Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к антигенам клонорхиса и опыт использования её в очагах инвазии в Хабаровской крае

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к антигенам клонорхиса и опыт использования её в очагах инвазии в Хабаровской крае"

ХАБАРОВСКИ/1 ГОСУДАРСТВЕННА МВДИЦИНСКИЯ ИНСТИТУТ

ИНСТИТУТ ЛЕДИЦИНСНШ ПАРАЗИТОЛОГИИ И ТРОПИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНА им. Е.И.МАРЦИНОВСКОГО ГКСЭН РФ

РЛ_Б___04-----------------------------------------------

- ; : ; " На правах рукописи

СЕМЁНОВА Татьяна Александровна

УДК 616.990.112-07:57.0833-07 571.61/62

РАЗРАБОТКА ИШУНОФЕРМЕНТНОЛ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ¿1Я ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ иЛОНОРХИСА л ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЕЁ В ОЧАГАХ ИНВАЗИИ В ХАБАРОВСКОМ КРАЕ

03.00.±9 - паразитологии

Автор диссертации на степени кандидата

е I1, е р а т соискание учёной . биологических наук

Хабаровск - 1994

/ Работа выполнена на кафедре медицинской биологии Хабаровского государственного медицинского института и в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.Ил^арциновского. -

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор П.С.Посохоь, кандидат биологических наук Н.Е.Баллад

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.А.Астафьев, кандидат медицинских наук, доцент Т.И.Авдюхинг

Ведущее учреждение:

Защита диссертации состоится "_" 1994г.

в " " часов на заседании Специализированного Совета Д.074.39.С при институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И.Марциновского ГдСЭп Р&.

А д р е с: 119435, .»юсква, ул.Малая Пироговская, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского.

Автореферат разослан " ^¿г" Л- 1994г.

Учёный секретарь Специализированного Совета

А.А.Фролова

ОНДАН ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Несмотря на существенную роль клонорхоза в краевой патологии Приамурья, до сих пор не удаётся установить надёжный контроль за эпидситуацией, наладить систему своевременного выявления заболевших. Одной иа причин этого являются трудности в диагностике обычными методами копроовоскопии. Достаточно сказать, что в течение десятилетий в годовых отчётах санитарно-эпидемиологической службы Хабаровского края фигурировали единичные случаи клонорхоза, тогда как целенаправленные исследования показали значительную поражён-' ность коренного населения - от 8 до 30%, а общее число больных достигает 2,5 - 3 тысяч человек ( К.И.Скрябин и соавт.,1929; Б.А. Астафьев,1960; Л.И.Синович, 1964; П.С.Посохов,1984 ).

Практически во всех работах, посещённых клонорхозу, прямо или косвенно обсуждается необходимость совершенствования диагностики, разработки новых методов, в частности, серологических ( П.С. Посохов и соавт.,1987; В.А.Фигурнов и соавт.,1986, 1991; О.П.Соро-копуд и соавт.,1990; Э.Л.Щенников и соавт.,1991; В.Н.Кораблёв,1991).

Решение проблемы клонорхоза осложняется и неблагоприятной динамикой природных и социальных процессов: загрязнением среды, нарушением экологического баланса, усилением миграции населения, смещением акцентов в традициях питания у пришлого контингента дальневосточников, доступностью рыбных запасов Амура. Расширение неиммунной прослойки среди населения ведёт к увеличению числа клинически тяжёлых случаев заболевания на ранних стадиях. Отмечен рост заболеваемости у пришлых групп населения ( В.Н.Кораблёв,1991).

Актуальность всестороннего изучения клонорхоза усиливается и тем обстоятельством, что данный гельминтоз является высокопатогенным трематодозом, обусловливающим тяжёлые сдвиги в состо^ии

здоровья человека, нередко приводящие к инвалидности, а иногда и к смерти больных (A.C.Посохов и соавт.,I9Ü7; Л.В.Круглякова и со-авт.,1987). Возбудитель клонорхоза, стимулируя пролиферативные процессы в эпителии желчных протоков, является одним из сильных биоканцерогенов, провоцирующих развитие первичного рака печени,

В условиях Хабаровского края даже при низкой интенсивности инвазии более 80% инвазированных имеют клинически выраженное течение заболевания, проявляющееся в форме болевых, диспепсических и неврологических симптомов и обычно сопровождающееся изменениями со стороны периферической крови (В.Н.Дроздов и соавт.,1971,1973).

Традиционным методом диагностики клонорхоза до настоящего времени является копроовоскопия - метод толстого мазка по Като, иногде дополняемый микроскопией дуоденального содержимого. Данные диагностические приёмы имеют объективные, но существенные ограничения: невозможность паразитологического подтверждения в ранней стадии заболевания до начала репродуктивной деятельности паразита и в связи с нерегулярной яйцепродукцией в хронической стадии и снижением выделения яиц, вплоть до полного прекращения, при длительно текущей инвазии; маловероятность нахождения яиц паразита в случаях . низкой интенсивности инвазии (обычно именно такой уровень поражения преобладает в эндемичных районах Приаыурья). В случаях суперинвазии, при которой наблюдается полное отсутствие выделения яиц, копроовоскопия также малоэффективна.

В настоящее время в паразитологии всё прочнее завоёвывают позиции иммунологические методы диагностики, в частности, иммунофер-ментный анализ на твёрдой фазе ( ELISA ). Так, для диагностики описторхоза создано несколько модификаций тест-систем (В.А.Золотухин и соавт.,1989; И.А.Клебановская и соавт.,1990; О.Ю.Старостина и соавт. ,1990). Учитывая филогенетическую близость CiofloulUS SinCniii

- ['; -

и О^ИогеЬа ^ейпси!, > мы предположили возможность аналогично высокой чувствительности и специфичности данного метода и в диагностике клонорхоза. К тому же опыт использования гомологичного и гетерологичного антигенов в иммуноферментном анализе для диагностики члонорхоза на материале из Вьетнама дал обнадёживающие результаты ( Г.А.Гицу и соавт.,1991).

Всё вышеперечисленное и обусловило выбор данной темы, разработка которой открывает возможности внедрения в практику здравоохранения современного эффективного метода диагностики.

Цель исследования. Разработка и внедрение в практику лечебно-профилактических учреждений иммуноферментного теста для определения антител к антигенам клонорхиса.

Задачи исследования:

- разработать методику проведения иммуноферментного анализа для определения антител к антигенам клонорхиса;

- вычислить диагностическую границу и разработать диагностический критерий иммуноферментного теста для визуальной и инструментальной оценки результатов;

- оценить диагностическую эффективность разрабатываемой тест-системы ( определить чувствительность, специфичность, достоверность результатов) при использовании теста на эндемичных территориях;

- применить иммуноферментный анализ для диагностики клонорхоза в очаге заболевания в Нанайском районе и изучить особенности серо-эпидемиологии клонорхоза на этой территории.

Научная новизна.

Впервые приготовлен соматический антиген из Приамурской популяции клонорхисов, основные параметры и показатели реакции адаптированы к условиям применения в Приамурском очаге клонорхоза.^

Разработана иммуно^ерментная тест-система для определения антител к антигенам клонорхиса, отвечающая современным требованиям, и проверена на практике её эффективность.

Впервые иммуноферментный тест применён при массовом обследовании населения эндемичной территории Нанайского района Хабаровского края, что позволило дать оценку эпидситуации на основе серологических исследований.

Осуществлён опыт организации одновременного исследования сывороток крови на клонорхоз, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекцию, содержание иммуноглобулинов различных классов, иммунных комплексов и некоторые другие биохимические показатели, что позволило сократить трудозатраты и избежать повторных манипуляций, связанных с внутривенным забором крови.

Практическая значимость.

Использование иммуноферментного анализа позволяет выявлять больных на ранних стадиях заболевания, контролировать эффективность лечения, избавиться от субъективности в лабораторной работе, более качественно и оперативно контролировать состояние эпидситуации в очагах клонорхоза различной напряжённости, а также приблизиться к созданию единой комплексной иммунологической системы диагностики, охватывающей паразитарные заболевания и инфекции (в т.ч. ВИЧ-инфекцию).

Внедрение б практику.

На основе проведённой разработки составлены методические рекомендации для медицинских работников .Хабаровского края по использованию иммуноферментной тест-системы для диагностики клонорхоза (Хабаровск, 1992).

Разработанная методика проведения ИФА для диагностики клонорхоза внедрена в ряде лечебно-профилактических учреждений Дальнего

Востока: в Хабаровском краевом центре государственного санитарно-эпидемиологического надзора, в Хабаровской краевой клинической больнице № I, в Хабаровском краевом противотуберкулёзном диспансере, в Дальневосточном региональном центре по борьбе со СПИД.

В результате применения ИФА для диагностики клонорхоза, по данным Хабаровского краевого центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора, количество обследованных на клонор-хоз увеличилось в сотни раз, установлена серопозитивность до 40% в некоторых сёлах Нанайского района.

Данные сероэпидемиологических исследований в очагах клонорхоза на территории Хабаровского края используются в учебном процессе на каФедрах медицинской биологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета Хабаровского медицинского института и Хабаровского базового .училища повышения квалификации среднего медицинского персонала.

Публикации.

По теме диссертации выпущены методические рекомендации, опубликована I статья, сдана в печать I статья, опубликованы .тезисы докладов на 2-х конференциях, выпущено информационное письмо.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на заседании общества эпидемиологов и микробиологов (г.Хабаровск, 1993 г.), на конференции по проблемам трематодозов (г.Суш, 1992 г.), на конференции (г.Новосибирск, 1993г.).

Работа апробирована на заседании каФедры медицинской биологии Хабаровского медицинского института (апрель 1994 г.) и на заседании комиссии по предварительной экспертизе диссертаций, представляемых в Специализированный Совет при ИМПиТМ им.Е.И.Марциновского (16.05.94).

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, собственных исследований, выводов, заключения и материалов внедрения. Список использованной литературы включает 105 названий ( 70 отечественных и 35 зарубежных авторов), таблиц 9, рисунков

Положения, выносимые на защиту:

- разработанная иммуноферментная тест-система для определения антител к антигенам клонорхиса пригодна для использования

в лабораторной диагностике клонорхоза,

- показатели диагностической эффективности иммуноферментного ана лиза (чувствительность и специфичность) свидетельствуют о хоро шей дифференцирующей способности теста,

- иммуноферментный анализ для определения антител к антигенам клонорхиса может быть использован при массовых обследованиях населения и в эпидемиологической практике в очагах заболевания

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. При создании иммуноферментной тест-системы для определения ан тител к антигенам клонорхиса нами был взят за основу вариант ELI выявляющий четырёхкомпонентный антиген-антительный комплекс, успешно использованный в ИФА для диагностики описторхоза (И.А.Кл бановская и соавт.,1990). В качестве антигена использовали цельный экстракт гомогената марит'клонорхиса. Материал для приготовления антигена собирался в районе им.Лазо. Спонтанно заражённых кошек вскрывали методом неполного гельминтологического вскрытия по К.И.Скрябину. Полученный антиген содержал не менее 2-2,5 мгД белка.. Твёрдой фазой для адсорбции антигена клонорхиса служили

- ^ -

полистироловые микротитровальные планшеты московского завода "Медтехника", Санкт-Петербургского завода "Медполимер", НИИ биологического приборостроения, для проявления комплекса "антиген-антитело" применяли коммерческие препараты конъюгата антител к иммуноглобулинам человека с пероксидазой ( производство НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). В качестве субстратной смеси использовали О,Ь% раствор 5-аминосалициловой кислоты (Ь-АС) (0,8 иг/т) в смеси с 0,05% перекисью водорода в отношении 9:1. Планшеты промывали фосфатно-солевым буфером рН 7,2 с добавлением 0,05$ твин-20. Результаты учитывали с помощью спектрофотометров: отечественного КАИЦ-1 и " МиШ^кап " фирмы " Лом " (Великобрита-

ния) при длине волны 492 нм в единицах оптической плотности.

Материалом для отработки методики проведения иммунофермент-ного анализа явились сыворотки крови больных клонорхозом людей, которые заразились на территории Хабаровского края. Материал собирался в лабораториях паразитологического отдела краевого центра по санитарно-эпидемиологическому надзору, краевой клинической больницы, кафедры биологии ХГмЙ и в условиях экспедиционных выездов в очаги заболевания. Большинство больных клонорхозом проходили клиническое обследование и лечение азиноксом.

Контрольные группы Формировались из здоровых лиц, проживающих вне очага инвазии (г.Хабаровск и г.Москва) и больных непаразитарными заболеваниями (туберкулёз лёгких и различные патологии гепатобилиарной системы и желудочно-кишечного тракта).

За 3 года методом иммуно^ерментного анализа исследовано 4325 сывороток крови человека. В общее число исследований входят 243 сыворотки больных клонорхозом различной длительности и течения заболевания, подтверждённым паразитологически;'62 сыворотки больных эхинококкозом, 90 сывороток больных метагонимозом, 55 сывороток

больных нанофиетозом, 68 сывороток больных описторхозом, 29 сывороток больных трихинеллёзом, а также сыворотки больных энтеробио-зом ( 20 ), аскаридозом С 2 ), трихоцефалёзом ( I ), дифиллоботри-озом ( I ), альвеококкозом ( б ) и цистицеркозом ( I ).

Для определения чувствительности и диагностической эффективности ИФА было проведено параллельное копроовоскопическое и серологическое обследование 273 человек. Факт имеющейся инвазии регистрировался нахождением яиц в кале (количественной модификацией метода Като) и желчи (исследованием осадка всех порций дуоденального содержимого). Дуоденоовоскопию проводили только стационарным больным. Для выяснения эпидемиологической обстановки в районах Хабаровского края проводили массовое копроовоскопическое обследование населения. Методом Като обследовано 1092 человека ( 843 жителя Нанайского района, 47 жителей Хабаровского сельского района, 202 жителя Ульчского района).

Разработка методики иммуноферментного анализа для определения антител к антигенам клонорхиса.

Разработка иммуноферментного теста на клонорхоз включала ряд этапов.

1. Отработка условий проведения иммуноферментного анализа (создание методики). Результаты этого этапа явились предметом первого раздела собственных исследований, куда вошли: а) методика приготовления иммунодиагностикума; б) выбор разводящего раствора для сывороток и конъюгата; в) определение оптимального разведения испытуемых сывороток.

2. Вычисление диагностического значения ИФА.

3. Формирование диагностической тест-системы для использования в лабораторной практике, для чего были созданы контрольные образцы сывороток ( положительной, отрицательной и с диагностическим

количеством антител).

4. Заключительным этапом создания иммуноФерментного теста на клонорхоз стала оценка ,его диагностической эффективности, основными показателями которой являются чувствительность и специфичность реакции.

В выборе реагентов и условий проведения ИФА мы опирались на уже существующие разработки для диагностики других гельминтозов. Предпочтение отдавалось наиболее экономичным и безопасным в работе материалам. Вместе с этим оценивалась возможность унифицирования методики в дальнейшем и создания комплексного набора для определения антител к антигенам возбудителей гельминтозов различ ных видов.

Отработка условий проведения иммуноФерментного анализа велась относительно стандартов положительной и отрицательной сывороток. Критерием выбора параметров иммуноФерментного теста было получение максимальной разнищ.1 в окраске ( показателях опти ческой плотности) проб положительной и отрицательной сывороток, причём максимальным показателем отрицательной'был 0,2, а минимальным показателем положительной - 0,8.

За время исследований было приготовлено Ь серий антигена с содержанием белка от 1,8 до 2,6 мг/мл. Материалом для каждой серии служили мариты в среднем от двух спонтанно заражённых кошек. В качестве рабочего раствора для разведения и сорбции антигена нами выбран фосФатно-солевой буфер с рН 9,6 по наиболее высокой разнице показателей оптической плотности положительной и •отрицательной сывороток при одновременно низком значении ИФА в реакциях с контрольной отрицательной сывороткой.

Оптимальную дозу антигена для адсорбции определяли параллел но с определением рабочего разведения конъюгата. Наиболее Аффек-

тивно работающие разведения антигена для разных серий колебались от 1:80 до 1:200. Рабочее разведение конъюгата значительно колебалось в зависимости от серии коммерческого препарата: от 1:1200 до 1:80. Как правило, наиболее результативное разведение конъюгата находилось в пределах 1:600 - 1:800. При использовании в ИФА планшетов новой производственной серии дозу антигена для адсорбции и оптимальную дозу конъюгата необходимо определять заново.

В качестве белкового стабилизатора разводящего раствора для сывороток и конъюгата были испытаны бычий сывороточный альбумин, кроличья сыворотка, желатина и растворы нормальной лошадиной сыворотки, Результаты этого исследования позволили выбрать 10% раствор лошадиной сыворотки, дающий лучшие показатели специфического связывания антител. Нреемлимые для' использования результаты даёт также кроличья сыворотка и желатина.

Нами доказана возможность использования раствора антигена для вторичной сорбции с небольшой ( в 3-4 раза меньше обычной дозы) добавкой сухого лиофилизированного антигена.

Сухой лиофилизированный антиген сохраняет активность в течение 12 месяцев при хранении в холодильнике ( 4-5°С ). Раствор антигена после адсорбции необходимо хранить в морозильной камере.

Проведён выбор температурных условий приготовления антигенного диагностикума ( условия сушки планшетов: 4-5°С; 37°С в течение I часа и 37°С в течение 12 часов). Оптимален вариант

Таким образом, в результате отработки условий проведения ИФА для определения антител к антигенам клонорхисов была выбрана , следующая схема постановки реакции. . .

На одном планшете исследовали 43 образца сыворотки в одном разведении (вариант скрининга) или 8 сывороток в раститровке от 1:100 до 1:12800. Если реакция проводилась в скрининговом раз-

ведении, то каждая сыворотка ставилась в дубле. В качестве контроля чистоты реакции на планшете отводилась лунка для разводящего раствора без сыворотки. Остальные лунки отводились под контроль: положительная сыворотка Я+, К+; отрицательная сыворотка К-; сыворотка, определяющая диагностическую границу, Д.

Сыворотки (исследуемые и контрольные) перед испытанием разводили 1:100 на основе фосфатно-солевого буфера рН 7,2.

Сыворотки вносили по 0,2 мл в каждую лунку. Планшет с нанесёнными сыворотками инкубировали в течение I часа при температуре 37°С. После инкубации остатки сывороток стряхивали, а планшет триады промывали разводящим раствором от несвязавшихся антител.

Конъюгат вносили по 0,2 мл в каждую лунку в оптимальном разведении. Раствор для разведения конъюгата использовали тот же, что и для сывороток. Планшет с конъюгатом инкубировали в течение I часа при температуре 37°С. Отмывку производили также, как после адсорбции сывороточных антител.

Для приготовления субстратной смеси ВО мг 5-аминосалициловой кислоты растворяли в 100 мл дистиллированной воды, подогретой до 70°С. Доводили рН раствора до 6,0 и смешивали с 0,0Ъ% раствором перекиси водорода в соотношении 9:1.

Во все лунки микротитровального планшета вносили по 0,2 мл готовой субстратной смеси. Реакция протекала при комнатной температуре при слабом встряхивании планшета.

Учёт результатов проводили через I- час.

Вычисление диагностической границы ИФА и учёт результатов реакции. Для определения статистически обоснованного диагностического коэффициента, коррелирующего с максимальным показателем оптической плотности в контрольной группе сывороток на каждом планше-

те, использовали методику Н.Е.Баллад и соавт.(1986).

Анализ результатов иммуноферментной'реакции с сыворотками крови здоровых людей показал их нормальное распределение, что дало возможность вычисления диагностического значения ( Д ) по формуле: 1 Д = М + 3(о , где М - среднее значение оптической плотности в группе контрольных сывороток, а С - его среднее квадратическое отклонение. При исследовании 1200 контрольных сывороток установили прямолинейную зависимость <Г от М, что позволило вычислить диагностический коэффициент: 1,96 М + 0,06. |

Эмпирические диагностические значения ИФА, полученные в отдельных опытах, подтверждают возможность использования вычисленного коэффициента для расчёта диагностической границы ИФА на каждом планшете.

«

Приготовление контрольных образцов сывороток для лабораторных диагностических комплектов. Для стандартизации теста и использования его в практике была проведена отработка приготовления и применения контрольных сывороток: положительной, отрицательной и сыворотки с диагностическим количеством антител. Использование контролей на каждом планшете позволяет производить визуальную оценку результатов. Контрольные сыворотки использовали в разведении 1:100.

Стандарт отрицательной сыворотки ( К- ) готовили из смеси равных объёмов сывороток доноров из неэндемичной по клонорхозу местности (Москва);и доноров, не являющихся группой риска (медпер- | сонал больниц Хабаровска). Параллельно использовалась сыворотка человека нормальная, выпущенная Ставропольским НИВС.

Стандарт положительной контрольной сыворотки ( ) готовили из смеси равных объёмов сывороток крови больных с паразитологичес-

- 1.5 -

ки подтверждённым клонорхозом, а также использовалась нормальная сыворотка человека ( К+- ) в разведении, дающем результат, равный Для производственной комплектации тест-системы наиболее удобно и экономично использовать такой стандарт сыворотки К+.

Образец сыворотки с диагностическим количеством антител ( Д ) готовили из смеси нормальной сыворотки человека в разведении, дающем показатель ИФА, равный вычисленному диагностическому значению. ; Проведение учёта результатов реакции по образцу контрольной сыворотки с диагностическим количеством антител позволяет обеспечить надёжность визуального способа оценки ИФА и возможность стандартизации теста.

Чувствительность теста. Чувствительность реакции определи- •

лась на материале от больных клонорхозом, диагноз которых был под- ; твервдён паразитологически. Чувствительность реакции определялась

по Формуле Ч = х 100%, где а - число положительных результатов }

ИФА, в - число исследованных сывороток крови больных клонорхозом. ;

Из 37 сывороток крови стационарных больных краевой клинической больницы с клинико-эпидемиологически установленным диагнозом ;

7

кл^норхоза, подтверждённым паразитологическим исследованием кала |

и дуоденального содержимого, положительными в ИФА были 31, что 1

определило чувствительность теста 83,78%. |

При параллельном обследовании населения Нанайского района дву- |

мя методами (копроовоскопия и ИФА) была выделена группа больных |

( 61 человек^ для определения чувствительности иммуноФерментной |

реакции. При обследовании инвазированных в различных посёлках, |

чувствительность теста колебалась от 70,58% до 88,8%. Б целом [ в группе больных хроническим клонорхозом чувствительность теста составила 78,68%.

*

1 I

- 16 -

л

8 ранней (острой) стадии клонорхоза (12 наблюдений) определена 100% чувствительность теста, что соответствует литературным данным и исключает иной показатель при существующей методике Формирования выборки больных.

При определении чувствительности и специфичности иммунофер-ментного теста мы использовали диагностический критерий М + 3(? , обеспечивающий достоверность результатов с версятностью 99%.

-Специфичность теста. Для оценки эффективности иммунофермент ного анализа был определён показатель специфичности на сыворотках от здоровых лиц, больных различными гельминтозами и непаразитарными заболеваниями.

Контрольные группы, состоящие из здоровых людей, представлены донорами Москвы ( 1200 человек) и донорами Хабаровска ( 815 человек). Специфичность теста в обеих группах практически совпала ( 99,09% + 0,27 и 99,01% + 0,34 соответственно). Хотя г.Хабаровск находится ка эндемичной территории, риск заражения для обследованной группы населения чрезвычайно мал по сравнению с сельскими жителями. Это практически здоровые люди, не имеющие традиций сыроедения рыбы. В.среднем специфичность теста оказалась достаточно высока - 99,06% + 0,21.

Обследованы также группы контроля, составленные из больных непаразитарными заболеваниями ( таблица 1) и инвазированных различными возбудителями, за исключением больных клонорхозом (таблица 2).

В целом по группе сывороток от больных специфичность теста оказалась несколько ниже: 94,85% + 0,58. По всей вероятности, этс связано с особенностями формирования некоторых контрольных групп. Так, в противотуберкулёзный диспансер поступают больные со всего

Таблица 1

Специфичность ИФА для диагностики клонорхоза

Группы обследованных Количество исследованных сывороток Количество положительных результатов ИФА Специфичность ИФА ( % )

Здоровые (доноры) г.Москва 1200 II 99,09 + 0,27

Здоровые (доноры) г.Хабаровск 815 8 99,01 + 0,34

Больные непаразитарными 1 заболеваниями:

- стационар краевой больницы III 2 98,19 + 1,26

- противотуберкулёзная больница 679 21 96,90 + 0,66

- ЦРБ Нанайского района взрослые 181 20 88,96 + 2,30

дети 33 I 96,97 + 2,90

- ЦРБ Ульчского района 206 3 93,54 + 0,83

Хабаровского края, особенно многочисленны представители корен- ■■ ных народов Приамурья, с бытом которых неразрывно связаны тра- ?

I

диции сыроедения рыбы. Пациенты центральной районной больницы | Нанайского района с патологией гепатобилиарной системы также |

принадлежат к группе повышенного риска заражения клонорхозом, | хотя паразитологически инвазия исключена у всех обследуемых.

ч

При обследовании стационарных больных Ульчского района, на ! территории которого отсутствуют природные очаги клонорхоза, имму- {■', ноферментный тест показал специфичность 98,54% + 0,33.

Таблица 2

Результаты обследования методом ИФА с антигенами клонорхиса больных с различными гельминтозами

Инвазия

Количество обследованных

Количество сероположительн

абс.

%

Метагонимоз Описторхоз Нанофиетоз Трихинеллёз Энтеробиоз Трихоцефалёз Аскаридоз

Эхинококкоз гидатидоз! Эхинококкоз альвеолярный Дифиллоботриозы Цистицеркоз

90 0 -

68 35 52,9 + 6,0

ЬЬ 0 -

29 3 10,3 + 5,6

20 2 10,0 + 0,7

1 0 -

2 0 -

62 26 41,9 + 6,2

6 2 -

3 0 -

1 0 -

Процент перекрёстных реакций с сыворотками крови лиц с гас роэнтерологическими заболеваниями непаразитарной этиологии в це лом составил 4,89$ + 0,93, что свидетельствует о хорошей дифференцирующей способности теста.

Нами проведено исследование сывороток крови больных разли* ными гельминтозами на предмет перекрёстных реакций в ИФА с кло-норхоэным диагностикумом (таблица 2).

Перекрёстные реакции с описторхозом не влияют серьёзно на эффективность теста, поскольку очаги описторхоза и клонорхоза

- 1.9 -

разобщены территориально. Кроме того, можно рекомендовать параллельное испытание сывороток с описторхозным и клонорхозным диагно-стикумами. Различия в диагностических титрах двух реакций могут способствовать правильной постановке диагноза.

Перекрёстные реакции с метагонимозом и нанофиетозом отсутствовали.

Получен высокий процент перекрёстных реакций с гидатидозным эхинококковом (41,93% + 6,2), однако эффективность иммуноФермент-ного теста в диагностике клонорхоза не будет заметно снижена в связи с тем, что среди населения Хабаровского края эхинококкоз встречается относительно редко на территориях, неэндемичных по клонорхозу.

Таким образом, специфичность иммуноФерментного теста для регистрации антител к антигенам клонорхиса, определённая на различных группах здоровых и больных людей, колебалась от 47,1% до 100%, в среднем составляя 97,32% + 0,27.

Зависимость чувствительности И&А от яйцепродукции паразитами и интенсивности инвазии проследить не удалось из-за отсутствия статистически достоверных выборок.

Эпидемиологической особенностью клонорхоза б Приамурье является низкая интенсивность инвазии у населения, что подтвердили и наши исследования. У 93% инвазированных с единичными яйцами паразита в препарате по Като титры антител не превышали 1:800, тогда как все случаи заражения с интенсивностью инвазии свыше 100 яиц на I г фекалий имели высокие титры антител к антигенам клонорхиса ( 1:800 - 1:6400 ).

Нами проведено наблюдение за эффективностью лечения группы больных клонорхозом (18 человек). С помощью ИМ'у них определялся

уровень специфических антител к антигенам клонорхиса до и1через 12 месяцев после лечения азиноксом. Динамику падения титров антител после лечения пронаблюдать_не удалось, через год после лечения у всех иммуноферментный анализ дал отрицательный результат.

Различия в чувствительности теста на различных стадиях заболевания и-после лечения, а также зависимость от степени тяжести клинических проявлений, интенсивности яйцепродукции паразитами, характер изменения титров антител в ходе заболевания требуют дальнейшего изучения.

Опыт использования ИФА для диагностики клонорхоза в эндемичных районах Приамурья.

Анализ эпидемиологической ситуации по клонорхозу в Хабаровском крае был проведён достаточно скрупулёзно П.С.Посоховым (1984). Однако для выявления поражённых лиц использовались только методы овоскопии. Нами предпринят первый опыт использования ИФА в массовых обследованиях населения с целью определения его эффективности и информативности при диагностических и сероэпидемиологических • исследованиях. Апробацию теста проводили во время экспедиций 19911993 гг. в Нанайском районе Хабаровского края (сёла Найхин, Дада, Даерга, Джари, Верхний Нерген, Троицкое), в Хабаровском сельском районе (с.Улика-Национальная), в Уяьчском районе (сёла Тахта, Дуди, Богородское).

Населённые пункты в Нанайском и Хабаровском районах расположены вдоль основного русла р.Амур, где проживают преимущественно представители народностей Севера - нанайцы, среди которых широко распространено сыроедение .рыбы. Этот район Приамурья является самым северным участком нозоареала клонорхоза.

В Ульчском районе условии жизни и обычаи населения сходны с таковыми в Нанайском районе, оцнако риск инвазированин клонорхи-сами в этом районе практически отсутствует.

Поражённость клонорхозом населения Нанайского района, установленная с помощью иммуноферментного анализа, коррелировала с показателями копроовоскопии. При обследовании 843-х человек методом Като поражённость населения национальных посёлков составила 16,4% + 1,3, количество сероположительных лиц - 19,7% + 1,4 из 759 человек. Превышение показателя ИФА над результатом копроовоскопии объясняется, по нашему мнению, довыявлением случаев ранней стадии инвазии, когда паразиты ещё не достигли'репродуктивной активности, а также случаев недавнего заражения низкой интенсивности. Такое соотношение характерно для очагов описторхоза с низким уровнем эндемии (В.Д.Завойкин и соавт.,1989). Однако, учитывая, соотношение показателей ИФА и копроовоскопии для взрослого и детского населения раздельно и колебание общего числа инвазированных в пределах не ниже 20-30%, мы склонны отнести территорию Нанайского района к активным очагам среднего и высокого уровня эндемии. К такой оценке очага приводит анализ данных серологического обследования: превышение выявляемости инвазированных копроовоскопичес-ки по сравнению с количеством сероположительных среди взрослого населения ( 27,1% и 20,9% соответственно) и обратное соотношение этих же показателей у детей, среди которых выявлено 5,5% + 1,1 больных клонорхозом, а при исследовании сывороток на наличие антител к антигенам клонорхиса оказалось 16,5% + 2,6 сероположительных. Среди сероположительных детей при дальнейшем наблюдении были обнаружены яйца клонорхиса, что подтверждает предположение о выявлении с помощью ИФА ранней (острой) стадии заболевания.

В Нанайском районе был проведён опыт одновременного обследования 243-х человек двумя методами: копроовоскопический анали (количественная модификация метода Като) и иммуноферментная реа ция. Совпадения положительных и отрицательных результатов двух диагностических тестов достаточно высоки: разница мевду количес вом инвазирбванных клонорхисами лиц, выявленных путём паразитол гического анализа (25,5% + 2,7), и количеством сероположительны лиц среди обследованных (27,9^ + 2,8) недостоверна ( 1 = 0,61 )

Общая поражённость населения, определённая с использование; двух методов, составила 33,7% + 3,0, куда включены случаи инваз:

доказанные паразитологически, дающие как положительный, так и

\

отрицательный результат в ИМ, и случаи ранней стадии заболевания, выявленные на основании только данных ША.

Во всех посёлках Нанайского района мы наблюдали примерное соответствие результатов выявляемое™ каждым методом в отдельно! ти, причём суммарный показатель числа инвазированных неизменно превышает и ИФА, и метод Като в отдельности: в с.Найхин - на 5% в с.даерга - на 2-9%, в с.Дада - на 8-13%, в с.Джари - на 4-8%. Поэтому, с целью наиболее полного выявления больных клонорхозом при обследовании населения в очаге инвазии целесообразно использовать оба метода одновременно.

ВЫВОДЫ

I. Разработана иммуноферментная тест-система для определен! антител к антигенам клонорхиса, которая характеризуется высокой диагностической эффективностью: чувствительность МФА в острой • стадии клонорхоза составляет 100%, в хронической стадии - 84,04' специфичность по группе здоровых лиц - 99,06%, по группе больны:

непаразитарными заболеваниями - 96,12%.

2. Иммуноферментная тест-система может давать перекрёстные реакции с сыворотками больных описторхозом ( 52,9%_+ 6,0), эхинококковом гидатидозньш (41,9% + 6,2), трихинеллёзом (10,3% + 5,6) и эхинококкозом альвеолярным. С дальневосточными эндемичными трематодозами ( нансФиетозом и метагонимозом) перекрёстных реакций не наблюдается.

3. В острой стадии клонорхоза и в случаях недавнего заражения низкой интенсивности иммуноферменгаый анализ является единственным специфическим методом лабораторной диагностики инвазии.

В хронической стадии клонорхоза возможно содержание антител к антигенам клонорхиса ниже диагностического уровня, в связи с чем рекомендуем параллельное применение овоскспических и серологических методов.

4. Эпидемиологическая информативность иммуноферментного ани- ' лиза не уступает возможностям копроовоскопии при определении по-ражённости населения в очагах инвазии. Лоражённость населения Нанайского района клонорхозом, по данным копроовоскопии, составила 16,4% + 1,3, иммуноФерментный анализ дал положительный результат у 19,7% + 1,4 обследованных.

5. Поражённость населения Нанайского района, определённая двумя методами (копроовоскопическим и серологическим), составила 33,735 + 3,0, что превышает показатели, полученные каждым методом в отдельности.

6. Территорию Нанайского района можно отнести по данным >'.мму-ноферментного анализа к очагам среднего или высокого урозня эндемии на основании превышения выявляемости инвазированных копросво-скопически по сравнению с количеством сероположительных среди

взрослого населения {'¿7,1% и ¡¿0,9$ соответственно) и обратного со отношения этих показателей у детей (Ь,Ь% и 16,Ь% соответственно) при общей поражённости населения 20-30%.

7. Достаточно высокая диагностическая и эпидемиологическая информативность иммуноферментного теста на клонорхоз, а также преимущества его перед овоскопическими методами диагностики позво ляют рекомендовать ИФА для широкого использования в клинической и эпидемиологической практике в очагах заболевания.

Перспективы использования разработанной тест-системы для определения антител к антигенам клонорхиса

1. Необходимо организовать производство антигенного диагнос-тикума для иммунойерментной тЙст-системы, что обеспечит широкое использование её в очагах клонорхоза.

2. Необходимо организовать постоянный контроль за эпидситуа-цией на территории с высокой поражённостью населения клонорхозом с помощью массовых серологических обследований.

3. На территории с низким уровнем передачи инвазии (поражён-ность населения 1-2%) массовые паразитологические исследования вследствие их неэффективности могут быть заменены серологическими а в условиях клинических лабораторий дополнены ими.

4. Желательно установить паразитологический контроль за въез дом лиц из сопредельных стран, эндемичных по клонорхозу ( Китай, Корея, Япония, Вьетнам).

- гй -

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TIME ДИССЕРТАЦИИ

I. Баллад U.E., Гицу Г.А., Нроцкий Л.С., Семёнова Т.А.,

Иващенко Е.А., Кораблёв В.Н. Разработка иммуно^ерментного теста для диагностики клонорхоза и оценка его диагностической эффективности.// Тез. докл. Всес. науч. конф. Сумы, 9-II октября 1991г. Москва, 1991.- C.II-IÜ.

'¿. Семёнова Т.А., Баллад U.E., Посохов П.С., Кораблёв В.Н., Иващенко Е.А., Нроцкий Л.С. Иммуноферментный тест для диаг- . ностики клонорхоза и его использование в эндемичных районах Приамурья.// Мед. паразитология и параз. бол. 1993,— № <¿.— С. 8-10.

3. Семёнова Т.А., Посохов П.С., Баллад Н.Ё., Козырева Т.Г., Кораблёв В.Н., Иващенко Е.А. Опыт параллельного использования иммуноферментного анализа и копроовоскопии для оценки пора-жённости населения клонорхозом в Хабаровском крае.// Ыед.паразитология и параз. бол. ( сдана в печать ).

4. StEv-nova I.A., Jbaroütina I.а. , ßoto&cb V.V., posokhov P.S., Durntva V.K. Alternation oí' Immune Response in the Organism of native Fopulbtlon of Khabarovsk Region under endemic Trematodcses.//International J. Immunorehabilitation:Abstacts I.International Congress Immunorehabilitation, Sochi, Juli '7-10, 19^4,- N I.- supplement.- P. j>LI-Í>I¿-