Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и сравнительное изучение различныхвариантов иммуноферментного анализа для детекции антигенов вируса гриппа типа А

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и сравнительное изучение различныхвариантов иммуноферментного анализа для детекции антигенов вируса гриппа типа А"

РГ8 ОД

О *7 * * 1 Г. I

1-. .

На правах рукописи

ФИЛИППОВА

Ирина Евгеньевна

Разработка о сравнительное изучите различных вариантов нммупофсрметтгпого апалша для детекцнн антигенов вируса гриппа тшш А

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ

1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гриппа Российской академии медицинских наук. Директор института - доктор биологических наук О.И.Киселев.

Научный руководитель: доктор медицинских наук А.А.Соминина

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Л.Г.Руденко кандидат медицинских наук В.Б.Климович

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский институт микробиологии и эпидемиологии им. Пастера.

Защита состоится " // " ¿¿Н^и 1996 г.

в " " часов на заседании Диссертационного совета Д.074.48.01 НИИ гриппа РАМН ( 197022, Санкт-Петербург,уллроф. Попова

15/17 ).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ гриппа РАМН.

Автореферат разослан "//" 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат ьмэдог и чесни*, наук

Е.Е. Покровская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Грипп продолжает оставаться наиболее массовой и неуправляемой инфекцией, несмотря на определенный прогресс в области разработки средств профилактики этого заболевания. Одной из причин неспособности контролироватьэту инфекцию является отсутствие четких знаний об изменениях, происходящих в вирусной и человеческой популяциях в межэпидемический по гриппу период (Ьеотезй Л.,1986 ).

В последние годы получены новые данные о бессимптомных формах гриппозной инфекции ( Соминина А А. и др., 1994 ), однако,могут ли здоровые вирусоносители бьггь источником инфицирования при гриппе и каков вклад этого явления в развитие эпидемического процесса до конца не выяснено.

Трудности в решении этих вопросов связаны, с одной стороны,с биологическими особенностями вирусов гриппа А, крайне трудно выделяющихся в межэпидемический период и при персистентных формах гриппозной инфекции (Иванова Н.А. и др.,1984;Лузянина ТЛ.идр.1978; Медведева М.Н. и др.,1977;Смородинцев А.А. и др.,1961;1981). С другой стороны,известно,что традиционные тесты специфической диагностики гриппа, такие как метод иммунофдуоресценции (МИФ), носят качественный характер,страдают субъективизмом (Евру й а1.,198б;£ЬаШ е1 а!., 1985) и имеют ряд ограничений при проведении массовых исследований. Это не позволяет использовать МИФ как для оценки процессов циркуляции вирусов гриппа в человеческой популяции, так и мониторинга инфекционного процесса у больных гриппом людей, необходимого для понимания механизмов становления хронических и осложненных форм гриппозной инфекции,в том числе заболеваний аутоиммунной природы и поражений центральной нервной системы (ЦНС). Указанные недостатки МИФ могут быть успешно преодолены при использовании иммуноферментного анализа (ИФА) как наиболее доступного метода количественной детекции вирусных антигенов.

В этой связи создание иммуноферментных тест-систем (ИФТС) высокой чувствительности и специфичности для быстрой индикации гриппозной инфекции, отк^* *?*»*<?Е5ее новые перспективы в изучении нераспознанных аспектов эпидемиологии и клиники гриппа, следует признать

задачей,весьма актуальной для науки и практики здравоохранения.

Цель н задачи исследования. Целыо настоящей работы явилось усовершенствование ИФТС детекции антигенов вируса гриппа типа А на основе использования иммунореагентов моноклонального типа, новых субстратов и твердофазных носителей с изучением лабораторных параметров новых вариантов ИФТС и их апробацией в клинической и эпидемиологической практике.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить свойства новых препаратов моноклональных антител (МЛ) к различным детерминантам поверхностных и внутренних белков вирусов гриппа человека и птиц.

2. Провести отбор МА,пригодных для диагностических исследований в экспериментальной и клинической вирусологии.

3. Определить оптимальные комбинации различных МА при конструировании ИФТС.

4. Изучить возможности применения вновь разработанных вариантов ИФТС для изучения динамики накопления вирусных антигенов (ВА) на клеточном уровне в сравнении с традиционными тестами.

5. Оценить возможности и перспективы использования новых вариантов ИФА при индикации ВА в клинических материалах.

6. Определить возможность замены канцерогенного субстрата иммунопероксидазной реакции на неканцерогенный.

Основные положения .выносимые да защиту:

I .Сравнительное изучение чувствительности,

специфичности и диапазона реагирования панели моноклональных антител к гемагглютинину

(ГА),нуклеопротеину (НП) и М-беяку вирусов гриппа А человека и птиц позволило отобрать МА к НП (1С6, Р8, 24В4), в наибольшей мере отвечающие заданным лабораторным параметрам, важным для специфического распознавания гриппа Айв клинических условиях и эпидемиологической практике.

2.Укаэанные МА к НП позволяли диагностировать грипп А вне зависимости от субтипа и видовой принадлежности вируса. Методом конкурентного ИФА установлено, что МА 1С6, Б8 и 24В4 направлены к эпитопу НП, общему для всех известных субтипов вирусов гриппа А человека и изученных вирусов гриппа птиц ( в отличие от МА 5С10 к НП и МА 25С4, ЗЗП к ГА, реагирующих только с вирусами определенной видовой

принадлежности ) , что свидетельствует в пользу возможности их диагностического применения и в случае появления нового пандемического штамма.

3. На основе МА 1С6 к НП вируса гриппа сконструирована высоко специфичная ИФТС (ИФТС-НП), пригодная для детекции вирусных антигенов в сложных биологических смесях и в клинических материалах.

4. На модели клеточных культур впервые показана высокая стабильность НП-детерминанты выявляемой с помощью МА 1С6,чго позволяет в течение длительного времени определять присутствие вирусного антигена в культуральной жидкости инфицированных клеточных культур, а также в секретах респираторного тракта при гриппозной инфекции.

5. Установлена возможность детекции вирусного НП в клинических материалах (носоглоточные смывы, аспираты), полученных от больных гриппом , а также при бессимптомных формах гриппозной инфекции. Показано,что динамика накопления и последующей элиминации ВА из носоглотки больных гриппом людей коррелирует с уровнем специфических сывороточных антител классов 1§М и ^О.

6. Разработан безопасный вариант ИФТС-НП с использованием в качестве неканцерогенного субстрата тетраметилбензидина , который может быть рекомендован для широкого внедрения в производство ИФТС без снижения чувствительности и специфичности реакции (взамен канцерогенного по своей природе ортофенилещщамина).

7.Предложен новый вариант простого ускоренного дот-мембранного моноклонального ИФА для диагностики гриппа А,не уступающий по показателям чувствительности и специфичности хорошо апробированному в клинических условиях планшетному варианту ИФТС.

Научная новизна работы:

1. Впервые отобраны для целей диагностики гриппа А высоко специфичные МА 1С6 , Б8 и 24В4 к НП вируса гриппа А, распознающие антигенные детерминанты, общие для вирусов гриппа человека и птиц.

2. На основе МА 1С6 впервые разработаны ИФТС детекции НП вируса гриппа типа А с показателями чувствительности и специфичности - 92 и 95%, соответственно, при сравнении с результатами диагностики гриппа с использованием комплекса традиционных методов.

3.Впервые показана возможность использования ИФТС-НП для обнаружения вирусных антигенов на отдаленных сроках экспериментальной и естественной гриппозной инфекции.

4. Для выявления вирусных антигенов в клинических материалах (носоглоточные смывы ) предложено использовать новый вариант простого ускоренного дот-мембранного ИФА (ДМ-НП) на основе пероксидазного конъюгата МА 1С6 и неканцерогенного субстрата.

5. Выявлена высокая диагностическая значимость разработанных вариантов ИФТС при анализе клинически выраженных и бессимптомных форм гриппозной инфекции.

Практическая значимость работы. Разработана и внедрена в практику усовершенствованная ИФТС-НП, позволяющая (в отличие от ИФТС поликлонального типа) существенно повысить частоту диагностирования гриппа А при детекции вирусного НП в носоглоточных смывах и аспиратах.

Показана перспективность использования ИФТС-НП для оценки процесса латешной циркуляции вирусов гриппа в человеческой популяции и определения его значимости в развитии эпидемического процесса. Кроме того, ИФТС моноклонального типа можно рекомендовать для мониторинга инфекционного процесса и изучения противовирусной активности новых соединений на клеточном уровне.

Результаты детекции вирусного НП у отдельных больных на поздних сроках инфекции свидетельствуют о целесообразности назначения средств специфической противовирусной терапии не только в ранние сроки болезни, но и в более поздний период ( при затяжном инфекционном процессе).

Новый субстрат для ИФА - З.З'ДУ-тетраметилбензидин (ТМБ) может бьпь рекомендован в широкую диагностическую практику, как не проявляющий мутагенного и канцерогенного действия (в отличие от широко используемого ортофенилендиамина).

Разработан новый вариант простого и ускоренного ДМ-НП для детекции антигенов вируса гриппа типа А, который не уступает по чувствительности и специфичности хорошо апробированному планшетному варианту ИФТС-НП. Методы ИФА, предлагаемые для внедрения в широкую диагностическую практику,позволят осуществить раннюю диагностику гриппа , что, в конечном итоге, может определить новую врачебную тактику при назначении химиопрепаратов с целью этиотропного лечения или экстренной профилактики гриппа в очагах, в том

числе в стационарах во избежание развития внутрибольничной инфекции.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых НИИ гриппа (Санкт-Петербург, май 1993) , на выездной сессии РАМН ( Санкт-Петербург, 1995 ) , международной конференции " Progress in clinical virology " (Прага, сентябрь 1995).

Публикашш. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура работыЛиссертация изложена на ■192 страницах машинописного текста, включая 27 таблиц и 21 рисунок. Работа состоит из введения,обзора литературы,5 глав собственных исследований,обсуждения и списка литературы.Список литературы держит ^отечественных и ¿со зарубежных публикаций.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Могажлональньге антитела. Исследованы иммуно-диагностаческие свойства 21 типа МА к ГА, НП и М-белку вирусов гриппа человека (ВГЧ) и птиц (ВГП), полученных из коллекций различных НИИ России (табл. 1 .).

Вирусы. Для оценки диапазона реагирования МА использовали 24 штамма ВГЧ и ВГП типа А субтипов H1N1, HswlNl, H2N2, H3N2, H3N8, H6N4, а также рекомбинантные штаммы Heq3N8, H3Neq2. Вирусы размножали в аллантоисной полости куриных эмбрионов или клеточной культуре MDCK в течение 48 ч при 37° С при дозе заражения 103 - 105 ЭЙД / 0.1мл.

Содержание инфекционного вирусашределяли титрованием на куриных эмбрионах, титры выражали в lg ЭИД50 , определяемых по методу Reed and Muench (1938). Концентрацию гемагглютининов в вируссодержащей жидкости определяли титрованием по стандартной методике с использованием 1% суспензии эритроцитов кур.

Ивгоуноферментньш анализ. Использовали прямой сэндвич-вариант ИФА в планшетной технологии, при котором на стадии захвата использовали МА к ГА, НП или М-белку вирусов гриппа, а на детекции - коныогаты тех же МЛ с пероксидазой

хрена (ПОХ-МА) или поликлональных антител (ПОХ-ПА) к антигенам вирусов гриппа субтипа A(H1N1) или A(H3N2), очищенных методом дифференциального

^яьтрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. ПОХ-ПА готовили по методу Nakane et al. (1974).

Методику проведения анализа и комплектацию ИФТС осуществляли в соответствии с Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ (1995). В качестве контрольных проб использовали вирус гриппа гетерологичного типа (ВГ"), а также культуральную жидкость неинфицированных клеток MDCK (НКЖ) и аллантоисную жидкость незараженных куриных эмбрионов (НАЖ). Для контроля неспецифической реактивности конъюгата в ИФА вместо вируса вводили 0.01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ), pH 7.2.

В качестве субстратов для пероксидазы хрена использовали ортофенилендиамин (ОФД) в концентрации 1мг/мл Na-цитрат-фосфатного буфера с 0.03% ШО: или 3,У,5,5>-тетраметилбензидин (ТМБ) (НПО " Реактив-Сервис", Москва) в концентрации 0.1 мг/мл в 0.1М цитрат-ацетатном буфере (ЦАБ), pH 5.2-5.5 с 0.005% Н2О2 ( Hierholzer et al., 1990 ).Оценку результатов диагностики проводили спектрофото метрически на мультаскане АИФЦ-01С при 490 нм или 450 нм при использовании ОФД и ТМБ, соответственно ( после внесения стоп-реагента - 1Н H2SO4) считали положительныммпри величине отношения сигнал/фон для поликлональной ИФТС не ниже 1.7, а для ИФТС-НП не ниже 3.2 (максимальное значение - 4.2).

Дот-мембранный вариант ИФА (ДМ-НП) для детекции антигенов вируса гриппа типа А проводили по модифицированному нами методу Ивановой ИА. (1994). Вирус сорбировали на нитроцеплюлозных мембранных фильтрах. Неспецифические точки связывания блокировали с помощью 10% обезжиренного молока. Для детекции вирусного НП использовали пероксидазный конъюгат МА к НП (клон 1С6), а в качестве субстрата - ТМБ в концентрации 0.05 мг/мл в присутствии 0.003% перекиси водорода.Перед окрашиванием фильтры обрабатывали 5 мин 1% раствором декстран сульфата в ЦАБ , pH 5.1 - 5.2 (McKimm-Breschkin, 1990).

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Использовали прямой (Coons,Kaplan,1950) и непрямой (Weiler, Coons,1954) вариант МФА с применением МА или ПА для детекции ВА в клеточных культурах и клинических материалах.

Таблица!.

Перечень моноклоналъных антител, использованных для изучения диагностических свойств в иммуноферментш тх реакциях

Штамм вируса грнппа,шлользуе- мыйдпя иммунизации и его видовая принадлежность Эпигопная направленность Нанмеповапие (шнфр)МА Авторы- разработчики МА,организация

А/Лсшшград/385/80 (НЗЩ), человек Молекула гемагглюгшшпа (ГА) 25С4,33F1.7H9, 34Д10,2С9,11Д7, 18Q10,41Е12 Синева С. Л. и др. (1989).НИИ особо чистых биопрепаратов, Сангг-Пегербург (НИИОЧБ)

М-белок 41Е4 Те же

НП 24В4 Те же

А/чайка/Казахстап/ 470/79 (H1N1) нп F8 Свешников П.Г.(1993) Всероссийский цешр молекулярной диагностики и лечения, Москва

А/утка/Альберта/35/ 76(H1N1) ГА ЗЕ10, 2Д2 Черных А-А. (1991),. НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии

А/упл/Украива/1/63/ (НЗЩ) ГА 3F6,3G4, ЗН4, ЗД8,2В10,2А11 Те же

А/цьшленок/Пснсиль-вания/1370/83 (H5N2) НП 1С6.5С10 Те же

Определение ттров и уровня противовирусных антител.

Содержание антител в крови пациентов определяли с помощью РТГА и ИФА в соответствии с Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ (1995). Для ИФА использовали ИФТС , разработанные в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа (УоуссекЬоУвкауа Е.М. ег а!., 1991) при использовании

конъюгатов МА к ^М и человека,разработанных в

Центральном научно-исследовательском рентгено-

радиологическом институте,Санкт-Петербург (Климович В.Б. и др. , 1988).

Эта ИФТС предназначены для дифференциальной диагностики гриппа типов А и В , а так же РС-вирусной и аденовирусной инфекций. При исследовании парных сывороток от больных диагностически достоверным считали 4-х и более кратный прирост титров антител (в РТГА) или увеличение оптической плотности (ОП) продуктов ИФА не менее чем на 0.3 ед.

Клинические материалы. С помощью ИФА были исследованы носоглоточные смывы (НГС) и аспираты (НГА) от 249 больных, госпитализированных в различные клиники Санкт-Петербурга с диагнозом гриппа и ОРЗ. Кровь и НГС от больных людей брали при поступлении и перед выпиской из стационара. НГС получали в соответствии с Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ (1995), суспендировали в 1.5 мя ФСБ и хранили до исследования при -25° С. НГА отбирали и обрабатывали как описано На!опеп е1 а!. ( 1983 ).

Результаты и обсуждение

Сравнительная характеристика моноклональных антител к различным детерминантам вирусов гриппа А человека и пггац в иммуноферментных реакциях

В целях совершенствования первого поколения ИФТС поликлонального типа (Букринская А.Г. и др.,1986 ; Веселов С.Ю. и др.,1985 ; Соминина A.A. и др., 1989) был сформирован банк МА к изменчивым и консервативным белкам вирусов гриппа человека и птиц , включая гемагглютинин (16 клонов) , нуклеопротеин (4 клона) и М-белок (I клон). Проведено исследование полученных МА при индикации вирусных детерминант в составе очищенных вирионов, а также в лизатах инфицированных клеток MDCK, вируссодержащей культуральной жидкости (ВКЖ) и вируссодержащей

аллантоисной жидкости (ВАЖ) с использованием всех контрольных проб,указанных в разделе "Материалы и методы".

Оказалось, что реактивность 10 исследованных МА к ГА ВГЧ (клоны 25С4,33F1) и ВГП (клоны ЗЕ10, 2Д2, 3F6, 3G4, ЗН4 , ЗД8 , 2В10 и 2А11 ) ограничивается гомологичным субтипом вируса,а также определяется видовой принадлежностью исследуемых штаммов. Так,МА к ГА ВГП субтипа A(H3N8) и A(H1N1) в сочетании с гомо- и гетерологичным типом ПОХ-МА конъюгата четко реагировали с вирусами гриппа птиц своего субгипа, но не с ВГЧ того же субтипа (НЗ или Hi).

Таким образом, ни один из исследованных эпитопов ГА ВГП не имел антигенного представительства в молекуле ГА ВГЧ , что свидетельствует в пользу независимого пути эволюции вирусов гриппа человека и птиц (Смородинцев А.А.,Коровин АЛ., 1961; Smorodintsev А.А. et а!.,1982).Эти исследования показали также невозможность использования МА к ГА вирусов птиц для индикации вирусов гриппа человека.

Сравнительное исследование тест-систем с использованием - MA25G4 и 33F1-K эпитопам молекулы ГА (НЗ) вируса гриппа А/Ленинград/385/80 показало,что они отвечают требованиям специфичности и не реагируют с гетерологичным типом вируса и host-компоиентами ( в отличие от МА 7Н9, 34Д10, 2С9, 11Д7, 18QI0 и 41Е12, обладающих такой реактивностью). Чувствительность ИФТС на основе МА 25С4 и конъюгата ПОХ-ПА составляла в среднем 0.1 ГАЕ/0.1мл при тестировании вируса в лизатах и ВКЖ (рис. 1 .). В препаратах ВАЖ вирус удавалось распознавать в концентрации не менее 4 ^ЭИДзо/0.1мл. Чувствительность ИФТС на основе МА 33F1 была в 2 раза ниже (рис. 1 .)

Ограничение спектра реактивности МА к ГА гомологичным субтипом вируса, с одной стороны, определяет возможности использования такого варианта ИФА для субтиповой дифференциации изолятов, но делает их непригодными для индикации новых субтапов пандемических вирусов гриппа А, возникающих в результате шифтовых изменений в молекуле ГА.

В этой связи существенный интерес представляло изучение диапазона реактивности МА к консервативным детерминантам в составе внутренних белков (НП, М-белок) вирусов гриппа. Результаты исследований показали, что в отличие от МА к ГА антитела к НП ( 24В4, 1С6, F8 ) специфически выявляли все 24 исследованных штамма ВГЧ и ВГП, выделенных в период различных пандемий за период с 1934 по 1993 год, вне

Рис.1.Сравнение чувствительности и спектра специфической активности ИФТС моно-клонального типа при детекции антигенов различных субтипов вируса гриппа А в культуральной жидкости и лизатах клеток MDCK

Обозначения: 1 - лизаты клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа А/Ленин-град/325/88 (H1N1); 2 - культурапьная жидкость клеток MDCK, инфицированных тем же вирусом; 3 - Культурапьная жидкость клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа А/Вильнюс/26/90 (H3N2); 4 - лизаты клеток, инфицированных тем же вирусом; Контрольные пробы: лизаты (Ц ) и культурапьная жидкость (□) клеток MDCK, зараженных гетерологичным вирусом гриппа В/Панама/45/90; лизаты (ES) и культурапьная жидкость ( Q ) неинфицированных клеток MDCK.

зависимости от субтипа и видовой принадлежности вируса (табл.2.). Уровень специфического сигнала при детекции 1 ГАЕ варьировал от 0.15 до 1.26 в зависимости от детектируемого вируса и был выше для ВГП.

Чувствительность ИФТС на основе МА к НП 24В4, 1С6 и F8, выраженная в единицах гемагглютинирующей активности вируса, варьировала от 0.1 до 0.01 ГАЕ/0.1мл в зависимости от системы накопления,видовой принадлежности штамма и типа МА (рис.1.). Лимит чувствительности ИФТС-НП, определенный при параллельном титровании инфекционной активности, составлял 3-4 lg ЭИДзо /0.1мл.

Следует отметить, что МА 5С10 к НП вируса гриппа А/цыпленок/ Пенсильвания/1370/83 (H5N2) при тех же условиях не реагировали ни с одним из ВГЧ и выявляли эпитоп,присущий НП только ВГП. Результаты конкурентного ИФА подтвердили, что МА 24В4, IC6 и F8 реагируют с эпитопом, общим для ВГЧ и ВГП, в отличие от МА 5С10,не конкурировавшими с вышеперечисленными МА за связывание с соответствующим эпитопом НП.

Таким образом, ИФТС на основе МА 5С10 может бьггь использована для дифференциального определения видовой (хозяйской) принадлежности вирусов гриппа А.

Изучение свойств МА 41Е4 к детерминанте в составе М-белка показало сходство полученных с МА к НП результатов по диапазону реактивности , однако чувствительность анализа оказалась ниже в 5 раз по сравнению с ИФТС на основе МА 1С6 и F8 (рис.1.).

Все исследованные МА к НП и М-белху отличались специфичностью и не реагировали с клеточными MDCK -антигенами, НАЖ , НКЖ, 10% суспензиями различных органов эмбриона человека и вирусами гриппа В. В целом при детекции 1 ГАЕ различных препаратов вируса использование МА к ГА обеспечивало в среднем 15-кратное , МА к М-белку - 10-кратное и МА к НП - 30-кратное превышение фона. Эти исследования продемонстрировали существенное преимущество ИФТС на основе МА IC6, F8 и 24В4 к высоко консервативной детерминанте молекулы НП перед другими ИФТС по уровню специфического сигнала при детекции вирусов гриппа А различной антигенной структуры и видовой принадлежности.

Главные преимущества ИФТС моноклонального типа перед политональными заключались в повышении чувствительности теста и полном устранении неспецифических реакций с host -компонентами, связанными с их инкорпорацией в структуру

поверхностных гликопротеинов вируса и высокой иммуногенностыо. Это ярко проявлялось при иммунизации, например, вирусами аллантоисного происхождения.

Таблица 2.

Диапазон специфического реагирования различных вариантов ИФТС-НП* при детекции известных пандемических и дрейф -вариантов вирусов гриппа А

Вирусы гриппа (субтпп, штамм,видовая принадлежность) Результаты ИФА (ОГЦ»)** при использовании МА на стадии захвата

24В4 К? 1С6 5С10

А(№«1М1),человек: Х-53,рехомбинантный штамм 0.195 0.205 0.538 0.045

А.(Нэт» Ш1),свинья: А^теЛ976/31 0.228 0.614 0.853 1042

А(НШ1),человек: А/РШ8/34гАЯ7М/1.47,А/Прага/1/84, А/1 айвавъ/Шь, А/Я енинградШЗ/ЙВ, А/Техас/36/91 0.205 (0.1550.300) 0.273 (0.2050.492) 0.366 (р. 5650.732) 0.047

А(Н11Ч1)дтщц: АУутка/Альберга/35/76 1.213 0.320 1.260 1.095

А(Н2К2),человек: А/Ленингр ад/459/80 0.165 0.246 0.282 0.046

А(НЗ.\ 2), челомк: А/Гошонг/1/68, А/Лешшград/385/80, А/Сычуапь/2/87, А/Закарпаи.с/354/89, А/Випьшос/26/90, А/Харьков/38/91, А/С-Петсрбург/40/92, А/Пеюш/32/92, А/Владимир/5/93, А/Хабаровск/41363/93, АУМинсе/109/93 0.225 (0.1570.378) 0.356 (0.1760.723) 0.362 (0.1650.780) 0.046

А(1Ш8Х1тщы: А/упа/Украш1а/1/63Ауу1*а/Калифорния/ 72 0,8?0 0.380 0.807 0.753

А(Н«Ч4Хдггици: А/курица/Кишивсв/7 5 0.729 0.451 0.915 0.407

Коитролысоныотата 0.048 0.053 0.046 0.041

Примечание. * - во всех опытах на стадии детекции использован хоньюгат ПОХ -МА1С6.

** - приведены средние значения и диапазон реагирования в зависимости от использованного штамма (в скобках).

Иммунизация цельными вирусными частицами индуцирует в организме животных сильную иммунную реакцию, в первую очередь, на поверхностные гликопротеины (ГА). В этом случае полученные ПА к ГА могут опознавать антигенные сайты, общие для ГА вирусов и гликопротеинов хозяина. В ряде сообщений высказываются предположения о существовании явления молекулярной мимикрии, связанного с гомологией между отдельными аминокислотными последовательностями гликопротеина вируса (ГА) и мембран клетки (Жилинская И.Н.,1995).

Эти предположения находят подтверждение и в нашей работе при документации перекрестной реактивности ряда МА к ГА ( клонов 7Н9, 34Д10, 2С9, 11Д7, 18(210 и 41Е12) с Ьоя!-компонентами НАЖ (в отличие от МА к внутренним белкам). Если учесть, что направленность МА к молекуле ГА была определена разработчиками МА методом иммуноблота ( Синева С.А. и др., 1989), следует признать, что эпитопы "мимикрии" включены в состав вирусного ГА,поскольку мигрируют при электрофорезе в ту же зону.

Таким образом, анализ полученных данных выявил отчетливые преимущества ИФТС моноклонального типа перед поликлональными. При этом МА !С6 к НП вируса гриппа выгодно отличались универсальным характером специфического реагирования с различными представителями вирусов гриппа типа А,высоким уровнем специфического сигнала, что представляет особую ценность при детекции вирусных антигенов в неочищенных биологических смесях.

Использование ИФТС-НП дня изучения динамики накопления вирусных антигенов в клеточной культуре М1ХЖ

Динамика репродукции вирусов гриппа в клеточных культурах хорошо изучена с детекцией инфекционного потомства и определением накопления вирусных антигенов методом флуоресцирующих антител (Камфорин Л.Е. и др.,1968;Соминина А.А.,1967), а также вирусспецифических последовательностей РНК с помощью гибридизации нуклеиновых кислот ( Кузнецова Е.В. и др., 1989 ).

Представляло интерес изучить возможности вновь сконструированной ИФТС на основе МА 1С6 (на стадии захвата

и детекции вируса в составе ПОХ конъюгата) для количественного определения накопления вирусного НП в динамике репродукции вируса в клеточных культурах. Наши результаты показали возможность индикации НП в лизатах клеток MDCK с помощью ИФТС-НП при пермиссивной инфекции уже через 2ч после заражения, когда впервые регистрируется синтез вирусных полипептидов. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными. Так, сообщалось, что с помощью радиоиммунного анализа (РИА) вновь синтезированный НП-белок может быть выявлен через Зч после заражения, примерно за час до появления ГА ( Kilboum Е., 1987).

Нами впервые документирована высокая стабильность эпитопов в составе НП вируса гриппа,опознаваемых MA 1С6 и выявляемых до 35с инкубации инфицированных клеточных культур MDCK (в составе ВКЖ), т.е. на срокахдогда инфекционный вирус уже давно не обнаруживался.Такая устойчивость к действию различных клеточных протеаз (в отличие от ГА) при 37°С позволяла расчитывать на возможность детекции вирусного НП и в секретах респираторного тракта на отдаленных сроках инфекции, что необходимо, например, для распознавания гриппозной природы пневмоний, осложняющих первичную инфекцию.

Внутриклеточный антиген m situ мог быть обнаружен лишь до 4 суток после заражения методом иммунофлуоресценции и при ИФА лизатов клеток, после чего вирусные антигены высвобождались в культуральную жидкость и могли быть обнаружены там только с помощью соответствующих ИФТС.

Для подтверждения специфичности полученных результатов мониторинга гриппозной инфекции на клеточном уровне было проведено исследование противовирусной активности химиопрепаратов (энциклан, препараты 17-06 и 17-07 в дозах 20 и 80 мкг/мл) в клетках, инфицированных вирусом гриппа А/Виктория/35/72 (НЗШ).Обнаружено полное подавление синтеза ГА и НП в присутствии этих соединений на всех сроках наблюдения, начиная с 2 ч и до 1 с после заражения. Действие энциклана, 17-06 и 17-07 проявлялось как при высоких (80 мкг/мл), так и при низких (20 мкг/мл) концентрациях препарата.

Полученные данные указывают на высокую специфичность ИФТС моноклонального типа и свидетельствуют о возможности их использования для оценки антивирусного действия вновь синтезируемых соединений. Сходные результаты были получены Леневой ИА. и соавт. (1994).

Оценка диагностических свойств ИФТС-НП при выявлении вирусных антигенов в клинических материалах ( НГС и НГА )

С помощью ИФТС-НП были исследованы НГС и НГА от 249 больных с диагнозом гриппа и ОРЗ, госпитализированных в различные клиники Санкт-Петербурга. Для подтверждения диагноза материалы от больных параллельно тестировали МФА. Кроме того, учитывали результаты определения специфических антител в крови методами РТГА и ИФА.Для изучения специфичности ИФТС-НП анализировали НГС от клинически здоровых людей.

Раздел работ по использованию иных методов диагностики был выполнен совместно с сотрудниками НИИ гриппа Войцеховской Е.М., Зибиной Э.А., Чепик Е.Б., Милькинт К.К. и другими специалистами.

Результаты испытания двух тест-систем моно- и поликлонального типа показали выраженные преимущества моноклонального варианта ИФТС перед поликлональным по частоте диагностирования и уровню специфического сигнала.Значения позитивного сигнала в моноклональной тест-системе в зависимости от сроков заболевания колебались от 0.2 до 0.6 и превышали аналогичный показатель поликлональной ИФТС в 1.5-2 раза при 1.5-кратном снижении фоновых реакций. Частота диагностирования гриппа А при использовании ИФТС-НП повышалась в среднем на 48% (значения варьировали от 46 до 51% в зависимости от сроков болезни). Сходные результаты были продемонстрированы Walls et al. (1986) и Doller et al. (1992) при использовании ИФТС для детекции НП вируса гриппа в смывах от больных с инфекцией нижних дыхательных путей.

Чувствительность разработанной ИФТС при сравнении с другими диагностическими тестами, оцененная как описано Chomel et al. (1992), составляла от 85 до 90% и только применение совокупности последних (МФА,РТГА,ИФА-^0 и ИФА-IgM) обеспечивало достаточно высокую частоту диагностирования гриппа А, равную 92% (табл.3.). Специфичность ИФТС-НП составила 95% при сравнении с МФА.

ТаблицаЗ.

Сравнение различных методов диагностики гриппа А

ИФТС-НП Иимуно- флуо-ресценг-ный метод РГГА ИФА-!^ ИФА-1гм Совокупность диагностических тестов

+ - + - + - + - + -

+ 40 9 17 11 19 6 18 б 67 5

_ 6 191 3 1 2 5 2 6 6 171

Число обследованных больных 246 32 32 32 249

Чувстыггель ность ИФТС-НП по ■ отношению к указанному тесту (%) 87 85 90 90 92

Подгверж-даеыость другими тесгамн (%) 94 56 75 75 96

Причина расхождений результатов, получаемых МФА и в ИФТС-НП, связана с тем, что их возможности резко отличны на поздних сроках болезни, когда вирусный антиген не может быть обнаружен внутри клеток, поскольку находится во внеклеточной среде. Высокая результативность ИФА сохранялась вплоть до 811 суток болезни, тогда как для МФА ограничивалась первыми 3 днями болезни. Эти данные четко коррелируют с ранее полученными результатами на модели клеточных культур и подтверждаются данными выявления антигенов вируса гриппа в

НГС от больных с помощью непрямого варианта МФА (\Чкегй)гс1 сХ а!.. 1989).

Необходимо отметить, что у отдельных больных удавалось определить вирусный НП в НГС вплоть до 17 дня болезни, хотя его содержание было намного ниже, чем в остром периоде. У половины таких больных наблюдали осложнения в виде пневмоний. Можно предположить, что длительное присутствие антигенов вируса гриппа в организме связано с нарушением механизмов элиминации возбудителя вследствие угнетения клеточного звена иммунитета. Известно, что вирусы гриппа могут сами по себе подавлять клеточные факторы иммунитета, например, ингибироватъ фагоцитоз ( Филдс Б.,1989).

Использование высоко чувствительных ИФА-тестов впервые показало, что наблюдаемые у 86% больных остаточные посттриппозные явления (Исаков В.А. и др., 1994; Шаманова М.Г. и др., 1994) могут быть обусловлены длительным присутствием вируса в дыхательных путях.

Анализ комплексного обследования больных с диагнозом гриппа и ОРЗ с помощью моноклональных ИФТС детекции вирусного НП и антител классов ^М и 1^0

* Кумулятивный анализ данных ИФА выявил характерную динамику накопления вируса в носовых секретах (рис.2.).По существу эти данные свидетельствуют о возможности мониторинга инфекционного процесса при гриппе с помощью ИФТС-НП. Вирусный НП присутствовал в высокой концентрации преимущественно в острый период (первые 3 дня заболевания), когда средний уровень содержания специфических антител классов ^М и 1§0 не превышал исходные показатели.

Первое достоверное снижение уровня НП-антигена в НГС, наблюдаемое на 4-5 с болезни, происходило на фоне выраженного подъема уровня антител класса ^М и, следовательно, могло быть связано с нейтрализующим действием этих антител на вирус, что согласуется с данными 1ао е1 а1. (1970), которые нашли ,что начиная с 3 с болезни происходит снижение содержания вируса на фоне подъема уровня интерферона. Известно, что интерферон, как фактор неспецифической резистентности, вырабатывается преимущественно

сенсибилизированными Т-лимфоцитами под влиянием вирусного антигена в присутствии макрофагов (Петров

Рис. 2. Результаты комплексного анализа динамики присутствия НГТ-антигена вируса гриппа А и антител различных классов в клинических материалах от больных гриппом с помощью ИФТС моноклонального типа.

Обозначения : I - детекция НП-антигена в НГС с помощью ИФТС-НП ; 2 и .1 - уровни противогриппозных антител классов ^М и

, соответственно , в сыворотках кровцСпра-ва приведены значения дпя отрицательных контрольных образцов : 4 - НГС от клинически здоровых детей ; 5 - НГК+для ИФТС-НП ; б -сыворотка эмбриона человека,негативная по ^М.

По оси абсцисс - сроки от начала заболевания (сутки ) ; по оси ординат -показатели ОП.

Р.В.,1987). В это же время антиген-специфический медиатор Т-хелперов стимулирует и продукцию антител класса ^М В-клетками.

Повторное снижение уровня антигена (7-14 с болезни) коррелировало с динамикой накопления антител класса которые, как известно,способны выходить из кровяного русла через слизистые оболочки в просвет дыхательных путей и подобно секреторным антителам класса 1§А нейтрализовать вирус ( Waldman е{ а1., 1973 ).

Таким образом, впервые при использовании ИФТС моноклонального типа установлена четкая корреляция между уровнем вирусного НП в НГС и динамикой накопления специфических антител классов 1дМ и в сыворотках тех же больных. Полученная информация имеет существенную диагностическую значимость . Вследствие того, что больные поступают в стационар или обращаются в амбулаторные учреждения на разных сроках болезни .включая поздние,принципиально важно установить оптимальные сроки , на которых может быть рекомендовано использование тех или иных диагностических методов. Так, МФА является высоко результативным тестом в первые 3 дня болезни .тогда как ИФТС-НП позволяет диагностировать грипп А вплоть до 8-11 дня заболевания. Очевидно,что кратковременное повышение уровня ^М на 4-6 с заболевания может служить подтверждением гриппозной природы заболевания,тогда как достоверный прирост антител класса ^О по сравнению с исходным может бьггъ зарегистрирован начиная с 8-11 суток болезни.

Таким образом, правильный выбор средств ранней и ретроспективной диагностики имеет существенную значимость и должен осуществляться с учетом возможностей каждого из методов, определяемых в свою очередь локализацией и реальной динамикой присутствия в организме тех или иных маркеров вирусной репродукции (вирусных антигенов, специфических антител различных классов).

Изучение возможности использования ИФТС-НП для обнаружения вирусных антигенов при бессимптомных формах гриппозной инфекции

Для подтверждения специфичности полученных в клинических условиях результатов ИФА было проведено обследование 74 клинически здоровых детей 14-16 - летнего возраста из воинского училища.Проведен анализ частоты обнаружения вирусного НП с помощью ИФТС и заболеваемости гриппоподобными инфекциями как в наблюдаемом коллективе, так и в целом по городу за период 1993-1994г.

Оказалось,что у здоровых детей в небольшом проценте случаев (3-5%) мог быть обнаружен вирусный НП на протяжении всего срока наблюдения,однако в период эпидемического подъема заболеваемости частота детекции НП повышалась до 17%.Эти наблюдения еще раз подтверждают полученные ранее данные (Банников Л.И. и др.,1994 ; Карпова Л.С. Др-,1994; Соминина А.А. и др., 1994) и являются очередным свидетельством в пользу возможности латентной циркуляции вирусов гриппа А в человеческой популяции (Ровнова З.И. и др., 1990).Вопрос о существовании персистентных форм гриппозной инфекции у людей нуждается в дальнейшем изучении.

Исследование возможности замены в ИФА канцерогенного субстрата на неканцерогенный

Наряду с подготовкой высоко специфичных иммунореагентов важное значение при создании следующего поколения ИФТС имеет выбор субстрата ПОХ.Широко используемый в настоящее время на практике ортофенилендиамин обладает выраженными канцерогенными и мутагенными свойствами (Нго Т., 1988; Hancock et al., 1986), что создает опасность для здоровья медицинских работников и требует особых мер предосторожности при работе с ним, а также специальных способов утилизации.

Проведено исследование возможности замены ОФД на иной субстрат ПОХ Ъ,У,5,У-тетраметилбензидин. Результаты сравнительного испытания обоих субстратов показали, что лимит чувствительности ИФТС при использовании ОФД(ИФА-ОФД) и ТМБ (ИФА-ТМБ) оказался равноценным при детекции антигенов вируса гриппа типа А и В в ВКЖ (0.01-0.02

ГАЕ/О. 1мл), однако уровень фоновых реакций в ИФА-ТМБ был в 1.3 раза ниже при сравнении с ИФА-ОФД.

Использование двух субстратов при детекции вирусных антигенов в НГС от 242 больных гриппом и ОРЗ показало,что ИФА-ТМБ не уступал по диагностическим параметрам (чувствительность, специфичность) ИФА-ОФД,что полностью подтвердило наше предположение о возможности замены ОФД на новый безопасный субстрат ТМБ.Эти материалы согласуются с данными Doller et al. (1992) и Hancock et al.(1986) .

Использование нового варианта простого ускоренного дот-мембранного ИФА для детекции антигенов вируса гриппа типа А в клинических материалах

Самостоятельной задачей исследований явилась разработка методически простых средств ускоренной диагностики гриппа А на мембранах,что имеет принципиально важное значение для практики в связи с расширяющимися возможностями в области применения этиотропных химиопрепаратов для экстренной профилактики и лечения гриппа.

При разработке модифицированного нами дот-мембранного (ДМ) теста были использованы МА 1С6 к НП вируса гриппа и ТМБ в качестве субстрата (ДМ-НП). Исследована возможность выявления НП вначале в культуральных препаратах вируса А/Санкт-Петербург/40/92 (НЗШ) , а затем в НГС от больных людей. Полученные результаты показали,что новый метод ДМ-НП позволял выявлять 0.03 ГАЕ в 3 мкл ВКЖ клеток МОСК.Контрольные пробы гетерологичного вируса гриппа типа В,сорбированные на фильтрах,не окрашивались.Эти результаты оказались сопоставимы с данными .приводимыми Ригауа К. е! а1. (1984) о разрешающей способности ИФА-мембранного теста,равной 1.25 - 0.3 ГАЕ в 50 мкл пробы культуральных вирусов гриппа А.

Чувствительность и специфичность ДМ-НП при анализе 106 клинических материалов оказались 100 и 91 %, соответственно, а значения позитивного и негативного прогноза составили 90 и 100 % , соответственно,при сопоставлении с результатами МФА. При сравнении с результатами ИФТС-НП показатели чувствительности, специфичности,позитивного и негативного прогноза ДМ-НП теста составили 100 , 96 , 96 и

100 %, соответственно.

Выявленные расхождения результатов при тестировании 5 НГС от больных,позитивных в ДМ-ИФА, но не подтвержденных в МФА, были исследованы в блок-тесте ИФА. Специфичность результатов ДМ-НП была подтверждена в 3 случаях, в двух других - отрицательный результат в МФА, по-видимому, объяснялся поздними сроками забора материала (6 и 7 сутки от начала заболевания).

Таким образом, ДМ-НП в предлагаемой модификации является качественным методом диагностики,не уступает традиционному МФА и хорошо апробированному в клинической практике ИФТС-НП по чувствительности и специфичности, но выгодно отличается от последнего по простоте исполнения,сокращенному до 5-6 часов времени проведения анализа и отсутствию необходимости применения дорогостоящего оборудования.

Выводы

1. Проведен скрининг 21клона МА к различным антигенным детерминантам в составе ГА , НП и М-белка вирусов гриппа различного видового происхождения в иммуноферментных реакциях. Для экспериментальной и клинической вирусологии рекомендованы МА 24В4 , 1С6 и Р8 , высоко активные в отношении консервативных эпитопов,общих для НП вирусов гриппа человека и птиц.

2. Использование ИФТС-НП позволяло отражать реальную динамику накопления вируса и последующего длительного сохранения НП в ВКЖ инфицированных клеточных культур,что свидетельствовало о высокой стабильности антигенных сайтов НП,распознаваемых МА 1С6.

3. Использование ИФТС-НП позволяло выявлять вирус в НГС у больных гриппом на разных стадиях болезни,включая поздние,когда возможности МФА уже исчерпаны.Показатели чувствительности и специфичности ИФТС-НП составили 92 и 95 % , соответственно.

4. Показана возможность детекции вирусного НП у клинически здоровых детей.Частота выявления бессимптомных форм гриппозной инфекции в эпидемический по гриппу период возрастала на 13 %при сравнении с межэпидемическим.

5. Изучение динамики инфекционного процесса у больных гриппом людей позволило установить отчетливые корреляции

2t

между уровнем содержания вирусных антигенов в носоглотке и накоплением противовирусных антител классов ^М и ^О.

6. Экспериментально обоснованы и определены условия замены канцерогенного субстрата иммунопероксидазных реакций ОФД на тетраметилбензидин без снижения чувствительности и специфичности реакции.

7. Показана возможность использования в клинических условиях простого ускоренного дот-мембранного варианта ИФА для детекции вирусного НП.Показатели чувствительности и специфичности ДМ-НП не уступали хорошо апробированному планшетному варианту ИФТС-НП (100 и 96 % ,соответственно ).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Филиппова И.Е. , Крутова И.В. Изучение З.З'ДУ-тетраметилбензидина и ортофенилендиамина при иммуноферментной детекции вирусных антигенов. //В сб. НИИ им. Пастера "Актуальные проблемы инфекционной патологии". Часть 3. - Тез .докл. юбилейной конф. 25-27 мая 1993г. - Санкт-Петербург. - 1993. - С. 93.

2.Филиппова И.Е. , Соминина A.A. , Войцеховская Е.М. и др. Разработка нового поколения препаратов для диагностики клинически выраженных форм гриппозной инфекции// В сб. Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов. Тез. докл. симпозиума,Санкт-Петербург ,5-7 октября 1994г. - Санкт-Петербург.-1994.-С.66.

3. Филиппова И.Е., Черных A.A., Соминина A.A. Спектр реактивности различных типов моноклональных антител к нуклеопротеину вирусов гриппа человека и птиц// В сб. Новые подходы к • целенаправленному конструированию противовирусных препаратов. Тез. докл. Симпозиума, Санкт-Петербург,5-7 октября 1994г.-Санкт-Пеггербург.-1994.-С.65.

4. Filippova I.E.,Ivanova I.A., Zibina E.A., Chernykh A.A., Chepic E.B.,Sominina A.A. Application of new dot- membrane enzym immunoassay influenza A - NP test for detection of virus antigen in clinical speciments // Intern. Symposium "Progress in clinical virology".-1995,- Prague.- P. 251.

5. Соминина A.A..Медведева H. A., Коз елецкая К.Н.,Синева С. А.,Филиппова И.Е.,Потапенко Л.Б. Новые аспекты применения иммуноферментных тест-систем,предназначенных для индикации вирусных антигенов,оценка противовирусной

активности химиопрепаратов// В сб. НИИ им. Пастера "Актуальные проблемы инфекционной патологии" .Часть 3.- Тез. докл. юбилейной конф. 25-27 мая 1993г. - Санкт-Петербург. -1993,- С. 89.

6. Соминина A.A., Козелецкая К.Н., Медведева НА., Филиппова И.Е.. Бурмистрова В.В. и др. Иммуноферментный анализ в определении антивирусной активности новых противовирусных препаратов // В сб. Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных прапаратов. Тез. докл. Симпозиума. Санкт-Петербург, 5-7 октября 1994г.-Санкт-Петербург.-1994.-С.25.

7. Соминина A.A., Цыбалова Л.М., Карпова Л.С.,Липина Н.В., Никаноров И.Ю., Семилуцкая И.Б., Бехтерева ТА., Попова Т.Л., Коновалова Н.И., Гринбаум Е.Б., Филиппова И.Е., Киселев О.И. Генетическая предрасположенность детей с группой крови В (III) к латентному носительству вирусов гриппа А - возможная причина возникновения новых эпидемических штаммов в странах Юго-Восточной Азии II Веста. РАМН.- 1994 -N. 9.-1994.-C.2Í-24.

8. Sominina A.A., Kisselev O.I., Bechtereva ТА., Lipina N.V., Filippova I.E. et al. Monoclonal EIA kits and polimerase chain reaction in diagnosis of Influenza // Intern. Symposium "Progress in clinical virology".- 1994,- Stockholm. Sweden. - P. 2/11.