).

Таким образом, тест-системы обладали высокой чувствительностью и позволяли дифференцировать близкородственные микроорганизмы, имеющие высокую степень гомологии.

9 10 11 12 13 U 15

21.09 ТПН_

4.19 ТПН— 2.29 ТПН 1.71 ТШК

0.64 ТПН_ 0.53 ТПН_ 0.47 TOIL-0.34 ТПН-

334 ПН

рисунок 2.. Здектрофореграша -продуктов ЩР при определении чувствительности тест-системы для выявления Ы. hominis. i- маркеры мол. массы ( Pvu), 2- ДНК li.lmlnls 10. нг в пробе , 31 НГ, 4- 100 пг. 5- 10 пг, 6-1 пг, 7- 100 фг, 8- 50 фг, 9- 10 фг, 10- 5 фг, И- 1 фг, 12- 0.

ik

Таблица 1. Оценка видоспецифичности ПНР с праймерами. M.fermentans рРНК-206 И рРБК-629.

Виды микоплазы и бактерий, используешх в ПНР с праймерами рРНК-206 и рРНК-629 Результат ПЦР

температура отита 55 С-30 циклов температура отжига 50гС-5 циклов 57гС-5 циклов 55 С-£5 циклов

Acholeplasma:

A.axanthum - -

A. laidlaxvi - -

Mycoplasma:

M.arglnlnl + -

U.arthrltldls + -

M.gallisepticmi - -

M. hominis + -

M. my col des ssp mycoldes + -

M. orale + -

U. pneumoniae - -

Ureaplasma:

U. urealytlcum -

Bacillus pasteurll + -

Chlamydia trachomatis - -

Clostridium innocum 1 f -

Escherichia coll - -

Helicobacter pllori - -

Legionella pneumophila - -

Leptospira interrogans - -

Listeria mnocitogenes - -•

Klebsiella pneumoniae - -

Salmonella typhimuri urn - -

Shigella boydil - -

Streptococcus pyogenes + -

Vibrio cholerae - -

Yersinia pestis - -

да - -

is- "

1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 1112 1314 15

21.09 ТПН_ 4.19 Т1Щ_

2.29 ТПН_

1.71 ТПН—

0.64 ТПН_

0.53 ТПН 0.47 ТПН--', 0.34 ТИН-"

■ 423 ПН

рисунок 3. Зхеетрофореграша продуктов ПНР при' определении чувствительности тес'^ейстеш для выявления М.ГегтпЬапз.

1- маркеры мол. пассы ( Рл;), г- ДЕК М. Сегяъп1апз 10 нг в тгробе , 3- 1 НГ, 4- 100 иг, 5- 10 пг, 6- 1 ПГ, 7- 100 фг, 8- 50 фг, 9- Ю фг, 10- 5 фг, II- 1 фг, 12- 0.

Отработка методов полготовки клинического материала для анализа з НДР.

ведущим существенным этапом при создании тест-систем явилась отработка оптимальных »¿етодов подготовки клинического материала для анализа в ПЕР. Неудовлетворительная подготовка проб может язитьса причиной резкого снижения чувствительности метода и лодноотрицательньа результатов. Для выделения ДЕН микоилазм из ллинического материала ш сравнивали и аппробировали различные методы обработки клинических проб (см. "Материалы и методы").

Наиболее оптимальным методом обработки сыворотки явился метод адсорбции ДНК на частицах двуокиси кремния. Основным достоинством метода была высокая чувствительность - 5'Ю3 клеток а мл. Кроме того, данный способ отличался простотой и незначительными потерями ДЕК.

Для выделения ДНК микоплазм из суспензий органов был отработан метод безфенольной обработки органов. Метод имел высокую чувствительность - 1000 клеток в мл и отличался простотой.

С целью анализа в ПНР эпителиальных соскобов урогенитального тракта был аппробирован метод, основанный на лизисе клеток микоплазм кипячением. Метод отличался высокой чувствительностью - 500 клеток в мл.

Таким образом, удалось подобрать оптимальные методики подготовки различного клинического и патологического материала для анализа з ПНР.

Применение ДПР-анализа ддя изучения персистентной инфекции, обусловленной И.fermentaos у экспериментально инфицированных мьшей-

В нашей работе ш проанализировали возможность применения амшшфикационной тест-системы для изучения персистенции X.ferstentans у »шеи BALB/C. В таблице 2 представлены результаты по выявлению возбудителя из крови и органов экспериментально зараженных животных. Параллельно с ЩР материал от животных использовали и для выявления антигенов в PATA.

При изучении данной инфекции была выявлена определенная динамика распространения к.fermentaos в организме инфицированных животных. Внутрибрюшинное введение М. fermentaos приводило к дис-ееминации возбудителя по всему организму. Ухе через 24 часа после заражения возбудитель выявляли с помощью ЩР в крови и некоторых органах. В то же время положительный результат в PATA подучен только для тимуса.

Генерализацию инфекционного процесса наблюдали до 2-х недель после заражения, когда возбудитель выявляли почти во всех-органах и в крови зараженных животных. Причем в крови и органах методом ЩР возбудитель выявляли до 14 суток, ' в то время как в PATA -только до 8 суток.

После острой стадии инфекции на сроках 1-1,5 месяца возбудитель персисгировал в органах иммуногенеза (селезенка , тимус) и во внутренних органах в незначительном количестве. Его практически не удавалось обнаружить с помощью серологического метода, а

Таблица 2. Выявление М.СвгтвпСапв в крови и органах экспериментально инфицированных мышей.

сроки NN исследуемый материал

инфекции мыш&и

кровь сердце почки печепь легкие селевенка тимус

ПЦР РАГА ПЦР РАГА ПЦР РАГА ПЦР РАГА ПЦР РАГА ПЦР РАГА ПЦР РАГА

контроль 1 о - - - - • - - - - - -

24 часа & 3 + - - + - - . - + - + + +

4 + - - - - - - - - + + +

.4 дня 5 + + - - + - + - + + +

б + + - - - + - + - + + -

8 дней 7 + + + + + + + - + + +

8 + + - - + + ; + - + +

14 дней 9 + - - + - + - + - + + +

10 + - + - - + - + - + + +

1 месяц И - - + - - + - - - - + -

12 - - - - - - + + + - + -

1,5 месяца 13 - - - - - - - - - + + -

14 - - - - - - - - - + ■

3 месяца 15 + - + + - - - - - + +

16 + - + - - - + + + +

4 месяца 17 - - - - - - - - - + -

18 - - - - - - - + —

5 месяцев 19 + - - + + - - - - ~

20 + - - + + - - + - + +

6 месяцев 21 - - - + - + - + +

22 - - - + - + - - + —

->— 23 . - - - + - - - ■ +

йэ

только методом ЩР.

Через 3 месяца после заражения наблвдалась, по-видимому, эндогенная реинфекция, сопровождающаяся выходом возбудителя в кровь и персистеяцйей в различных органах. У зараденных животных M.fer-mcttafis псрсистировада до б месяцев ( срок наблвдения). Показано, что основными очагами переистирущих микоплазм являлись легкие, почки, тимус и селезенка. Результаты эксперимента согласуются с данными ранее щюбодишх исследований экспериментальных инфекций, зазванных у крыс и кроликов M.fermsntans (Вухьфовт В.В., 1985; 1991).

Полученные данные, достоверно (р<0,01) свидетельствуют о более высокой диагностической эффективности ЩР по сравнен® с РАГА при исследовании проб, как на ранних, так и на поздних стадиях инфекционного процесса. Тем самш, применение метода ЩР позволило получить более точные данные о локализации возбудителя и показать, --что в органах животных длительное время персистирует популяция жизнеспособных микоплазм.

Сравнительная оценка диагностической эффективности различных лабораторных методов обнаружений U.urealytícm и М. hominis.

В дальнейшем мы провели сравнительную оценку диагностической эффективности ПЦР-аналиаа и методов серологического и микробиологического тестирования при выявлении U.urealyticum и У. hominis у больных е урогенитальной патологией. В качестве клинического материала .для выявления ДНК микоплазм в ЕЦР исследовали соскобы

эпителиальных клеток урогенитального. тракта. Параллельно материал

20

от бальных анализировали традиционными метода»«: соскобы - микробиологическим методом, мазки из материала соскобов исследовали в РИФ. В пробах сыворотки крови с помощью PATA определяли наличие специфических антигенов.

В таблице 3 приведены данные по "обнаружений у больных U. urealyticujii. С целью выявления U.urealyticum было обследовано 34 пациента. С помощью комплекса вышеуказанных методов уреаплазма была выявлена в 66 случаях. Примененение метода ЩР для детекции уреаплазм позволило выявить этот микроорганизм в 9.5,5% положительных проб. Использование микробиологического - выделения U.urealyticum дало возможность получить 25,8% положительных результатов, применение РИФ - 51,5Z, PATA - 53,0%.

Таблица 3. Сравнительная оценка эффективности обнаружения U.urealyticum с -помощью лабораторных методов.

Число обследуемых лиц Число лиц у которых выявлена уреаплазма Выявление в ЩР Выявление U.urealyticum традиционными методами Одновременное выявление уреаллазмы в ЩР и традиционными методами

микро-биоло-гичес-ки в РИФ в PATA тремя методами

84 66 63 1? 34 35 54 47

100% 95,5% 25,8% 51,5% 53,0% 81,1% 71,2% .

В таблице 4 приведены данные по обнаружен» у больных U.hominis. При обследовании 88 больных комплексом - методов hominis была обнаружена в 31 случае. С немощью ЩР-анализа получено 93,52 положительных результатов, микробиологически -35,51. в PATA - 54,8Z.

Метод ЩР в сравнении с апробированными методами диагностики давал достоверные результаты. Так, и для U.urealyticm и для М.hominis положительные при микробиологическом выделении образцы также положительно тестировались в ЩР. Одновременное выявление уреаллазмы в РИФ и 8 ЩР ва&тдали в 91,12 случае, и 88,51 случаев в PATA и ПНР. В 88,21 случаев обнаружение М.hominis с помощью ЩР коррелировало с ее выявлением в PATA. Кроме того, применение ЩР позволило повысить чувствительность тестирования U.urealyticm на 14,4%, а М.hominis на 19,31.

Таблица 4. Сравнительная оценка эффективности обнаружения М.hominis с помощью различных лабораторных методов.

Число обследованных лиц - Число лиц у которых выявлена М.hominis Выявление в ПИ? Выявление Ы.hominis традиционными методами Одновременное выявление tí.hominis в ПЦР и традивдрн-ными методами

микро-биоло-гичес-ки в PATA двумя методами

89 31 29 11 17 23 21

100% 93,52 35,51 54,8% 74,2% 67,7%

Таким образом, была показана диагностическая эффективность ПНР-анализа и его преимущества по сравнению с традиционными методами детекции микоплазм.

Применение разработанных тест-систем для изучения этиологической роли микопдазм и уреаплазм при хронических инфекциях уро-генитального тракта, бесплодии и патологии плода.

Многие исследователи считают, что урогенитальные микоплазмы являются причиной развития воспалительных заболеваний урогени-тальной сфер!, бесплодия у мужчин и женщин (Copin Е., 1991; Hay Р., 1994; Horner Р., 1994). Однако широкое распространение уроге-нитальных микоплазм, их частое выявление у практически здоровых лиц затрудняют решение вопроса о роли этих микроорганизмов в патогенезе заболеваний урогенитального тракта.

В связи вьшеизложенпым на следующем этапе работы амплифика-ционные тест-системы были использованы для изучения этиологической роли микоплазм при хронических инфекциях урогенитального тракта и бесплодии.

В таблице 5 представлены данные, полученные методом ПЦР, по частоте выявления отдельных возбудителей (М.hominis и U.urealyti-cum), а также смешанных микошсазмо-уреаплазменных инфекциях при. анализируемых патологических состояниях. Было обследовано 169 больных, с различными нозологическими формами заболеваний урогенитального тракта и контрольные группы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в группах лиц

с различными патологическими состояниями урогенитального тракта

23

^ Таблица 5. Удельный вес микоплазменной, уреаплазменной и смешанной микоплазмо-уреаплазменной инфекций при различных нозологических формах.

N группы Диагноз Число обследованных лиц Результаты ЩР

Моноинфекция Смешанная ифекция U.ureal.t М. hominis Всего

U.ureal. U. horn. и. игеа!у М.hominis

число лиц (X) число лиц (%)

число лиц (%) число лиц (Г.) число лиц (%)

женщины 1 2 3 мужчины 4 5 6 Хронические воспалительные заболевания гениталий Бесплодие Контрольная группа Хронический простатит Хронический неспецифический уретрит Контрольная группа 48 45 21 47 29 10 22 46,8% 16 35,6% 7 33,3% 14 29,8% 9 31% 2 20% 3 6,4% 2 4,4% 2 9,5% 4 8,5% 2 6,9% 0 0% 7 14,5% б 13,3% 0 0% 2 4,3% 3 10,3% 0 0% 29 60,4% 22 48,9% 7 33,3% 16 34% 12 41,4% 2 20% 10 20,8% 8 17,8% 2 9,5% 6 12,8% 5 17,2% 0 . 0%

инфицированноеть микоплазмами распространена значительно чаще по сравнею® с лицаш1 контрольнш групп. Гак, в группе женщин с хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта с помощью ЩР-анализа U. ureal у ti сип была выявлена в 60,4% случаев, а М.hominis - 20.81. В то же время у здоровых женщин U.urealyticw была выявлена в 33,3% случаев, а И. hominis - в 9,52. У мужчин с хроническим неспецифическим уретритом U.urealyticw была выявлена в 41,4%, а N.hominis в 17,22. В контрольной группе мужчин U. urealyticm была обнаружена в 202 случаев, И.hominis не была выявлена. Следует отметить высокий процент смешанной инфекции, обусловленной U. urealytlcum и М.hominis во всех группах лиц с различными патологическими состояниями, з то же время у лиц контрольных групп случаев смешанной инфекции не наблюдалось.

Показано, что доля участия U.urealytlcum в этиологии всех анализируемых нозологических форм значительно вше ( в среднем в 3-7 раз), чем М.hominis. Гак, например, у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта моноинфекцию, обусловленную уреаплазмой обнаруживали в 46,82, в то время как моноинфекция, обусловленная Af.hominis, составляла лишь 6,42.

Отмечена более частая инфицированность урогенитальяыми ми-коплазмами женщин, чем мужчин. Для женщин инфицированность уре-аплаэмами составила от 33,32 до 60,42, для мужчин от 202 до 41,42. Для женщин инфицированность М.hominis составила от 9,5Ä до 20,82, для мужчин от 02 до 17,22.

Таким образом, представленные давние подтверждав этиологическую роль U.urealyiicm и H.fminis в возникновении хронических воспалительных процессов урогенитального тракта и нарушении репродуктивной функции.

Наибольшую опасность микоплазменная й уреанлазменная инфекция урогенитального тракта представляет для беременных. Урсгени-тальныи микоплазмоз беременных может явиться причиной внутриутробного инфицирования плода, приводящего к спонтанным абортам, мертворожденна и порокам развитая (Rcbertson J., 1990; Horowitz 3., 1992).

Нами были исследованы в ЩР органы 20 новорожденных, с весом менее 2000 г, умерших в течении двух недель после рождения и имевших диагноз врожденная пневмония. Параллельно в суспензии органов с помощью PATA определяли наличие антигенов к U.urealyticum и М.fermentaos. Результаты исследования представлены в таблице 6.

Применение метода ППР позволило значительно повысить частоту выявления уреаплазменной инфекции. Так с помощью ЩР U.urealyticum в анализируемых пробах легких выявлена в 9 случаях (45%), в пробах печени - в 5 случаях (25%). В PATA уреашгазму удалось тестировав в б пробах (30%), в печени - в 3 образцах (15%). Кроме того, в легких одного ребенка обеими методами была обнаружена М. fermentare.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов и свидетельствуют о том, что при внутриутробном микошшмозе

развивается генерализованный патологический процесс, поражаются

26

Таблица б. Данные исследования в ЩР органов новорожденных, умерших в возрасте до двух недель и имевших диагноз врожденная пневмония.

йсследуешй материал Всего исследовано Данные по обнаружение микоплазм

U.urealyticm U.fenmntans

ПЦР РАГА ЩР РАГА

легкие - 20 9 6 1 1

45% 30% 5% 5%

печень 20 5 3 0 0

25 % 15% 0% 0%

органы дыхания плода, страдает печень, почки, ЦНС (Sail Н., 1983; Cassel G., 1988). Более высокая эффективность ПЦР-анализа при выявления уреаплазменной инфекции позволяете рекомендовать этот метод для использования в клинической практике при обследовании беременных женщин.

Таким образом, нами разработы высокоспецифичные и чувствительные амплификационные тест-системы для выявления U.urealytl-сит, М.hominis и M.fernent&ns. Полученные результаты дают возможность рекомендовать использование метода ПНР в следующих случа-

2*

ях:

* до экспресс-диагностики урогенитальных инфекций неясной зишогнн

* для диагностики хронических форм микоплазмозов

* для выявления носительства урогенитальных микоплазм у беременных хетт и пар сградаюцих бесплодием

* для контроля sa динамикой инфекционного процесса и эффект« ностыо применяемых лекарственных средств

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны -амплификационные тест-системы, позволяющие строго специфично и е высокой чувствительностью выявлять патогенные микоплазмы человека: Mycoplasma hominis, Mycoplasma ferma n-tans, Ureaplasma ureälyti ст.

Z. Подобраны оптимальные методики подготовки различных клинических образцов (цельной крови, сыворотки крови, суспензий тканей органов, соскобов эпителиальных клеток), позволяющие выявлять до 500 клеток ыикоплазм в мл.

3. Доказана эффективность метода ЩР при исследовании распространения возбудителя в организме хозяина как на ранних, так и на поздних сроках инфекционного процесса.

4. Показано, что при воспроизведении экспериментальной модели микоплазменной инфекции, обусловленной M. fernenbans на шшах основными очагами локализации микоплазм являлись: легкие, почки,

тимус и селезенка.

26

5. Применение ПЕР ори диагностике острых и хронических ми-коплазмоеов позволило повысить чувствительность тестирования U.urealyticm на 14.4%, а М. hominis на 19,3% в сравнении с комплексом традиционных методов. Полученные результаты позволяют рекомендовать применение ПНР-анализа с шлью повышения эффективности диагностики.

6. Установлена более частая инфицированноеть U.urealyticum и М.hominis (в среднем в 1,5-2 раза) и высокий процент смешанных микоплазмо-уреаплазменных инфекций у лиц с различными патологическими состояниями УГТ по сравнению с контрольной группой, что позволяет говорить о причастности этих микроорганизмов к развитию ряда заболеваний УГТ и бесплодия.

СПИСОК РАБОТ, 'ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Соловьева C.B., Зигангирова H.A., Гончарова С.А., Раковс-кая И.В., Гинцбург А.Л., Прозоровский C.B. Применение ашлифика-ционной тест-системы для выявления яерсистирующих мккоп-лазм//ЖЭИ. - 1994. - Приложение. - с.60-64.

2. Зигангирова Н.А., Соловьева C.B., Гинцбург А.Л., Прозоровский C.B. Оценка диагностической эффективности амплификацион-ных тест-систем для выявления урогенитальных микоплазм// Материалы 1 Всероссийской научно-практической конференции "Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения". Тезисы докладов. - Сочи, 1996. - с.49-53.

3. Zigangirova N.A., Popova O.V., Solovjeva S.V., Gintzburg

59

A.L., Prozorovsky S.V. Development of a PCR- based method for diagnosing M.pneumoniae infections// Lett. Appl. Mlc- robiol. -1538. - vol.16. - p.106-109.

4. Zigangirova N.A., Solovjeva S.V., Aksenov M.Y., Gintzburg A.L., Prozorovsky. S.V. The use of PCR-based assay for diagnostic of mycoplasma infections in acute and latent stage of disease// 8th Congress of microbiologists in Bulgaria. Abstracts. - Voida. 1993. - p.45.

Подписано в печать 10.03.97 г. Зак. 483. Тираж 70 экз. Формат бумаги 60x90/jg Объем : 1.875 усл.печ.л.

Типография ЬВИА вы. проф. Н.Е. Жуковского

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соловьева, Светлана Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Микоплазмозы человека и их роль в инфекционной патологии.

1.1. Нозологические формы, обусловленные мико-плазмами.

1.2. Патогенные свойства микоплазм.

1.3. Проблема персистенции микоплазм.

ГЛАВА 2. Методы диагностики микоплазменных инфекций.

2.1. Микробиологическое выделение микоплазм.

2.2. Серологическая детекция микоплазм.

2.3. Метод молекулярных зондов.

2.4. Метод полимеразной цепной .реакции ПЦР.

2.4.1. Молекулярно-генетические основы" метода ПЦР. 43 2.4.2. Применение ПЦР-анализа для изучения пробмы диагностики микоплазмозов.

СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. Материалы и методы.

ГЛАВА 2. Разработка амшшфикационных тест-систем для выявления патогенных микоплазм человека.

2.1. Амплификационная тест-система для обнаружения Ureaplasm urealyticum.

2.1.1. Выбор праймеров и оптимальных условий проведения ПЦР-анализа.

2.1.2. Определение чувствительности тест-системы.

2.1.3. Проверка эффективности тест-системы на культурах, выделенных от больных.

2.2. Амплификационная тест-система для выявления Mycoplasma hominis.

2.2.1. Выбор праймеров и оптимальных условий проведения ПЦР-анализа.

2.2.2. Определение чувствительности тест-системы.

2.2.3. Проверка эффективности тест-системы на культурах, выделенных от больных.

2.3. Создание амплификационной тест-системы специфичной для Mycoplasma fermentans.

2.3.1. Выбор праймеров и оптимальных условий проведения ПЦР-анализа.

2.3.2. Определение чувствительности тест-системы.

ГЛАВА 3. Отработка методов подготовки клинического материала для анализа в ПЦР.

3.1. Подбор оптимальных способов обработки сыворотки крови для анализа в ПЦР.

3.2. Подбор оптимальной методики обработки цельной крови.

3.3. Подбор оптимальной методики обработки тканей органов.

3.4. Подбор оптимальной методики обработки соскобов урогенитального тракта.

ГЛАВА 4. Применение ПЦР-анализа для изучения персис-тентной инфекции, обусловленной M.fermen-tans на экспериментально инфицированных мышах.

4.1. Выявление M.fermentans на ранних сроках инфекции.

4.2. Обнаружение персистирующих микоплазм на поздних сроках инфекции.

4.3. Оценка диагностической эффективности ПЦР-анализа.

ГЛАВА 5. Сравнительная оценка диагностической эффективности различных лабораторных методов обнаружения U.urealyticum и М. hominis.

5.1. Выявление U.urealyticum в клиническом материале.

5.2. Обнаружение М.hominis в клиническом материале.

ГЛАВА б. Применение разработанных тест-систем для изучения этиологической роли микоплазм и уреаплазм при хронических инфекциях урогенитального тракта, бесплодии и патологии плода.

6.1. Выявление U.urealyticum и М.hominis у больных с различными нозологическими формами заболеваний.

6.2. Обнаружение и. игеа1уЫсиш и М^егтепЬапБ у детей умерших от внутриутробной пневмонии.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и использование амплификационных тест-систем для выявления возбудителей урогенитальных микоплазмозов"

Урогенитальные микоплазмозы относятся к группе широко распространенных и социально значимых инфекций. По данным ведущих исследователей в последние годы наблюдается тенденция к возрастанию роли микоплазм и уреаплазм в заболеваниях урогенитального тракта (УГТ) и даже к некоторому преобладанию инфекций, обусловленных ими, над "классическими" венерическими заболеваниями (181). В настоящее время данные о распространенности U.urealyticum и М.hominis среди различных групп населения немногочисленны и противоречивы. Показатели инфицированности по данным разных авторов варьируют для М.hominis - от 10 до 50%, для U.urealutlcum от 16 до 80%. Большинство исследователей рассматривают виды М.hominis и U.urealyticum как патогенные в полном соответствии с постулатами Коха. Генитальные микоплазмы могут явиться причиной развития воспалительных заболеваний урогенитальной сферы, бесплодия у мужчин и женщин, прерывания беременности, преждевременных родов и абортов, а также патологии плода и заболеваний новорожденных (38, 41, 85, 118, 122, 197). По клиническим признакам урогенитальные микоплазмозы сходны с заболеваниями, вызываемыми другими микроорганизмами: хламидиями, вирусами, грибами, и некоторыми другими инфекционными заболеваниями, имеющими полиэтиологическую природу. Урогенитальные микоплазмозы могут протекать остро, но чаще всего они имеют хроническое рецидивирующее течение. При этом не всегда удается предвидеть продолжительность и последствия микоплазменных инфекций.

Таким образом, широкое распространение микоплазменных инфекций, трудность установления диагноза урогенитального микоплазмоза только по клиническим симптомам, возможность микоплазмоноситель-ства и длительное персистирование возбудителя определяют необходимость применения новых высокочувствительных и специфичных методов для диагностики микоплазмозов.

В настоящее время для диагностики микоплазменных инфекций используются, разработанные несколько десятилетий назад микробиологические и серологические методы. Однако микоплазмы, как правило, оказывается сложно или почти невозможно выделить и культивировать в лабораторных условиях. Эффективность микробиологического метода ограничена главным образом ввиду широкого спектра питательных потребностей микоплазм, обусловленного их минимальными биосинтетическими возможностями. Микробиологическое выделение перепетирующих микоплазм затруднено также из-за потери ими способности к автономному росту после паразитирования на клетках хозяина (88). Слабая иммуногенность микоплазм, наличие у них поверхностных антигенов, идентичных антигенам клеток тканей хозяина, высокий уровень антигенной изменчивости, циркуляция микоплазменных антигенов в периферической крови, в тканях в составе иммунных комплексов осложняет применение различных вариантов иммунологических методов диагностики. Кроме того, анализ зачастую приходится проводить в образцах с крайне низкой концентрацией инфекционного агента.

В связи с этим необходим поиск новых методических подходов для эффективной диагностики микоплазм. Одним из наиболее перепек- ? тивных методов в настоящее время является полимеразная цепная ре- i акция (ПЦР), основанная на амплификации in vitro специфических последовательностей ДНК. К числу достоинств метода ПЦР, как основы для создания диагностических тест-систем, следует отнести высокий уровень чувствительности, специфичность анализа и быстроту получения конечного результата. Применение метода ПЦР позволит не только установить природу возбудителя, но и проводить контроль за динамикой инфекционного процесса и эффективностью применяемых лекарственных средств. Анализ результатов применения ПЦР для выявления различных возбудителей заболеваний человека показывает, что этот подход позволяет значительно сократить время и повысить надежность окончательных результатов диагностики (1).

Целью нашего исследования явилась разработка амплификацион- / ных тест-систем для экспресс-диагностики урогенитальных микоп-| лазмозов и изучение роли персистирующих форм микоплазм при хронических микоплазмозах.

Основными задачами исследования были:

1. Разработка амплификациннных тест-системы для выявления патогенных микоплазм: U.urealyileum, М. hominis, M.fermentans.

2. Подбор надежных и эффективных методов обработки клинического материала для анализа в ПЦР.

3. Применение ПЦР-анализа для изучения персистенции у экспериментальных животных.

4. Проведение сравнительной оценки достоверности ПЦР-анализа и методов серологического и микробиологического тестирования при диагностике острых и хронических микоплазмозов. 5. Использование разработанных тест-систем для исследования этиологической роли персистирующих микоплазм и уреаплазм при хронических инфекциях урогенитального тракта, бесплодии и патологии плода.

Научная новизна работы.

- Разработан метод экспресс-диагностики на основе ПЦР, позволяющий с высокой чувствительностью (до 500 клеток микоплазм в мл) и строгой видовой специфичностью выявлять U.urealytlcum, М.hominis и M.fermentans в клиническом и патологическом материале.

- При изучении экспериментальной персистентной инфекции метод ПЦР дал возможность оценить продолжительность и динамику развития инфекционного процесса, выявить очаги локализации микоплазм.

- Показаны преимущества метода ПЦР перед методами серологического и микробиологического анализа при диагностике хронических форм микоплазмозов.

- При использовании разработанных тест-систем установлена более частая инфицированность U.urealytlcum и М. hominis лиц с хроническими воспалительными заболеваниями УГТ и бесплодием у женщин по сравнению с контрольной группой, что позволяет говорить о причастности этих микроорганизмов к развитию ряда заболеваний УГТ и бесплодия.

Научно-практическая ценность работы.

Определены оптимальные условия проведения ПЦР-анализа для надежного и быстрого обнаружения в клиническом и патологическом материале U.urealyticum, М. hominis, и M.fermntans. Разработанные тест-системы могут быть рекомендованы при лабораторном обследо-ваннии разных контингентов урологических и гинекологических больных, беременных, женщин страдающих бесплодием, больных СПИДом . Возможность ранней диагностики позволит клиницистам своевременно проводить этиотропную терапию.

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 2 тезисов в отечественной и зарубежной печати.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Соловьева, Светлана Владимировна

выводы.

1. Разработаны амплификационные тест-системы, позволяющие строго специфично и с высокой чувствительностью выявлять патогенные микоплазмы человека: Mycoplasma hominls, Mycoplasma fermen-tans, Ureaplasma urealyticum.

2. Подобраны оптимальные методики подготовки различных клинических образцов (цельной крови, сыворотки крови, суспензий тканей органов, соскобов эпителиальных клеток), позволяющие выявлять до 500 клеток микоплазм в мл.

3. Доказана эффективность метода ПЦР при исследовании распространения возбудителя в организме хозяина как на ранних, так и на поздних сроках инфекционного процесса.

4. Показано, что при воспроизведении экспериментальной модели микоплазменной инфекции, обусловленной M.fermentans на мышах основными очагами локализации микоплазм являлись: легкие, почки, тимус и селезенка.

5. Применение ПЦР при диагностике острых и хронических ми-коплазмозов позволило повысить чувствительность тестирования U.urealyticum на 14,4%, a M.hominis на 19,3% в сравнении с комплексом традиционных методов. Полученные результаты позволяют рекомендовать применение ПЦР-анализа с целью повышения эффективности диагностики.

6. Установлена более частая инфицированность U.urealyticum и M.hominis (в среднем в 1,5-2 раза) и высокий процент смешанных микоплазмо-уреаплазменных инфекций у лиц с различными патологическими состояниями УГТ по сравнению с контрольной группой, что позволяет говорить о причастности этих микроорганизмов к развитию ряда заболеваний УГТ и бесплодия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соловьева, Светлана Владимировна, Москва

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции. - Молек. генетика, микр., и вирус., 1993, 4, с 3-8.

2. Анкирская A.C., Демидова Е.М., Земляная A.A. с соавт. Гени-тальные микоплазмы как фактор риска развития акушерской и перинатальной патологии. Вестник АШССР, 1991, 6, с 17-20.

3. Астратян А.А., Козлова 0.В. Сероэпидемическая характеристика инфекции, вызванной М.hominis. В сб.: Микоплазмы и микоплазмозы. - М., 1985, с 31-35.

4. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических иследованиях. М., 1962, с. 117.

5. Байжомартов М.С. Воспроизведение острой и хронической М.рпеилкшае-инфекции на морских свинках. Тез. докл. 8 всесоюзной конференции иммунологов. М., 1982, с. 78.

6. Башмакова М.А. Микоплазменные инфекции генитального тракта человека. Вестник АМНССР, 1991, 6, с. 13-16.

7. Бондаренко В.М., Тимофеева О.Л., Бондаренко Вл.М. и др. О значимости высеваемости клебсиел, энтеробактер, цитробактер, и кишечных ерсиний при бактериальных исследованиях. ЖМЭИ, 1987, 6, с. 74-79.

8. Борхсениус С.Н., Чернова O.A., Меркулова С.Н. и др. Обнаружение и идентификация микоплазменных заражений методом ДНК-гибридизации. Цитология, 1987, т. 28, 8, с. 934-941.

9. Борхсениус С.Н., Чернова O.A. Микоплазмы. Л., 1989, с. 155.

10. Вульфович Ю.В., Зильфян A.B., Жевержеева И.В. и др. Длительная персистенция M.arthritidis и М.fermentans в организме экспериментально инфицированных крыс. ЖМЭИ, 1981, 1, с. 14-17.

11. Вульфович Ю.В., Зильфян A.B., Пронин A.B. и др. Персистенция M.artritidis и некоторые показатели клеточного иммунитета при экспериментальном артрите крыс. Биол. науки, 1981, 8, с. 23-25.

12. Вульфович Ю.В., Жевержеева И.В., Ретиг В. Возможная этиологи-чаеская роль микоплазм при ревматоидном артрите. В сб.: Микоп-лазмы и микоплазмозы. - М., 1985, с. 70-77.

13. Вульфович Ю.В. Артритогенность микоплазм и микоплазменные артриты человека. Вестник АМНССР, 1991, б, с. 6-9.

14. Гамова H.A., Власенко М.В., Вульфович Ю.В., Гончарова С.А. Выявление микоплазменной инфекции у женщин в послеродовом периоде. Вестник АМНССР, 1991, 6, с. 21-22.

15. Горина Л.Г., Саламова Р.Э., Цветков B.C., Прозоровский C.B. Выявление антител к M.arthritidis и М.fermentans у больных ревматоидным артритом имммуноферментным методом . ЖМЭИ, 1985, б, с. 48-52.

16. Горина Л.Г., Романова Р.Ю., Гончарова С.А. Микробные ассоциации при хронических заболеваниях респираторного тракта. ЖМЭИ,1986, 4, с. 18-20.

17. Горина Л.Г., Вульфович Ю.В., Зильфян A.B. и др. Микоплазмен-ные артриты человека и некоторые механизмы их патогенеза. Вестник АМНССР, 1989, 6, с. 84-87.

18. Горина Л.Г., Гончарова С;А., Игумнов A.B. Лабораторная диагностика микоплазмозов человека. Вестник АМНССР, 1991, 6, с. 44-47.

19. Дрейзин P.C., Астафьева Н.В. Острые респираторные заболевания. М., 1991, с. 133.

20. Жевержеева И.В., Каптелова Е.й., Неустроева В.В. и др. Индикация микоплазм в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом. ЖМЭИ, 1983, 9, с. 63-66.

21. Зигангирова Н.А, Попова О.В., Аксенов М.Ю. и др. Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики микоплазменной пневмонии. ЖМЭИ, 1993, 4, с. 25-30.

22. Зильфян A.B., Худаверян Д.Н., Гегамян О. и др. О возможном механизме раннего поражения костной ткани и суставного хряща при экспериментальной микоплазменной инфекции. Биол. Науки, 1981, 10, с. 28-30.

23. Злщников Д.М., Казанцев А.П., Шаманова М.Г. Микоплазмоз человека. Л., 1975, с.231.

24. Каминский Л.С.Станистическая обработка лабораторных и клинических данных. Л., 1964, с.251.

25. Келлер В., Гамова Н.А., Вульфович Ю.В. и др. Экспериментальная инфекция кроликов, вызванная U.ureaalyticum. В сб.: Микоп-лазмы и микоплазмозы. - М., 1985, с. 60-65.

26. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980, с.293.

27. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. -М., 1984, с. 479.

28. Марантиди А.Н., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И. и др. Экспериментальная микоплазменная инфекция урогенитального тракта у обезьян. ЖЗИ, 1987, 1, с. 87-90.

29. Марантиди А.Н., Гамова Н.А., Вульфович Ю.В. и др. Инфициова-ние обезьян U.urealyticum 8 серотипа. ЗКМЭИ, 1990, 6, с. 13-18.

30. Марантиди А.Н., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И. и др. Использование обезьян для моделирования микоплазмозов человека. Вестник AMHCCF, 1991, 6, с. 51-55.

31. Петросова В.Н., Раковская И.В., Раскова Т.М. и др. Серологическая характеристика некоторых видов микоплазм по данным реакции агглютинации, связывания комплемента и ингибиции роста. ЖМЭИ,1969, 10, с. 67.

32. Прозоровский С.В., Вихнович Э.М., Каган Г.Я. и др. использование модели экспериментальной пневмонии при сравнительном изучении патогенности М.pneumoniae. Бюлл. экспер. биол., 1967, 2, с.

33. Прозоровский C.B., Покровский В.И., Васильева В.И. Микоплазма пневмонии инфекция. М., 1978, с.310.

34. Прозоровский C.B., Пронин A.B., Санин A.B. Иммунологические механизмы персистенции микоплазм. Вестник АМНССР, 1985, 10, с.43-51.

35. Прозоровский C.B. Проблемы инфектологии. М., 1991, с. 399.

36. Прозоровский C.B., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология. М., 1995, с. 636.

37. Раковская И.В., Зильфян A.B. Сравнительная характеристика артритов, индуцированнных M.arthritidis у мышей разных линий. -В сб.: Микоплазмы и микоплазмозы. М., 1985, с. 85-91.

38. Раковская И.В., Бахрамов A.B., Мигушина В.Л. Роль мембран во взаимодействии лимфоцитов с микоплазмами. Виол, науки., 1986, И, с. 25-29.

39. Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Урогенитальные микоплазмозы. -Сборник ВНИИМИ, 1990, с. 80.

40. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. В кн.: Анализ генома. - М., 1990, с. 176-190.

41. Саламова Р.Э., Горина Л.Г., Волкова И.Я. Определение антигенов М.pneumoniae и антител к ним иммуноферментным методом у больных с заболеваниями дыхательного тракта. ЖМЭИ, 1985, 7, с. 48-51.

42. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Л-формы бактерий и семейство Мусор-lasinataceae в патологии. М., 1973, с. 392.

43. Шегидевич Э.А. Питательные среды, методы выделения и идентификации микоплазм. Б сб.: Микоплазмозы животных. М., 1976, с.1. СО1. Оо-оо.

44. Aslanzadeh J. Application of hydrochloride for post-PCR sterilization. Ann. Clin. Lab. Sei., 1992, v. 22, p. 280.

45. Barile M. Mycoplasma-tissue cell interactions In: Mycoplasmas. Ed. by Barik M.N.Y., S-F, London, 1978.

46. Barile M. Mycoplasma-tissue cell interaction. In: The mycoplasmas. Ed. by Tylly and Whitcomb R., Acad. Press, N.Y.,1979, v. 2, p. 425-474.

47. Baseman J.В., Cole R.M., Krause D.S. et al. Molecular basis foi cytadsorption of M.pneumoniae. -J. Bact., 1982, v.151, p.1514-1522.

48. Baseman J.В., Morrison-Plummer J., Drocullard D. et al. Identification of a 32-kilodalton protein of M.pneumoniae associated wiht hemadsorption. Isr. Med. Sei, 1987, v. 23, p. 474-479.

49. Bell J. The polymerase chain reaction. J. Immunology Today, 1989, v. 10, N 10, p.351-355.

50. Bernet C., Garret M., Barbeyrac B. et al. Detection of M.pneumoniae by using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1989, v. 27, N 11, p. 2492-2495.

51. Blanchard A. Ureaplasma urealyticum urease genes; use of UGA tryptophan codon. Mol. Microbiol., 1990, v. 4, N 4, p. 669-676.

52. Blanchard A., Gauteier M., Mayau V. Detection and identification of mycoplasmas by amplification of rDNA. FEMS

53. Mycrobiol. Letters., 1991, v. 81, p. 37-42.

54. Blanchard A. Rapid detection tetM in M.hominis and U.urealyticum by PCR: tetM confers resistance to tetracyclyne byt not to doxycycline. FEMS Microbiol. Letters, 1992, v. 95, p. 277-282.

55. Blanchard A., Yanez A., Dybvig K. et al. Evaluation of intraspecies genetic variation within the 16 S rRNA gene of M.hominis and detection by polymerase chain reaction. J.' Clin. Microbiol., 1993, v. 31, N 5, p. 1358-1364.

56. Blanchard A., Hamrick W., Duffy L. Use of polymerase chain reaction for detection of M.fermentans and M.genitalium in the urogenital tract and amniotic fluid. Clin. Infect. Dis., 1993, v. 17, N 1, p. 272-279.

57. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol., 1989, v. 28, p. 495-503.

58. Brown D.M., Schell P. The reaction of hydroxylamine with cytosine and related compounds. J. Med. Biol., 1961, v. 3, p. 709-710.

59. Brunner H. Studies on the pathogenesis of experimental M.pneumoniae infection in the guinea pig. In: Les Colloques de L'Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale INSERM, 11-17 Sept. 1974, v. 33, p.411-420.

60. Brunner H., Prescott B., Greenberg H. et al. Unexpectedly high frequency of antibody to M.pneumoniae in human sera asmeasured by sensitive techniques. J. Infect. Dis., 1977, v. 135, N 4, p. 524-530.

61. Buck G.E., O'Hara L.C., Summersgill J.T. Rapid, simple method for treating clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis to remove DNA for polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1992, v. 30, p. 1331-1334.

62. Buffone G.J., Demmler G.J., Schimbor et al. Improved amplification of cytomegalovirus DNA from urine after purification of DNA with glass beads. 1991, Clin. Chem., v. 37, p. 1945-1949.

63. Burstain J.M., Grimpel E., Lukehart S.A. et al. Sensitive detection of Treponema pallidum by using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1991, v. 29, N 1, p. 62-69.

64. Busolo F., Zorzenon M., Piacentini I. Comparative evaluation of some methods for detection of M.pneumoniae antibodies. Boll. Ist. sieroter. milan, 1979, v. 59, N 5, p. 416-422.

65. Busolo F., Tonin E., Meloni A. Enzyme-linked immunosorbent assay for serological diagnostic of M.pneumoniae infections. J. Clinic. Microbiol., 1983, v. 18, p. 432-435.

66. Cahill J., Cole B., Wiley B. et al. Role of biologocal mimicry in the pathogenesis of rat arthritidis induced by M.arthritidis. Infect. Immun., 1971, v. 3, p. 24-35.

67. Carson T., Coller A. Host-pathogen interactions in experimental M.pneumoniae disease studied by the Freeze-Fracture technique. Rev. Infect. Dis., 1982, v. 4, p. 173-178.

68. Cassel 6.H., Crouse D.T., Waites K.B. et al. Does U.urealyticum cause respiratory disease in newborns ? Pediatr. Infect. Dis. J., 1988, v. 7, N 8, p. 535-541.

69. Chandler D.K.F., Grabowski M.W., Barile M.F. Cell-mediated cytotoxicity toward measles virus-infected target cell in randomly bred Syrian hamsters. Infect. Immun., 1982, v. 38, N 2, p. 580-584.

70. Chang M.W. Isolation of U.urealyticum from healthy young persons in Korea. Microbiol. Immunol., 1984, v. 28, N 1, p. 113-116.

71. Chang M.W. Study of urogenital mycoplasmas. Med. J. Hiroshima Univ., 1986, v. 34, N 4, p. 433-442.

72. Chia W.K., Spence L., Dunkley L. et al. Development of urease conjugated enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for detection of IgM and IgG antibodies against M.pneumoniae in human sera. - Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1988, v. 11, p. 101-107.

73. Chien A., Edgar D.B., Trela J.M. Deoxyribonucleic Acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bact., 1976, v. 127, N 3, p. 1550-1557.

74. Chima J.C., Onoviran 0. A passive haemagglutination test for detection of antibodies against M.mycoides subsp. mycoides using glutaraldehyde-fixed sheep erytrocytes. Vet. Microbiol., 1982, v. 7, p. 343-349.

75. Cimino 6.D., Metchette K.C., Isaacs S.T. et al. More false-positive problems. Nature, 1990, v. 347, p. 340-341.

76. Cimino G.D., Metchette K.C., Tessman J.W. et al. Post-PCR sterilization a method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, p. 99-107.

77. Clark H.W., Bailey J.S., Fowler R.C. et al. Identification of Mycoplasmataceae by the fluorescent antibody method. J. Bact., 1963, v. 85, p.111.

78. Clerc M.T., Renaudin H., Barbeyrac B. et al. PCR, a useful tool for biovar determinanion in U.urealytlcum. 10-th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1993, v. 3, p. 326-327.

79. Clyde W. Mycoplasma species identification based upon growth inhibition by specific antisera. J. Immun., 1964, v. 92, N 6, p. 958.

80. Clyde W.A. Mycoplasma-pneumoniae infection in man. In: Human and animal mycoplasmas. Ed. by Tully J.G., Whitcomb R.F. Acad. Press, 1979, v. 2, p. 320.

81. Clyde W.A. Growth inhibition tests. In: Methods in Mycoplasmology. Acad. Press., N.Y., 1983, v. 1, p. 405-410.

82. Cole B., Golightly-Rowland L., Ward J. et al. Immunological respons of rodents to murine mycoplasmas. Infect. Immun., 1970, v. 2, N 4, p. 419-425.

83. Cole B., Ward J. Mycoplasmas as arthritogenic agents. In: The mycoplasmas. Ed. by Tylly J.G., Whitcomb R.F. Acad. Press, N.Y., 1979, v. 2, p. 367-368.

84. Copin E., Lebrun L. Infections a mycoplasmes urogenitaux.

85. Feuill. biol., 1991, v. 32, N 181, p. 9-15.

86. Dajani A.S., Clyde W.A., Denny F.N. Experimental infectionwith A/.pneumoniae. J. Exp. Med., 1965, v. 121, p. 229.

87. Davidson M.K., Lindsey J.R., Brown M.B. et al. Comparasion of methods for detection of M.pulmonis in experimentally and naturally infected rats. J. Clin. Microbiol., 1981, v. 27, N 3, p. 646-655.

88. Davis I.K., CassellG.H., Minion F.C. et al. Mycoplasma host-cell interaction resulting in chronic inflamation: acqusition of host antigens and other mechanisms. Israel J. Med. Sci., 1981, v. 17, p. 633-636.

89. Davson M.S., Wang R., Hayes M. et al. Detection and isolation of M.fermentans from urine of patients with AIDS. In Programm and abstracts: general meeting of the American Society for Microbiology (Dallas). Washington 1991.

90. Deragon J.M., Sinnett D., Mitchell G. et al. Use of gamma irradiation to eliminate DNA contamination for PCR. Nucleic Aids Res., 1990, v. 18, p. 6149.

91. Dorigo-Zetsma J.W., Zaat S.A., Ursi D. Quantification of M.pneumoniae in simulated clinical specimens using a nested Polymerase Chain Reaction. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 496.

92. Dwyer D.E., Saksena N. Failure of ultra-violet irradiation and autoclaving to eliminate PCR contamination. Mol. Cell Probes, 1991, v. 6 , p. 87-88.

93. Edert D., Catelle, Le Faou A. Usefulness of IgM detection for the diagnosis of M.pneumoniae Infections. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 151.

94. Feldner J., Gobel U., Bredt W. Mycoplasma pneumoniae adhesin localized to tip structure by monoclonal antibody. Nature, 1982, v. 289, p. 765-767.

95. Fodor M. Difference in virulence of U.urealyticum isolates. -Acta Microbiol. Acad. Hung, 1980, v. 27, N 2, p. 161-169.

96. Fox J.C. Ait-Khalid M., Webster A. et al. Eleminating PCR contamination: is UU irradiation the answer ? J. Virol. Methods., 1991, v. 33, p. 375-383.

97. Freese E., Stach H.B. Induction of mutations in transforming DNA by hydroxylamine. Proc. Natl. Acad. Sei, 1962, v. 48, p.1796-1803.

98. Freundt E.A., Whitcomb R.F. Cultivation and identification of mycoplasmas. Yale J. Biol. Med., 1983, v. 56, N 5, p. 819-823.

99. Gabrige M., Schneider P. Cytotoxic effect of M.fermentans on mouse thymocytes. Infect. Immun., 1975, v. 11, N 3, p. 460-465.

100. Gabrige M.G., Dec Bardenstahl Y., Polisky R. et al. Difference in the attachment of M.pneumoniae cells and membranes to tracheae epitelium. Infect. Immun., 1977, v. 16, N 3, p. 776-781.

101. Gail H., Cassel M., Richard G. et al. Isolation of M.hominis and U.urealyticum from amniotic fluid. Sex. Trans. Dis., 1983, v. 10, N. 4, p. 294-302.

102. Geary S.J., Gabrige. Characterization of a human lung fibroblast recepor site for M.mneumoniae. Isr. J. Med. Sei, 1987, v. 23, p. 462-468.

103. Gibson P.E., Gardner S.D., Field A.M. Use of molecular probe for detecting ICY DNA directly in human brain material. J. Med. Virol., 1986, v. 18, p. 87-95.

104. Gobel U.B., Geiser A., Stanbride E.I. Oligonucleotide probes complementary to variable regions of ribosomal RNA descreminate between mycoplasma species. J. Gen. Microbiol., 1987, v. 133, p. 1967-1974.

105. Goodburn D.M., Marmion B.P. A study of properties of Eaton's primary atipical pneumonia organism. J. Gen. Microbiol., 1962, v. 29, p. 271.

106. Graber C.D., Greticos P., Valicenti J. et al. Mycoplasma in human reproductive failure. Obstet, and Gynecol., 1979, v. 54, N 5, p. 558-561.

107. Grattard F., Lucht F., Pozzetto B. et al. Typing of strains of M.hominis isolated from successive genital samples of HIV-1 infected subjects by arbitrarily-primed PCR. 10 th Int. Congr. I0M., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 350-351.

108. Grattard F., Clerc M., Barbeyrac B. et al. application of arbitrarily-primed PCR to the epidemiological typing of isolates of U.urealyticum isolated from pregnant women and neonattes. 10 th Int. Congr. I0M., 1994, v. 3, p. 328-329.

109. Grayston J.T., Kenny G.E., Foy H.M. et al. Epidemiologicalstudies of M.pneumoniae infections in civilians. Ann N.Y. Acad. Sei., 1967, v. 143, p. 436.

110. HO. Qrayston J.T., Foy H.M., Kenny G.E. The epidemiologic of Mycoplasma infections of the human respiratory tract. In: The Mycoplasmatales and L-fase of bacteria. Ed. by Hayflick L., N.Y., 1969, p. 651.

111. Griffas R., Thibon M. Detection of Chlamydia Trahomatis by polymerase chain reaction. Res. Microbiol., 1989, v. 140, p. 139-141.

112. Grimpel E., Sanchez P.J., Wendel G.D. et al. Use of polymerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid fetal and cerebospinal fluid. J. Clin. Microbiol., 1991, v. 29, N 8, p. 1711-1718.

113. Grunstein M., Hogges D. Colony hybridization: a method for isolation of cloned DNAs that contain a spesific gene. Proc. Natl. Acad. Sei., 1975, v. 75, p. 3961-3969.

114. Hakkarainen K., Turunen H., Miettinen A. et al. Mycoplasmas and arthritis. Ann. Reum. Dis., 1992, v. 51, p. 1170-1172.

115. Harwick H., Kalmauson G., Fox M. et al. Arthritis in mice due to infection with M. pulmonis. Clinical and microbiologic features. J. Infect. Dis., 1973, v. 128, p. 533-540.

116. Hawkins R.E., RickmanL.S., Vermund S.H. Association of mycoplasma and HIV infections: detection of amplified M.fermentans DNA in blood. J. Infect. Dis., 1992, v. 165, p.581.585.

117. Hayflick L. The mycoplasma (PPLO) species of man (isolation, artritis, malignacies, respiratoryand genitourinary disease). N.Y. Acad. Sei., 1965, v. 27, p. 817-827.

118. Hay P.E., Rosenstein I.J., Lamont P. et al. Bacterial vaginosis and vaginal carriage of M.hominis in early pregnancy are predictive of late miscarriage preterm birth. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 149.

119. Hempstead P.G. An improved method for the rapid isolation of chromosomal DNA from Mycoplasma spp. Can. J. Microbiol., 1990, v. 36, p. 59-61.

120. Higuchi R., Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: PCR thechnology. Principles and applications for DNA amplification. Ed. Erlic, Stockton Press, N.Y., 1989, p. 31-38.

121. Henrich B., Feldmann R.C., Kamba V. et al. The pole of P50 and P100 proteins in adgesion patogenic species M.hominis. J. Clin. Microbiol., 1987, v. 26, p. 811-815.

122. Horner P.'J., GilroyC.B., Tomas B.J. et al. The role of U.urealyticumin non-gonococcal urethritis. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 151.

123. Horowitz S. Ureaplasma colonization of amniotic fluid in early mid-trimester and in premature rupture of membranes. -Abstr. 9 th Int. Congr. IOM.,Ames, Iowa USA, 1992, p. 83.

124. Hu P.C., Cole R.M., Huang Y.S. et al. Mycoplasma pneumoniae infection: role of a surfase protein in attachment organelle.

125. Science, 1982, v. 226, p. 313-315.

126. HuP.C., SchaperV., Collier A.M. et al. The mechanism of adherence in M.genitalium. Infect. Immun., 1987, v. 55, p 1126-1131.

127. Hyman H.C., Yogev D., Razin S. DNA probes for detection and identification of M.pneumoniae and M.genitalium. J. Clin. Microbiol., 1987, v. 25, p. 726-728.

128. Hyman H.C., Levinson S., Yogev D. et al. DNA probes for M.gallisepticum and M.synoviae: application in experimentally infected chickens. Vet. Microbiol., 1989, v. 20, p. 323-337.

129. Ibrahim A.A., Jamomoto R. Arginine catabolism by M.meleagridis and its role in pathogenesis. Infect. Immunol., 1977, v. 18, p. 226-229.

130. Ieven M., Ursi D., Niesters H. et al. Detection of M.pneumoniae by a simplified PCR protocol and by culture in child hood respiratory tract infection. 10 th Int. Congr. IOM., Bougeaux, 1994, v. 3, p. 458-459.

131. Integrated DNA technology. In: Product insert. Integrated DNA technology, 1992, Coralville, Iowa.

132. Isaacs S.T., Tessman J.W., Metchette K.C. et al. Post-PCR sterilization: develo pment and application to an HIV-1 diagnostic assay. Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, p. 109-116.

133. Jablonsky E., Moomaw E.W., Tullis R.M. et al. Preparation of oligonucleotide alkaline-phosphatase conjugates and their use as hybridization probes. - Nucl. Acids Res., 1986, v. 14, p.6115-6128.

134. Jackson D.P., Hayden J.D., Quirke P. Extraction of nucleic acid from fresh and archival material. PCR. A practical approach. Ed. McPherson. Oxford University Press, Oxford-N.Y.-Tokyo, 1991, p.29-50.

135. Jacobs E., Buchnolz A., Kleimann B. Use of adherence protein of M.pneumoniae as aantigen for enzyme-linked immunosorbent assay. Isr. J. Med. Sci., 1987, v. 23, p. 709-712.

136. Jacobs E., Goerendt U., Brodt. Isolation and characterization of U.urealyticum and M.hominis. Zbl. Bacterid., 1990, v. 98, N 1, p. 273.

137. Jacobs E. Serol6gical diagnosis of M.pneumoniae infections: a critical reviev of current procedures. Clin. Infect. Dis., 1993, v. 17, p. 579-582.

138. Jansson E., Vainio U., Snellman 0. et al. Search for mycoplasma in rheumatoid artritis. Ann Rheum. Dis., 1971, v. 30, p. 413-418.

139. Jansson E. Mycoplasmas and arthritis. Scand. J. Rheumatol., 1975, N 4, p. 39-42.

140. Jensen J.S., Sondergard-Andersen J.U., Lind K. Detection of M.pneumoniae in simulated clinical samples by Polymerase Chain Reaction. APMIS, 1989, v. 97, p. 1046-1048.

141. Jensen J.S., Ulduiri S.A., Sandergard-Andersen J. et al. Polymerase chain reaction for detection of M.&enitallum in clinical samples. J. Clin. Microb., 1991, v. 29, N 1, p. 46-50.

142. Jensen K.E. Measurement of growth inhibiting antibody for M.pneumoniae. J. Bact., 1963, v. 86, p. 1349.

143. Jensen K.E. Antibodies to M.pneumoniae measured by inhibition of tetra zolium reduction. Bacterid. Proc., 1964, p. 70-71. ,

144. Jones T., Hersch J. The interaction in vitro of M.pulmonis with mouse peritoneal macrophages and L-cell. J. Exp. Med., 1971, v. 133, p. 231-259.

145. Jones T., Jeh S., Hersch J. Studies on attachment and ingestion phases of phagocytosis of M. pulmonis by mouse peritoneal macrophages. Soc. Exp. Biol. Med., 1972, v. 139, p. 464-470.

146. Kahan I., Banai M., Razin S. et al. Attachment of mycoplasmas to host cell membranes. Rev. Infect. Dis., 1982, v. 4, p. 185-192.

147. Kahan I. IN vitro studies on the mechanism of adherence and pathogenecity of mycoplasmas. Isr. J. Med. Sci., 1984, v. 20, p. 874-877.

148. Kahan I. Pathogenic mycoplasmas cause oxidative stress in the host cell. 6 th Int. Congr. IOM., Birmingham, 1986, p. 70.

149. Kayser F.H. Changis in spectrum of organisms causing respiratory tract infections. In: Ciprofloxacin in pulmonology, Ed. by Shah R.M., W. Zuckschwerdt Verlag, N.Y., 1991, p. 1-8.

150. Kenny G.E. Antigenic analysis of the Mycoplasmatales. Nongonococcal urethritis and relat. infection. Washington D.C.,1977, p. 376-382.

151. Kingsbury D.T. Rapid detection of Mycoplasmas with DNA probes. In: Rapid detection and identification of infections agents. - Acad. Press., N.Y., p. 219-233.

152. Kitchin P.A., Szotyori Z., Fromholc C. et al. Avoidance of false positives. Nature, 1990, v. 344, p. 201.

153. KokT.W., Varkanis G., Marmion B.P. et al. Laboratory giagnosis of M.pneumoniae infection. 1. Direct detection of antigen in respiratory exudates by enzyme immunoassay. Epidemiol. Infect., 1988, v. 101, p. 669-684.

154. KokT.W., Marminion G., Varkanis G. et al. Laboratory diagnosis of M.pneumoniae infection. 3. Detection of IgM antibodies to M.pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiol. Infect., 1989, v. 103, p. 613-623.

155. Krause S.J., Jacobs F.W., Chandler F.W. et al. Experimental animal infections with M.hominis and U.urealyticum. Infect. Immun., 1977, v. 16, N 1, p. 302-306.

156. Krause D.C., Leith D.K., Wilson R.M. et al. Identification of M.pneumoniae proteins associated with hemadsorption and virulence. Infect.Immun., 1982, v. 35, p. 809-817.

157. Kundsin R.B. Mycoplasma infections of the female genital tract. Progr. Gynecol., 1975, v. 6, p. 291-306.

158. Kwok S., Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. -Nature, 1989, v. 339, p. 237-238.

159. Langdale T.A., Malcolm A.D.B. A rapid method of gene detection using DNA bound to sephacril. Gene, 1985, v. 36, p. 201-210.

160. Lehmer R.R., Andrews B.S., Robertson J.A. et al. Clinical and biological characteristics of U.urealyticum induced polyarthritis in a patient with common variable hypogammaglobulinaemia. Ann. Rheum. Dis., 1991, v. 50, N 8, p. 574-576.

161. Lemcke R.M. Serological reaction of Mycoplasmas. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1973, v. 46, p. 225.

162. Levinsohn S., Hyman H.C., Perelman D. et al. The use of specific DNA probe for detection of M.gallisepticum in filed outbreaks. Avian. Pathol., 1989, v. 31, p. 1-12.

163. Longo M.C., Berninger M.S., Hartley J.L. Use of uracil DNA Glycosylase to control-over contamitation in polymerase chain reaction. Gene, 1990, v. 93, p. 125-128.

164. Lo S.C., Shih J.W-K., Jang N.J. et al. A novel virus-like infections agent in patients with AIDS. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989, v. 40, N 2, p. 213-226.

165. Lo S.C., Wang R.J-H., Newton P.B. et al. Fatal infection of silvered leaf monkeys with a virus-like infections agent (VLIA) derived from a patient with AIDS. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989, v. 40, N 4, p. 339-409.

166. Lo Y.W., Mehael Z, Fleming K.A. False positive results and the polymerase chain reaction. Lancet, 1990, v. 1, p. 679.

167. Lu S.D., Mecca J.J., Weiss J.B. Development of a multiplex PCR system for the detection of M.hominis and U.urealyticum. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 374.

168. Marko M.A., Chipperfield R., Birnboim H.C. A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. Anal. Biochem., 1982, v. 121, p. 382-387.

169. Marmion B.P., Williamson J., Worswick D.A. et al. Experience with newer techniques for the laboratory detection of Mycoplasma pneumoniae infection: Adelaide, 1978-1992. Clin. Infect. Dis., 1993, v. 17, N 1, p. 90-99.

170. McCormack W.M., Zie J.H., Zinner S.H. Sexual experience and urethral colonization with genital mycoplasmas. A study in normal men. Ann. Intern. Med., 1973, v. 78, p. 696-698.

171. McGarrity G.J., Sarama J., Vanaman V. Effects of mycoplasmas on cell culture systems. In vitro, 1979, v. 15, N 2, p. 186.

172. McGarrity, Kotani H. Detection of cell cultire mycoplasmas by a genetic probe. Exp. Cell. Res., 1986, p. 273-278.

173. Moller B., Freundt E. Experimental infection of genital tract of female grivet monkeys by M.hominis. Infect. Immun., 1978, v. 20, N 1, p. 248-257.

174. Moller B., Freundt E. Experimental infection of the genital tract of female grivet monkeys by M.hominis: effect of different routes of infection. Infect. Immun., 1979, v. 26, N3, p. 1123-1128.

175. Moller B.R. Black F.T., Freundt E.A. Attempt to produce gynaecological disease in grivet monkeys with U.urealyticum. J. Med. Microbiol., 1981, v. 14, p. 475-478.

176. Moller B.R., Taylor-Robinson D., Furr P.M. Acut upper genital-tract disease in female monkeys provoked experimentally by M.genitalium. Brit. J. Exp. Pathol., 1985, v. 66, N 4, p. 417-427.

177. Montagnier L., Berneman D., Guetard D. et al. Inhibition del'infectiosite de souches prototypes du VIH par des anticorps diriges contre une sequence peptidique de mycoplasme. C.R. Acad. 3ci 3, 1990, v. 311, p. 425-430.

178. Mufson M.A., Sanders V., Chanoch R. Primary apypical pneumoniae du to Mycoplasma peumoniae (Eaton agent): report of a case with a residual pleural abnormality. New. Engl. J. Med., 1963, v. 268, p. 1109.

179. MullisK., FaloonaF., Scharf S. etal. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction. J. Mol. Biol., 1986, v. 51, p. 263-273.

180. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol., 1987, v. 156, p. 335-350.

181. Naot J, Ginsburg H. Activation of B lymphocytes by mycoplasma mitogen. Immunology, 1978, v. 34, p. 715-720.

182. Okamoto S.L. Time trends in sexually transmitted disease in the world. Asian. Med. J., 1989, v. 32, N 8, p. 450-457.

183. Opitz H.M., Duplessis J.B., Cyr M.J. Inderect ¡nioro-enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to Ai.syrioviae and M.gallisepticum. Avian. Dis., 1983, v. 27, N 3, p. 773-786.

184. Ou C.Y., Moore J.J., Schochetman S.V. Use of UV irradiation to reduce false positivity in the polymerase chain reaction. -Bio Techniques, 1991, v. 10, p. 442-446.

185. Owens D.R., Wagner J.E. Lentsch R.H. et al. Techniques for culture and identification mycoplasma. Lab. Anim., 1980, v. 9, N 3, p. 22-27.

186. Persing D.H. Polymerase chain reaction: trenches to benches. J. Clin. Microbiol., 1990, v. 29, p. 1281-1285.

187. Pickerring W.J., Birch D.F. Bacteriologic and serologic findings in experimental pylonephritis caused by U.urealyticum. -Infect. Immun., 1989, v. 57, N4, p. 1235-1239.

188. Ponka A. Central nervous system manifeststions associated with serologically verified M.pneumoniae infection. Scand. J. Infect. Dis., 1980, v. 12, p. 175-184.

189. Poumarat F., Perrin M., Belli P. et al. Recher che des anticorps anti-mycoplasma bovis dans le serum des bovins a l'aide de la reaction d'hemagglutination passive valeur et limites de la reaction. Revue Med. Vet, 1987, v. 138, N 12, p. 981-989.

190. Povlsen K., Jensen J.S. Determination of biovar and the presence of tet M in clinical U.urealyticum isolates by polymerase chain reaction. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux,1994, v. 3, p. 381-382.

191. Powell D., Clyde W. Opsoniversible resistance of M.pneumoniaeto in vitro phagocytosis by alveolar macrophages. -Infect. Immun., 1975, v. 11, p. 540-550.

192. Razin S., Gross M., Wormser M. et al. Detection of mycoplasmas infecting cell cultures by DNA hybridization. In vitro, 1984, v. 20, N 5, p. 404-406.

193. Razin S. Mycoplasma adhesins and lectins. In: Microbial lectins and agglutinis., Ed. by D. Mirelman N.Y. John Wiley and Sons, 1986, p. 217-235.

194. Razin S., Hyman H.C, Nur I. et al. DNA probe for detection and identification of mycoplasmas (Mollicutes). Isr. J. Med. Sei., 1987, v. 23, p. 735-741.

195. Razin S., Jacobs E. Mycoplasma adhesion. J. Gen. Microbiol., 1992, v. 138, p. 407-422.

196. Rigby P.W., Dieckman I., Rhodes C. et al. Labeling deoxyribonucleic acid hidh specific activity in vitro by nich translation with DNA polymerase 1. J. Mol. Biol., 1977, v. 113, p. 237-251.

197. Risi Jr.G.F., Martin D.H., Silberman J.A. A DNA probes for detec- ting M.genitalium in clinical specimens. Mol. Cell. Probes., 1988, v. 2, p. 327-335.

198. Robertson J.A., Honore L.H., Kakulphimip J. et al. Assotiation of U.urealyticum with spontaneus abortion. In: INUMS Congress Bacteriology I Mycology, 1990, p. 156.

199. Robertson J.A., Vekrls A., Bebear C. et al. Polymerase Chain Reaction using 16S rRNA gene sequences distinguishes the two biowars of U.urealyticum. J. Clin. Microbiol., 1993, v. 31, p. 324-830.

200. Roberts D., Olesink 0. Immunological competence of the chicken embryo and the neonatal chicken to M.gallisepticum. J. Infect. Dis., 1966, v. 116, N 4, p. 490-494.

201. Roberts D.D., Olson L.D., Barile M.F. et al. Sialic acid-dependent adhesion of M.pneumoniae to purified glycoproteins. J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 9289-9293.

202. Saiki R.K., Scharf S., Falona F. et al. Enzymatic amplification of B-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diadnosis of sickel cell anemia. Since, 1985, v. 230, N 4732, p. 1350-1354.

203. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA wiht a thermostable DNA polymerase. Sience, 1989, v. 239, N 4839, p. 487-491.

204. Santha M., Burg K., Rasko I. et al. A specific DNA probe for the detection of M.g'allisepticum. Infect. Immun., 1987, v. 55, p. 2857-2859.

205. Sarkar 6., Sommer S.S. Sheddind light on PCR contamination. Nature, 1990, v. 343, p. 27.

206. Sarkar G., Sommer S.S. More light on PCR contamination. -Nature, 1990, v. 347, p. 340-341.

207. Sarkar G., Sommer S.S. Parameters affecting susceptibilityof PCR contamination to UV inactivation. Bio. Techniques, 1991, v. 10, p. 590-594.

208. Schabinski G., Baumann B., Zatzsch J. et al. Untersuchungen zur ätiologischen bedentung zellwandfeier microoorganismen bei der pyelonephritis. Z. Urol. Nephrol., bd. 74, s. 609-612.

209. Schochetman G., Ou C.Y., Jones W.K. Polymerase chain reaction. J. Infect. Dis., 1988, v. 158, p. 1154-1157.

210. Schuster V., Matz B., Wiegand H. et al. Detection of human cytomegalo-virus in wrine by DNA-DNA and RNA-DNA hybridization. -J. Infect. Dis., 1986, v. 154, p. 309-314.

211. Skani L., Sard A., Just J. et al. Detection of M.pneumoniae in clinical samples from pediatric patients by polymerase chain reaction. J. Clin. Microb., 1992, v. 30, N 10, p. 2638-2643.

212. Smith C.B., Fiederwald W.T., Chanock R.M. Inactivated M.pneumoniae vaccine. Evaluation in volunteers. JAMA.,1967, v. 199, N 6, p. 353-358.

213. Sritharan V., Barker R.H.J. A simple method for diagnosis of M.tuberculosis infection in clinical samples using PCR. Mol. Cell. Probes, 1991, v. 5, p. 385-395.

214. Stanbrige E. Mycoplasma-lymphocyte interactions and their possible role in immunopathologic manifestâtiones of mycoplasmae disease. Rev. Infect. Dis., 1982, v. 4, p. 219-226.

215. Stanbrige E. Mycoplasma immunity and immunopathology: summary. Rev. Infect. Dis., 1982, v. 4, p. 227.

216. Stelzner A., Urbach H., Winter J., Untersuchungen zurlabordiagnostisohen Verwendungsfähigkeit eines nenen komplementbinden den M.pneumoniae antigens. - Z. Ges. Hyg., 1973, bd. 8, s. 602-606.

217. Stevens M.K., Krause D.O. Localization of M.pneumoniae суtoadherence-associated proteins HMW1 and HMW4 in cytosheletonlike triton shell. -J. Bact., 1991, v. 173, p. 1041-1050.

218. Stubner G. Mycoplasmennachweis durch direkt fluorochromeirung mit acridinderivaten. Dtsen. Med. Wocheusche, 1976, bd. 101, N 34, s. 1257-1258.

219. SugataT., OhkawaM., Nakashima T. et al. Isolation of U.urealyticum from patients with chronic prostatitis. Acta urol. Jap., 1987, v. 33, N7, p. 1043-1048.

220. Sygijama Т., Smith P.F., Langworthy T.A. et al. Immunological analysis of glycolipids and lipopolysaccharides derived from various mycoplasmas. Infect. Immunol., 1974, v. 10, N 6, p.1273-1279.

221. Tarshis M.A., Ladydina V.G., Migoushina V.L. Interaction of Acholeplasma laidlawii cells with mouse spleen lymphocytes. -Zbl. Bact. Hyg. I. Abt. Orig. A 250, 1981, p. 153-166.

222. Taylor-Robinson D., Shirai A., Sobeslavsky 0. et al. Serologic response to M.pneumoniae infection. 2. Significance of antibody measured by different tecthiques. Amer. J. Epidemiol., 1966, v. 84, p. 301-313.

223. Taylor-Robinson D., Manchee R.J. Adherence of mycoplasmas toglass and plastic. J. Bact., 1967, v. 5, p. 1781-1782.

224. Taylor G., Taylor-Robinson D., Keystone E. Effect of lymecycline on M.pulmonis induced arthritis mice. Br. J. Exp. Pathol., 1978, v. 59, N 2, p. 204-212.

225. Taylor-Robinson D. Metabolism inhibition tests. In: Method in Mycoplasmology, Ed. by Razin S. by Tylly J.G., Acad. Press, N.Y., 1983, p. 411-418.

226. Tchen P., Fuchs R.P.P., Sage E. et al. Chemically modified nucleic acids as immunodetectable probes in hybridization experimens. Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1984, v. 81, p. 3466-3470.

227. Thomas C.B., Jasper D.E., Boothby J.T. et al. Detection of bovine serum antibody specific to M.bovis and M.californlcum by ELISA. Isr. J. Med. Sei, 1987, v. 23, p. 723-728.

228. Thouvenot D., Bosshard S. Rewiew of human mycoplasma infections. Sei. Vet. Med. Comp., 1989, v. 91, N516, p. 211-225.

229. Tindall K.R., Kunkel T.A. Fidelity of DNA synthesis by Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry, 1988, v. 27, N 16, p. 6008-6013.

230. Tully J.G. General cultivation techniques for mycoplasmas and spiroplasmas. In: Method in mycoplasmology. N.Y. Acad. Press, 1983, v. 1, p. 99-102.

231. Tully J.G. Current status of the mollicute flora of man. -Clin. Infect. Dis., 1993, v. 17, N 1, p. 2-9.

232. Turtzo D.F., Qhatak P.K. Acute hemolytic anemia with M.pneumoniae. J. Amer. Med Assoc., 1976, v. 236, p. 1140-1141.

233. Ursi D., Ieven M., Bever H.V. Typing of M.pneumoniae by polymerase chain reaction. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 508-509.

234. Walker E., Eriedman M., Olson N. On ultrastructural study of avian synovium infected with on arthrotropic M.synoviae. Vet. Pathol., 1978, v. 15, N 3, p. 407-416.

235. Walzi H., Schutze E.„ Laber G. Clinical and histopathological findings in mycoplasmae polyarthitis of rats. 2. Course of disease between the 2 nd and 6-th week. Zbl. Bakt. Hyg. 1. Abt. Orig. A 231. 1975, p. 229-242.

236. Washburn L., Cole B., Gelman M. Chronic arthritis of rabbits induced by mycoplasmas. Arthr. Rheum., 1980, v. 23, N 7, p. 825-836.

237. Washburn L., Cole B., Ward J. Recognition of M.arthritidis membrane antigens by rats and rabbits. Arth. Rheum., 1982, v. 25, N 8, p. 937-946.

238. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bact., 1991, v. 173, N 2, p. 697-703.

239. Whittestone P. Isolation of M.suipneumoniae. In: Isolation methods for microbiologists. Acad. Press N.Y., 1969, p. 51-61.

240. Willey C.A., Quinn P.A. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of specific antibodies to U.urealyticum serotypes.-J. Clin. Microbiol., 1984, v. 19, N3, p. 421-426.

241. Williamson J., Marmion B.R., Antic R. et al. Confirmation of fatal Mycoplasma pneumoniae infection by PCR detection of adhesin gene in fixed lung tissue. 10 th Int. Congr. IOM., Borgeaux, 1994, v. 3, p. 462.

242. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A. et. al. 16S ribo-somal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bact., 1991, v. 173, N 2, p. 703-707.

243. Wise K., Cassell G., Acton R. Selective association of murine T lymphoblastoid cell surface alloantigens with M.hyorhinis. -Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1978, v. 75, p. 4479-4483.