Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и совершенствование тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для диагностики некробактериоза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и совершенствование тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для диагностики некробактериоза"

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

На правахрукописи

РОМАНЕНКО МИХАИЛ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА

03.00.23 - биотехнология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2004-4 19287

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

На правах рукописи

РОМАНЕНКО МИХАИЛ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА

03.00.23 - биотехнология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП)

Научный руководитель: доктор биологических наук Дмитрий Павлович Кузнецов

• Научный консультант: академик РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Олег Анатольевич Верховский;

доктор ветеринарных наук, заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации Николай Васильевич Мельник

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.

Защита состоится 16 января 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г.Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 15 декабря 2003г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

НОС. НАЦИОНАЛЫ«*! МЫИОТСКА

С1

о»

Ю.Д. Фролов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одно из центральных мест в инфекционной патологии крупного рогатого скота занимает некробактериоз. Некробактериоз -инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Это заболевание наносило и продолжает наносить значительный экономический ущерб.

Кроме того, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической ситуации по некробактериозу, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства.

Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни. Некробактериоз поражает все виды домашних и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека. Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом, третье по распространенности место после лейкоза и туберкулеза. Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50-70 тыс. оленей погибает 30-35% животных. Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот.

В.. настоящее время, для выявления и идентификации возбудителя некробактериоза применяют. серологические, биохимические,

микробиологические методы, а также постановку биопробы на лабораторных животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) с. успехом используют для; обнаружения микробных; антигенов в различных патологических материалах. Предложены и применяются несколько вариантов РИФ.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность, применяемых в настоящее время методов заставляет исследователей- обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых.высокочувствительных и специфичных методов диагностики - некробактериоза. В этой связи актуальным является внедрение методов диагностики на основе иммуноферментного анализа (ИФА). Основными достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность анализа соединений с различной молекулярной массой, строго инструментальный учет-результатов, что позволяет увеличить число проб, унифицировать - методы и реагенты, а также вести прямую обработку информации.

Таким образом, создание тест-систем для ускоренной диагностики некробактериоза на сегодняшний день является важной и актуальной задачей.

Целью настоящей работы являлась разработка диагностикумов на основе очищенного антигена F.necrophorum, определение белкового состава и изучение иммуногенных свойств его отдельных компонентов для использования их при-создании иммуноферментной, люминесцентной и гистохимической тест-систем для диагностики некробактериоза при определении уровня антител - в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах.

Решались следующие задачи:

1. Разработать метод получения.очищенного антигена..F.necrophorum и изучить белковый состав антигена F.necrophorum.

2. Изучить клеточный и гуморальный. иммунитет КРС при некробактериозе:

3. Выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС сыворотки на кроликах.

4. Выделить анти-F. necrophorum антитела из сывороток клинически больных животных.

5. Изготовить коньюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG КРС и коньюгаты анти-Е necrophorum IgG с ФИТЦ и ПХ:

6. Провести сравнительную оценку эффективности определения уровня amn-F.necrophorum антител и антигена F.necrophorum в патологическом материале традиционными методами и ИФА. '

7. Разработать тест-систему для диагностики некробактериоза при определении уровня антинекробактериозных антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна.- Разработан метод получения очищенного антигена F.necfophorum, определен белковый: состав F.necrophorum и изучены иммуногенные свойства его отдельных компонентов.

Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

Показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток.

б

Впервые в Российской Федерации разработана иммуноферментная, люминесцентная и гистохимическая тест-системы для диагностики некробактериоза КРС на основе очищенного антигена F.necrophorum.

Практическая значимость работы. Разработана иммуноферментная,

люминесцентная и гистохимическая тест-системы, предназначенные для диагностики некробактериоза КРС. Созданы «Набор- для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С», «Набор для иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» и «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л». Материалы.работы использованы при составлении научно-технической документации (НД) которая утверждается в установленном порядке. Наборы предназначаются для индикации антигенов F.necrophorum и количественного определения- анти-F.necrophorum антител в сыворотках крови КРС.

Внедрение в практику указанных наборов позволит проводить диагностику некробактериоза КРС в племенных и пользовательских хозяйствах при первых проявлениях клинических признаков, что будет способствовать оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности и продуктивности поголовья, улучшению качества продукции.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и положительно оценены на заседаниях Ученого Совета ВНИТИБП 2000-2003 г.

Результаты работы доложены на. XI Московском Международном Ветеринарном Конгрессе (Москва, 2003 г).

По материалам диссертации опубликовано 3 работы

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста и состоят; из следующих разделов: обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические- предложения.- Список литературы содержит 165 источников, из них; 100 зарубежных и 65 отечественных авторов. Работа иллюстрирована 21 рисунками, 10 таблицами. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Материалы и методы

Работа выполнена.в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП в.2000-2003 гг. в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой.

Бактериальная масса Fusobacterium necrophorum была получена с Щелковского биокомбината (производственный штамм F.necrophorum «O-1» (ВИЭВ)).

Бактериальную массу F.necrophorum дезинтегрировали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Реакцию торможения гемагглютинации проводили по методу Simon P.S. (1975) В реакции участвовали три компонента: иммунная сыворотка, антиген (испытуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты.

Электрофорез в ДСН - ПААГ проводили по методу Лаэмли.

«Вестерн» иммуноблоттинг и электроперенос, белков осуществляли по о методике Тоубина. (1984). Иммуноиндикацию белков на нитроцеллюлозных мембранах проводили непрямым методом ИФА.

Гипериммунные полиспецифические антисыворотки к IgG КРС получали, по методу, разработанному в лаборатории иммунологии и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП.

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки-КРС высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой- ионообменной хроматофафией на ДЕАЕ-Трисакрил-М.

Очистку анти-IgG КРС проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на ВгСп-Сефарозе 4В (Fluka) IgG KPC, по стандартной методике. Контроль чистоты препаратов IgG проводили с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном;геле (ПААГ) в слабощелочной; среде. Однородность и- специфичность препаратов: IgG. проверяли в иммуноэлектрофорезе (ИЭФ).

Для получения коньюгатов анти-IgG КРС с- пероксидазой; из хрена (RZ>3,0) использовали периодатный метод Nakane Р (1974). Рабочее разведение: коньюгата определяли согласно временной инструкции по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, утвержденной Главбиопромом Агропрома СССР в 1986 г. Реакцию учитывали на автоматическом спектрофотометре.

В работе использовали стандартные методы прямого- и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall (1971) и др., а также метод конкурентного ИФА по Van Weeman (1971) и др. Результаты анализа учитывали визуально или фотометрически через. 15- 30 минут после внесения субстратного раствора;.

Коньюгат aHmu-F.necrophorum IgG - ФИТЦ, а также анти-lgG-KPC -ФИТЦ получали по Coons A.H. (1950).

При изучении клеточного иммунитета кровь. лабораторных животных стабилизировали. 0,1% ЭДТА. Вьщеление лимфоцитов из крови животных проводили методом градиентного центрифугирования на Фиколле-400. Абсолютное количество лейкоцитов крови определяли в жидкости Тюрля в камере Горяева, относительное -визуально под световым микроскопом в мазках крови, окрашенных по Романовскому.

Для количественного определения- В-лимфоцитов; применяли, метод комплементсвязывающего (ЕАС РОК) розеткообразования,. Т-лимфоцитов -метод спонтанного (Е РОК) розеткообразования..

Количественное определение и оценку функциональной активности Т-лимфоцитов в крови и лимфоидных органах проводили с использованием реакции розеткообразования (Е-РОК), постановку и учет которой осуществляли по стандартным методикам (Караулов А.В.,1999) в нашей модификации.:

ELISPOT проводили по методу Sedgwick J.D. (1998). Результаты оценивали с помощью микроскопа (Х40).

2. Результаты исследований 2.1.Получение антигена

Бактериальную массу Fusobacterium necrophorum, полученную с. Щелковского биокомбината (производственный штамм F. necrophorum «0-1» (ВИЭВ)), ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 15 секунд импульсивно 6 раз. Затем разрушенную ультразвуком бактериальную массу Fusobacterium necrophorum вновь ресуспендировали в фосфатном буферном растворе и центрифугировали 30 мин при 5000 об/мин. Полученный супернатант фракционировали. методом; гель-фильтрации на хроматографической колонке К25/100 (Pharmacia) с Toyopearl 55 S. Получаемые

фракции, собирали с помощью коллектора фракций.. Измерение оптической плотности полученных фракций проводили на спектрофотометре СФ— 26 при длине волны 280 нм. Содержимое.надосадка.разделялось на два-выраженных пика,

С целью определения наиболее активных в иммунологическом отношении фракций была построена кривая отношения ОП450 нм (активность в ИФА) к ОП28о нм. Молекулярная масса белков, специфичных в ИФА, распределялась в диапазоне от 30 до 300 килодальтон.

Наиболее активные фракции были объединены, сконцентрированы ультрафильтрацией, предварительно очищены от низкомолекулярных продуктов на Сефадексе. G-25 и иммобилизованы на.BrCN Сефарозе. 4В по стандартной методике.

Сравнительное изучение полипептидных профилей) полученных фракций проводили с помощью электрофореза в 7,5% ПААГ с окрашиванием амидочерным. Фракции с наибольшей иммунной активностью в ИФА состояли из 13 полипептидов с молекулярными массами от 30 до 300 кДа.

Для определения полипептидной специфичности антител белки, разделенные электрофорезом в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозные мембраны, и исследовали с помощью иммуноблотинга с сывороткой - КРС, переболевшего некробактериозом, разведенной 1:50 (титр в ИФА 1:102400).

Результаты исследования белков методом иммуноблотинга показали, что антитела сыворотки переболевшего некробактериозом животного реагировали с большинством белков, присутствующих в объединенной фракции. Наиболее яркие полосы соответствовали полипептидам с м.м. 300,93,75 и 55 кДа..

2.2.Клеточный и гуморальный иммунитет КРС при некробактериозе

Одним из основных показателей оценки состояния'иммунной-системы является» определение количества и функциональных свойств

иммунекомпетентных клеток: Использование реакций розеткообразования (РОК) для выявления популяций лимфоцитов, а так же характеристика АСК дает возможность оценить потенциал иммунного ответа на инфицирование организма-Г.песгоркогыт.

До настоящего времени количественную оценку Т- и В-субпопуляций лимфоцитов проводят в основном методом розеткообразования. Каждая реакция РОК типирует определенные. субпопуляции лимфоцитов: спонтанные (Е) - Т-лимфоциты, так как они имеют рецептор на своей поверхности к определенным-эритроцитам, комплементзависимые (ЕАС) - В-лимфоциты с рецептором к. СЗ компоненту комплемента..

Сравнительно недавно введенный в практику, метод точечного иммуноферментного.анализа ЕЬКРОТ в настоящее время широко применяется при исследованиях в области иммунологии. ЕЬКРОТ основан на обнаружении и подсчете АСК, сорбированных- на нитроцеллюлозной мембране, выстилающей дно- 96-луночной микропанели. Данный метод предоставляет возможность выявлять единичные антителосекретирующие В-лимфоциты.

Для изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе использовали опытную (п=6) и контрольную (п=6) группы телят. Предварительно все животные были проверены на отсутствие антител к Г.песгоркогыт. Телятам опытной группы вводили некробактериозную вакцину производства ГЩБК (Щёлковский биокомбинат) согласно наставлению. Контрольной. группе животных вводили неполный адьювант Фрейнда. Кровь брали на 1,3,5,7,9,11 и 14 день после введения вакцины.

Проведенные исследования показали наличие в крови как опытных, так.и контрольных телят ^-секретирующих клеток. В крови контрольных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества-спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК клеток на 7 сутки. Полученные данные

свидетельствуют о том,.что динамика образования спонтанных Е-лимфоцитов совпадала с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

2.3.Разработка иммунофлуоресцентной тест-системы для определения-¥.пвсгоркотит в патматериале

Для детекции Г.нвстркогит в патматериале в реакции иммунофлуоресценциич (РИФ), необходимо было создать тест систему, основными* компонентами которой являются:. коньюгатанти-/\А?есгорЛогмлг-ФИТЦ (для прямого метода), коньюгат антикв КРС - ФИТЦ и анти-Г.нвсгоркогит IgG КРО (для непрямого метода).

Патматериал, полученный - от больных и подозрительных животных различных, хозяйств, был использован для сравнительной оценки прямого и непрямого РИФ. Результаты, полученные в РИФ, сравнивали с результатами в РТГА. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех трех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах РИФ, остальные были положительными во всех трех реакциях.

Таблица 1.

Сравнительная оценка чувствительности РТГА и РИФ при обнаружении Г.нвсгоркогит в патматериале. (п=6)

РТГА* Кол-во образцов Прямой. РИФ Кол-во образцов Непрямой РИФ Кол-во образцов

64-128 14 ++++ 13 +-И-+ 13

32-64 66 +++ 66 +++ 66

2-16 38 ++ 39 ++ 39

4 + 4 • + • 4

-• 8 - 8 8

*- представлены значения, обратные титрам в РТГА

Оба варианта РИФ не уступают по чувствительности такому надежному методу- какРТГА. Неоспоримым преимуществом РИФ «являются простота, и высокая. скорость. постановки реакции. Метод технически не сложен, хотя и требует определенных навыков в интерпретации результата.

2.4.Разработка тест-системы для индикации антител к F.necrophorum в сыворотке КРС

Для детекции антител к F.necrophonim в сыворотке крови. КРС в ИФА необходимо было разработать тест-систему, основными компонентами которой являются антиген, специфическая (из неблагополучных по некробактериозу КРС хозяйств); ати-КпесгорИогит сыворотка,, отрицательная (контрольная) сыворотка и коньюгат анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена.

В качестве фермента для маркирования антител использовали пероксидазу из хрена (ПХ),. марки А, - 2,9 - 3,1. Рабочая.концентрация. полученного иммунопероксидазного коньюгата составила 200 нг/мл (в расчете на ПХ). При данном разведении величина в реакции с положительным антигеном

составила 1,48, с отрицательным - 0,02 оптические единицы.

С целью, оптимизации; процесса постановки реакции, для увеличения. точности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, были подобраны концентрации используемых реагентов. Для определения концентрации антигена при постановке. ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:200.

Оптимальное разведение антигена составило 1:400, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности ( равен. 1,3 - 1,5) и достоверное

различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.

Для определения пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины продукта реакции от разведения сыворотки. Опыт

проводили при рабочей концентрации сорбированного антигена ЕместорЫгыт. Двукратные разведения положительной сыворотки начинали с разведения 1:100. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чемв 2 раза) наблюдалось при разведении специфической:и контрольной сывороток с 1:200. При разведении ниже 1:200 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции.

Таким образом, была определена концентрация антигена В.пвегорЫгыт и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для диагностики некробактериоза КРС иммуноферментным методом.

2.5.Сравнительная оценка чувствительности ИФА для детекции антител в сыворотке больных животных с другими методами исследования

Методом ИФА и РПГА было исследовано* 145 сывороток: КРС, полученных из различных хозяйств:

Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РПГА. 35 сывороток отрицательных в РПГА соответствовали титру 1:400 в ИФА. Обе методики позволяют, исследовать большое, количество сывороток. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем РПГА.

Таким образом, при сравнительной. оценке; уровня ати-¥.песгорЫгыт антител,"полученных методами РПГА и ИФА; установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокую степень соответствия с результатами РПГА. Метод чувствителен, быстр в исполнении и может быть использован, при определении уровня анты-¥.песгорЫгытг антител при обследовании большого количества животных.

Сравнительная оценка титров антинекробактериозных антител в ИФА и РПГА

Активность в РПГА* Кол-во «-» сывороток Кол-во «+» сывороток Титры в ИФА* Кол-во «+» сывороток

35 - ■ 400 35

2-4 - 7 400-800 7

4-8 > - 34' 800-1600 34

8-16 - 56 1600-3200 56

32-64 - 10 3200-6400 10

128-256 - 3 12800-25600 3

* - представлены значения, обратные титрам в РТГА и ИФА:

2.6.Определение диагностического титра антител в ИФА

Для определения диагностического титра антител исследовали сыворотки КРС, распределенных по пяти группам. Исследования сывороток проводили. каждую неделю в течение месяца (четырехкратно), с одновременным контролем, клинических признаков некробактериоза: их лабораторным подтверждением диагноза. В ходе опыта животные не получали никакого лечения.

На. основании полученных данных, результаты которых приведены в таблице 3, нами-был выявлен диагностический титр антинекробактериозных антител. Диагноз на заболевание животных некробактериозом считается, подтвержденным, в случае если титр исследуемых сывороток в ИФА: 1:800 и выше. Сомнительными считаются пробы, титр которых в ИФА. лежит в диапазоне от 1:400 до 1:800. В этом случае диагноз может быть подтвержден, если при исследовании сывороток, отобранных с интервалом: 14-21 сут после первого исследования, отмечается увеличение:титра антинекробактериозных антител на 2 и более разведения от диагностического титра.

Определение диагностического титра антинекробактериозных антител в сыворотке больных животных

Труп 0 нед. 1 нед. 2. нед 3 нед. 4 нед. ' • |

■ ПЫ (п=6) Титр в-ИФА* Клин, проявлс ни* - Титр к ИФА» Клнн. проявлс НИ я Титр в • ИФА*' Клим, ггроявл ения Титр в ИФА* Клнн. прояя лския Титр в ■ ИФА* Клин П ром 8.1 сния

] 200400 - 200.400 - 200-400 200-400 - 200-400 -

2 8001600- - ■ 32006400 - 640012800' 1 1280025600 3 1280052000 5

3 32006400 - 640012800 . 1280025600.' 2 1280052000- 4 2560052000 6

4 1280025600 2 2560052000 5' 2560052000' 5 52000104000" 6 52000104000 6

5 52000104000 6 52000104000 6 52000208000' 6 104000208000 • 6 104000208000 6

* - представлены значения, обратные титрам в ИФА; «-»отсутствие, клинических признаков некробактериоза.

2.7.Тест-система для индикации антигенов В.пвсгорИогит в патматериапе. и гнойно-некротических поражениях КРС

Для выявления типоспецифичных- антигенов В.пвсгорИогит в патматериале и гнойно-некротических поражениях необходимо было разработать тест систему, основными компонентами которой-являются анти Ж.пвсгоркогит IgG, коньюгат анти IgG КРС-ПХ, коньюгат анти В.пвсгорИогит ^О-ПХ.

Приготовление сорбента для аффинной хроматографии на основе очищенного видоспецифичного антигена В.пвсгорИогит проводили по стандартной методике, предварительно очистив антигенную фракцию от низкомолекулярных продуктов на 8ерИяёех О-25.

Коньюгат анти-F.necrophorыm - ПХ получали по стандартной методике.

Далее была определена концентрация «первых» антител, при которой антитела покрывали бы максимально возможную часть поверхности лунки при сорбировании.- Последовательные двойные разведения «первых» антител начиная с 1:100 были нанесены в лунки миропланшет в 0,01 М карбонатном буфере рН 8,0 (сорбционный-буфер). После часовой инкубации при +37°С и стандартной процедуры- отмывки- в лунки добавляли анти-КРС иммунопероксидазный коньюгат в рабочем- разведении и после часовой: инкубации при +37°С проявляли реакцию. Последнее разведение антител подложки, после которого начинает падать оптическая плотность, соответствует, их концентрации - ЗООнг/мл и, соответственно, их оптимальному количеству-(ЗОнг) на лунку.

Для детекции некробактериозных антигенов первые антитела сорбировали в определенной, как описано выше, рабочей концентрации на микропланшеты в сорбционном буфере и после часовой; инкубации при +37°С и стандартной процедуры отмывки в лунки добавляли.последовательные двойные разведения некробактериозной массы в ЗФР-Т и нормальной (предварительно протестированной на отсутствие антител к, F.necrophorыm) сывороткой КРС, содержащей 0,1% Твина-20, в качестве модели баксодержашей суспензии. После часовой инкубации и отмывки добавляли анти^.песюрЫгыт сыворотку КРС в разведении 1:200 в ЗФР-Т, инкубировали в течение часа при +37°С, отмывали и добавляли анти-^О КРС иммунопероксидазный коньюгат.

Таким образом былиг получены все необходимые компоненты тест-системы для детекции антигенов F.necrophorыm методом ИФА и создания на ее основе набора для иммуноферментной индикации F.necrophorыm.

Сравнительная оценка чувствительности РТГА, конкурентного и «сэндвич» ИФА при обнаружении ¥.пеегоркогыт в патматериале..

РТГА Кол-во. образцо в Кол-во ' + образцо в Конкурент ный ИФА Кол-во + образцов; «Сэндвич» ИФА Кол-во + образцов

- 12 - 12 - 12

- 44 - 32-64 44 32-64 44

4-8 29 64-128 29 64-128' 29

16-32 - 31 128-256 31 128-256 31

32-64 - 33' 256-512 33 256-512. 33

64-128 - 15 512-1024 15 512-1024 15

*- представлены значения обратные титрам в ИФА и РТГА

Патматериал, полученный от больных и подозрительных животных различных хозяйств, был использован для сравнительной оценки.конкурентного и «сэндвич» — вариантов ИФА..

Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РТГА. Из 130 образцов патматериала 12 образцов оказались отрицательными во всех трех реакциях, 44 образца отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах ИФА, остальные были положительными во всех трех реакциях.

2.8.Тест-система для гистохимической индикации антигенов ¥.пеегоркогыт в патматериале;

Для выявления типоспецифичных антигенов В.пеегорИогыт в патматериале и гнойно-некротических поражениях, был разработан гистохимический вариант ИФА, основными компонентом которого был

коньюгат анти F.necrophorumlgG-UX. Для проявления реакции использовалась, субстратная смесь, образующая нерастворимый окрашенный.продукт: раствор тетрагидрохлорида 3,3 диаминобензидина рН 7,6, содержащий 0,01% НгО2

На чистые предметные стекла.наносили мазки из пораженных областей. Мазки фиксировали метиловым или этиловым спиртом 15 минут, после чего трехкратно промывали ФБР с 0,01% Triton X 350. Затем наносили коньюгат aumu-F.necrophorum IgG-ПХ в рабочей концентрации в ФБР с 0,01% Triton X 350. После часовой инкубации при +370С мазок трехкратно отмывали и вносили субстратную смесь. Инкубировали 5-10 мин при комнатной температуре. Окрашивание останавливали промыванием образца бидистиллированной водой. Учет реакции проводили под световым микроскопом при увеличении X 40.

Таблица 5

Сравнительная оценка чувствительности гистохимического ИФА, РТГА и РИФ при обнаружении F.necrophorum в патматериале. (п=6)

Результаты- детекции антигенов F.necrophorum, полученные, в гистохимическом варианте ИФА, сравнивали с результатами РТГА, непрямого и прямого вариантов РИФ; Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех четырех реакциях, 4 образца - отрицательными в РТГА

и положительными в двух;вариантах.РИФ и гистохимическом варианте ИФА, остальные были положительными во всех четырех сравниваемых реакциях.

ВЫВОДЫ

1. Отработан метод получения очищенного антигена F.necrophorыm. С помощью электрофореза в ПААГ в составе антигена определена молекулярная-масса белков в диапазоне от 30 до 300 КД, специфичных в ИФА.

2..Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

3. Показана возможность выделения; антинекробактериозных. антител из сыворотки. переболевших животных с помощью аффинной хроматографии - на нерастворимой фракции бактериальных клеток.

4. Получены анти-^О КРС сыворотки на кроликах с титром в РДП 1:32 -1:256. Синтезированы- высокоактивные коньюгаты. анти-^О КРС с ФИТЦ (1:1000 в непрямой РИФ) и ПХ (1:20000 в непрямом твердофазном ИФА).

5. Показано, что разработанная тест-система характеризуется специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью, результатов. Установлена явная корреляционная зависимость методов РТГА и РИФ при обнаружении антигена F.necrophorыm в гнойно-некротических поражениях КРС, ИФА и РПГА при количественном определении содержания антител к F.necrophorыm. Выявлено, что метод ИФА при определении антигена F.necrophorыm, превосходит по чувствительности РТГА.

6. Технология получения реагентов и методика проведения ИФА положены в основу разработанной, тест-системы и созданы: «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для

серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А»;

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..

В практику предложены иммуноферментная, люминесцентная: и гистохимическая тест-системы для обнаружения антител и антигенов к Ж.пеегоркогыт в сыворотках: КРС. Методы может быть рекомендованы. для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики некробактериоза..

Материалы работы использованы при составлении нормативной документации на «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для серологической - иммуноферментной: диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» (ТУ, Инструкция и Наставление)

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. М.Н.Романенко, В.В.Меньшенин, И.И.Кочиш, Д.П.Кузнецов -Разработка тест-систем для детекции антигенов Fыsobacteriыm пеегоркогыт в гнойно-некротических очагах больных животных с помощью ИФАУ/ Мат. XI. Московского международ, ветер, конгресса, Москва, 2003 г, с.250-252.

2. М.Н.Романенко, В.В.Меньшенин, И.И.Кочиш, Д.П.Кузнецов -Использование реакции иммунофлуоресценции (РИФ) для детекции антигенов Fыsobacteriыm песгоркогытЛ Мат. XI Московского международ, ветер, конгресса, Москва, 2003 г, с.252-253

3. М.Н.Романенко, В.В.Меньшенин, И.И.Кочиш, Д.П.Кузнецов - Очистка и получение специфических антител к. антигенам Fыsobacteriыm песгоркогытЛ Мат. XI Московского международ, ветер, конгресса, Москва, 2003 г, с.253-255.

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. № 79G тир. 1GG

РНБ Русский фонд

2004-4 19287

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романенко, Михаил Николаевич

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Некробактериоз

2.2. Характеристика возбудителя

2.2.1. Историческая справка, таксономическое положение

2.2.2. Морфология, тинкториальные свойства, метаболическая активность

2.2.3. Патологоанатомические изменения

2.3. Биохимическая характеристика возбудителя

2.3.1. Гемолизин

2.3.2. Липополисахаридный эндотоксин (ЛПС)

2.3.3. Лейкотоксин

2.4. Профилактика и меры борьбы

2.4.1. Чувствительность к антибиотикам

2.4.2. Специфическая профилактика

2.5. Диагностика

2.5.1. Иммуноферментный метод для диагностики некробактериоза крупного рогатого скота

2.5.2. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

2.5.3.Гистохимический вариант ИФА

2.6. Исследование клеточного иммунитета

2.6.1. Роль клеточного и гуморального иммунитета при бактериальных инфекциях

2.6.2. ELISPOT-метод

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и совершенствование тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для диагностики некробактериоза"

2.2. Актуальность темы

Одно из центральных мест в инфекционной патологии крупного рогатого скота занимает некробактериоз. Некробактериоз - инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Это заболевание наносило и продолжает наносить значительный экономический ущерб.

Кроме того, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической ситуации по некробактериозу, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства.

Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни. Некробактериоз поражает все виды домашних и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека. Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом третье по распространенности место после лейкоза и туберкулеза. Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50-70 тыс. оленей погибает 30-35% животных. Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот.

В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя некробактериоза применяют серологические, биохимические, микробиологические методы, а также постановку биопробы на лабораторных животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) с успехом используют для обнаружения микробных антигенов в различных патологических материалах. Предложены и применяются несколько вариантов РИФ.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность, применяемых в настоящее время методов, заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики некробактериоза. В этой связи актуальным является внедрение методов диагностики на основе иммуноферментного анализа (ИФА). Основными достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность анализа соединений с различной молекулярной массой, строго инструментальный учет результатов, что позволяет увеличить число проб, унифицировать методы и реагенты, а также вести прямую обработку информации.

Таким образом, создание тест-систем для ускоренной диагностики некробактериоза на сегодняшний день является важной и актуальной задачей.

1.2. Целью настоящей работы являлась разработка диагностикумов на основе очищенного антигена F.necrophorum, определение белкового состава и изучение иммуногенных свойств его отдельных компонентов для использования их при создании иммуноферментной и люминесцентной тест-систем для диагностики некробактериоза при определении уровня антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах.

Решались следующие задачи*.

1.2.1. разработать метод получения очищенного антигена F.necrophorum и изучить белковый состав антигена F.necrophorum',

1.2.2. изучить клеточный и гуморальный иммунитет КРС при некробактериозе;

1.2.3. выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС сыворотки на кроликах;

1.2.4. выделить awm-F.necrophorum антитела из сывороток клинически больных животных;

1.2.5. изготовить коньюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG КРС и кролика, коньюгаты анти F.necrophorum IgG с ФИТЦ и ПХ;

1.2.6. провести сравнительную оценку эффективности определения уровня аши-F.necrophorum антител и антигена F.necrophorum в патологическом материале традиционными методами и ИФА;

1.2.7. разработать тест-систему для диагностики некробактериоза при определении уровня антинекробактериозных антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах методом иммуноферментного анализа.

1.3. Научная новизна.

- разработан метод получения очищенного антигена F.necrophorum',

- определен белковый состав F.necrophorum и изучены иммуногенные свойства его отдельных компонентов;

- установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК;

- показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток;

- впервые в Российской Федерации разработана иммуноферментная тест-система для диагностики некробактериоза КРС на основе очищенного антигена F.necrophorum.

1.4. Практическая значимость работы

Разработана иммуноферментная, люминесцентная и гистохимическая тест-системы, предназначенные для диагностики некробактериоза КРС.

Созданы «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С», «Набор для иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» и «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л». Материалы работы использованы при составлении научно-технической документации (НД) которая утверждается в установленном порядке. Наборы предназначается для индикации антигенов F.necrophorum и количественного определения анти- F.necrophorum антител в сыворотках крови КРС.

Внедрение в практику указанных наборов позволит проводить диагностику некробактериоза КРС в племенных и пользовательских хозяйствах при первых проявлениях клинических признаков, что будет способствовать оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности и продуктивности поголовья, улучшению качества продукции.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

1.5.1. результаты разработки оптимальных условий очистки антигена F.necrophorum;

1.5.2. результаты исследования белкового состава антигена F.necrophorum',

1.5.3. результаты испытания антигенов F.necrophorum, полученных на базе очищенных препаратов, в качестве компонентов в серологических реакциях (РТГА и ИФА);

1.5.4. результаты исследования напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе КРС;

1.5.5. результаты разработки тест — системы ИФА для определения уровня анти- F.necrophorum антител в сыворотках вакцинированных, больных и переболевших животных и проведения сравнительной оценки определения уровня антител в РТГА и ИФА;

1.5.6. результаты разработки тест — системы ИФА для детекции антигенов F.necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;

1.5.7. результаты разработки люминесцентной тест — системы для детекции антигенов F.necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;

1.5.8. результаты испытания и промышленного изготовления наборов для иммуноферментной и люминесцентной диагностики некробактериоза КРС.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Некробактериоз

Некробактериоз - инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных на мясо, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни.

Некробактериоз поражает все виды домашних (72) и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека (114, 86, 148, 126). Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16 % мелкого рогатого скота, занимая, таким образом, третье по распространённости место после лейкоза и туберкулёза (57, 35, 53). Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50 — 70 тыс. оленей погибает 30 - 35% животных (21). Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот. Даже, несмотря на то, что поголовье скота за последние годы резко сократилось, заболеваемость не только не имеет тенденции к снижению, но и даже несколько возросла (57).

Основным источником каждой вновь начинающейся эпизоотии среди крупного рогатого скота в первую очередь следует считать здоровых животных микробоносителей, а не больных, которые присоединяются позднее, так как бактерия представляет собой нормального обитателя пищеварительного тракта. Заселение желудочно - кишечного тракта

F.necrophorum происходит в первые дни жизни. Поэтому по месту обитания возбудителя некробактериоз следует отнести к факторным инфекциям (50).

В основном некробактериоз не заносится в хозяйство с больными животными, а возникает при появлении соответствующих условий, ведущих к нарушению существующего биологического равновесия между микро- и макроорганизмом. Нарушение рубцового пищеварения, вследствие дефицита микроэлементов и витаминов, влекущее за собой нарушение обменных процессов и снижение естественной резистентности организма, сырость в помещениях и недостаточно качественная очистка стойл, создающая агрессивную среду и ведущая к размягчению копытного рога и мацерации кожи, травмирование тканей разного рода колющими и режущими предметами - все это является предпосылкой для вспышки заболевания (50, 12). Следствием многообразия клинических форм болезни и полиморфностью возбудителя стало сравнительно недавнее присвоение некробактериозу статуса самостоятельной нозологической единицы. В 1932 году А. Г. Ревнивых своими опытами на северных оленях доказал, что возбудителем заболевания является F.necrophorum (42), хотя установлено, что в этиологии некробактериоза помимо основного возбудителя огромную роль играет гнойно-некротическая микрофлора: Clostridium petfringens, Staphilococcus aureus, Corynebacterium pyogenes и др. Микробные ассоциации своими ферментативными системами усиливают действие основного возбудителя, тем самым существенно повышая его вирулентность (54, 138).

У животных F.necrophorum вызывает абсцессы внутренних органов, аборты, копытную гниль, некротический ларингит (дифтерия телят) и другие поражения (123, 137). У человека некробактериоз клинически проявляется некротическим тонзиллитом, септицемией, стоматитом, периодонтитом, абсцессами печени и внутренних органов, эндокардитами (125, 131, 144, 46,

71,74).

Возможные факторы патогенности F.necrophorum - лейкотоксин, липополисахаридный эндотоксин, гемолизин, гемагглютинин, ферменты (ДНКазы, лецитиназа, фосфатидаза, коллагеназа, фибринолизин, стрептокиназа, декарбоксилаза, щелочная фосфатаза, липаза) (159, 67).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Романенко, Михаил Николаевич

Результаты исследования белков методом иммуноблотинга показали, что антитела сыворотки переболевшего некробактериозом животного реагировали с большинством белков, присутствующих в объединенной фракции. Наиболее яркие полосы соответствовали полипептидам с м.м. 300, 93, 75 55 кДа.

Из практики иммуноферментного анализа известно, что внесение в систему ИФА лишь одного элемента — сыворотки крови - создает столько проблем, сколько их может не встретится в разработке метода в целом. Антитела в ИФА используют в виде высокоактивных гипериммунных сывороток. Для сорбции на твёрдую фазу используют IgG - фракцию, выделенную из иммунной сыворотки. Методы выделения иммуноглобулинов, применяемые в разных лабораториях, различны. Используя накопленный опыт различных исследователей и применив отдельные этапы их разработок, мы, комбинацией ряда иммунохимических методов получили чистые и высокоактивные препараты иммуноглобулина КРС класса G с тем же или несколько более высоким титром преципитирующей активности.

Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) проводили методом аффинной хроматографии. Объем наносимой на колонку антисыворотки зависел от ее титра в РДП: чем ниже титр, тем больший объем наносили. Так, при титре 1:64 наносили 8 мл, 1:32 — 16 мл, 1:8 — 32 мл, соответственно.

Чувствительность и воспроизводимость ИФА во многом зависит от качества используемых коньюгатов. Для конъюгации ферментов с антителами или антигенами используют чаще всего глутаровый альдегид или перийодат натрия. Мы в своей работе исплдьзовали для получения коньюгатов пероксидазу из хрена (ПХ), марки A, RZ - 2,8 - 2,9. В результате был получен высокоспецифичный, стабильный коньюгат, сохраняющий свою активность после лиофильного высушивания.

Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РПГА. 35 сывороток отрицательных в РПГА (т.е. 24,1%) были положительны в ИФА. Обе методики быстры и позволяют исследовать большое количество сывороток. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем РПГА.

Таким образом, при сравнительной оценке уровня анти -F.necrophorum антител, полученных различными методами РПГА и ИФА, установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокую степень соответствия с результатами РПГА. Метод чувствителен, быстр в исполнении и может быть использован при определении уровня анти-F.necrophorum антител при обследовании большого количества животных.

Анти-F.necrophorum IgG получали с помощью аффинной хроматографии. Приготовление сорбента на основе очищенного видоспецифичного антигена F.necrophorum проводили по стандартной методике, предварительно очистив антигенную фракцию от низкомолекулярных продуктов на Sephadex G-25.

С иммуносорбента элюировалось 6-7 мг антигена, сорбировалось, соответственно, 37-43 мг, что составляет 74-86 % от исходного. Объем сорбента был равен 12 мл, в 1 мл геля иммобилизовано 3,5 - 3,7 видоспецифичного антигена F.necrophorum.

На колонку наносили сыворотку, содержащую антитела к F.necrophorum с титром в ИФА не менее чем 1:12800.

Специфичность и активность полученных иммуноглобулинов была проверена в тест-системе для определения анти-F.necrophorum

Для сравнительной оценки конкурентного и «сэндвич» — вариантов ИФА был использован патматериал, полученный от больных и подозрительных животных различных хозяйств.

Явным преимуществом методов ИФА оказалась более высокая чувствительность, чем РТГА. Однако, при общей высокой чувствительности сэндвич»-вариант ИФА был более прост и быстр в исполнении чем конкурентный.

Результаты детекции антигенов F.necrophorum, полученные в гистохимическом варианте ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РТГА, непрямом и прямом вариантах РИФ. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех четырех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах МФА и гистохимическом варианте ИФА, остальные были положительными во всех четырех сравниваемых реакциях. Таким образом, гистохимический вариант ИФА не уступает по чувствительности и воспроизводимости прямому и непрямому варианту РИФ и такому надежному методу как РТГА. Неоспоримым преимуществом гистохимического варианта ИФА являются простота и доступность для ветеринарных лабораторий не оснащенных оборудованием для люминесцентной микроскопии. Предложенная схема постановки ИФА может быть использована как в практических, так и в научных целях.

Одним из перспективных направлений в плане совершенствования флуоресцирующих диагностикумов является получение фракции антител, используемых для метки, с максимальным содержанием специфических антител. Преимуществом РИФ является ее специфичность, высокая чувствительность, определение искомого антигена среди других смешанных антигенов, получение быстрого результата, выявление как живых, так и мертвых микроорганизмов и их антигенов, простота выполнения.

Первым этапом создания люминесцентной тест-системы для определения F.necrophorum в патматериале было получение коньюгата анти-F.necrophorum IgG - ФИТЦ и коньюгата анти-IgG КРС IgG - ФИТЦ.

Результаты, полученные при проверке работы иммунофлюоресцентной тест-системы, сравнивали с результатами в РТГА. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех трех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах РИФ, остальные были положительными во всех трех реакциях.

Таким образом, оба варианта РИФ не уступают по чувствительности такому надежному методу как РТГА. Неоспоримым преимуществом РИФ являются простота и высокая скорость постановки реакции. Метод технически не сложен, хотя и требует определенных навыков в интерпретации результата.

Для изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе использовали опытную (п=6) и контрольную (п=6) группы телят. Предварительно все животные были проверены на отсутствие антител к F.necrophorum. Телятам опытной группы вводили некробактериозную вакцину производства ГЩБК (Щёлковский биокомбинат) согласно наставлению. Контрольной группе животных вводили неполный адьювант Фрейнда. Кровь брали на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 14 день после введения вакцины.

В результате изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе, установлено, что в крови контрольных животных наблюдается увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК клеток на 7 сутки. Полученные данные свидетельствуют о том, что динамика образования спонтанных Е-лимфоцитов совпадала с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

6.1. Отработан метод получения очищенного антигена F.necrophorum. С помощью электрофореза в ПААГ в составе антигена определена молекулярная масса белков в диапазоне от 30 до 300 КД, специфичных в ИФА.

6.2. Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

6.3. Показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток.

6.4. Получены анти-IgG КРС сыворотки на кроликах с титром в РДП 1:32 - 1:256. Синтезированы высокоактивные коньюгаты анти-IgG КРС с ФИТЦ (1:1000 в непрямой РИФ) и ПХ (1:20000 в непрямом твердофазном ИФА).

6.5. Показано, что разработанная тест-система характеризуется специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью результатов. Установлена явная корреляционная зависимость методов РТГА и РИФ при обнаружении антигена F.necrophorum в гнойно-некротических поражениях КРС, ИФА и РПГА при количественном определении содержания антител к F.necrophorum. Выявлено, что метод ИФА при определении антигена F.necrophorum, превосходит по чувствительности РТГА.

6.6. Технология получения реагентов и методика проведения ИФА положены в основу разработанной тест-системы и созданы «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А»;

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В практику предложены тест-системы для обнаружения антител и антигенов к F.necrophorum в сыворотках КРС методом иммуноферментного анализа. Метод может быть рекомендован для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики некробактериоза.

Материалы работы использованы при составлении нормативной документации на «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-JI», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» (ТУ, Инструкция и Наставление)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романенко, Михаил Николаевич, Шелково

1. Абдугалиев Ж.Д. /Опыт лечения некробактериоза КРС. /Проблемы развития животноводства и кормопроизводства Северного Казахстана в современных условиях. Петропавловск, 1992, с. 64-65;

2. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. /Иммуноферментный анализ /Ветеринария, 1981, 8, 33-35;

3. Балабанов В.А. /Некробактериоз животных., М., 1971;

4. Бережнов М.Н. /Хирургическое лечение некробациллеза оленей. /Магаданский оленевод , вып. 14, 1965;

5. Бондарько Д.Н. /Болезни копытец у крупного рогатого скота в животноводческих комплексах. /Диагностика и профилактика болезней животных в молочных комплексах. Омск, 1980, 51-59;

6. Бондарько Д.Н., Циро А.И. /Клинико-бактериологические исследования и лечение окситетрациклином при некробактериозе пальцев у крупного рогатого скота/Науч. тр. Омского ветеринарного института. 1967, вып. 1,т.25, с. 138-148;

7. Босхомоджиева Е.Д. /Гипериммунная сыворотка против некробактериоза КРС. Автореферат канд. Диссертации , М. 1994;

8. Бывкова Н.Н., Лукина В.А., Бойко А.А. /Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов). /Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности, 1985, т.9, с. 8-11;

9. Волкова А.А., Галиев P.P., Овчаренко В.И. /Некробациллез овец. Фрунзе, 1965;

10. Гарбарец Б.А. /Биохимическая лабораторная техника. Киев. Здоровье, 1983, с. 200;

11. Демкин Т.П., Баренов В.Н., Александров В.М. /Некробактериоз свиней. Межвузовский сборник, часть 2, Саратов, 1990;

12. Дженсен Р., Маккей Д. /Болезни крупного рогатого скота при промышленном откорме. М.: Колос, 1977;

13. Джутгина С.И. Некробактериоз инфекция факторная /Ветеринария 1999, №2, с. 9-11;

14. Забородин В.А., Лайшев А.Х. /Болезни северных оленей. М., Колос, 1980;

15. Захаров В.И. /Лечение и профилактика заболеваний копыт у коров в условиях привязного содержания. Материалы в помощь с-х16,17.18,19,20,21,22,23,24,25,2627,28

16. Игнатьев A.M., Мони Ю.В., Бабикова Р.А., Петрова И.А. /Использование метода иммунофлуоресценции при диагностике Инфекции КРС /Сб. научн. Трудов МВА им. Скрябина, 1973, 70, с.118 -119;

17. Каган Ф.И., Соломатин В.И. /Лечение биомицином и террамицином КРС и овец, больных некробациллезом / Ветеринария, 1963, 3, с.46-48;

18. Калашник И.А. Болезни копытец у коров в хозяйствах промышленного типа /Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Тарту, 1983, Т. 1., с.80-82;I

19. Караваев Ю.Д., Мачахтыров И. /Некробактериозу можно сказать "нет". /Животновод. 1998, №7, с.24-25;

20. Караваев Ю.Д., Семенова И.Н. /"Вооружена" и очень опасна" /Животновод. 1995, №3. с. 12;

21. Караваев Ю.Д., Семенова И.Н. /Ветеринария 1999, №8, с.11-12;

22. Караулов А.В. Клиническая иммунология. // М., Медицинское информационное агентство, 1999,-604с

23. Кицак В.Я. /Твердофазный иммуноферментный анализ в вирусологии. Обзор литературы. /МРЖ, 1988, разд.М., I, 20-23;

24. Козин А.И., Зимонов А.Н. /Некробактериоз КРС и способы его ликвидации . Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертизы, Ульяновск, 1990, с. 64-66;

25. Кокуричев П.И., Домнин Б.Г., Кокуричева М.П. /Патологическая анатомия сельскохозяйственных животных./СПб, Агропромиздат, 1994, с.9-13;

26. Коленкин Е.Т., Абрамов Е.Н., Кокорин Н.А. /Эффективность различных методов лечения некробактериоза. Болезни конечностей сельскохозяйственных животных, Москва, 1988, с. 60-62;

27. Кэрстак Э. /Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретации результатов. /Семинар ВОЗ по проблеме получения вирусных реагентов, М., СССР, 11-24/XII, 1983.;

28. Лайшев А.Х., В.П. Афанасьев, A.M. Силков, Р.И. Булгаков и др. /Лечение и профилактика некробактериоза северных оленей /Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 1988. №2, с. 74-79;

29. Маслов М.В. /Лечение коров с некробактериозными поражениями копытец. Сб научных трудов Ленинград, вет. Институт, 1989, вып 102, с. 143-147;30,31.