Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка средств профилактики, диагностики и лечения некробактериоза и болезней копытец крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка средств профилактики, диагностики и лечения некробактериоза и болезней копытец крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ХУЗИН ДАМИР АБДУЛХАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА И БОЛЕЗНЕЙ КОПЫТЕЦ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ 7 0КТ 2015

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005563055

Казань-2015г.

005563055

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральны! центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ ВНИВИ»), г. Казань

Научный консультант: Макаев Харис Нуртдинович - доктор ветеринарии

наук, профессор, заслуженный деятель науки Р1 заслуженный работник сельского хозяйства РФ

Официальные оппоненты: Сидорчук Александр Андреевич - доктор ветеринар

ных наук, профессор, заведующий кафедро эпизоотологии и организации ветеринарного дел Московской государственной академии ветеринарно медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина;

Андреева Альфия Васильевна - докт биологических наук, профессор, зав. кафедр инфекционных болезней, зоогигиены ветсанэкспертизы Башкирского государственно! аграрного университета;

Ермолаев Валерий Аркадьевич - докт ветеринарных наук, профессор, заведуют! кафедрой хирургии, акушерства, фармакологии терапии Ульяновской государственной сельск хозяйственной академии им. П.А. Столыпина

Ведущее учреждение: Федеральное государственн бюджетное научное учреждение «Инсти экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальне Востока» (г. Краснообск)

Зашита состоится «15» декабря 2015 года в 10°" часов на заседай диссертационного совета Д-220ЛЛ2.01 при ФГБУ «Федеральный це! токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Каза* Научный городок-2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» Казань). Текст объявления о защите и автореферат размещен на официальном сайте В рф wwvv.vak2.ed.eov.ru: полный текст диссертации, автореферата и огзыв научи консультанта - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www-vnivi.ru .

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь /1 /

диссертационного '¡ЬлТГ&Р^Ь'_Степанов Владимир Иванович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В промышленном скотоводстве, наряду с многочисленными положительными сторонами, имеются серьезные трудности, обусловленные концентрацией большого количества животных на ограниченных площадях. При постоянном безвыгульно-стойловом содержании, механизации основных производственных процессов, силосно-концентратном типе кормления скота значительно повышается возможность появления и быстрого распространения различных заболеваний конечностей, в том числе некробактериоза [4,5,9].

Промышленная технология создает большие трудности, связанные с поддержанием здоровья животных, так как высокопродуктивные коровы с интенсивным обменом веществ реагируют даже на незначительные стресс-факторы, которые приводят к снижению естественной иммунологической резистентности организма, а также обуславливает благоприятные условия для распространения условно патогенных и высоковирулентных микроорганизмов [1,2,4].

На фоне снижения общей резистентности организма животных возникают различные заболевания, среди которых ведущее место занимают некробактериоз и болезни пальцев и копытец (БПК), первичным признаком которых является хромота [13].

С учетом вышеизложенного, предупреждение возникновения и распространения некробактериоза и незаразных болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.

Степень разработанности проблемы. Разработкой диагностических и лечебно-профилактических мероприятий при БПК незаразной этиологии и некробаетериозе, занимаются во многих скотоводческих странах мира. В нашей стране БПК и некробактериоз регистрируются у разных видов животных, но чаще среди северных оленей и рогатого скота [8, 10]. В странах Европы, Северной Америки, Южной Африки, Австралии болезни пальцев и копытец обычно диагностируют, как Ьатепев (англ.) или К1аиеп1атЬек (нем.) [1, 9, 16, 18,] и подразделяют на незаразные и инфекционные. Среди инфекционных заболеваний копьгтец зарубежные авторы чаще отмечают межпальцевый дерматит и пальцевый дерматит (болезнь Мортелларо), возбудители которых до конца не установлены. Некробактериозу, как отдельной нозологической единице, уделяется довольно мало внимания - чаще его описывают как острый межпальцевый некробациллез (панариций) [18]. Вместе с тем, в нашей стране некробактериоз считают одним из самых распространенных социально значимых инфекционных болезней [11].

В настоящее время в ветеринарной практике Российской Федерации довольно широко используются несколько вакцин против некробактериоза рогатого скота [4, 13]. Также имеются сообщения об использовании таких вакцин за рубежом [9,17]. Однако, общепринятые методы диагностики,

профилактики и лечения крупного рогатого скота при БПК и некробактериозе

не всегда дают желаемые результаты.

Цель и задачи. Исходя из изложенного, целью исследований явилась разработка методов диагностики, профилактики и лечения некробактериоза и БПК крупного рогатого скота.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить клинические формы проявления болезней пальцев и копытец незаразной этиологии и особенности эпизоотологии некробактериоза крупного рогатого скота в сельхозпредприятиях различных регионов РФ;

2. Разработать унифицированную систему оценки болезней пальцев и копытец незаразной этиологии и методику диагностики некробактериоза;

3. Выделить и изучить биологические свойства эпизоотических изолятов Б. песгорЬогит, циркулирующих в различных регионах РФ;

4. Отобрать штаммы Р. песгорЬогит, обладающие стабильными антигенными и иммуногенными свойствами, и разработать технологию производства антигена для создания средства специфической профилактики и лабораторной диагностики некробактериоза;

5. Разработать дешевую питательную среду для культивирования Р. песгорЬошш, технологию изготовления и контроля вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота и эффективные лечебные препараты для парентерального и наружного применения;

6. Изучить иммунобиологические свойства вакцины против некробактериоза и антимикробные, токсико-фармакологические свойства лечебных препаратов в лабораторных и производственных условиях и разработать нормативную документацию на них;

7. Испытать эффективность опытно-промышленных серий вакцины против некробактериоза и лечебных препаратов для внедрения в ветеринарную практику в виде комплекса диагностических и лечебно-профилактических мероприятий при БПК и некробактериозе.

Научная новизна исследований. Впервые:

- выявлены клинико-эпизоотологические особенности проявления болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота заразной (некробактериоз) и незаразной этиологии в различных регионах РФ и разработаны методы их дифференциальной диагностики. Выделено и идентифицировано 130 изолятов возбудителя некробактериоза и подтверждена ведущая роль Р. песгорЬогит в этиологии некробактериоза

крупного рогатого скота;

изучены фенотипические (культурально-морфологические, тинкториальные, гемолитические, антигенные, патогенные), генотипические (по генам: лейкоцидина, белка оболочки, ДНК-гиразы, гемагглютинина, транспазона) и биологические свойства выделенных изолятов, определен спектр патогенности и их токсигенности для лабораторных и естественно восприимчивых животных, отобрано два оригинальных штамма возбудителя

некробактериоза с взаимодополняющими антигенными свойствами для производства вакцины и диагностических препаратов.

- разработаны технологии изготовления протективного антигена, формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота и лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан.

Новизна прикладных разработок подтверждена 5 патентами Российской Федерации на изобретения.

Теоретическая и практическая значимость. В работе дано теоретическое обоснование необходимости дифференциального подхода к болезням пальцев и копытец заразной и незаразной этиологии при их диагностике, профилактике и лечении. На основании результатов проведенных исследований внедрены в ветеринарную практику: формол-эмульсионная вакцина против некробактериоза крупного рогатого скота и антибактериальные препараты Фузобаксан (ФБС) и Фузосан (ФЗС) для лечения БПК, осложненных некробактериозом и микробами ассоциантами; технология промышленного производства и методы контроля их качества, а также новые подходы при комплексной диагностике, профилактике и лечении крупного рогатого скота при этих болезнях.

По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены в установленном порядке 7 научно-методических документов, рекомендации, руководство и учебное пособие

Методология и методы исследований. Для выполнения поставленных задач и достижения цели диссертационной работы применяли эпизоотологические, клинические, бактериологические, диагностические, патоморфологические, серологические, молекулярно-генетические и биологические методы исследований; методы экспериментального заражения восприимчивых животных, выделения и культивирования возбудителя некробактериоза и других микробов-ассоциантов, вызывающих поражения пальцев и копытец крупного рогатого скота; методы обнаружения антигена в РИФ и генома Р.песгорЬоплп в ПЦР, выявления антител к возбудителю некробактериоза в РА, РНИФ, ИФА, РДП, а также принципы диспансерного обследования поголовья крупного рогатого скота до и после проведения лечебно-профилактических мероприятий. Подробное описание методологии и методов проведения исследований отражены в главе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование необходимости дифференциальной диагностики БПК незаразной этиологии и некробактериоза для правильной организации лечебно-профилактических мероприятий и оценки эффективности вакцинопрофилактики некробактериоза;

2. Выделение, идентификация и сравнительное изучение биологических свойств музейных и свежевыделенных изолятов Р.песгорЬогиш;

3. Технология получения питательной среды из непищевого сырья для культивирования Р.песторЬошш в биореакторе:

4. Способ изготовления некробактериозного антигена;

5. Разработка и экспериментальное обосновгяие технологии изготовления формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота;

6. Разработка и экспериментальное обоснование технологии изготовления, контроля и применения лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан;

7. Разработка, изучение эффективности и внедрение комплекса лечебно-профилактических мероприятий с использованием формол-эмульсионной вакцины и лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан при БПК и некробактериозе крупного рогатого скота.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных данных подтверждена статистической обработкой результатов методом вариационной статистики с применением прикладного приложения MS Office-MS Excel.

Основные положения диссертационной работы доложены на ежегодных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 1990-2014 гг., Международных, Всероссийских и республиканских наз'чно-практаческих конференциях, съездах, симпозиумах и конгрессах (Казань, 1991-1992; 19941999; 2001-2014; Харьков, 1991, 2011; Киров, 1998; Владимир, 2003; Ульяновск, 2003; Щелково, 2004; Краснообск, 2010; Курск., 2010; Краснодар, 2011, Санкт-Петербург, 2013; Москва, 2013; Уфа, 2014).

Публикации. Основные результаты докторской диссертации опубликованы в 129 печатных работах и материалах конференций, в т.ч. 22 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 учебных пособиях, 6 методических рекомендациях; получено 5 Патентов РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах и включает: введение, основную часть и заключение, список литературы, состоящий из 482 источника, в том числе 182 иностранных, и приложения. Диссертация содержит 61 таблицу и 28 рисунков.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 1990 по 2015 гг. в лаборатории биотехнологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической радиационной и биологической безопасности» в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ (№ гос. регистрации 01200202602) по заданию 3 «Биологическая безопасность».

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с установленными требованиями к эксперименту по постановке контроля, подбору животных аналогов и соблюдению одинаковых условий их кормления и содержания. Результаты исследований апробированы и внедрены в неблагополучных по некробактериозу и массовым заболеваниям копытец крупного рогатого скота хозяйствах Республик: Татарстан, Чувашия, Марий-Эл, Мордовия, Удмуртия, Башкортостан; Самарской, Ульяновской, Оренбургской, Московской, Пензенской, Кировской, Тульской,

Новосибирской, Курской, Воронежской и Ивановской областей; Приморского и Ставропольского краев.

Работа начата по инициативе профессора Г.Х.Камалова в 1990 году. Отдельные этапы работы были выполнены с участием д-ра вет. наук, профессора Макаева Х.Н., д-ра биол. наук Семенихина В.И., канд. биол. наук Сабировой В.В., Александрова Д.И. и Сальниковой М.М.

Материалы исследований

1. Животные. Нелинейные белые мыши живой массой (ж.м.) 15-20 г; белые крысы ж.м. 180-200 г.; кролики ж.м. 2,0-2,5 кг; бараны доноры; крупный рогатый скот разного возраста.

2. Штаммы. В работе использованы 130 изолятов возбудителя некробактериоза, выделенных из биологического материала от больных животных с гнойно-некротическими поражениями пальцев и копытец и штаммы Р.песгорЬогиш, полученные го НИИ СХ Крайнего Севера (шт.89-9), ФГБУ «ВГНКИ» (шт. 3430) и из ГНУ «ИЭВС и ДВ» (шт. 5КЕМ, ВП, КПН 3/1765, 4/1762). Два штамма: 8 ТБ630501 и 12ТБК630501 депонированы нами в НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» (2005) под номерами В-1075 и В1076, соответственно. На штамм 12Т8К630501 получен Патент РФ за № 2347806.

3. Вакцины. Опытные образцы моно- и полиштаммовых инакгивированных вакцин (ПШВ) против некробактериоза, изготовленные в лаборатории биотехнологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Для изготовления ПШВ использовали разные сочетания местных штаммов возбудителя некробактериоза и штаммов, полученных из других научных учреждений [Патенты РФ на изобретение №2040273 (1993) и № 2943773 (1995)].

Формол-эмульсионная вакцина (ФЭВ) против некробактериоза изготавливается из штаммов «8X8630501» и «12Т5К630501», имеющих генетические маркеры. [Патент РФ на изобретение № 2347806 (2008) Свидетельство о регистрации ПВР-1-2.7/02055, Сертификат соответствия № РОСС Яи.ФВО 1 .В19206].

4. Препараты. Фузобаксан (ФБС) в форме эмульсии для лечении некробактериоза крупного рогатого скота разработан в лаборатории биотехнологии ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ». Фузобаксан в качестве активно действующего вещества содержит тилозина тартрат, а в качестве вспомогательных веществ-желатин, ланолин, полизтилсилоксан и воду. [Патент РФ № 2262936; Свидетельство о регистрации ПВР-3-5.11/02717. Сертификат соответствия № РОСС Яи. ВП01.Н00338].

Фузосан (ФЗС) - композиция для наружного применения в форме присыпки при лечении БПК, состоящая из сульфатов магния, натрия, меди, цинка и поливинилового спирта, разработан в лаборатории биотехнологии ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ».

5. Стандартные наборы реактивов с пометкой х.ч. и о.с.ч.

6. Сертифицированное оборудование и инструменты: микроскопы, термостаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклавы, калибровочные пипетки и одноразовые наконечники для них, спектрофотометры, иономеры,

автоматический синтезатор, КФК-2МП, полуавтоматический биохимический анализатор, автоматический гематологический анализатор, весы лабораторные, водяные бани, центрифуги, ультразвуковой дезинтегратор, биореакторы: 250-ти, 36-ти и 90-литровые; «МагиЫзЬ>, «ЬаЫЬге 5», реактор-инактиватор и для розлива биопрепаратов, пробирки вакуумные и др.

За период работы проведено клинико-эпизоотологическое обследование 613 сельхозпредприятий с исследованием 1079 проб патологического материала (фаланг-395, витальных срезов-289, органов-43); выделено 415 изолятов Б. песшрЬогиш и проведено их культивирование в бутылях и ферментерах более 856 циклов; выполнено 67 ПЦР-анализов, 48 электронно-микроскопических исследований, анализов крови: гематологи-ческие-136, биохимические-120, серологические (РА, РНИФ, ИФА, РДП) - 1146, паггологоанатомических и токсикологических исследований с использованием проб полученных от 138 голов крупного рогатого скота, 23 овец, 729 кролика, 34 морских свинок, 80 белых крыс и 2546 белых мышей; изготовлено ФЭВ-520 серий, ФБС-230, ФЗС-195 серий.

Методы исследований

При клинико-эпизоотологическом обследовании хозяйств руководствовались «Методическим указанием по комплексной диспансеризации крупного рогатого скота», одобренные Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР [8] и «Рекомендацией по методике эпизоотологического исследования» [3].

Отбор биологического материала (после убоя и прижизненный) проводили во время выездов в сельхозпредприятия различных регионов Российской Федерации, неблагополучных по БПК крупного рогатого скота и овец. Биологический материал также поступал в лабораторию с нарочными. Бактериологические исследования осуществляли согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза», [7]. В качестве исследуемого материала служили:

- послеубойный материал - пораженная конечность по путовый сустав, кусочки паренхиматозных органов - сердце, печень, легкие, почки, кусочки желудка и кишечника;

- прижизненные витальные срезы — у больного животного отбирали с пораженного участка срезы, которые помещали в специальную транспортную среду.

В исследованиях в качестве основы питательной среды использовали ферментативный гидролизат маточно-плацентарной и эмбриональной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота, который готовили согласно разработанных нами «Методических рекомендаций по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза», одобренных научно-методическим советом и утвержденные директором ФГНУ «ВНИВИ» (2004 г)

Для выделения возбудителя некробактериоза из биологического материала использовали элективные питательные среды на основе ФГМПЭМ

под вазелиновым маслом или среду Китга-Тароцци с добавлением к их общему объему 0,5% глюкозы и 2% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота, 0,3-2,0% глюкозо-сывороточный и глюкозо-кровяной агары, а также проводили биологическую пробу на лабораторных животных (белые мыши и кролики).

В качестве дополнительных тестов для индикации возбудителя использовали реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) в прямом варианте и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Чистые культуры возбудителя некробактериоза получали постановкой биологической пробы на белых мышах и кроликах, пересевами в среду Китга-Тароцци, агаровые пластины, трубки с выделением отдельных колоний, а также последующими пассажами на лабораторных животных.

Культурально-морфологические биологические свойства изучали общепринятыми в микробиологии методами. Идентификацию выделенных культур проводили, используя «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» [12].

Для текущей работы культуры F.necrophorum поддерживали в жидкой среде на основе ФГМПЭМ и среде Китга-Тароцци, периодически пересевая их через каждые 7-10 сут и (или) сохраняли в лиофилизированном виде в ампулах.

После изучения морфологических, биохимических и биологических свойств полученных штаммов определяли спектр их антигенности в РНИФ и РА перекрестным методом против гомологичных и гетерологичных гипериммунных сывороток, которые получали на кроликах и крупном рогатом скоте по разработанной нами методике. Активность и специфичность сывороток оценивали в реакции агглютинации (РА), реакции иммунофлюоресценции прямой (РИФ) и непрямой (РНИФ), иммуно-ферментном анализе (ИФА), реакции диффузионной преципитации (РДП) и гемагглютинации (РГА).

Патогенность и токсигенность штаммов определяли на белых мышах и кроликах. Дозу заражения титровали методом серийных разведений от 1:2 до 1:128 по разработанной нами методике.

Бактериальную ДНК выделяли фенольно-детергентным и сорбционным методами.

Для отбора и генетического маркирования вакцинных штаммов, используемых в ФЭВ против некробактериоза, применяли тест-систему для ПЦР-анализа, где в качестве специфических компонентов использовали две пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарные ДНК в области, характерной для вирулентных штаммов F. necrophorum и праймеры, полученные к микрофлоре, участвующей в патологии пальцев и копытец (стафилококки, стрептококки, микрококки, кишечная палочка). С помощью наружных праймеров №11 и №22 в ПЦР синтезировали большие фрагменты. Вторую пару праймеров №011 и №022 применяли для синтеза меньшего фрагмента, структурно входящего в большой. Анализы считали

положительными, если размер первого и второго ампликоиов соответствовал ожидаемым размерам, соответственно 558 и 289 н.п.

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов проводили по двум цепочкам ДНК, используя общепринятую методику Максама-Гилберта.

Амплификацию при постановке RAPD-fingerprinting осуществляли в следующем режиме: денатурации ДНК 5 мин при 94°С, 45-кратное повторение последовательности следующих стадий - денатурации (94°С 1,0 мин), отжига (40°С, 2,0 мин) и элонгации (72°С, 0,5 мин) и заключительного досинтеза в течение 3 минут.

Фрагменты ГТЦР анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном и 6% полиакриламидном гелях в присутствии ДНК фага, расщепленной по EcoRI-ffindlll сайтам рестрикции, и 100 bp ДНК маркера.

Определение размеров фрагментов ДНК проводили с использованием пакета прикладных программ «Gel-Pro 3.1», а степени филогенетического родства и построения диаграмм — «PHYLIP».

Для электронно-микроскопических исследований использовали методы негативного контрастирования, сканирования и ультратонких срезов.

Для получения некробакгериозного антигена использовали периодический метод культивирования в 2-х и 5-ти литровых колбах, 20 литровых бутылях в условиях термостата и глубинно-суспензионным способом культивирования в 12-, 36- и 90 литровых биореакторах, оснащенных автоматизированной системой подачи питательной среды с регулятором температуры, скорости перемешивания и рН среды. Концентрацию исходной баксуспензии определяли с помощью ФЭК-56М, по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича и путем прямого подсчета в камере Горяева.

При определении параметров роста культур учитывали удельную скорость роста, время удвоения биомассы микробных клеток и максимальное накопление продуктов метаболизма бактерий в питательной среде.

Для изготовления вакцины использовали эндо- и экзотоксины, полученные из разрушенных микробных клеток и культурапьной жидкости.

С целью получения высокоиммуногенного препарата подбирали разные режимы культивирования, методы инактивации, разрушения, концентрирования, очистки, сбора и стандартизации антигенных фракций, полученных из биомассы бактерий F.necrophorum. Экзотоксин получали из культуральной жидкости после отделения бакмассы. Для получения эндотоксина инактивированную бакмассу суточной культуры F.necrophorum ресуспензировали в дистиллированной воде и разрушали 3-4-х кратным замораживанием (-50°С ) и оттаиванием при (+50°С), или в ультразвуковой установке в течение 15 мин при 23кГц.

Стандартизацию антигена по белку осуществляли на спектрофотометре «СФ-46» при рН=7,0 и температуре 20°С.

Масляный адъювант готовили из синтетического масла ПЭС-3, (кремнийорганическая жидкость ГОСТ 13004-77), которую смешивали в соотношении (85:15) с подогретым в водяной бане ланолином, автоклавировали при 120°С в течение 1 ч, охлаждали и использовали для приготовления вакцины и лечебного препарата Фузобаксан.

Полиштаммовую формол-эмульсионную вакцину (ПШВ) и формол-эмульсионную вакцину (ФЭВ) против некробактериоза рогатого скота изготавливали согласно инструкции по изготовлению, утвержденной директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», путем их эмульгирования в масляном адъюванте с помощью высокоскоростного перемешивающего устройства (25л). Контроль серий вакцины на стерильность, безвредность и иммуногенность осуществляли согласно ТУ 10-07-253-91.

ФБС изготавливали согласно разработанному технологическому регламенту и контролировали по ТУ 9337-001-00492374-2011.

ФЗС готовили по разработанной нами прописи согласно инструкции по изготовлению, утвержденной директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Безвредность опытных образцов и серий препаратов ФБС и ФЗС определяли по ОСТ 9380-076-00008064-96 «Препараты ветеринарные. Методы определения безвредности. Основные положения».

Реактогенность опытных образцов вакцины оценивали по наличию или отсутствию поствакцинальных осложнений у привитых животных в течение 10 сут после иммунизации.

Иммуногенные и антигенные свойства ПШВ и ФЭВ против некробактериоза рогатого скота изучали в лабораторных опытах на белых мышах, кроликах и на ограниченном поголовье крупного рогатого скота в хозяйствах, где ранее вакцины не применяли.

Оценку иммуногенной эффективности проводили в неблагополучных сельхозпредприятиях на основании фактических данных по количеству больных животных до и после применения вакцины и титру поствакцинальных антител в РА, РНИФ и ИФА. Для серологических исследований использовали бактериальный антиген Р.песгорЬотт вакцинного штамма «12Т8К630501» и сыворотки крови опытных животных в разведении с 1:10 до 1:1280.

Широкое производственное испытание эффективности вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота проводили в неблагополучных сельскохозяйственных предприятиях различных регионов РФ на более чем 900 000 гол скота.

Изучение токсикологических свойств препаратов Фузобаксан и Фузосан осуществляли в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [14].

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Причины и факторы распространения некробактериоза и БПК крупного рогатого скота

Клинико-эпизоотологическое обследование неблагополучных по БПК и некробактериозу сельхозпредприятий, занимающихся скотоводством, проводили в 18 регионах Российской Федерации, начиная с 1990 года. За этот период проведено изучение этиологии, клинико-эпизоотических особенностей и дифференциальная диагностика некробактериоза и БПК незаразной этиологии в 613 сельхозпредприятиях с охватом 693460 голов крупного рогатого скота, из которых в 415 хозяйствах был установлен некробактериоз, при этом число больных БПК животных составляло от 9,3 до 76%. Чаще поражались тазовые конечности (87,9%). Больше всего поражение пальцев и копытец отмечали у высокопродуктивных коров, особенно в последний период стельности или вскоре после отела, при этом удой у больных коров снижался на 25,8-58,5%, в зависимости от тяжести процесса, вынужденный убой колебался от 15,8 до 58,7% к общему количеству больных животных. Черно-пестрая и голштинская породы скота были более подвержены заболеваниям (42,5%), чем симментальская и бестужевская (13,5%).

Болезнь протекала по типу энзоотии, имела стационарный характер с пиком заболеваемости в стойловый период и спадом в пастбищный сезон. С внедрением промышленных технологий БПК стали протекать более злокачественно с менее выраженной сезонностью.

При выяснении причин возникновения некробг.ктериоза в 415 обследованных сельхозпредприятиях в 71,8% случаях патогенные штаммы возбудителя были занесены завозным скотом и зарегистрированы лабораторными исследованиями, в остальных причины не установлены.

Отличительной особенностью некробактериоза от других БПК было в том, что некротические процессы обычно возникали без видимых травм на коже пальцев одновременно у большого числа животных и очаги некроза обнаруживали на вымени, слизистых оболочках ротовой полости, желудочно-кишечного тракта, половых органов, а при генерализованной форме в легких, сердце и печени.

По клиническим признакам и тяжести течения БПК и некробактериоз условно подразделяли на три степени проявления: легкую, среднюю и тяжелую.

В большинстве обследованных сельхозпредприятиях процентное соотношение больных с легкой степенью было в пределах 30-40%, средней -60-70 и тяжелой 5-10%, что свидетельствовало о несвоевременной выбраковке тяжелобольных животных и некачественном проведении лечебно-профилактических мероприятий.

С завозом голштинского скота и внедрением зарубежных технологий ведения скотоводства эпизоотическая ситуация по некробактериозу и другим БПК усугубилась, поэтому заболеваемость скота остается на высоком уровне.

Этиологические факторы, приводящие к возникновению и распространению БПК и некробактериоза, в каждом отдельно взятом хозяйстве имели свои особенности.

По нашим наблюдениям молодые животные (бычки и телочки) до 6-месячного возраста более устойчивы к некробактериозу и другим БПК. Эти болезни наиболее широко распространены в крупных промышленных молочных комплексах и встречаются значительно реже там, где используют летне-лагерное содержание скота.

Ввиду отсутствия строгой отчетности по некробактериозу и БПК, частых изменений условий хозяйствования достоверной информации о распространении некробактериоза и количестве неблагополучных пунктов не имеется. Стойкое благополучие сельхозпредприятий по некробактериозу и БПК возможно при проведении комплексных общехозяйственных и специальных зооветеринарных мероприятий и устранении многочисленных причин их вызывающих и поддержании высокой общей резистентности животных.

3.2 Разработка унифицированной системы оценки БПК и диагностики некробактериоза

Для систематизации диагностики, организации лечения и профилактики все болезни пальцев и копытец условно по этиологическому принципу (вызывающим факторам) разделили на три основные группы: 1. Травматические; 2. Вызванные нарушениями кормления, содержания и хозяйственного использования животных; 3. Инфекционные- некробактериоз.

При проведении ортопедической диспансеризации животных все БПК по принципу анатомо-топографической локализации патологии в структуре тканей пальцев и копытец разделили на 5 групп болезней: рогового башмака (деформации, нарушения белой линии, трещины; расседины); дермы в области мякиша, межпальцевого свода, венчика (раны, язвы, дерматиты, абсцессы, флегмоны); основы кожи копытец (пододерматиты, ламиниты, язва Рустерхольца); суставов и связок (артриты, тендениты, тендовагиниты); костей пальцев ( периоститы, оститы, остеомиелиты, некроз, кариес).

На одной и той же конечности регистрировали различные сочетания этих патологий, однако они не имеют такого широкого распространения как при некробактериозе.

Окончательный диагноз на некробактериоз и БПК ставили по результатам клинико-лабораторных исследований с постановкой биологической пробы на лабораторных животных.

В частности, при исследовании 284 проб патологического материала при БПК возбудитель некробактериоза был выделен только в 90 пробах. При бактериологических исследованиях в 100% случаях регистрировали разные ассоциации микроорганизмов из 5-6 и более видов, среди которых, наряду с Б. песгорИошт, обнаруживали микрококки (86,4%),стафилококки (77,3%), стрептококки (57,3%), эшерихии (45,5%) и протеи (31,8 %) и др.

Следовательно, микробный пейзаж в очаге пораженной конечности отличался по составу, и не всегда БПК проходили с участием возбудителя некробактериоза.

При исследовании патологического материала методом ПЦР-анализа получали 90%-ное совпадение с результатами бактериологических исследований и биопробы.

Результаты наших исследований свидетельствуют, что в настоящее время основными методами диагностики некробактериоза остаются бактериологические исследования в сочетании с биопробой на лабораторных животных и методом ПЦР-анализа. Неэффективность других методов диагностики связана с полиэтиологичностью, многообразием проявления БПК и широкой антигенной вариабельностью Б. песгорЬошт. При этом, важное значение имеют разработанные нами методы отбора и хранения биологического материала в специальной транспортной среде, которая позволяет доставить патологический материал с сохранением жизнеспособности возбудителя некробактериоза.

Некробактериоз считали установленным, если при заражении лабораторных животных суспензией патологического материала на месте введения развивался характерный некротический процесс и животные погибали. При этом в мазках из мест поражений и внутренних органов обнаруживали микробные клетки возбудителя болезни, во всех остальных случаях считали, что имеют место БПК незаразной или иной этиологии.

Серологические реакции из-за широкого штаммового разнообразия Б. песгорЬошт для диагностики некробактериоза не применяются, на практике они служат для установления напряженности иммунитета у вакцинированных животных и как вспомогательный инструмент при изучении широты распространения некробактериоза.

33 Изучение биологических свойств, ультра-гонкого строения Р.песгорЬогит и их молекулярно-генетический анализ

За период работы нами выделены 415 изолятов возбудителя некробактериоза, у 130 из них изучены культурально-морфологические и биологические свойства в сравнении с штаммами Р. песгорЬошт, полученными из НИИСХ Крайнего Севера, ФГБУ «ВГНКИ» и «ИЭВСи ДВ».

Культуры имели типичные для вида РивоЬа^епит песгорЬошт культурально-морфологические свойства, в разной степени образовывали индол и сероводород, не разжижали желатин, только 10% из них свертывали молоко и были в разной степени активными в отношении некоторых углеводов и многоатомных спиртов. Все культуры вызывали гемолиз эритроцитов и обладали свойством самоагглютинации, образуя серый налет на кусочках печени, но отличались по скорости и степени агглютинации, из них 33 культуры штаммов РивоЬа^епит песгорЬошт в разной степени вызывали агглютинацию куриных эритроцитов в разведениях от 1:2 до 1:128, а 7 из них не обладали этой способностью и седиментировали.

При постановке реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с гипериммунной антинекрофорусной сывороткой отмечалось специфическое свечение культур Р. песгорЬошт (рис. 1).

Б

Рисунок 1 - Световая (А) и люминисцентная микроскопия (Б) Р. песгорЬошт Окраска по Граму (х 1350) РИФ (х 1350)

При отборе наиболее активных штаммов для производства биопрепаратов большое значение имеет их патогенность. При подкожном заражении все взятые в опыт культуры Р. песгорЬошт вызывали некроз тканей на месте введения бактериальной взвеси. Гибель белых мышей обычно наступала на 410 сутки. При внутрибрюшинном заражении гибель мышей наступала на 2-3 сут, но при этом 7 изолятов оказались слабо патогенными.

Сравнительное изучение использованных в опытах 40 штаммов и изолятов песгорЬошт от крупного рогатого скота показало их значительные антигенные отличия.

При биотипировании 50% взятых в опыт штаммов отнесли к биотипу А, а остальные - к биотипам АВ и В. При этом 50% изолятов И. песгорЬошт биотипа А относятся к 1, 2 и 3 серотипам, 7 изолятов биотипа В - к 1 и 2 серотипам, и остальные штаммы биотипа АВ - к 2 и 3 серотипам. При этом некоторые штаммы обладали антигенными признаками, общими для двух и даже трех серотипов, а два штамма (Р-4 и МК) отличались от всех остальных отсутствием или слабой антигенной активностью к гетерологичным гипериммунным сывороткам.

Результаты биотипирования в реакции гемагглютинации и изучения вирулентных свойств культуры РшоЬайепит песгорЬошт показали, что культуры изолятов ВК и ТС являются наиболее активными по этим показателям. Они имеют стабильные ростовые свойства, типичные для вида культуральные, морфологические и биохимические свойства, относятся к биотипу А с широкой антигенной активностью, характерной для 1-3 серотипов. Летальная доза (ЬЦ) их для кроликов составила 9,77 млн.м.к.

Изучение геномного полиморфизма 40 выделенных на территории Российской Федерации изолятов Р.песгорЬошт с помощью одно- и двухпраймерной ПЦР, позволило выяснить генетические связи между различными культурами и отобрать из них два штамма Р.песгорЬошт (ВК и ТС), наиболее пригодные для дальнейшей работы по производству профилактических и диагностических препаратов. Результаты этих

исследований позволили нам выявлять большое число маркеров, рассеянных по всему геному микробной клетки и строить генетические карты. По результатам генотипирования эти штаммы были выбраны, как наиболее характерные представители Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum, и получили наименование соответственно, штамм ВК -«12TSK630501» штамм TC-«8TS630501». Принадлежность этих штаммов к подвиду subsp. necrophorum подтверждена последующими исследованиями по установлению нуклеотидной последовательности генов: транспозона, белка оболочки, ДНК-гиразы, гемагглютинина и лейкоцидина.

Отобранные штаммы сохраняют свои исходные свойства при длительных пересевах на питательных средах и пассажировании через лабораторных животных.

При электронно-микроскопических исследованиях (рис.2) обоих штаммов F. necrophorum методом ультратонких срезов, регистрировали клетки палочковидной и гантелевидной делящейся формы, у которых хорошо просматривалась извилистая многослойная клеточная стенка, имеющая гладкую поверхность и плазматическая мембрана с перетяжками. Общая толщина слоев клеточной стенки составляет 24 - 35 нм. Ультраструктура цитоплазмы F. necrophorum была очень гетероморфной и отмечалось наличие большого количества включений и гранул.

Вокруг клеток, или в непосредственной близости с наружной мембраной клеточной стенки, были видны сферические везикулы, ограниченные мембраной размером 45 - 250 нм. На ультратонких срезах наблюдали процесс выделения веществ из периплазматического пространства через клеточную стенку в окружающую микроорганизмы среду. Клеточная стенка таких бактерий практически на всем протяжении не меняет своей структуры. Иногда наружная оболочка выглядела размытой и в некоторых местах обнаруживали разрывы (дефекты) клеточной стенки. В культурах обоих штаммов часто встречали сферопласты.

Рисунок 2 - Метод ультратонких срезов Культуры штаммов «8Т8630501»- А, «12Т8К630501».- Б А-участок клетки и сферопласт. Короткие стрелки показывают везикулы внешней мембраны. Условные обозначения: Н- нуклеоид; В1- включения 1 типа, ЦП - цитоплазма.

Отличий в строении клеточной стенки и цитоплазматической мембраны у двух изученных штаммов не выявлено.

При исследовании штаммов методом негативного контрастирования наблюдали палочковидные клетки различной длины («8TS630501» 0,3-0,67 мкм по ширине и 1,25-14,1 мкм по длине, «12TSK630501» - 0,58-0,67 мкм по ширине и 1,85- 5,56 мкм по длине) (рис.3).

Изучение клеточной поверхности методом сканирующей электронной микроскопии этих штаммов, также показало наличие везикул разного размера (от 80 до 170 нм) и пузырьков (размером от 250 до 600 нм), которые обычно находились в трех состояниях: в процессе образования, тесного контакта и отрыва от бактериальной клетки, что может свидетельствовать о активном выделении экзотоксина и (или) образовании биопленки (рис.4).

При этом в культуре F. necrophorum штамма «12TSK630501 » ¡всегда было большое количество везикул и пузырьков.

Таким образом, результаты изучения культурально-морфологических, биохимических и молекулярно-генетических особенностей эпизоотических изолятов, выделенных из разных регионов Российской Федерации, позволили нам отобрать для дальнейших работы два генетически маркированных штамма, имеющих широкий антигенный спектр, стабильные ростовые свойства и высокую патогенность. Штаммы «8TS630501» и «12TSK630501» депонированы в ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», под регистрационными номерами НИИ ККМ: В-1075 и В-1076, соответственно. Штамм «12TSK630501» запатентован в качестве референтного штамма F. necrophorum spp. necrophorum.

Рисунок 3 - Метод негативного контрастирования Fusobacterium necrophorum штамм «8TS630501»

Рисунок 4 - Сканирующая электронная микроскопия Fusobacterium necrophonim штамма «12TSK630501»

3.4 Разработка технологии изготовления вакцины для профилактики некробактериоза

3.4.1 Изыскание оптимальной питательной среды и отработка режима крупномасштабного культивирования Р.песгорЬогит

Для производства вакцины против некробактериоза была разработана технология изготовления дешевой питательной среды на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров в 250 или 500 литровых реакторах.

По эффективности выхода бактериальной массы и экзотоксина Р. песгорЬогит данная питательная среда не уступает среде Китт-Тароцци и не

оказывает отрицательного влияния на культурально- морфологические, биохимические, антигенные, вирулентные и иммуногенные свойства этого микроорганизма.

Готовая питательная среда имеет следующий состав (рН 7,2-7,6):

ФГМПЭМ 25-30%

Дистиллированнная вода 67-70%

Хлористый натрий 0,5%

Двузамещенный фосфат калия 0,2%

Глюкоза (40%-ная) 1,0%

Сыворотка крови КРС 2,0%

Вазелиновое масло 0,4%

При испытании различных вариантов и режимов культивирования штаммов Р.песгор1югит, наиболее технологичным и продуктивным в отношении выхода бактериального сырья и получения высокоактивного антигена оказался отливно-доливной метод культивирования, который позволяет увеличить выход бактериальной массы до 15,6 млрд.м.к./мл и накопление внеклеточных белков культуральной жидкости до 13,7 мг/мл, что в 1,7 и 1,4 раза, соответственно, превышает данные показатели при культивировании в бутылях. Таким образом, средний выход целевого продукта оказывался выше по сравнению с периодическим культивированием (в бутылях) в 19-20 раз.

Отливно-доливной способ культивирования производственных штаммов в питательной среде на основе ФГМПЭМ позволил нам за один цикл культивирования в реакторе небольшой емкости получать до 150-300 л и более продукта с высоким содержанием бактериальной массы и белка в культуральной жидкости, обладающего всеми свойствами токсина при биологическом контроле, и дал возможность отбирать лучшие культуры и оптимальные режимы культивирования, способствующие активному накоплению в суспензии максимальной концентрации бактериальной массы и экзотоксина и тем самым получать стандартное, заданное качество популяции Е. песгорЬошш, дающее возможность значительно повышать иммуногенные свойства вакцины.

3.4.2 Конструирование экспериментальных вариантов вакцины, определение их специфичности и антигенной активности.

В связи со слабой антигенной активностью корпускулярных антигенов Б. песгорЬогат, принципиально новым этапом в разработке эффективного препарата для специфической профилактики некробакгериоза было создание химической вакцины, полученной из антигенных фракций этого возбудителя (экзо- и эндотоксина).

Выход эндо- и экзотоксина в одном цикле периодического культивирования зависел от показателей роста оптической плотности бактериальной суспензии и изменений концентрации белка в культуральной жидкости. Эти показатели имели общие закономерности, отличались у разных

штаммов и во многом зависели от удельной скорости роста культуры (ц) в экспоненциальной фазе роста и времени, необходимого для удвоения числа микробной популяции (1<1). Экспрессия экзотоксина бактерийными клетками начиналась практически сразу после засева, о чем свидетельствовала гибель белых мышей на 3-4 сут после заражения, интенсивное образование белка и показатели РНИФ в титре 1:320 уже после 6-8 ч роста культуры. Дальнейшее увеличение времени ферментации существенно не влияло на прирост микробной массы и экзотоксина.

Таким образом, быстрый рост количества клеток Р. пегорЬопнп сопровождался интенсивным синтезом экзотоксина.

Метод получения эндотоксина некробактериозного антигена состоял из нескольких этапов: очистки, концентрации и стандартизации инактивированной биомассы Р.песгор1ютит; ресуспензирования бакмассы в стерильной дистиллированной воде до концентрации 200 млрд. м.к. в 1 мл; замораживании и оттаивании до полного разрушения микробных клеток; фильтрации и сбора цитоплазматической фракции (ЦПФ) - эндотоксина.

Экзотоксин собирали осаждением белка КЖ фталаилжелатином в изоэлектрической точке, в бутылях или в разделительной колонке.

Оптимальным условием для осаждения белка культуральной жидкости (экзотоксина) оказалась комнатная температура (+20), рН = 4,0 и добавление 0,04 % фталаилжелатина к общему объему. При этих условиях показатель белка в осадке у разных штаммов варьировал в больших пределах от 6,5 до 30,0 мг/%.

Полученный экзотоксин и эндотоксин контролировали на стерильность, определяли белок и объединяли в единый специфический антигенный комплекс при их оптимальном соотношении и эмульгировали в масляном адъюванте.

Иммуногенные свойства вакцины определяли по ее специфичности, связанной со степенью ее соответствия эпизоотическому штамму, биологической активности, концентрации и очистки от балластных веществ.

Все образцы вакцины, после проведения контроля по общепринятым тестам, использовали для вакцинации ограниченного поголовья крупного рогатого скота и из них отбирали наиболее иммуногенные варианты.

Полученные варианты вакцин отвечали требованиям безвредности, обладали выраженной антигенной активностью в опытах на лабораторных животных и показали достаточно высокую иммунологическую и противоэпизоотическую эффективность при вакцинации крупного рогатого скота в неблагополучных по некробактериозу хозяйствах.

3.4.3 Разработка метода контроля иммуногенности вакцины против некробактерноза

Наиболее достоверным методом контроля иммуногенности вакцин является прямое заражение опытных и контрольных животных, поэтому этот метод был разработан нами для определения иммуногенности вакцины против некробактерноза.

Минимальную летальную (БЬМ) дозу Р.песгорЬотиш заражающего штамма определяли предварительной титрацией дозы заражения одновременно на белых мышах и кроликах.

Результаты титрации дозы заражения отобранных для исследования штаммов свидетельствовали, что они отличаются по патогенности (токсигенности). При этом установлена высокая чувствительность кроликов к возбудителю некробактерноза, которая наиболее четко выявлялась в пороговых дозах- близких к БЬМ, поэтому для дальнейших исследований по испытанию иммуногенности серий вакцины использовали кроликов, которые позволяли оценить иммуногенность вакцины как по болезни и гибели контрольных и выживанию опытных кроликов, так и по уровню тигра антител.

В основе дозирования комплексного антигена в готовой вакцине было положено весовое количество белка. В опытах по испытанию пяти вариантов вакцины с титрованными дозами антигена наиболее оптимальной дозой, отработанной на кроликах, была - 15 мг/мл белка. Менее низкое содержание белка не вызывало выраженного иммунного ответа, а более высокое содержание белка (20-30 мг/мл) угнетало антител ообразование. Для проведения контроля иммуногенности экспериментальных вариантов и производственных серий вакцины кроликам вводили по 1 см3 препарата.

Пик нарастания титра антител наступал на 30 сут после однократной иммунизации. При этом уровень антител, вызванный антигенными комплексами штаммов, использованных в моно- и полиштаммовых вариантах вакцины, больше всего выявляли антигенами из штаммов ВК, ТС, ВУП и 89-9, что стало основанием использования их в качестве контрольных при изучении иммуногенности вакцин.

При прямом заражении вакцинированных кроликов и белых мышей, наиболее устойчивыми к заражению оказались животные, привитые ПШВ и вакциной из заражающего (контрольного) штамма ВУП. При этом кролики, привитые ПШВ, легче переносили заражение и выживали до конца эксперимента (30 дней, срок наблюдения), а из 15 зараженных белых мышей выжило 13 (86,9%), тогда как все контрольные животные пали в течение 4-5 сут после заражения.

Эти результаты получили подтверждение в полевых условиях при подборе дозы вакцины на клинически здоровом крупном рогатом скоте и позволили рекомендовать следующие дозы вакцины, см3:

• крупному рогатому скоту старше года - 2,0

• молодняку старше 6 месяцев -1,0

Вакцину вводили внутримышечно в область верхней трети шеи.

Первые опыты по изучению антигенной и иммуногенной активности моно- и полиштамовых вариантов вакцины против некробактериоза в производственных условиях были проведены в неблагополучном по некробакгериозу колхозе «Россия» Республики Удмуртия. Пораженность скота дойного стада и быков на откорме составляла 26%. Поголовье откормочных быков старше 6 мес и коров разделили на шесть опытных и одну контрольную группы. Опытные группы условно-здоровых животных (бычков и -50 коров в группе) прививали моноштаммовыми вариантами (Р-4, С-1, ВУП, КОН, ТС) и полиштаммовой вакциной из этих штаммов, взятых в равных соотношениях. Контрольную группу условно-здоровых животных не прививали.

Через 30 сут после иммунизации провели клиническое обследование и отбор проб крови от опытных и контрольных (не привитых) бычков и коров.

Установлено, что наиболее выраженную противоэпизоотическую эффективность и антигенную активность имели моно- и полиштаммовые варианты вакцины, изготовленные с использованием протективных антигенов местного штамма, а также штамма ТС.

Таким образом, используя разные моно- и полиштаммовые варианты вакцины на группах скота в условиях неблагополучных хозяйств, мы выявляли наиболее активные изоляты, обеспечивающие лучшую защиту животных от заражения некробактериозом.

В опытах на крупном рогатом скоте, проведенных в ряде сельхозпредприятий, где ранее вакцины не применялись («Россия», «Сюгаильский», «Центральный», «Сапмачи», им. Мичурина и др.), изучали развитие иммунитета после однократного введения оптимальной дозы вакцины (30 мг белка в 2 см3) по количеству больных животных до и после вакцинации животных и динамике антителообразования. При введении вакцины животные оставались здоровыми, сохраняли пищевую возбудимость, привесы и удои. На месте введения вакцины формировалась припухлость соответственно ее введенному объему, которая была безболезненна и сохранялась не более 3-4 месяцев. Серологически выявляемое антителообразование отмечали с 7-14 сут, достигало максимальных показателей на 21-30 сут после прививки, постепенно снижаясь до 180 суток.

Ограничений в применении вакцины стельным животным не выявляли.

Все серии ПШВ отвечали требованиям стерильности, безвредности и иммуногенности при контроле на лабораторных животных. Результаты их применения в неблагополучных хозяйствах были положительными. Применение ПШВ вызывало в организме привитых животных значительное повышение иммунного статуса, выражающегося выработкой как гуморального, так и клеточного иммунитета (табл. 1).

Таблица 1 - Иммунный статус коров, привитых ПШВ

Показатель № коровы Сроки исследований (сут)

До вакцинации 14 30 60

ДО 1 20,13 21,71± 0,19 23,0 23,6± 0,78 23,13 24,35:Ь 0,46 21,17 21,91± 0,02

2 21.43 22,5 23,71 21,87

3 21,98 24,7 25,01 21,94

1 2,14 2,61± 0,02 2,34 2,37± 0,01 2,49 2,5 8± 0,08 2,09 2,11± 0,0

2 2,19 2,38 2,69 2,18

3 2,13 2,35 2,47 2.11

В-<%) 1 43,19 42±0,0 46,97 43,7± 0,0 47,29 23,6± 0,78 42,99 23,6* 0,78

2 41,97 45,37 45,78 41,15

3 42,00 43,7 44,88 41,42

Т-(%> 1 20,16 21,1± 0,0 21,7 21,8± 0,36 22,1 21,9± 0,23 19,91 21,3* 0,0

2 20,93 21,29 21,57 21,03

3 21,12 22,32 2202 21,32

ФА <%) 1 48,90 45,1± 0,0 51.6 51,4± 0,0 51.34 51,1± 0,0 49,8 47Д± 1,48

2 49,21 51,2 50,91 49,34

3 45,14 51,4 51,11 45,14

ФЧ (м.т.) 1 6,98 6,45± 0,0 7,59 7,63± 0,06 7,48 7,45± 0,0 6,77 6,53± 0.0

2 6,79 7,71 7,39 6,99

3 6,45 7,55 7,25 6.55

ФИ (м.т.) 1 3,78 3,96± 0,0 5,18 5,76± 0,14 5,17 5,41± 0,04 3,68 3,47± 0,0

2 3,56 5,56 5,46 3,96

3 3,96 5,96 5,36 3,47

При исследовании крови у животных отмечалось увеличение Т- и В-лимфоцитов, концентрации иммуноглобулинов класса и ^М и повышался уровень фагоцитарной активности нейтрофилов крови.

Таким образом, однократная вакцинация обеспечивала устойчивость всех привитых животных к некробактериозу в течение 6 мес их содержания в очаге инфекции при ежедневном контактировании с больными животными и зараженной окружающей средой.

Поствакцинальный иммунитет сопровождался значительным ростом титра специфических агглютининов, которые находились в обратной коррелятивной связи с БПК у привитых животных.

Эти исследования позволили нам сделать заключение о иммунологической активности и противоэпизоотической эффективности препарата.

Все производственные процессы изготовления и контроля вакцины против некробактериоза проводили согласно разработанной нами НД: инструкции по изготовлению и контролю, технических условий (ТУ) и инструкции по применению, утвержденной директором ВНИВИ, которые были рассмотрены методическим советом ВНИВИ и методической комиссией по биопрепаратам В ГНК И ветпрепаратов. Разработанная НД позволила нам организовать производство необходимого количества вакцины в профильной лаборатории ВНИВИ по заказам отдельных хозяйств и регионов Российской Федерации, включая в их состав имеющиеся у нас штаммы с наиболее широким антигенным спектром и местные изоляты и проводить широкие испытания эффективности вакцины в неблагополучных по некробактериозу хозяйствах.

Иммунизация ПШВ защищала скот от заражения и тем самым способствовала сокращению случаев заболевания и снижению потерь от Б ПК.

3.4.4 Испытание иммуногенносги вакцины при экспериментальном некробактсрнозе крупного рогатого скота

Для проведения опыта по испытанию иммуногенносги ПШВ при экспериментально вызванном некробактериозе телят 6-7 мес возраста разделили на две группы: опытную (4 головы), которых вакцинировали однократно, подкожно в дозе 2 см 3, в область средней трети шеи и контрольную (3 головы), которых не вакцинировали. |

Оценку клинического состояния, общей резистентности и иммунологической перестройки организма опытных и контрольных телят проводили до вакцинации, через 7,14,21 сут после вакцинации и в течение 30 сут после заражения с 7-сут интервалами на основании клинического обследования животных, а также гематологических и серологических исследований крови.

Каких-либо изменений в общем состоянии животных опытнэй группы и патологических процессов на месте введения препарата не отмечали.

В первые 14 сут после вакцинации повышалось общее количество лейкоцитов (10-11 тыс/мм3), фагоцитарная активность (с 48 до 72%) и фагоцитарный индекс (с 0,56 до 4,5). Общее количество эритроцитов и гемоглобина существенно не изменялось. В лейкоцитарной формуле отмечали незначительное увеличение палочкоядерных нейтрофилов.

До вакцинации в сыворотке крови телят антитела к некробйктериозным антигенам не выявлялись. Начиная с 7 сут исследования титр противонекробакгериозных антител в РНИФ был в пределах 1:160, а к 21 сут исследования составлял 1:1280.

После заражения у вакцинированных телят через 21 день после вакцинации суточной культурой штамма ВУП в ранее оттитрованной дозе у опытной группы телят повышение температуры тела не отмечалось, тогда как у контрольных телят в первые дни после заражения температура тела повысилась до 40,1° -40,6°С, которая снижалась до физиологической нормы на 3 сут исследования.

Через сутки животные контрольной группы начали опираться на зацепную часть копытец, подводя конечность под туловище. В последующие сроки эти признаки усиливались, развивалось угнетение, снижался аппетит, животные больше лежали. На месте инъекции отмечали припухлость, покраснение, болезненность; при движении наблюдали хромоту, которая усиливалась при проводке животного по твердому грунту. В дальнейшем развились поражения в виде размягчения мягких тканей пальцев и копытец, флюктуация и расплавление кожи с выделением гноя со специфическим запахом. При микроскопии мазков-отпечатков из пораженных участков тканей и в культурах, выращенных в среде Китг-Тароцци, обнаруживали характерные для Р.песгорЬогит нитевидные клетки, патогенные для лабораторных животных.

Таким образом, доказана высокая иммунологическая эффективность ПШВ в дозе 2 см3 при экспериментальном некробактериозе.

3.4.5 Разработка унифицированной формол-эмульсноннон вакцины против некробактсриоза крупного рогатого скопга

По результатам исследований биологических свойств и молекулярно-генетического анализа р.песгорЬогит были отобраны и депонированы в качестве производственных (вакцинных) два штамма («8Т8630591» и «12Т8К630591»), имеющие стабильные биологические свойства, широкий взаимодополняющий антигенный спектр, генетические маркеры и хорошо растущие на искусственных питательных средах. В связи с этим, начиная с 2008 года, вакцину изготавливали на основе эндо- и экзотоксина указанных штаммов, инактивированных 0,5% раствором формалина и эмульгированных в масляном адьюванте.

Технологический процесс производства вакцины состоит из следующих этапов: 1. Приготовление посевного материала; 2. Приготовление питательной среды; 3. Глубинно-суспензионное культивирование; 4. Инактивация и объединение суспензии; 5. Сепарирование суспензии на БМ и КЖ; 6. Разрушение БМ и фильтрация ЦПФ; 7. Флокуляция КЖ, осаждение и фильтрация экзотоксина; 8. Стандартизация и объединение антигенных комплексов; 9. Приготовление масляного адъюванта; 10. Эмульгирование антигенных комплексов в масляном адьюванте.

Общая доза антигена в ФЭВ составляет 30 мг в 2 мл препарата. Применение ФЭВ в такой дозировке антигена на крупном рогатом скоте, при условии выполнения всех требований «Инструкции по применению вакцины....» способствует стабилизации благополучия хозяйств в короткие сроки. В сравнении с известными аналогами ФЭВ отличается малым объемом препарата, вводимого внутримышечно в одну точку (2 мл), местной и общей ареактогенностью для животных, отсутствием ограничений по физиологическим показателям (стельности), формированием стойкого иммунитета через 15-20 сут после однократной вакцинации, сохраняющегося в течение 6 месяцев.

При изучении иммунологической эффективности и сроков годности серий вакцины, свежеприготовленных и хранившихся различное время в архиве лаборатории при 2...8°С, была подтверждена безвредность, ареактогенность и иммуногенная активность вакцины в течение 12 месяцев.

По результатам комплексных лабораторных и производственных испытаний разработана НД, которая рассмотрена в ВГНКИ и утверждена Россельхознадзором.

Утвержденная НД на ФЭВ позволила внедрить ее в ветеринарную практику 89 хозяйств 15 регионов РФ, неблагополучных по некробактериозу. В данных хозяйствах вакцинировали против некробактериоза 459700 голов крупного рогатого скота старше 6-месячного возраста (табл.2).

Таблица 2 - Сведения о применении ФЭВ против некробактериоза в

Республики, области, край Количество хозяйств Общее поголовье скота Вакцинировало и ревакцннировано всего

Удмурта» 5 6800 4570

Марий-Эл 7 8300 69Е0

Мордовия 9 10700 34350

Татарстан 23 29900 19760

Чувашия 5 6850 4400

Башкортостан 2 3500 1700

Самарская 18 23300 1695(

Ивановская 1 2300 600

Ульяновская 2 3200 2200

Нижегородская 9 10720 3900

Кировская 1 2400 1200

Курская 1 2500 1030<

Новосибирская 2 3700 2850

Оренбургская 2 3700 4000

Приморский 2 3100 4450

ВСЕГО 89 120920 45970'

После проведения вакцинации новые случаи выявления некробактериоза прекращались. Однако в данных хозяйствах оставалось значительное количество животных с ВПК незаразной этиологии, которые могли способствовать рецидиву и распространению некробактериоза. Кроме того, применение вакцины провоцировала болезнь у скрыто больных некробактериозом животных «инкубатиков» и возникала необходимость своевременного их лечения. Учитывая это обстоятельство, нами были разработаны препараты для парентерального и наружного применения, которые использовали в общем комплексе лечебно-профилактических мероприятий.

3.5 Разработка комплексного препарата для парентеральной терапии некробактериоза и БПК

В ветеринарии для лечения животных с БПК неинфекционнон этиологии и некробактериозом используют разнообразные средства и методы лечения. Однако эффективность лечения животных в условиях практики не превышает 60%. В связи с этим разработка новых средств и методов лечения БПК и некробактериоза в условиях практики остается актуальной задачей.

При разработке комплексного препарата для парентеральной терапии наиболее технологичным по изготовлению, соотношению цена/качество, безвредности, ареактогенности, удобству применения оказался препарат, где в качестве активно действующего вещества использовали тилозин тартрат, а пролонгатора - масляный адъювант (Патент РФ № 2262936).

Для государственной регистрации и сертификации нового лекарственного препарата - Фузобаксан провели его доклиническое испытание с изучением токсико-фармакологических свойств, согласно «Руководства по

экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [14] с 3-4 кратной повторностью.

Технологический процесс производства Фузобаксана состоит из следующих последовательных этапов: 1. Приготовление водно-органического растворителя; 2. Приготовление рабочего раствора тилозина; 3. Приготовление масляного адъюванта; 4. Приготовление Фузобаксана

3.5.1 Антимикробная активность Фузобаксана

Исследованиями согласно методикам, предложенным Г.Н. Першиным и Ф.И. Каган, установлено, что ФБС в зависимости от использованного тест-микроба проявляет различную бактерицидную активность. В частности, через 60 мин непосредственного контакта «in vitro» минимальная подавляющая концентрация для F.necrophorum составила 7,8 мкг/мл по АДВ; для кишечной палочки - 250 мкг/мл; для стафилококка и стрептококка - 1,8; клостридий -31,2; микрококка - менее 0,45 мг/мл. При этом развития: устойчивости к препарату возбудителя некробактериоза и других тест-микробов не происходило.

3.5.2 Токсикологические параметры Фузобаксана

3.5.2.1 Острая токсичность Фузобаксана Обобщенный анализ результатов проведенных исследований по определению параметров острой токсичности ФБС представлен в таблице № 3.

Таблица 3 - Параметры острой токсичности ФБС

Вид животного Способ введения, ЛДэд мг/кг

подкожно внутримышечно

белые мыши 1140 920

белые крысы - 2075

кролики — 1300

телята (4-х мес.) - Ш

Примечание: «--» - не исследовано; «9» - введение максимально возможной дозы ФБС

не вызывает гибели животных.

Результаты исследований позволяют констатировать, что данное лекарственное средство является слабо токсичным и согласно ГОСТу 12.1.007 — 76 относится к веществам IV класса опасности — малоопасные.

3.5.2.2 Субхроническая токсичность и кумулятивные свойства Фузобаксана

При изучении субхронической токсичности ФБС на белых мышах и кроликах за время эксперимента у подопытных животных не обнаружено признаков интоксикации и нарушения поведения. При осмотре тушек убитых по окончании эксперимента подопытных животных макроскопических изменений внутренних органов не выявлено. Таким образом, определить субхроническую токсичность и кумулятивные свойства ФБС не удалось.

3.5.2.3 Хроническая токсичность Фузобаксана

Изучение хронической токсичности ФБС свидетельствует о том, что при длительном поступлении ФБС не вызывает каких-либо изменений в организме животных. Введение животным ФБС в суммарной дозе 45 мл/гол для белых крыс и 225 мл/гол для кроликов не вызывало признаков интоксикации и гибели. Это еще раз подтверждает отсутствие кумулятивных свойств

препарата. При длительном (60 сут) введении ФБС крупному рогатому скоту (в суммарном объеме 1080 мл/гол) никаких изменений в их клиническом состоянии не обнаруживали, корм и воду принимали охотно. Болезненности на местах введения ФБС не регистрировали.

Обобщенный анализ результатов экспериментов на белых крысах, кроликах и крупном рогатом скоте дополнительно подтверждает, что ФБС не обладает кумулятивным свойством и относится к низкотоксичным лекарственным средствам.

3.5.2.4 Кожио-раздражающее действие Фузобаксана

При определении кожно-раздражащих свойств ФБС, нанесением на кожу и слизистую оболочку кроликов-альбиносов и белых мышей ФБС и плацебо, каких-либо функциональных нарушений кожи и слизистых оболочки глаза не отмечено, что свидетельствует об отсутствии кожно-раздражающих свойств препарата.

3.5.2.5 Изучение возможных отдаленных последствий при применении Фузобаксана (мутагенное, эмбриотоксическое, тератогенное и иммунотоксическое действия)

При оценке мутагенной активности ФБС с использованием теста Эймса, согласно общепринятой методики по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности, сравнением числа колоний в опытных и контрольных чашках Петри установлено, что ФБС не обладает мутагенной активностью.

В процессе опытов по изучению эмбриотоксического, тератогенного и иммунотоксического действий ФБС установлено, что количество спариваний в опытных и контрольных подгруппах было аналогичными, беременными были все 100% самок. Клиническое состояние животных, получавших ФБС, не отличалось от контрольных, следовательно препарат не оказывает отрицательного воздействия на клиническое состояние беременных белых крыс. Показатели размеров плодов (вес, длина) в опытных и контрольных группах на 15 и 20 сут внутриутробного развития и в первые сутки после рождения, существенно не отличались. При осмотре половых органов во время беременности видимых отличий не обнаружено. Потомство развивалось без отклонений и сохранность приплода в течение 20 сут была 100%.

Обобщенный анализ результатов проведенных исследований позволяет констатировать, что ФБС при введении в организм животных в дозе, в 4 раза превышающей терапевтическую, не проявляет выраженного эмбриотоксического и тератогенного действий.

Изучение возможного иммунотоксического действия фузобаксана и масляной основы фузобаксана (плацебо) с использованием белых мышей (СВА х С57В176), согласно «Методическим указаниям по оценке иммунотоксического действия фармакологических средств» [14] свидетельствует, что ФБС не оказывает иммунотоксического действия.

3.5.3 Определение массовой доли тилозина и подлинности компонентов активно действующего вещества в Фузобаксане

Результаты определения количества АДВ образцов трех серий ФБС и качества АДВ в составе ФБС жидкостной хроматографией сЕ.идетельство-вапи о сохранности активности препарата в течение года.

Данные определения количества и подлинности компонентов ФБС в сравнении со стандартным образцом тилозина методом жидкостной хроматографии через 46 сут хранения при 50"С представлены на рисунках 7 и 8. В первой хроматограмме (рис.7) представлены результаты исследования стандартного образца, во второй (рис.8) -водно-спиртовой вытяжки ФБС.

Время Компонент Площадь пика Сумма площадей по группам

6,46 Тилозин С 7,614

10,61 Тилозин В 159,553

12,98 Тилозин О 1,949

17,40 Тилозин А 1629,16 1798,276

17,04 Неизвестный компонент 1 1,899

22,23 Неизвестный компонент 2 13,391 15,29

Рисунок 7 - Данные хроматограммы стандартного образца тилозина и площадей

пиков

Время Компонент Площадь пика Сумма площадей по группам

6,40 Типозин С 7,8948

10,65 Тилозин В 14930845

12,94 Тилозин й 2,3664

17,54 Тилозин А 1543,17925 1702,75

14,71 Неизвестный компонент 1 1,55465

22,23 Неизвестный компонент 2 139,4663 141,02

Рисунок 8 - Данные хроматограммы образца Фузобаксана п площадей пиков

Массовую долю тилозина в препарате в процентах вычисляли по формуле:

с„х к х 100 0/о в^х т

Боб - сумма площадей пиков изомеров тилозина на хроматограмме испытуемого раствора;

8СТ - сумма площадей пиков изомеров тилозина на хроматограмме стандартного раствора;

Сст_ концентрация изомеров тилозина в стандартном растворе мг/мл

ш - навеска фузобаксана в мг

К - коэффициент разведения (400)

!т75хЦс400 хюо = 18,94 (%) 1798,28 х 2000

Подсчеты с использованием существующей формулы показали, что количество действующего вещества в испытанных образцах составляет 18,94% ( 96% от исходного уровня).

Анализ полученных данных свидетельствует, что при хранении Фузобаксана в течение 46 сут при 50°С, что равносильно 12 мес хранения при температуре 5-10°С, достоверных изменений в содержании активно действующего вещества ФБС не регистрируется. В компонентном составе тилозина-тартрата (фракций С, В, Д, А), также существенных изменений не происходит, что соответствует условиям, предусмотренным ТУ.

3.5.4 Определение активности действующего вещества Фузобаксана и стабильности эмульсии в зависимости от сроков хранения

Результаты микробиологических исследований с использованием тест-бактерий Мисгососсш Меш АТСС 9341 позволяют констатировать, что активность ФБС при хранении в течение расчетного времени (12 мес) снижается всего на 1-2 % от исходного уровня.

Во всех тестируемых сериях ФБС отделение водной фазы не регистрируется, что свидетельствует о стабильности эмульсии.

3.5.5 Изучение фармакокинетики Фузобаксана

При изучении фармакокинетики ФБС микробиологическим методом установлено, что максимальный уровень антибиотика регистрировали в

мышцах в месте введения, через 24 ч в сыворотке крови и 36 часов в печени, легких, почках и моче. В последующем регистрировали снижение тилозина, однако он сохранялся в бактерицидной дозе для возбудителя некробакгериоза в месте введении до 48 часов.

Обнаружение АДВ ФБС длительное время в почках и моче свидетельствует, что он выводится из организма через почки.

Полученные данные позволяют констатировать, что при внутримышечном введении в организм животных ФБС в дозе 0,2 мл/10кг, бактерицидная концентрация действующего вещества по отношению Б. песгорЬошш сохраняется в течение 2 суток.

Отсутствие статистически значимых изменений качественных и биохимических показателей мяса животных после введения ФБС позволяет использовать его без ограничения через 8 сут, а молоко через 5 сут, после последнего его введения.

3.5.6 Определение оптимальной терапевтической дозы Фузобаксана при экспериментальном некробакгериозе кроликов

Опыты проведены с использованием 15 кроликов ж.м. 2-2,5 кг, разделённых на 5 групп по 3 головы в каждой. Всех кроликов заражали суточной суспензией культуры Р.песгорЬогиш по 1 мл в основание ушной раковины. Лечение заражённых животных осуществляли с момента проявления клинических признаков заболевания. ФБС вводили животным 1-4 групп в дозах: 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 мл/кг один раз в сутки, 5-ая группа кроликов служила контролем, их лечению не подвергали (табл. 4).

Таблица 4 - Оптимальная терапевтическая доза Фузобаксана при _экспериментальном некробакгериозе кроликов _

№гр. Доза ФБС, мл/Юкг Количество животных в группе, гол. Дней лечения Выздоровело / пало,гол.

1 0,1 3 9 0/3

2 0,15 3 9 1/2

3 0,2 3 5 3/0

4 0,25 3 5 3/0

5 Контроль 3 - 0/3

Клиническими исследованиями установлено, что животные, получавших ФБС в дозах ОД и 0,25 мл/кг, соответственно, все выжили, а курс лечения составил 5 дней. Кролики контрольной группы пали на 7-9 сут опыта.

Таким образом, наиболее эффективной и целесообразной дозой является 0,2 мл/Юкг живой массы.

3.5.7 Определение оптимальной терапевтической дозы Фузобаксана при некробакгериозе крупного рогатого скота

Эксперименты проводили в условиях стационарно неблагополучных хозяйств, где некробактериоз был установлен лабораторными исследованиями. Для эксперимента были отобраны 3 группы животных с различной степенью поражения пальцев и копытец: начальной, средней и тяжёлой. Животные с легкой степенью были разделены на 5 групп по 7 голов в каждой, 1-5-й группам внутримышечно один раз в сутки вводили ФБС в дозах:

0,11; 0,14; 0,17; 0,20; 0,22 мл/10 кг живой массы в область бедра пораженной конечности (табл. 5).

Таблица 5 - Оптимальная терапевтическая доза ФБС при легкой степени

№гр. Доза ФБС, мл/10 кг Животных в группе, гол. Кратность обработок/сут лечения Выздоровело гол/%

1 0,11 7 4/10 6/85,7

2 0,14 7 4/10 7/100

3 0,17 7 3/7 7/100

4 0,20 7 2/5 7/100

5 0,22 7 2/5 7/100

А ШПииЛ^ 1\11V ... — —" -г-1------/--- I----

остальными дозировками, отмечены при инъекции ФБС в дозах 0,2,0,22 мл/10 кг живой массы. При этом терапевтический эффект обнаруживался после первой инъекции, а клиническое выздоровление всех больных животных отмечали на 5 сут лечения.

Результаты проведенных экспериментов позволяют констатировать, что оптимальной лечебной дозой ФБС при легкой степени поражения пальцев некробактериозом является 0,20 мл/10 кг живой массы.

Для отработки оптимальной терапевтической дозы ФБС при средней и тяжёлой степени некробактериоза были отобраны 3 группы по 10 животных со средней степенью и 3 группы по 5 голов с тяжёлой степенью поражения. Животным 1-3 групп вводили ФБС один раз в сутки в дозах 0,17; 0,20; 0,22 мл/10 кг в область бедра поражённой конечности (табл.6).

Таблица 6 - Оптимальная терапевтическая доза ФБС при средней и тяжёлой степени некробактериоза

Средняя степень поражения Тяжелая степень поражения

N2 Ф Доза ФБС, мл/10 кг Животных в группе, гол. Кратность обработок/ сут лечения Выздоровело,г ол/% Животных в группе, гол Кратность обработок/ сут лечения Выздоровело, гол/%

1 0,17 10 4/13 8/80 5 8/20 2/40

г 0,20 10 3/11 8/80 5 7/17 2/40

3 0,22 10 3/11 8/80 5 7/17 2/40

при срсдпсп иирол^ппл —— -------—----------—

дозах 0,20 и 0,22 мл/10 кг ж.м. отмечали выздоровление 80% больных животных. Исходя из полученных результатов, наиболее эффективной и экономически целесообразной оказалась доза 0,20 мл/10 кг живой массы. Рецидивов заболевания среди выздоровевших животных за период наблюдения (30 сут) не регистрировали.

При тяжёлой степени поражения пальцев и копытец некробактериозом при 7-8 кратных инъекциях ФБС в дозах 0,17; 0,20 и 0,22 мл/10 кг эффективность лечения составила 40 %.

Анализ данных проведенных экспериментов свидетельствует, что 2-3-х кратное внутримышечное введение ФБС из расчёта 0,2 мл/10 кг ж.м. при легкой степени поражения пальцев некробактериозом обеспечивает

клиническое выздоровление 100% больных животных, при средней — 80%. При тяжелой степени некробакгериоза применение ФБС даже в сочетании с хирургической обработкой пораженной конечности не всегда дает желаемые результаты и экономически не целесообразно.

3.5.8 Влияния Фузобаксана на клинический статус, гематологические, биохимические показатели крови и функционально-метаболическую активность лейкоцитов крови

Исследования влияния ФБС на клинический статус проводили на кроликах и крупном рогатом скоте.

Животным опытных и контрольных групп ФБС вводили внутримышечно: кроликам в дозе 0,5 мл/кг живой массы, что соответствует терапевтической дозе; крупному рогатому скоту в дозе 15 мл/гол (выше терапевтической в 2 раза). Исследования проводили при одно- и многократном введении ФБС. Контрольным животным вводили плацебо.

В ходе экспериментов клинических отклонений в состоянии кроликов и крупного рогатого скота не обнаружено. В динамике лечения больных коров ФБС наблюдалось увеличение содержания в крови количества эритроцитов и гемоглобина, соответственно до 5,63х1012л и 91,0 г/л. Бактерицидная активность и опсоно-фагоцитарный индекс имели тенденции к снижению на 8,5% и 7,2%, соответственно. Изменения в лейкоформуле у подопытных животных характеризовались повышением процентного содержания нейтрофилов за счет сегментоядерных клеток, у кроликов от 33,6 до 38,0%, у крупного рогатого скота - от 33,3 до 31,2%.

При патологоанатомическом осмотре органов, тканей и слизистых оболочек кроликов после эвтаназии через 1 и 7 сут после последнего введения ФБС макроскопических изменений не обнаруживали.

3.5.9 Ветеринарно-санитарная экспертиза качества мяса при введении Фузобаксана

Исследование проб мяса проводили через 24 ч после убоя животных, учитывая внешний вид, цвет, консистенцию и запах. При этом визуально туши опытных бычков не отличались от контрольных.

При микроскопии мазков-отпечатков с поверхности туш опытных и контрольных животных обнаружены единичные кокки, которые отсутствовали на мазках-отпечатках, сделанных с глубины мышц. Ни в одном случае сальмонеллы и кишечные палочки не выявлены.

Установлено, что рН мяса контрольных и опытных животных существенно не отличался (5,9-6,0); коэффициент кислотности-окисляемости равнялся 0,5; реакция с пероксидазой была слабой; реакция с 5%-ым раствором сульфата меди-отрицательная. По химическому составу в мясе контрольных и опытных животных содержалось воды -74,8-75,4%; белка -19,4-21,1%; жира - 3,3-3,5%.

При проведении пробы варки было установлено, что бульон мяса опытных и контрольных животных прозрачный, ароматный, на его поверхности были видны капельки жира.

Биологическая проба показала, что как свежее, так и проваренное мясо, полученное после введения ФБС в дозе ОД мл/10кг, не оказывает отрицательного воздействия на рост и развитие крысят.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетель-ствуют, что введение ФБС не приводит к изменениям качественных и биохимических показателей мяса животных и позволяет использовать его в пищу без ограничения через 8 сут после последнего введения препарата.

3.5.10 Испытание терапевтической эффективности Фузобаксана в сравнении с зарубежными и отечественными аналогами

Испытание лечебной эффективности ФБС при некробактериозе крупного рогатого скота проводили в условиях сельхозпредприятий 16 регионов РФ.

В качестве контроля проводили лечение крупного рогатого скота антибактериальными препаратами, используемыми при некробактериозе: Окситетрациклин гидрохлорид внутримышечно, два раза в сутки; Бициллин-3, один раз ч/з 3 сут, Некрофарм и Террамицин ЬА согласно инструкции по применению, а также препараты зарубежного производства, сертифицированные в Российской Федерации - Цефтонит и Тиеркол.

Анализ результатов исследований позволяет констатировать, что для лечения животных с БПК в легкой степени поражения использование Фузобаксана, Террамицина ЬА, Некрофарма, Тиеркола, Цефтонита было эффективно в 100% случаях. При лечении этими препаратами животных со средней степенью БПК эффективность была на уровне 87,5-94,2%. Однако, дорогостоящие препараты тиеркал и цефтонит, а так же некрофарм и террамицин ЬА, приходится вводить в больших дозах в несколько точек, но даже, несмотря на это, в месте введения образуются очаги некроза.

Анализ данных клинических исследований, срока лечения и терапевтической эффективности в опытных и контрольных группах свидетельствует, что применение ФБС в оптимальной дозе позволяет сократить сроки лечения БПК при легкой степени на 2,9-6,1 сут, а при средней - на 5,7-6,6 суток. Терапевтический эффект был выше на 5,9-12,3 % при легкой степени и на 25,4-29,4 % - при средней степени поражения конечностей некробактериозом, чем при применении бициллина-3 и окситетраииклина гидрохлорида, соответственно.

Экономическая эффективность применения ФБС при БПК из расчета на 1 рубль затрат составляет 15,88 рублей.

На основании полученных результатов составлена НД на препарат, которые рассмотрены и одобрены НМС ФГБУ ФЦГРБ-ВНИВИ, согласованы ВГНКИ и утверждены Россельхозназором (Свидетельство о регистрации ПВР-3-5.11/02717. Сертификат соответствия № РОСС 1Ш. ВП01.Н00338).

3.6 Разработка препарата наружного применения для лечения крупного рогатого скота при некробактериозе и болезнях пальцев

При БПК и некробактериозе средней и тяжелой степени возникают серьезные деструктивные изменения в тканях, что обуславливает

необходимость хирургического вмешательства с использованием эффективных средств местной терапии.

В качестве лечебного препарата для местного наружного применения мы разработали комплексный препарат Фузосан - гигроскопический порошок в форме присыпки, состоящий из сульфатов магния, натрия, меди, цинка и поливинилового спирта, обладающий кровоостанавливающим, противовоспалительным, дренирующим и антисептическим свойствами.

Для лечения больных животных после хирургической обработки Фузосан накладывали на пораженный участок с марлевой салфеткой и фиксировали легкой повязкой. Перевязку препаратом повторяли через три дня до появления здоровой грануляции и использовали регенерирующие мази.

Определение лечебной эффективности Фузосана осуществляли в контролируемых производственных опытах в 11 неблагополучных по БПК и некробактериозу хозяйствах с поголовьем 1883 больных животных. Эффективность Фузосана при лечении БПК средней степени колебалась от 89,6 до 98,7%. В контроле при обработке 1090 больных животных другими препаратами (присыпка Плахотина, Островского, мазь, Вишневского, некрогель, чеми-спрей ) лечебная эффективность варьировала от 71,1 до 95,3% и в среднем равнялась 83,4%. В контрольных группах выздоровление наступало на 10-16, а в опытной группе - на 8-14 сутки.

Экономическая эффективность лечения крупного рогатого скота Фузосаном из расчета на 1 рубль затрат составляет 5,39 рублей.

Высокая эффективность лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан позволила нам разработать алгоритм лечения БПК (рис.9), который используется нами в неблагополучных по БПК и некробактериозу хозяйствах.

3.7 Разработка комплекса специфических и общехозяйственных мероприятий при некробактериозе и болезнях пальцев крупного рогатого скота

Анализ многолетних клинико-эпизоотологических исследований свидетельствует, что неудачи по оздоровлению хозяйства от БПК и некробактериоза связаны с отсутствием системы и планомерности проводимых мероприятий. В связи с этим, нами разработаны рекомендации по оздоровлению крупного рогатого скота от некробактериоза и БПК, включающие комплекс неспецифических и специфических мероприятий (общехозяйственных, зоогигиенических, ветеринарно-санитарных) с лечением больных животных препаратами Фузобаксан и Фузосан и поголовной вакцинацией скота ФЭВ в случае установления некробактериоза. Такой подход позволил полностью ликвидировать клиническое проявление некробактериоза и значительно снизить количество БПК во многих сельхозпредприятиях различных регионов РФ.

При оздоровлении хозяйств, неблагополучных по не]сробактериозу и БПК, использовали схему оздоровительных мероприятий, представленную на рисунке 10. На основе этой схемы для каждого сельхозпредприятия составляли план лечебно-профилактических мероприятий, которые

Рисунок 9 - Алгоритм лечения БПК Условные обозначения: + положительный результат; - отрицательный результат; НКБЗ-некробактериоз; Н - БПК незаразной этиологии; ФЗС - фузосан; ФБС - фузобаксан.

Рисунок 10 - Схема оздоровительных мероприятий

проводили с учетом причинно-следственных факторов, вызывающих БПК и некробактериоз.

Исследованиями установлено, что проведение такого комплекса мероприятий позволяет своевременно устранять основные причины возникновения БПК и некробактериоза, требует меньших материальных затрат, надежно профилактирует возникновение инфекции и способствует оздоровлению поголовья КРС сельхозпредприятий в короткие сроки.

Так, использование в течение 2 лет ножных ванн снижало % БПК на 24%, активный моцион - на 16, обрезка и расчистка копытец - на18%, а использование ФБС и ФЗС сводило БПК до единичных случаев.

Таким образом, комплексное применение специфических и общехозяйственных мероприятий при некробактериозе и БПК позволяет получить максимальный эффект при профилактике и лечении этих болезней.

3.8 Экономическая эффективность мероприятий при некробактериозе и болезнях пальцев крупного рогатого скота

В хозяйствах Республики Татарстан БПК незаразной этиологии и некробактериоз регистрируются у 10-25% откормочных бычков и маточного поголовья крупного рогатого скота. Эти заболевания приводят к снижениям: молочной продуктивности -на 20-40%, привесов - на 30-35%, выхода телят -на 17%, выбраковка увеличивается - на 35-40%, сервис-период в 2 раза, теряется генофонд, т.к. болеют самые продуктивные животные.

Так, в 2010 году в сельхозпредприятиях 34 районов Республики Татарстан имелось: дойных коров - 246 541 голов, нетелей - 65 000 голов. Итого- 311 541 голов. При заболевании 10% поголовья убытки от снижения молочной продуктивности, при удое 5 000 кг, составили 295 849 200 рублей; от снижения выхода приплода (17%) 16764 720 рублей; убыток от увеличения сервис-периода в 2 раза - 17 750 880 рублей; от выбраковки коров (35%) - 129 433 500 рублей.

Таким образом, потери от БПК и некробактериоза по республике составили 459 798 300 рублей. Профилактическая работа по предотвращению болезни пальцев и копытец у 311 541 голов коров и нетелей составила: по обработке и чистке копытец 62 308 200 рублей; лечению БПК средней степени тяжести-15 901 830 рублей.

Итого на профилактику и лечение БПК необходимо затратить денежных средств 78 210 030 рублей.

Экономический эффект при своевременной профилактике БПК составляет: 459 798 300 рублей - 78 210 030 = 381 588 270 рублей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании результатов исследований были сделаны следующие выводы:

1. Клинико-эпизоотологическими и лабораторными исследованиями около 700 тыс. голов крупного рогатого скота в 613 сельхозпредприятиях 18 регионов Российской Федерации установлено, что заболеваемость скота

некробактериозом и БПК незаразной этиологии достигает 80%. Возникновение и распространение болезней проявляется хромотой, гнойно-некротическими процессами на кожных покровах, паренхиматозных органах и слизистых оболочках, обусловлены снижением общей резистентности организма на фоне нарушения обменных процессов вследствие несбалансированного кормления, неудовлетворительных санитарно-гигиенических условий содержания, травматизма, отсутствия моциона и наличия источников высоковирулентного возбудителя некробактериоза и др.

2. Обследованием биологического материала, полученного из неблагополучных сельхозпредприятий, выделены 415 патогенных изолятов Р.песгорЬогит и зарегистрирован некробактериоз, а в остальных случаях имели место БПК незаразной этиологии. На основании результатов изучения биологических, иммуногенных, антигенных свойств, ростовой активности в процессе культивирования и молекулярно-генетического анализа из 130 изолятов отобраны 2 штамма («8Т8630501» и «12Т8К630501»), которые депонированы в НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» для использования в качестве производственных при изготовлении средств диагностики и специфической профилактики некробактериоза.

3. Источником возбудителя и основным резервуаром некробактериоза являются больные животные и бактерионосители.

В этиологии и патогенезе некробактериоза, помимо основного возбудителя Б. песгорЬогит, важную роль играют сапрофитные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, формирующие ассоциации, значительно осложняющие патологический процесс.

Для ускоренной диагностики некробактериоза и дифференциации БПК незаразной этиологии предложены - специальная транспортная среда и усовершенствованный метод биопробы на белых мышах и кроликах.

4. Разработана технология изготовления питательной среды на основе не пищевого сырья - ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы стельных коров (ФГМПЭМ) для культивирования и наработки бактериальной массы Р. песгорЬогит в биореакторах, характеризующаяся высокими питательными свойствами для роста Р. песгорЬогит с высокой биологической активностью. Использование разработанной среды в 4,8 раза экономичнее по сравнению с бульоном Хоттингера и позволяет в биореакторах небольшой емкости получать выход бакмассы в 1,7 раза и внеклеточного белка в культуральной жидкости в 1,4 раза больше, чем при периодическом культивировании.

5. Разработана технология изготовления формол-эмульсионной вакцины (ФЭВ) против некробактериоза, состоящая из комплексных антигенов генетически маркированных штаммов Р. песгорЬогит «8Т8630501» и «12Т8К630501», обладающих широким спектром антигенной и иммуногенной активности, эмульгированных в масляном адъюванте. Вакцина ареактогенна и безвредна для животных в десятикратной прививочной дозе. Иммуногенность производственных серий формол-эмульсионной вакцины против

некробактериоза доказана методом прямого заражения восприимчивых животных - белых мышей, кроликов и телят 6-7 мес возраста.

6. Оптимальной иммунизируюшей дозой ФЭВ при однократном внутримышечном введении крупному рогатому скоту старше 6 - месячного возраста является 2 мл/гол. Длительность поствакцинального иммунитета составляет 6 месяцев. Для поддержания иммунного статуса у привитых животных перспективной является ревакцинация в дозе 2 мл за 1 мес до предполагаемого окончания срока иммунитета. Вакцинация ФЭВ создает у животных иммунитет и провоцирует скрытые формы течения некробактериоза, тем самым предупреждаются рецидивы болезни и распространение инфекции животными бактерионосителями.

7. Однократная иммунизация животных обуславливает формирование некробактериозных антител у 95% животных, которые достигают максимальных титров на 21-30 сут и сохраняются на достаточно высоком уровне в течение 6 месяцев. Через 14-30 сут после иммунизации у вакцинированных животных максимально возрастает концентрация иммуноглобулинов классов биМи происходит увеличение всего пула Т- и В-лимфоцитов, одновременно возрастает интенсивность фагоцитоза нейтрофилов крови. Наличие противонекробактериозных антител в сыворотке крови в РА в титре 1:80 и выше в комплексе с высокими показателями естественной резистентности обеспечивает защиту животных от некробактериоза и оздоровление поголовья животных неблагополучных хозяйств. Вакцина зарегистрирована в РФ, сертифицирована, НД согласована ВГНКИ и утверждена Россельхознадзором.

8. Разработана технология изготовления, контроля и применения антибактериального препарата Фузобаксан для парентерального лечения крупного рогатого скота при некробактериозе и БПК незаразной этиологии, осложненных микробами-ассоциантами. Бактерицидная активность Фузобаксана в отношении Р. песгорЬошт и бактерий-ассоциантов, участвующих в патологии пальцев и копытец, колеблется от 1 до 2 мг АДВ/мл. Средняя летальная доза Фузобаксана при подкожном введении белым мышам составляет- 5,25 г/мл, при подкожном и внутримышечном введении белым крысам - 17,25 г/кг и 11,1 г/кг, соответственно. При внутримышечном введении крупному рогатому скоту Фузобаксан даже в 50 -кратной терапевтической дозе не оказывает токсического действия. Согласно ГОСТу-12.1.007-76 препарат соответствует 4-му классу опасности.

9. Введение Фузобаксана в терапевтической дозе (0,2 мл/10 кг массы тела один раз в сутки в течение 3-5 дней) обеспечивает 100% эффективность лечения при легкой степени поражения и выздоровление в 80 % случаях при средней степени поражения пальцев и копытец. Препарат обладает пролонгированным действием. Максимальная концентрация АДВ в сыворотке крови достигается через 1 ч, удерживается в терапевтической концентрации в течение 24 ч и выводится из организма в основном с желчью и мочой, а у лактирующих коров - частично с молоком. Убой животных на мясо

допускается через 8 сут после последнего введения препарата. Препарат зарегистрирован в РФ, сертифицирован, НД на Фузобаксан одобрена НМС ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ», ВГНКИ и утверждена Россельхознадзором.

10. Разработана рецептура и технология изготовления комплексного препарата Фузосан для наружного применения при лечении БГПС и некробактериоза. Фузосан в дозе 3-6 г/гол при лечении БПК и некробактериоза не вызывает побочных действий, нарушений жизненно важных функций в организме животных и обеспечивает заживление гнойно-некротических ран в течение 5-7суток. НД для широкого производственного испытания Фузосана в условиях РТ рассмотрена и утверждена ГУВ КМ РТ.

11. Разработана система диагностических, организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий, направленных на оздоровление неблагополучных сельхозпредприятий от БПК с использованием формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза и лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан, позволяющая в течение 1,5-2 лет полностью ликвидировать некробактериоз и снизить до минимума случаи возникновения болезней пальцев и копытец незаразной этиологии.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены в ветеринарную практику «Формол-эмульсионная вакцина против некробактериоза крупного рогатого скота» и лекарственный препарат «Фузобаксан».

По материалам исследований по разработке и применению вакцины и лечебного препарата Фузобаксан разработаны, согласованы ВГНКИ и утверждены Россельхознадзором следующие нормативные документы:

-«Технические условия на формол-эмульсионную вакцину против некробактериоза крупного рогатого скота (ТУ 9384-001-00492374-2008);

-«Инструкция по применению формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота»;

- Технические условия на Фузобаксан (ТУ 9337-001-00492374-2011);

-«Инструкция по применению Фузобаксана для лечения некробактериоза крупного рогатого скота».

В целях широкого производственного испытания лечебного препарата Фузосан в условиях сельхозпредприятий Республики Татарстан утверждены ГУВ КМ РТ Технические условия и Инструкция по его применению.

2. На основании полученных результатов исследований разработаны и внедрены в ветеринарную практику следующие методические рекомендации и учебные пособия:

-«Методические рекомендации по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза», обсуждены и одобрены Методическим советом ФГНУ ВНИВИ (2004 г.);

-Методические рекомендации «Применение ЯАРО-ПЦР анализа для молекулярно-генетического картирования культур РаадЬааепит песгорЬошт», рассмотренные и утвержденные подсекцией «Инфекционная

патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2006 г.);

-«Молекулярно-генетическое картирование культур Fusobacterium necrophorum», рассмотрены и одобрены НМС ФГУ «ФЩРБ» и Ученым Советом ГНУ ИЭВС и ДВ СО ВАСХН (протокол № 5 от 14.09.2006);

- Методическое руководство «Некробактериоз животных, мероприятия по оздоровлении хозяйств», рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, (2008 г.);

- Методические рекомендации «Диагностика, лечение и профилактика болезней конечностей крупного рогатого скота», рассмотрены и одобрены научно-методическим советом ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (2010 г.);

- Методические рекомендации по оценке поствакцинального иммунитета и диагностике некробактериоза животных», утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (2011 г.);

-Учебное пособие «Диагностика, лечение и профилактика болезней пальцев и некробактериоза высокопродуктивных коров», рассмотрено, одобрено и рекомендовано к изданию секцией « Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук (2013 г.).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анакина, Ю.Г. Причины и пути предупреждения болезней конечностей у скота в условиях интенсивной технологии: Обзор иностранной литературы / Ю.Г. Анакина // Ветеринария. -1989. - С. 68-70.

2. Гимранов, В.В. Патоморфологическая и ультраструктурная характеристика гнойно-некротических процессов в области пальцев у крупного рогатого скота: монография / В.В. Гимранов, C.B. Тимофеев, Г.Р. Шакиров. - Уфа: ФГОУ ВПО Баш-ГАУ и ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.А. Скрябина, 2009. -160 с.

3. Бакулов,И.А. Рекомендации по методике эпизоотического исследования / И.А. Бакулов, Г.Г.Юрков,А.П.Песковецкий.-Покров,-1979.-75с.

4. Иванов, A.B. Диагностика, лечение и профилактика болезней пальцев и некробактериоза высокопродуктивных коров /Учебное пособие./А.В. Иванов, Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин, C.B. Шабунин, Ю.Н.Алехин - Воронеж: издательство «Истоки»,-2013-132 с.

5. Макаев, Х.Н. Разработка средств диагностики, лечения и профилактики некробактериоза крупного рогатого скота / Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин, Е.К. Акимов и др. // Труды 1-го съезда вет. врачей РТ. - Казань, 2001. - С. 152-159.

6. Мельник, Н.В.. Некробактериоз животных - мероприятия по оздоровлению хозяйств /Методическое руководство/ Н.В. Мельник, Ю.Д. Караваев, ИЛСеменова, A.A. Плохова и др. - М., 2009 - 39 с.

7. Методические указания по - лабораторной диагностике некробактериоза. (Утверждены ГУВ Агропрома СССР,01.06.1987) -М.,1987.-5с.

8. Методические указания по комплексной диспансеризации крупного рогатого скота. М. 1988 -20 с.

9. Самоловов, А.А. Некробактериоз животных /А.А. Самоловов. -Новосибирск: Сибирь, 1993. - 128 с.

10. Самоловов, А.А. Хромота, болезни копытец, некробактериоз молочных коров / А.А. Самоловов, С.В. Лопатин // Ветеринария.- 2013. - №6. - С. 28-31.

11. Соломаха, О.И. Некробактериоз комплексное решение проблемы / О.И. Соломаха, Л.В. Кириллов // Аграрная Россия. - 2001. - №3. - С. 38-41.

12. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов/ М.А.Сидоров, Д.И.Скородумцев, В.Б.Федоров -М.:Колос,1981.-96 с.

13. Сидорчук, А.А. Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного рогатого скота: рекомендации / А.А. Сидорчук, Д.П. Аголори, Д. Панасюк и др. - М. Колос. - 2000. -14 с.

14. Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев, Е.В. Арзамасцев, Э.А. Бабаян и др. - М.: ФГУ НЦЭСМ, 2005. - 829 с.

15. Gunter, М. Erfahrungen beim Einsatz eines Verbandschutzes und des "Kleiberfehrens" bei der Behandlung von Klauenkrankheiten / M Gunter, R Kastner // Mh. Veter. Med. - 1983. - N. 38. - P. 822-814.

17. Ledecky, V. Dermatitis digitalis in cattle / V. Ledecky, A. Orsag // Folia Veterinada. -1997. - Vol. 41. - N. 1-2. P. 51-53.

16. Russell, A.M. Survey of lameness in British dairy cattle. /Russell A.M, Roulands G.J, Shaw S.R. et al. // Veter. Record. - 1982. - V.l 1. - N 8. - P.155-160. 19. Shearer, J. Laminitis More than How You Feed Your Cows (Laminitis, Claw Disorders, and Infectious Foot Diseases) / J. Shearer // Proceedings 2nd Florida Dairy Road Show. College of Veterinary Medicine University of Florida, Gainesville, FL. - 2005. - P. 8-21.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ Статьи в российских рецензируемых журналах из Перечня ВАК

1. Макаев, Х.Н. Оценка уровня специфических антител против некробактериоза в сыворотке крови иммунизированных животных / Х.Н.Макаев, Д.А.Хузин, Е.К.Акимов.//Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана.- Казань. - 2003.-Т. 174. - С. 22-26.

2. Коннов, М.Н. Инфекционный баланопостит крупного рогатого скота смешанной этиологии. / М.Н.Коннов, В.Г.Гумеров, Х.Н.Макаев, Д.А.Хузин, Х.З.Гаффаров, М.Ш.Шакуров // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана - Казань. - 2003.-Т. 175. -С.87-92.

3. Акимов, Е.К. Сравнительная оценка методов выявления антител при некробактериозе / Е.К.Акимов. Х.Н.Макаев, Д.А.Хузин, Н.А.Хисматулпина, В.Г.Гумеров, А.К.Галиуллин, В.В.Сабирова // Ветеринария. - 2005.- №1.- С. 28-29.

4. Семенихин, В.И. Исследования геномного полиморфизма изолятов Fusobacteríum necrophorum в Приволжском регионе / В.И.Семенихин, Д.А.Хузин, Х.Н.Макаев, С.А.Юрик, Е.В.Дударева // Сибирский Вестник с.-х. науки. - Новосибирск. - 2005. - № 4. -С. 131-135.

5. Семенихин, В.И. Выявление гена гемагглютинииа Fusobacteríum necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции / В.И.Семенихин, Д.А.Хузин, С.А.Юрик, Х.Н.Макаев, Е.В.Дударева // Сибирский Вестник с.-х. науки. - Новосибирск. - 2005. - № 3. - С.83-87.

6. Макаев, Х.Н. Влияние иммуномоделирующих препаратов на резистентность организма животных при вакцинации против некробактериоза / Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин и дрУ/Ветеринарный врач.- 2005,- №4,- С.34-36.

7. Хузин, Д.А. Роль дифференциальной диагностики болезней копытец в борьбе с некробактериозом крупного рогатого скота / Д.А.Хузин // Ветеринарный врач. - 2006.- №4. - С.14-16.

8. Семенихин В.И. Генетический полиморфизм ДНК культур Fusobacteríum necrophorum по данным RAPD-анализа / В.И.Семенихин, С.А.Юрик, Д.А. Хузин // Доклады Российской академии с/х наук. — Новосибирск.- 2007. - № 2. - С.43-45.

9. Семенихин, В.И. Исследование полиморфизма оли гомеров культур Fusobacteríum necrophorum / В.И. Семенихин, Д.А. Хузин, С.А. Юрик, А.В.Мокеева, О.С. Воронова, Е.В.Дударева // Сибирский Вестник с.-х. науки. - Новосибирск.- 2007. - №3. - С. 76-82.

10. Макаев, Х.Н. Иммуномодулирующие средства при вакцинации животных против инфекционных болезней / Х.Н.Макаев, Э.Г.Зиатдинов, Р.А.Асрутдинова, Д.А.Хузин, А.Г.Андреева // Ветеринарный врач. -2007. -№3.- С. 23-26.

11.Семенихин, В.И. Молекулярно генетическая характеристика штаммов / В.И.Семеннхин, С.А.Юрик, Д.А. Хузин, Х.Н.Макаев // Ветеринарная патология.- 2008.- С.181-183.

12. Хузин, Д.А. Опыт оздоровления крупного рогатого скота от массовых заболеваний конечностей в ООО «им. М.Джалиля» Бугульминского района Республики Татарстан / Д.А. Хузин, Ф.А.Хусниев, Д.НЛатфуллин, Н.А.Мухамметшин // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана.- Казань. - 2010.-Т. 208,- С. 307-311.

13. Хузин, Д.А. Принципы организации оздоровительных мероприятий при массовых заболеваниях копытец крупного рогатого скота / Д.А. Хузин, Ф.А.Хусниев, Д.НЛатфуллин, Н.А.Мухамметшин, Р.М.Потехина // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана,- Казань. 2010,- Т. 208,- С. 311-315.

14. Макаев, Х.Н. Принципы лабораторной диагностики некробактериоза / Х.Н.Макаев, Д.А.Хузин, Р.М.Потехина // Ветеринарный врач. - 2010. - №3. — С.33-35.

15. Крюков, С. В. Средства для ветеринарно- санитарных и лечебных мероприятий при заболевании некробактериозом крупного рогатого скота /

С. В Крюков, Н. В. Мельник, Д. А. Хузин // Ветеринарный врач. - 2010. - №4. - С. 7-9.

16. Хузин, Д.А. Этиология, патогенез и меры борьбы с некробактериозом крупного рогатого скота / Д.А.Хузин, Х.Н.Макаев, Ф.А.Хусниев, Д.Н. Латфуллин, H.A. Мухамметшин, Р.М.Потехина // Ветеринарный врач. - 2010. -№5. - С.49-51.

17. Хузин, Д.А. Опыт оздоровления крупного рогатого скота от заболеваний копытец / ДА. Хузин, Н.В.Андреев, Н.Н.Хазипов, А.В.Иванов, Х.Н.Макаев, Д.Н. Латфуллин // Ветеринария. -2011.- №11.- С.20.

18. Сальникова, М.М. Ультратонкое строение возбудителя некробактериоза F. necrophorum / М.М. Сальникова, В.Р. Сайтов, И.Ф. Рахматуллин, ДА. Хузин, Х.Н. Макаев // Ветеринарная патология.- 2012.-№2 (40).-С.52-58.

19. Иванов, A.B. Антисептическое средство 4Hooves для обработки копытец / A.B. Иванов, Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев, H.A. Мухамметшин, Ф.А. Хусниев // Ветеринария. - 2012. - №4. - С. 12-15.

20. Макаев, Х.Н. Профилактическая эффективность различных средств и методов лечения некротических поражений копытец крупного рогатого скота /Х.Н. Макаев, Д.А.Хузин, Р.М.Потехина, H.A. Мухамметшин// Ученые записки Казанской государственной академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2012.-Т. 209. - С.202-206.

21. ХузинДА. Профилактика заболеваний копытец КРС оптимизацией кормления, ухода и содержания / Д.А.Хузин, К.Х. Папуниди, Р.У.Бикташев// //Веткорм. - 2013. - №3,- С.24-25.

22. Хузин, Д.А. Болезни пальцев и копытец у коров их профилактика и лечение/ Д.А. Хузин, Т.Р. Гайнутдинов, Ф.А.Хусниев, Д.Н. Латфуллин и дрУ/ Ветеринарный врач. — 2014.- К» 5.- С.-24-28.

Патенты РФ

23. Патент РФ № 2040273 «Способ получения антигена против некробактериоза крупного рогатого скота»/ Г.Х.Камалов, Д,А.Хузин И.И.Алексеева - Заявлено 28.05.93; опубликовано 25.07.95; БИ № 21 - С 8.

24. Патент РФ № 2043773 «Способ получения вакцины против некробактериоза рогатого скота»/ Г.Х.Камалов, И.И.Алексеева, Д.А.Хузин -Заявлено 01.07.94; опубликовано 20.09.95; БИ № 26 -10 с.

25. Патент РФ №2262936 «Препарат против некробактериоза к.р.с. и респираторных заболеваний телят, способ лечения и профилактики некробактериоза к.р.с. и респираторный заболеваний телят» / Д.А. Хузин, Г.Х., Камалов, Х.Н. Макаев, А.З. Равилов, Д.И.Александров. -Заявлено 17.12.2002; опубликовано 27.10.2005; БИ № 30 - 2 с.

26. Патент РФ №2228743 «Антибактериальная композиция для лечения животных»/Ф.Ю.Ахмадуллина, Л.Н. Валеева, Р.К. Закиров, И.В. Вяткина, Х.Н. Макаев, Д.А.Хузнн. - Заявлено 13.08.2002; опубликовано 20.05.2004; БИ №14. -2с.

27. Патент РФ №2347806 «Штамм бактерий F.necrophorum spp. necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных»/ Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев,

B.И. Семинихин, С.А. Юрик. - Заявлено 18.01.2007; опубликовано 27.02.2009; БИ №6.-9 с.

Монографии

28 Мельник, Н.В. Некробактериоз животных. Мероприятия по оздоровлению животноводческих хозяйств от некробактериоза / Н.В.Мельник, Ю.Д.Караваев, И.Н.Семенов, А.А.Плохова, Д.А.Хузин // Методическое руководство ФГУ «Центр ветеринарии» МСХ РФ, ОАО «Институт биотехнологии ветеринарной медицины», ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - М., 2009.-36 с.

29 Иванов, A.B. Диагностика, лечение и профилактика болезней пальцев и некробактериоза высокопродуктивных коров. Учебное пособие/ А.В.Иванов, Х.Н.Макаев, Д.А Хузин, С.В.Шабунин, Ю.Н.Алехин. - Воронеж: изд-во «Исток», 2013. -132 с.

Статьи в других периодических изданиях, материалах конференций и сборниках научных трудов

Всего опубликовано статей 129, из них наиболее значимые:

30 Хузин, Д.А. Лечение крупного рогатого скота при некробактериозе препаратами «Фузобаксан» / Д.А. Хузин, Г.Х.Камалов // Труды первого съезда ветеринарных врачей РТ.- Казань, 1996.- С.148-151.

31. Макаев, Х.Н. Разработка средств диагностики, лечения и профилактики некробактериоза крупного рогатого скота / Х.Н.Макаев, Д.А. Хузин, Д.И.Александров // Журнал "Ветеринарный врач". - Казань.- 2000. -№ 4. -С.56-60.

32 Хузин, Д.А. Изыскание маркерных локусов ДНК возбудителя некробактриоза/ Д.А. Хузин, Т.Х. Фаизов //Матер, научно-производ. конф. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань. - 2001.-С.102-104.

33. Хузин, Д.А. Меры борьбы с некробактериозом крупного рогатого скота / Д.А. Хузин, Д.И.Александров // Ветеринарный врач. - 2002.- №1(9). -

C.46-49.

34. Макаев, Х.Н. Некробактриоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним/ Х.Н. Макаев, Д.А.Хузин. Слагаемое эффективного агробизнеса: обобщение опыта и рекомендации. Часть 2. Кормопроизводство и животноводство. - Казань.: Фолиант. - 2006.- С. 218-222.

35. Хузин, Д.А. Изучение стабильности препарата фузобаксан / Д.А.Хузин, Х.Н.Макаев, Н.Г.Шангараев // Матер, международной научно-практ. конф. «Актуальные проблемы современной ветеринарии», посвящен. 65-летию ветеринарной науки Кубани. Часть 2. - Краснодар,- 2011.- С. 103104.

36. Иванов, А.В. Болезни копытец крупного рогатого скота и меры борьбы с ним /А.В Иванов, Д.А.Хузни, К.Х.Папуниди, М.М.Сальникова, В.Р.Саитов // Матер. III Международной научно-практ. конф. «Актуальные проблемы с/х горных территорий». - Горно-Алтайск: РИО ГАГУ, 2011.- С. 189197.

37. Хузин, Д.А. Пути оздоровления хозяйств от болезней пальцев и некробактериоза / Д.А.Хузин, Х.Н. Макаев, Гайнутдинов Т.Р., Хузин Р.Д. //Ветеринария сегодня. - Владимир. - 2013. -№4(7) -С.26-28.