Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура популяций и антигенная изменчивость эпидемических вирусов гриппа А и В, циркулирующих в Казахстане

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структура популяций и антигенная изменчивость эпидемических вирусов гриппа А и В, циркулирующих в Казахстане"

2 1 [3

УДК 578.832.1:578:74

На правах рукописи

ЖУМАТОВ КАЙНАР ХАМЗАЕВИЧ

СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ И АНТИГЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЭПИДЕМИЧЕСКИХ ВИРУСОВ ГРИППА А И В, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КАЗАХСТАНЕ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учено» степени доктора биологических наук

Республика Казахстан Ал маты 1998

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии МН-АН РК

Научный консультант член-коррсспондент АН »АМН РК,

профессор Саятов М.Х.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Чувакова З.К.

доктор биологических паук, профессор Сержан Орынбай Сеитулы

доктор медицинских наук, профессор Аспетов Р.Д.

Ведущая организация Казахский Государственный медицинский

университет им. С.Д.Асфендияропа МОКЗ РК

Защита состоится 1998 г. в --часов на

заседании диссертационного совета Д.53.24.01 при Институте микробиологии и вирусологии МН-АН РК по адресу: 480100, г.Алматы, ул. Богенбай батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии МН-АН РК.

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета , у

кандидат биологических наук ' Айткельдиева С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность строблсми. Грипп до настоящего времени остается самым массовым инфекционным заболеванием вирусной этиологии, наносящим огромный г.)>сд здоровью населения. Его пандемии н последующие ежегодные эпидемические вспышки, охватывающие сотни миллионов люде ft по всему миру, япляются причиной значительного экономического ущерба. В то же время признанные и научно обоснованные средства борьбы с гриппом, включающие иммунизацию живыми или инактивировгнними вакцинами, а также применение химиопрепаратов, пока не дают достаточно эффективных результатов. Главная причина такого положения заключается в большом разнообразии вирусов гриппа и их чрезвычайной антигенной изменчивости,.что крайне затрудняет приготовление адекватных вакцин и своевременное проведение необходимых профилактических мероприятий.

Сложность этнологической ситуации по гриппу на современном этапе' обуславливается одновременной или поочередной циркуляцией вирусов серонодтипоп A(H3N2), A(HlNt) и серотипа В (Webster ct al., 1992; Gorman ct al., 1992; Kilbourne., 1997; Слепушкин и др. 1998). Помимо этого, возбуд!Гтели всех указанных разновидностей характеризуются ярко выраженной вариабельностью антигенных свойств, в результате которой постоянно возникают дрейф-варианты вирусов, способные преодолевать коллективный иммунитет населения (Смородинцеп, 1934). По этой причине особую актуальность приобретает проведение широкого эпидемиологического надзора в масштабе всей страны с изучением как конкретных возбудителей, так и состава популяции циркулирующих штаммов. При этом, оперативное пыявление новых вариантов и установление направления процесса изменчивости антигенной структуры вирусов гриппа может иметь прогностическое значение. Осуществление такого надзора n РК представляет особый интерес в силу ряда -факторов к числу которых относится: уникальное географическое положение республики и центре Евразии, большое разнообразие природных условий и климато-географнчсских зон, протяженная граница с КНР, где, как известно, чаше всего возникают эпидемические разновидности вируса гриппа. Раннее их появление в Казахстане и Средней Азии дало основание предположить, что этот регион яатяется одним из возможных очагов дальнейшего распространения

эпидемий гриппа в странах СНГ (Карпухин и др., 1979; Иванников, Исмагулов, 1983). В этой связи, всестороннее изучение антигенной структуры и бислогичгских свойств вирусов, циркулирующих на территории РК, имеет важное значение для решения практических задач здравоохранении и теоретических «опросов, касающихся происхождения и закономерностей естественной изменчивости эпидемических вирусов.

Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение характера и особенностей эпидемического распространения вирусов гриппа Л н D в Казахстане в период с 1990 по 1998 гг., определение степени гетерогенности популяций циркулирующих вирусов и направления 1« естественной антигенной изменчивости. •

Работа выполнена по программе фувдаметально-ирикладш ix исследований Института микробиологии и вирусологии МН-АН 1К "Физиолого-бнохнмическис, молекулярные и иммунологические оснош "репродукции микроорганизмов и вирусов ; биотехнология мнг.роСных и вирусных препаратов" (регистрационный N 0195 РК 00379) и соответствует специальности 00.03.06. - вирусология.

Для достижения указанной пели предполагалось решение елг;^ ющнх .чадят

1. Установил, этиолошю эпидемий гриппа 1990-1998 гг. и гловесги аналт заболеваемости гриппом населения РК.

2. Выделить эпидемически актуальные варианты вирусов гриппа и провести их идентификацию.

3. Получить антительные эритроцнгарные диагшетикумы (ЭД) для быстрой идентификации гриппозных агентов.

4. Изучить. антигенные взаимосвязи и биологические свойства возбудителей гриппа с целью выявления степени гетерогенности вирусной популяции и направления антигенного дрейфа.

5. Установить airnirciinbift состав казахстанских изолятов вирусов гриппа посредством картирования антигенных детерминант гемагглютинина (ГА) с помощью иммуносорбциоцного анализа и моноклинальных антител (МКАТ) в реакции торможения гемагглютинацнп (РТГЛ) и иммуноферментном анализе (ИФА).

6. Получить моноспецифические антисыворотки (МСА) к новым антигенным сайтам ГА вирусов гриппа, циркулировавших.на территории РК. •

Научная повита. Впервые проведен анализ особенностей развился эпидемического процесса при гриппе Л и D среди населения РК п период с 1990 по 1993 гг. Показано, что наиболее активным был вирус A(H3N2), явившийся основным возбудителем эпидемий в 1990, 1996, ¡997 гт. Эпидемии 1991, 1993 и 1995 сг. были обусловлены преимущественно вирусами серотипа В , а 1994 и 1998 гг. - вирусами A(H1N1). В со :етанную эпидемию сезона 1992 г. «циркулировали вирусы гриппа A(II3N2) и В.

В составе ГА эпидемически актуальных штаммов с помошыо МСА и ичмуносорбциошсого анализа определены новые аитнгешсые детерминанты: ИЗ. 18; Н3.20,21,22; 113.26; Н3.27 у вирусов A(H3N2) и Ш19, Ш20, Ш22 у вирусов серотипа В.

На территории РК в 1994 г. впервые после исчезновения в 19S9 г. отмечено позграшение п эпидемическую циркуляцию вируса гриппа A(H1N1) подобного эталону А/СССР/90/77. Антигенный состав ГА казахстанских ипаммов A(H1N1) 1998 г. был родственным референс-варианту A/Daiiepn/07/95. :

В гетерогенных популяциях вируса гриппа были представлены варианты с качественно новыми сочетаниями ранее идентифицированных сайтов ГА - • 113.18,19,20 у вирусов A(H3N2) в 1992 г., Т1.ГЗ.Ш15, Т1.Г4.Ш17 у вирусов серотипа В 1991, 1992 гг.

К оригинальным антигенным детерминантам казахстанских изолятов вирусов гриппа А и В получены МСА, пригодные для картирования ¡-.ншгенных маркеров в структуре ГА вновь возникающих эпидемических вариантов.

Предложен новый сснсибилиризирующий агент метол и медицинская желчь о качестве стабилизатора для приготовления антительных ЭД с целью экспресс-индикации вирусов гриппа А и В.

Практическая ценность работы:

1. Материалы диссертации включены в отчеты Национального ц«стра по гриппу М01СЗ РК, представлены в D03 (г.Женева) и использованы при . составлении приказа N394 МОКЗ РК "О совершенствовании системы эпидемиологического надзора за гриппом и ОРЗ". от 13.09.96 г.

2. Получены авторские свидетельства на оригинальные штаммы вируса гриппа A(H3N2) А/Алма-Ата/186/88, А/Алма-Ата/215/88 (А.с. 1699160 N4319446, А.с. 170S833 N4801739) и положительное решение на штамм вируса rpjinria П/Алматы/8/93 по заявке N970727.1 от 31.07.97. Указанные дрейф-варианты

. 6 используются при приготовлении диагностических препаратов для идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа и изучения напряженности коллективного иммунитета.

3. МСА к оригинальным детерминантам ГА вирусов гриппа А и В применяются в лаборатории иммунологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского

. РАМН и в лаборатории эпидемиологии и диагностики вирусных инфекций Научного центра гигиены и эпидемиологии МОКЗ РК при определении антигенной новизны эпидемических изолятов вирусов гриппа А и В.

4. Приготовлены антнтельные ЭД к вирусам гриппа с применением стабилизатора метола и медицинской желчи в качестве нового, доступного стабилизирующего агента. Полученные тсст-снстсмы превышают по чувствительности ЭД сконструированные ранее по другим схемам и используются для первоначальной экспресс-диагностики изолятов вируса гриппа в лаборатории эпидемиологии и диагностики вирусных инфекций Научного центра гигиены и эпидемиологии МОКЗ РК.

Основные положения, выносимые на запилу:

1. В РК вирусы ссроподтипа A(H3N2) явились основными этиологическими агентами эпидемий в 1990, 1996, 1997 гг. В 1992 г. они социркулиропали с вирусами типа В, которые, в свою очередь, вызвали эпидемии 1991, 1993, 1995 гг. Вирусы гриппа A(H1N1) обусловили эпидемию в 1994 и 1998 гг.

2. Популяции вирусов гриппа А и В 1990-1998 гг. характеризовались значительной антигенной гетерогенностью. В их составе в пределах одного эпидемического сезона определялись лрейф-варнанты с новыми и ранее идентифицированными антигенными детерминантами в различный сочетаниях.

3. В 1994 г. в РК впервые после 1989 г. возвратились в циркуляцию вирусы сероподтнпа A(IIINI), подобные прототипу А/СССР/90/77. Вирусы гриппа A(H3N2), выделенные в период с 1990 по 1997 гг. на территории Казахстана

' были близкородственны референс-штаммам А/Сычуань/2/87 А/Москва/172/92 и А/Москва/7/94.

4. Возбудители гриппа В 1990-1995 гг. в РК относились к эталонал В/СССР/100/83, В/Виктор1(я/2/87, В/Ямагата/16/88. Наряду с этим идентифицированы 'варианты, отличавшиеся от них но одному или дну» антигенным сайтам.

5. Естественный дрейф вирусов гриппа А и В проявляется в сложном процессе смены антигенных маркеров, при котором некоторые вновь возникающие штаммоспецифические сайты ГА получают наибольшее распространение в следующем эпидемическом сезоне и в ходе эволюции становятся группоспецнфическими.

6. Анти тельные ЭД на основе метола и медицинской желчи в качестве сенсибилизирующего и стабилизирующего агентов превосходят по чурствнтельности ЭД, приготовленные другими методами, и могут применяться для определения типовой и подтиповой принадлежности вновь выделенных гриппозных агентов.

7. МСА к новым антигенным детерминантам ГА могут использоваться При картировании антигенного состава эпидемических изолягов вируса гриппа.

Личный вклад автора. Dee основные разделы работы выполнены при личном участии автора.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на V объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана (Алматы,1991); VIII объединенном съезде гигиенистов, микробиологов, эпидемиологоп и паразитологов Белоруссии (Минск, 1991); научной конференции "Актуальные проблемы вирусологии" (пгг. Гвардейский, 1994); международной научно-практической конференции "Перспективы развтия производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" (Степногорск, 1995); международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии" (пгг. Гвардейский, 1998).

В завершенном виде работа доложена на заседании секции вирусологии Института микробиологии и вирусологии МП-АН РК.

Публикация результатов псслсдовапня. Содержание диссертации отражено в 36 научных публикациях, получены два авторских свидетельства и положительное решение на выдачу предварительного патента на изобретение.

Объем и структура дяееертащгя. Материалы диссертации изложены на 240 страницах текста компьютерного набора, иллюстрированы 58 таблицами, 8 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, заключения, выводов й списка использованной литературы, вюночающего 319 источников.

Автор выражает искреннюю благодарность нпучному консультанту члеиу-коррсспонденту АИ и АМН РК, профессору М.Х.Саятоьу за цен лиг совош н рекомендации и глубокую признательность профессору А-Т.Псматулову, старшему научному сотруднику Института вирусологии им. Д.И.ИианоБсииги РАМН Е.И.Исаевой, сотрудникам лаборатории экологии вирусов Лпспиуы микробиологии и вирусологии МН-АН РК Л.И.Шрхеоросюжш, С.Е. Лсановой, С.Р.Булгаковой, срачу-вирусологу Республиканской СЗС И-А-Шавриной, сотрудникам лаборатории респираторных вирусных инфекций Научною и"!1 к .1 гигиены и эпидемиологии МОКЗ РК Ж.А.1 кмагу.юьсж, ГгП.Гр^копой за плодотворное сотрудничество.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и истоды исследования. Анализ заболеваемости трнппом строили на данных обращаемости населения п лечебно-щюфилактические 'учреждения в спязи с гриппом н ОРЗ. Поскольку эи,темни, как прлшию, развиваются на стыке лет, в, анализ включались суммарные показаюл.т заболеваемости за эпидемический год, т.е. с 1 июля одпо-о года по 31 июня следующего год?..

Материалы о заболеваемости гриппом и ОРЗ но республике и г-Алыаты учитывали еженедельно суммарно для всего населения и по возрастим группам (0-2 гада, 3-6 лет, 7-14, 15 лет и старше). Для определения срока начала эпидемии, со продолжительности, времени наступления пика и его величины, а также для оценки шгтенсианости эпидемического процесса использованы толерантные границы неэпидемической заболеваемости ОРЗ по каждому юроду, при этом определялась тенденция развития заболеваемости гриппом А и В. Параметры уравнений трендов определялись по методу наименьших квадратов (Ягодннскнй, 1981). Доверительные границы средних значений заболеваемости рассчитывали методом малых выборок с использованием критерия Стьюдента. Для определения удельного веса чистого группа в общей заболеваемости использовали принцип исключения сезонной заболеваемости ОРЗ при подсчете иоражснности населения в период эпидемии гриппа.

58 эталонных штамма вируса грипоп гриппа А и Б получены из Института вирусологии им, Д.И.Ивановского ГАМН (Моста) и Института гриппа РАМН (Санкт-Петербург).

Эпидемические изоляты выделяли из носоглоточных смывов больных гриппом ¡1 ОРЗ на куриных эмбрионах и культуре клеток МДСК. Всего в период с 1990 но 1998 гг. обследовано 4416 носоглоточных смывов, изучено 108 шгаммол вирусов гриппа Л и В.

Идентификацию гемагтлютшшругаших агентов проводили в РТГА с использованием диагностических гриппозных сывороток производства НИИВС (Санкт-Петербург), иммунных кроличьих и крысиных сывороток к эталонным и местным шиммам вирусов гриппа серотипоп А и В, а также с помощью а!гппелы1ых ЭД, полученных по оригинальной методике (Жуматов, 1995). Клонирование штаммов проводили двумя способами: методом предельных разведений на куриных эмбрионах и методом бляшкообразовання на культуре клеток МДСК.

Дальнейший анализ антигенного состава ГА эпидемических изолятои проводили в РГГА и ИФА с использованием МСА к отдельным детерминантам ГА вирусов гриппа А и В различных лет выделения, а также МКАТ к вирусам : Л/Г)ашкок/1/79, А/Фплиппины/2/82 (I13N2), А/Бразилия/11/78 (H1N1), В/Ог)сгон/5/80 получены д-ром RAVebster (Детский госпиталь СВ. Иуды, Мемфис, Теннесси, США) и любезно предоставлены к.м.н, Е.Исаевой (Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН). В качестве антигена использовали элюат вируса, полученного из аллантоисной жидкости с исходным титром 1:80-1:320 и больше.

Иммунные кроличьи сыворотки получали от взрослых животных породы Шиншилла с использованием двух схем, одна из которых занимала три недели и заключалась в 2-кратном подкожном и внутривенном введении антигена, другую осуществляли в течение 4 недель путем внутривенного и внутрибрюшинного заражения. Крысиные иммунные сыворотки готовили посредством 4-кратного внутрибрюшинного инфицирования вируссодержащей аллантоисной жидкостью с. недельным интервалом.

Фракции иммуноглобулинов гипернммунных кроличьих сывороток получали с помощью гельфильтрацин на колонке (2,5 х 60 см) с Сефадсксом G-ГОО (фирма "Pharmacia", Швеция) по методике Р.Незлина, М.Кульпиной (Г964). Пробы в объеме 5 мл собирали на коллекторе "Redirak" (фирма "LKB", Швеция). Профиль элюции белков устанавливали путем измерения оптической плотности фракции при длине волны 280 им па спектрофотометре СФ-2ба.

Состав антигенных детерминант ГА вновь выделенных энидсмнчсских вирусов гриппа изучали с г.омошыэ иммуносорбционного анализа и МСА полученных по методу П. Косяком с сотр. (1976), Е.Исаевой с coip. (1937). Сущность его заключается в получении антител, направленных против одной или двух антигенных детерминант нз гетерогенной популяции иммунных кроличьих и крысиных сывороток. Это достигалось либо путем адсорбции элюатом вируса, имеющего в своем составе одну или две общие детерминанты с вариантом, взятым для иммунизации, либо избирательной специфической адсорбцией нз состава иммунных сывороток гстерологичным вирусом шпител нужной специфичности. Адсорбцию иммунных сывороток проводили на формалинизнроваиных эритроцитах человека, обработанных и нагруженных но методу З.Ровновой с сотр. (1976). После адсорбции сыворотки центрифугировали 1ч при 15000 об/мин и прогревали при температура 64° С в течение 1 ч.

НФА проводили непрямым методом в модификации Е.Испсвои с сотр. (1988). В качестве конъюгата использовали козьи антитела против lgG кролика, меченые пероксодазой (производства Санкт-Петербургского НИИВС). Субстрат ортофенилендиамин (фирмы "Sigma", Швеция) готовили непосредственно перед нанесением, результаты учитывали через 30 мин на автоматическом спектрофотометре "Miteitek Multiskan" (Финляндия).

Биологические свойства вирусов: инфекционную активность, термостабнльность гемштлютинина, спектр гемагглютинируюшей активности, чувствительность к сывороточным ингибиторам определяли общепринятыми методами.

Антнтсльные ЭД к вирусам гриппа А и В готовили по оригинальному способу (Жуматов и др.,1994) В качестве ноогтеля антител использовали формалиннзированные эрщрошггы барана. Источником сенситина служили фракции lgG-глобулинов, полученные из гипериммунных кроличьих сывороток методом гельфильтрации на Сефадексе G-200.

Гсмосенсибшшзацшо эрнгроцитов проводили посредством метола и раствора медицинской желчи в качестве стабилизирующего агента. Активность полученных алти тельных ЭД проверяли в реакции непрямой г-магглютинации (РИГА).

При статистической обработке эпидемиологических данных использовали

следующие методы: сравнение серий по способам связанных и несвязанных выборок с вычислением критерия достоверности, двухфакторный дисперсионный анализ, частотный анализ. Для всех серий результатов серологических опытов находили средние геометрические титры логарифмов и их средние ошибки (Урбах, 1975) или среднее значение трехкратных экспериментов. Статистический анализ материала проводили с помощью персонального компьютера IBM на базе пакетов прикладных программ "MESOSAUR", "Stateks", "Excel".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ЭпидсшкшоптскмЛ пиаляз. С 1990 по 1998 гг. на территории РК зарегистрировано 9 эпидемий гриппа (рисунок I). Вирусы сероподтипа A(H3N2)

Динамика эпидемической заболеваемостью гриппом в период с 1990 по 1998 гг.

10.8 н

1990 1991 1992 1993 1991 1995 1396 1997 1908

в Заболеваемость в % ко всему населению Рисунок 1.

вызвали моноэтиологнческие эпидемии в 1990, 1996 гг. и социркулировалн в 1992 и 1997 гг. с вирусами гриппа В. Вирусы А(НШ1) обусловили эпидемии в 1994 и 1998 гг., п 1991, 1993, 1995 гг. основными возбуд!ггелями явились вирусы

серотнпа В. В эпидемию каждого сезона учитывали ее продолжительность, заболеваемость отдельных возрастных 1рупп и всего населения, удельный вег гриппа в общей сумме острых респираторных инфекций. Продолжительность эпидемий колебалась в широких пределах от 3 до 11 недель, из всех 1руш: населения наиболее поражаемым контингентом были дети до 14 лет, составившие свыше 70% от общего числа больных. Удгльный вес гриппа также значительно варьировал, составив в 1977 г. в Жезказгат, Атырзу, Костамае, Шымкенте 71,0; 66,6; 66,6; 65,8%, соответственно. Видно,что минимальные се показатели (1,8 и 2,1%) отмечены в 1995, 1992 гг; максимальные (4,8; .5,6; 10,8%) в 1991, 1993 и 1998 гг. Резко возросший уровень сезона 1998 г. можно оРъяснить появлением в циркуляции новых антигенных вариантов вируса А(ШЖ) подобных А/Байерн/07/95.

Разработка аитительных ЭД. Проведение комплекса противоэпидемически и профилактических мероприятий при вируснь:/. 'инфекциях требует наличия в арсенале практических лабораторий простых и доступных х1стодов экспресс-диапюстики, позволяющих оперативно исследовать большое число проб. Возможности использования для этих целей И ФА и радиоиммунологическнх методов существенно ограничены ввиду того, что для их проведения необходимы специальное оборудование и дорогостоящие реактивы. По сочетанию критериев доступности и быстроты получения результатов РИГА с ЭД является наиболее удобным тестом для диагностики вирусных инфекций и индикации возбудителей. Нами изучена эффективность метода сенсибилизации эритроцитов с помощью метола с целыо приготовления ЭД. Выбор этого реагента объясняется тем, что он относится к классу фекольных соединений, которые обладают способностью образовывать прочные связи между белковыми молекулами. В качестве сенситина использовали фракцию иммуноглобулинов гиперимыунных кроличьих сывороток к ряду эталонных и местных штаммов вирусов гриппа А и В. Оптимальный режим приготовления иммуноглобулиновых ЭД с помощью конъюгата метола заключался в сенсибилизации 5% взвеси формалинизированных эритроцитов барана сенситином при 53°С в течении 40 мин в присутствии 1% водного раствора метола. ЭД были строго специфичны и взаимодействовали только с гомологичными вирусами * не реагировали с гетерологичными. Показано, что ЭД, полученные по разработанному методу, превосходят ' по своей

угстшгтельностн иммунореагенты, приготовленные с помощью амидола, танина I бидиазотированного Сензидина в 5-13 раз (таблица 1).

"аблица 1

Чувствительность диашостнкумов, полученных разными методами коныогированнп

ЭД, приготовленные с помощью Титр антигена в РИГА с ЭД к вирусу А/Мис/85 (НЗЫ2) в присутствии стабилизаторов

Тритон Х-100 (0,01%) Тритон X-100 (0,005%) Нормальная кроличья сыворотка Бычий альбумин-- (0.1%)

.мндола 1100 ±5,5 417 ± 0,2 112 ±0,4 208 ± 0,9

анина 315 ± 0,2 15Э ± 0,9 30 ± 0,5 70 ± 0,4

■идиязотированного ензидина 388 ± 1,5 315 ±0,2 158 ± 0,26 208 ± 0,28

1стола 1100 ±6,0 2048 ± 6,4 239 ± 0,3 315 ±0,2

Фактором, ограничивающим широкое внедрение РИГА в практические чрсжления медицинского и ветеринарного профиля, является необходимость ключения в состав ЭД дорогостоящих и дефицитных стабилизаторов для редотвращення спонтанной агглютинации. По стандаршой методике в качестге габплизлтора обычно применяют бычий сывороточный альбумин, нормальную .торотку кролика, а также раствор тритона Х-100, что приводит к мчитсльному удорожанию анализа. Нами в качестве стабилизатора испытана сдииинская желчь - доступный и дешевый препарат, выпускаемый лматинским биокомбннатом, в состав которого входят различные органические ислоты. В первоначальных опытах определяли оптимальную концентрацию елчн. Наибольший титр выявляемых антигенов вируса гриппа достигался с пользованием 1% желчи на физиологическом растворе. При других энцентрациях (0,5 и 2%) наблюдалась спонтанная агглютинация или резкое жжение титра обнаруживаемого антигена (таблица 2). Специфичность ¡зультатов проверяли в перекрестной РИГА. Вирусные антигены 1аимодействовали только с гомологичными диагностикумами и не реагировали

с гетеролошчными. Таблица 2.

Влияние концентрации желчи и температурного фактора на чувствительность РИГА с гомологичными ЭД

Вирус Концентрация желчи % Температура инкубации °С

0.5 1 1.5 18-22 30-35 35-37

А/СССР/90/77 СА 10240 512 10240 10240 512

А/Фнлиппины/2/82 СА 512 256 512 512 128

В/Сннгаипур/222/79 СА 512 128 512 512 128

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности ЭД, приготовленных с использованием метола в качестве конъютруаощего вгента и медицинской желчи как стабилизатора. В нашем исследовании первоначальную идентификацию всех выделенных гемапглютинирующих агентов проводили с уктчнными иммунореагеггшш.

Антигенные и биологические свойства вирусов гриппа A(II3N2), циркулирующих в Казахстане, Идентификация в РИГА позволила отнести Г > нзолятов 1990 г. к вирусам сероподтипа A(H3N2). Все они были исследованы в перекрестной РТГА с набором безьшгибиторных кроличьих иммунных сьшорогок. 26 штаммов не проявляли антигенных взаимосвязей с дреГ'ф-вариантами' вируса сероподтипа A(H3N2) 1973-1977 гг., 4 шгамма в низких титрах реагирогши с антнсывороткой А/Техас/1/77. Большинство нзолятов вируса гриппа, за исключением С штаммов, которые практически не вступали в реакцию, до 1/8-1/64 гомологичного титра нейтрализовались сывороткой к репрезентативному штамму А/Еангкок/1/79. Бее изоляты активно взаимодействовали с иммунными сыворотками к вирусам A(H3N2) 1979-1987 гг.. Из достаточно однородной группы вирусов гриппа A(H3N2), циркулировавших lia территории Казахстана в 1990 г., выделялись изолмы А/Шымкепт /48/90, А/Шымкент/110/90, А/Карапчща/395/90, А/Ал маты/42/90 которые в низких

титрах взаимодействовали с использованными сыворотками. По характеру взаимодействия с поликлональнымн кроличьими сыворотками казахстанские изоляты представляли собой более или менее гомогенную группу н были близки к эталону А/Сычуань/2/87, при этом только несколько штаммов полностью утратили родство с референс-штаммом А/Банпсок/1/79. Большинство вновь выделенных вирусов содержали в составе ГЛ антигенные детерминанты Н3.10 и Н3.16, свойственные вирусам бангкокской и сычуаньской разновидностей, соответственно. Четыре изолята (А/Алматы/168/90, А/Алматы/438/90,

А/Галдыкорган/486/90, А/Алматы/б30/90) имели своеобразное сочетание

*

антигенных детерминант и характеризовались наличием двух "старых4 детерминант Н3.7, 113.10 (обнаруженных в составе вирусов 1979-1989 гг.), общих с эталонным вирусом А/Бангкок/1/79 и новой "сычуаньской" детерминанты Н3.16, которая входит также в состав ГА актуального варианта А/Гуаидонг/39/89.

Свежевыделенные изоляты вируса А(НЗЫ2) 1990 г. слабо'. репродуцировались на куриных эмбрионах, плохо закреплялись при пассировании и характеризовались относительно низкой гемагглютннирующей активностью. При изучении терморезистентности ГА исследуемых вирусов, выявлено, что 11 штаммов имели термостойкий ГА. ГА штаммов А/Караганда/384/90, А/Караганда/388/90, А/Караганда/390/90,

А/Караганда/401/90, А/Галдыкорган/487/90 и А/Талдыкорган/488/90 был гермолабильным, их активность не обнаруживалась через 1-2ч прогревания при 56°С. Вирусы одинаково хорошо адсорбировались на форматированных эритроцитах кур, однако элюции вирусов с эритроцитов не происходило. Лишь штаммы А/Шымкент/48/90, А/Алматы/168/90, А/Алматы/438/90, А/Алматы/630/90 элюировалн на 15-50% в ходе 5 ч инкубации при температуре 37°С. Изоляты характеризовались узким спектром рецепторной активности. Они хорошо агглютинировали эритроциты кур (1:8-1:128), слабее - морских свинок ■ (1:4-1:64) и не взаимодействовали с эритроцитами мышей, овцы, а также свиньи, лошади и крупного рогатого скота. 13 штаммов в титрах 1:2-1:64 агглютинировали эритроциты белых крыс. Все изоляты вируса А(НЗШ) 1990 г. значительно различались между собой по чувствительности К сывороточным ингибиторам. Выделенные штаммы были чувствительными как к гермостабильным у-ингибиторам, так и термолабильным р-ингибнторам.

Характерной особенностью вирусов гриппа 1992 г. явилась значительная гетерогенность, Июляты в высоких титрах взаимодействовали с сивороткрми к эталонным вариантам вирусов гриппа A (H3N2) (титр 1:20-1:2560) и В (тигр 1:160-1:2560) и не реагировали с сыворотками к штаммам вируса гриппа Л (H1N1) и A (H2N2). При пассировании гетерогенной популяции выделенных изолятов на клетках МДСК наблюдалось появление разнородных клонов бляшек - крупных и мелких. Крупные бляшки представляют популяцию вируса гриппа A(H3N2), мелкобдяшечная популяция в высокой сгепенн реагировала с сывороткой к вирусу гриппа В/Семипалатинск/151/91. Использование МСА к отдельным антигенным детерминантам ГА вирусов гриппа A(H3N2) 1968-1992 гг. дало возможность обьективно оценить антигенную новизну ГА выделенных вариантов вирусов A(H3N2) (таблица 3). По составу антигенных детерминант г РТГА с МСА выделялись четыре разнокачественных группы. Большинство вирусов содержали антигенные детерминанты, свойственные вирусам гр.пн.а А '(H3N2): А/Гуандонг/39/89 и А/Москва/170/92, и имели формулу И3.19, Н3.21, Н3.22. Вторая группа вирусов по составу детерминант отличалась от предыдущей по двум антигенным сайгам - Н3.18 и ИЗ.20, проявляя антигенное родство с эталонным вирусом гриппа А/Пеюш/353/89 по антигенной детерминанте Н3.20, и со штаммом А/Новгород/75/90 по сайту Н3.18. Изолят а/Алмагы/97/92 отличался от двух предыдущих групп вирусов по композиции антигенных детерминант. Исследование вариантов А/Алматы/39/92, А/Алматы/29/92, А/Алматы/188/92, полученных из крупных бляшек, показало, что в ходе клонирования . исходные популяции изолятов претерпели существенные изменения. Так, оригинальные изоляты несли в составе ГА сайты НЗ.18,113.19,113.20 в то время как варианты, полученные из крупных бляшек, характеризовались наличием маркеров Н3.19,Н3.20,Н3.22.

Вирусы гриппа 1996 г., не взаимодействуя с сыворотками к эталонам 19681987 гг., в разной степени реагировали с сыворотками к вирусам A (H3N2) 19891994 гг. и характеризовались частичным родством с эталонами А/Гуандонг/39/89 и А/Шанхай/6/89. Эти изоляты и остальные эпидемические штаммы (А/У ральск/22/96, А/Алматы/591/96, А/Алматы/638/96, А/Алматы/99/96] проявляли высокую . степень родства с вариантами 1993-1994 гг (А/Владимир/б/93, А/Москва/7/94). Для выявления отличий в антигеннь» свойствах штаммов полйклональные сыворотки к А/Алматы/591/96 и

Таблица 3

Антигенная структура казахстанских штаммов вирусов гриппа А(НЗЫ2) 1992 г.

Штамм ы NN Моноспецифнческие антитела Антигенные детерминанты в цифровом обозначении

НЗ.1-3.17 113.18 Н3.19 113.20 Н3.21 Н3.22

92 0 0 80 0 80 160 Н3.19 Н3.21 Н3.22

104 0 0 80 0 80 80 Н3.19 Н3.21 Н3.22

119 0 0 160 0 160 160 H3.19H3.2I 113.22

155 0 0 160 0 320 320 Н3.19 Н3.21 »3.22

195 0 0 160 0 160 160 113.19 Н3.21 113.22

375 0 0 160 0 160 160 113.19 Н3.21 113.22

378 0 0 160 0 160 160 Н3.19 113.21 113.22

5 0 80 80 80 0 0 113.18 113.19 113.20

29 0 80 80 80 0 0 Н3.18 113.19 113.20

39 0 80 80 80 0 0 Н3.18 113.19 Н3.20

97 0 40 80 0 40 0 113.18 Н3.19 113.21

102 0 80 80 80 0 0 Н3.18 Н3.19 Н3.20

188 0 160 160 160 0 0 НЗ. 18 113.19 113.20

29к 0 0 2560 2560 0 640 113.19 нз:20 113.22

39к 0 0 640 25Й0 0 1280 Н3.19 Н3.20 113.22

188к 0 0 320 2560 0 640 Н3.19 Н3.20 113.22

П р и м с ч а н и е - к- отклонироваиные метолом бляшек варианты.

А/Алматы/638/96 были исследованы методом иммуносорбиионного анализа. Как видно из рисунка 2, до адсорбции сыворотки активно реагировали с вирусами 1993-1994 гг. После адсорбции вирусом А/Владимир/6/93 (Н3.20,Н3.22,Й3.23) сыворотки утрачивали антитела к общим антигенным детерминантам Н3.23 и

64056048040032024016080-

Исследование пилик-юнальных сывороток к вирусам А/Алматы/591/96 (I) и А/Алм»ты/638/9й (И) методом нммуносорбшш 1

□

ш □

640560480 4004 320 240160800

Ж

щ

У й I

I

X.

а б в

По оси абсиисс: 1 - А/Владимир/6/93; 2 - А/Москва/7/94; 3 - А/Алматы/591 /96; 4 - А/Алматы/638/96. а - до адсорбции;

б - адсорбция вирусом А/Владнмир/б/93; в - последующая адсорбция вирусом А/Москва/7/94. По оси ординат - обратные разведения сывороток, нмгибнрующлх 4

гемагглютииирующие едишпш вирусов в РТГА.

Рисунок 2

б

а

в

ИЗ.24. В сыворотке оставались антитела к сайту вирусов прежних лет Н3.25 и новому с оригинальными свойствами. Последующая адсорбция вирусом А/Москва/7/94 (Н3.20,Н3.22,Н3.23) определяла новый сайт, условно обозначенный нами Н3.26. Анализ ГА штаммов проведен также в РТГА с использованием МКАТ к вирусам А/Бапгкок/1/79 и А/Фнлиппины/2/82 (таблица 4). Варианты, содержащие антигенные сайта прошлых лет изоляции (А/Кокшетау/719/96, А/Алматы/603/96, А/Алматы/670/96) по-разному реагировали с МКАТ 156/2 и 85/1 к вирусу А/Бангкок/1/79, вместе с тем данные штаммы взаимодействовали с МКАТ 30 к вирусу А/Фнлиппины/2/82. Причем, у вирусов с одинаковым набором антигенных сайтов (А/Кокшетау/719/96 н А/Алматы/603/96) выявились различные эпитопы, о чем свидетельствовало взаимодействие их с соответствующими МКАТ. Для штамма Л/Алматы/638/96, содержащего ГА сайт с оригинальными свойствами, характерно активное взаимодействие с МКАТ 3 к вирусу А/Фнлиппины/2/82 н полное отсутствие реакции с МКАТ к вирусу А/Бангкок/1/79. Гемагглютннирующую активность; агенты 1996 г. проявляли по отношению к эритроцитам кур н морской свинки, не сорбировались эритроцитами кролика и агглютинировали эритроциты барана. По отношению к мышиным эритроцитам активность проявляли 5 штаммов. 6 казахстанских нзолятов оказались термостабильными и сохраняли спою активность в РГА после прогревания при 56" С. Штаммы А/Алматы/99/96 и А/Кокшетау/719/96 обладали термолабильным ГА, их титр в РГА после прогревания падал в 8 и более раз. По признаку ингибиторочувствительностн изоляты 1996 г. отчетливо разделились на три группы. Три изодята первой группы были резистентны по отношению к {»специфическим ингибиторам нативных и прогретых сывороток пяти видов животных. Вариант А/Уральск/26/96 проявлял умеренную чувствительность к термолабильным и тсрмостабильным ингибиторам сывороток крупного рогатого скота, морской свинки, крысы, барана. В третью группу входили изоляты А/Алматы/99/96, . А/Алматы/638/96, А/Алматы/670/96, А/Кокшетау/719/96 чувствительные к ингибиторам как прогретых, так и нативных сывороток. Интересно .отметить, что по указанному признаку гетерогенность популяции наблюдалась у вирусов, циркулировавших в один и тот же сезон в одном городе.

Методами иммуносорбционного анализа показано, что в составе 9 изученных изолятов 1997 г. содержатся новые антигенные группы (рис.3). Как

Таблица 4

Анализ антигенной Структуры изолятов втфусов гриппа А(НЗШ) с МКАТ к штаммам А/Ба1птсок/1/79 и А/Филнппины/2/82

Тест-вирусы А/Бангкок/1/79 А/Филиппины/2/82

45/5 156/2 60/3 85/1 3 11 12 . 13 14 20 29 30

А/Кокшетау/719/96 640 80 80 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 5120

А/Алматы/603/96 320 <20 80 160 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 5120

А/Алматы/670/96 1280 160 80 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 320

А/Алматы/638/96 <20 <20 <20 <20 160 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20

А/Бангкок/1/79 10240 10240 10240 10240 5120 <20 <20 10240 5120 320 1280 5120

А/Филиппины/2/82 10240 10240 1280 1280 10240 5120 10240 10240 10240 5120 5120 10240

А/ Гуандонг/39/89 5120 <20 <20 <20 1280 5120 10240 <20 5120 <20 <20 10240

А/Владимир/6/93 <20 <20 <20 <20 320 <20 <20 <20 <20 <20 <20 320

о

5120 1280 320 80 5120 1280 320 80

Исследование полпкл опальных сывороток к вирусам А/Ллматы/12/97 (1) и А/Алматы/24/97 ( II) методом иммуносорбцни

I

гь

...ГУ.Д—1_1_I_1_

4-

♦г' ^

п

-I-1-1-и

I

6 1

3 4 б

3 4 а

По осп абсинсс - рсференс - вирусы:

1 - А/Владимир/6/93;

2 - А/Москва/7/94;

Тест-вирусы:

3 - А/Алматы/591/96;

4 - А/Алматы/638/96;

5 - А/Апматы/12/97;

6 - А/Алматы/24/97.

а - сыворотки до адсорбции;

б - сыворотки адсорбированы вирусом А/Алматы/638/96

По оси ординат - обратные разведения сывороток, ингибируюших 4. гсмагглютинируюшие единицы вирусов в РТГА.

Рисунок 3

Л

видно из рисунка, да адсорбции сыворотки анти-А/Алматы/12/97 и анги-А/Алматы/24/97 реагировали с вирусами 1993-1996 гг. Сыворотка антн-А/Алматы/12/97 взаимодействовала с вирусами, содержащими в антигенной структуре детерминанты Н3.24, Н3.26. После адсорбции вирусом А/Алматы/638/96 (Н3.24,Н3.25,113.26) выявлена популяция антител к детерминантам с новыми оригинальными свойствами, которая peai провала только с вирусами А/Алматы/12/97 и А/Алматы/24 57. Исследования сыворотки к варианту А/Алматы/24/97 показало, что до адсорбции она реагировала со штаммами, содержащими сайты Н3.25 и Н3.26. После удаления популяции антител к ним с помощью адсорбции штаммом А/Алматы/638/96 в сыворогсе оставались антитела к новой антигенной детерминанте, условно обозначенной нами как Н3.27. Картирование детерминант на поверхности ГА эпидемических изолятов с помощью МСА к антигенным сайтах! вирусов A (H3N2) 1968-1996 тг. выявило характер различий в антигенной структуре ГА этих вирусов. Как видно " из таблицы 5, вирусы первой группы содержали в своем составе антигенные

Таблица 5

Антигенная структура гемагглютннинов изолятов вируса гриппа A(H3N2) согласно данным РТГА с моноспецифическими антителами

Группа Тест-вирусы Антигенные сайты

1 . А/Алматы/7/97 Н3.24 Н3.26 Н3.27

А/Алматы/9/97 Н3.24 113.26 113.27

А/Алматы/12/97 Н3.24 Н3.26 Н3.27

А/Алматы/14/97 Н3.24 Н3.26 1-13.27

II А/Алматы/22/97 113.25 Н3.26 Н3.27

А/Алматы/24/97 Н2.25 Н3.26 Н3.27

А/Алматы/30/97 Н3.25 Н3.26 Н3.26

111 А/Алматы/16/97 113.24 Н3.25 113.27 11. Ш20*. X"

А/Алматы/19/97 Н3.24 Н3.25 Н3.27 Т1. Ш20*. X**

Примечание: 1. *Т1 и 11120 - антигенные детерминанты вирусов гриппа серутннч В, 2. **Х - антигенная детерминанта не установлена,

113.24, Н3.26 и Н3.27. В структуре ГА вирусов второй группы выявлены сайты

113.25, Н3.26 и Н3.27. У вирусов третьей группы также идентифицированы три детерминанты - ИЗ.24, 113.25 и Н3.27. В гетерогенной популяции этой труппы вирусов, кроме сайтов присущих вирусам А (НЗЫ2), определялись антигенные детерминанта Т1 и 11120 вирусов серотнпа В. Анализ ГА эпидемических вариантов был проведен также с использованием МКАТ к вирусам А/Бангкок/1/79 и А/Филиппнны/2/82 (таблицаб).

Таблица 6

Анализ антигенной структуры гемашнотинннов изолятов вируса гриппа А(НЗШ) с моноклональными антителами

Тест-вирусы МКАТ к вир А/Бангкок/1 усу /79 МКАТ к вир А/Филиппнны усу /2/82

45/5 156/2 60/3 3 5 30

А/Кангк! </1/79 10240 10240 10240 5120 <20 5120

А/Фнлиппнны/2/82 10240 10240 1280 10240 10240 10240

А/Владнмир/6/93 <20 <20 <20 320 <20 320

А/Алматы/7/97 320 <20 80 640 <20 160

А/Алмагы/9/97 640 80 80 1280 80 80

А/Алматы/12/97 160 80 160 32 0 <20 <20

А/Ал маты/14/97 320 <20 80 320 80 320

А/Алматы/22/97 80 80 <20 80 <20 <20

А/Алматы/24/97 <20 <20 <20 80 <20 • <20

А/Ал м аты/30/97/ 160 80 <20 320 <20 <20

А/Ал маты/16/97 80 160 80 640 <20 160

А/Алматы/19/97 320 320 320 320 <20 320

Установлено, что в составе штаммов 1997 г. сохранился'эпитоп от вируса А/Бангкок/1/79, о чем свидетельствует реакция с МКАТ 45/5. Только штамм А/Ал маты/24/97 не взаимодействовал ни с одним МКАТ к этому вирусу. Остальные изоляты проявляли различную реакцию по отношению к МКАТ 156/2 и 60/3. Штаммы А/Алматы/9/97, А/Алматы/12/97, А/Алматы/16/97 и

А/Алматы/19/97 реагировали с обоими МКАТ. Штаммы А/Алматы/7/97 и А/Алматы/14/97 взаимодействовали с МКАТ 60/3, но не взаимодействовали с МКАТ 156/2. Штаммы А/Алматы/22/97 и А/Алматы/30/97, наоборот, распознавались МКАТ 156/2 и не взаимодействовали с МКАТ 60/3. Все изоляты реагировали с МКАТ 3 к вирусу А/Филиппшш/2/82. Вирусы А/Алматы/9/97 и А/Алыаты/14/97 содержали эпитопы, выявляемые МКАТ 5 и 30. Другие штаммы (А/Алматы/7/97, А/Алмати/16/97 и А/Алматы/19/97) взаимодействовали с МКАТ 30, но не с МКАТ 5. Третья группа изолятов (А/Алматы/12/97, А/Алматы/22/97, А/Алматы/24/97, А/Алматы/30/97) не распознавалась ни одним из этих МКАТ (5 и 30). Наибольшую гемагглютинирующую активность вирусы 1997 г. проявляли с эритроцитами кур. барана и морской свинки, но не связывались с эритроцитами кролика. По отношению к мышиным эритроцшам активность проявлял лишь один штамм. Все 9 вирусов были термостабильными и не связывались с ингибиторами сывороток кроен крысы и кролика. С сыворотками крупного рогатого сксгга, морской свинки и барана их поведение было различно. Изоляты А/Алматы/7/97, А/Алматы/9/97, А/Алматы/12/97 были чувствительны лишь к ингибиторам нормальной сыворотки крупного рогатого скота и барака. Штамм А/Алматы/30/97 проявлял незначительную активность в РТГА (1:80) только с нормальной сывороткой барана. Вирусы А/Алматы/22/97 и А/Алматы/24/97 не взаимодействовали с сыворотками морской свинки и барана и в Tirrpe 1:320 ингибировалнсь неспецифическимн субстанциями нзтивной сыворотки крупного рогатого скота. Варианты А/Алматы/24/97, А/Алматы/24/97, А/Алмагы/24/97 реагировали с термолабнлышми н термостабильными ингибиторами крупного рогатого скота. Изолят А/Алматы/12/97 был чувствителен к термолабильным и термостабильным ингибиторам крупного рогатого скота и термолабильным морской свинки и барана.

Таким образом, изучение распространения вирусов гриппа A(H3N2), что наиболее широкая их циркуляция отмечена в сезоны 1990, 1992, 1996 и 1997 гг. Удельный вес гриппа в эти колебался от 9,1% до 58,8 %, продолжительность эпидемии составила 4,9-7,3 недели. Большинство из 30 казахстанских изолятов 1990 г были родственными эталонам А/Сычуань/2/87. В 1992 г. в Казахстане нами выделены возбудители гриппа представлявшие гетерогенную популяцию штаммов родствешшх с вирусами A(H3N2) и В - А/Гуандонг/39/89,

А/Москва/170/92, В/Ямагата/6/88 и В/Семипалатинск/151/91. Большинство штаммов содержало антигенные сайты Н3.19, Н3.21, Н3.22, однако другая часть изолятов отличалась от них по детерминантам Н3.18, Н3.20, характеризующим эталоны А/Новгород/75/90 и А/Пекин/353/89. Штамм А/Алматы/97/92 имел своеобразное сочетание антигенных маркеров Н3.18, Н3.19, Н3.21. Показано изменение состава ГА у трех клонированных вариантов вируса A(H3N2) 1992 г. с Н3.18, 113.19, Н3.20 на . Н3.19, Н3.20, Н3.22. В 1996 гг. заболеваемость гриппом в РК составила 44,4% от общих случаев гриппа и ОРЗ н была относительно непродолжительной — 4,9 недели. Циркулировавшие в это время штаммы наибольшую степень проявили с вариантами А/Влади мир/6/93 и А/Москва/7/94, но сохранили частичную взаимосвязь с эталонами А/Гуандонг/39/895 и А/Шанхай/6/£9. Установлено антигенное разнообразие вирусов A(H3N2) 1996 г. и появление нового сайта Н3.26. Отчетливые различия прояв11лись среди нзолятов 1996 г. по ряду биологических свойств. В сезон 1997 г. эпидемия гриппа, вызванная преимущественно вирусом A(H3N2) продолжалась среди населения городов РК 7,2 недели, удельный вес чистого гриппа составил 58,7%. 9 изученных штаммов A(H3N2) эгого года по антигенной структуре ГА разделились на три группы. У всех изолятов присутствовала новая детерминанта Н3.27. Одна из групп была представлена штаммами А/Алматы/16/97, А/Алматы/17/97, которые по результатам иммунологического анализа являлись гетерогенными популяциями. В их составе определялись антигенные сайты ГГн 11120 вирусов серотипа В. Выраженная антигенная гетерогенность нзолятов 1997 г. обнаружена также с помощью МКАТ. Отмечены различия казахстанских изолятов 1997 г. по спектру гемагглютинируюшей активности и" ингнбиторочувствительности, в то же время все они обладали термостабильным ГА. •

Итоги НИР указывают на то, что вирусы гриппа A(H3N2) являются наиболее актуальными возбудителями данной инфекции на территории Казахстана, поражающими все слон населения с преобладанием, в целом, детского контингента. Исследование естественной изменчивости выявило гетерогенность популяции вирусов A(H3N2) каждого эпидемического сезона и регулярное пояатенле новцх антигенных сайтов в структуре ГА, что свидетельствует об их значительном антигенном дрейфе. Эпидемические . штаммы .также отличались в разной степени друг от друга по своим

биологическим характеристикам, что подтверждает высокую вариабельность вирусов этого сероподтипа. Следует отметить, тем не менее, что каких-либо коррелятивных взаимосвязей между биологическими свойствами дрейф-вариантов и их антигенным составом или местом выделения нами отмечено не было.

Характеристика вирусов гриппа A(IIINI), выделенных в РК. 7 штаммов вируса гриппа A(H1N1) 1994 г. наиболее активно в РТГА взаимодействовали с МСА к вирусам А/СССР/90/77 и А/Бразилия/11/78, свидетельствуя о наличии в их структуре общих антигенных детерминант. В целях их идентификации использовали РТГА с МСА к отдельным антигенным маркерам вирусов А/СССР/90/77 и А/Бразилня/11/78. Установлено, что варианты взаимодействовали с МСА к тнпо- и группоспецифическим детерминантам обоих вирусов, а также с МСА к штаммоспецнфической детерминанте эталона А/СССР/90/77, но не А/Бразилия/11/78 (таблица 7).

Таблица 7

Исследование антигенной структуры вирусов A(H1N1) 1994 г. с моноспсцифичсскимк сыворотками

Тест- Моноспецифичсские сыворотки к вирусам МСА к детерминантам

вирус A/PR /34 A/FM /47 А/Ден /57 А/СССР /77 А/Браз /78 Т ГС Шт. 1 Шт. 2

А/Алматы/35/94 0 0 0 160 80 80 40 40 0

А/Алматы/204/94 0. 0 0 320 160 160 40 40 0

А/Алматы/151/94 0 0 0 320 320 160 40 40 0

А/Алматы/97/94 0 0 0 320 160 160 80 40 0

А/Алматы/77/94 0 0 0 160 80 80 40 40 0

А/Алматы/270/94 0 0 0 320 80 160 40 40 0

А/Алматы/137/94 0 0 0 160 80 80 40 40 0

А/СССР/90/77 0 0 0 1280 320 160 640 80 0

П р и м е ч а и и е - Т, ГС - типо- и груплоспецифические детерминанты вирусов А/СССР/90/77, А/Бразилия/11/78; Шт.1 и Шт.2 - штаммоспецнфнческис детерминанты указанны* вирусов

Таким образом, характерной чертой эпидемического сезона 1994 г. была циркуляция вирусов гриппа A(H1N1), идентичних эталону А/СССР/90/77. Однако, с помощью МКАТ среди них были обнаружены варианты, свидетел])ствующие о дальнейшем антигенном дрейфе возбудителей этого

серопс-тгипа.

Результаты анализа антигенной структуры 8 штаммов вируса гриппа A(H1N1) 1998 г. с помощью МСА к отдельным антигенным детерминантам представлены в таблице 8.

Таблица 8

Анализ антигенной структуры изолятов вируса A(HIN1) 1998 г. 1

Изолчты Моноспецифические антитела к сайтам

Типоспе-цифичес-кие Штаммоспецнфические Группоспец. А/СССР /90/77 А/Бразилия /11/78

А/СССР /90/77 А/Браз. /11/78 А/Тех. /36/91 А/Бай /07/95

А/Ал маты/6/98 40 0 0 0 80 40

А/Алматы/7/98 SO 0 0 0 160 80

А/Ал маты/25/98 160 0 0 0 160 40

А/Алматы/26/98 80 0 0 0 80 80

А/Алматы/27/98 40 0 0 0 40 0

А/Алматы/29/98 40 0 0 0 80 0

А/Алматы/40/98 80 0 0 0 40 0

А/Алматм/45/98 80 0 0 0 80 0

А/СССР/90/77 160 320 0 0 0 640

МСА к штаммоспецифескнм сайтам А/СССР/90/77, А/Бразилия/11/78, А/Техас/36/91 не взаимодействовали с изолятами 1998 г. Штаммы А/Алматы/б/98, А/Алматы/7/98, А/Алматы/25/98, А/Алматы/2б/98 в составе ГА содержали детерминанту общую для эталонных вирусов А/СССР/90/77 и Л/Бралилия/11/78, Штаммоспецифический сайт вируса А/Байерн/07/95

определялся в структуре всех вновь изолированных вариантов. Следовательно в составе ГА вирусов А/Алматы/6/98, А/Алматы/7/98, А/Алматы/25/98, А/Алматы/26/98 идентифицировали 3 сайта - типоспецифический для вирусов А(НШ1), группоспецнфнческий для вирусов А/СССР/90/77 и А/Бразилия/11/78 и штаммоспецифический А/Байерн/07/95. В структуре ГА эпидемических цзолятов А/Алматы/27/98, А/Алматы/29/98, А/Алматы/40/98, Д/Алматы/45/98 определены 2 сайта - типоспецифический и штаммоспецифический А/Байерн/07/95. Третий сайт определял отличие новых изолятов от вирусов прежних лет. Среди изолятов 1998 г. можно выделить две группы различающихся по антигенной структуре ГА. Одна группа в составе ГА содержала типоспецифический сайт и сайт общий с вирусами А/СССР/90/77 и А/Бразилия/11/78. Третья детерминанта обусловила общность с циркулирующим в настоящее время вариантом А/ Байерн/07/95. В структуре ГА вирусов второй группы определяли помимо общей, тилоспецифнческой детерминанты, сайт характеризующий родство с вирусом А/Байерн/07/95 и сайт штаммоспецифический, присутствующий только у этих изолятов. По спектру гемагглютинирующей активности эпидемические изоляты 1998 г. представляют собой довольно однородную группу. Они не реагировали с эритроцитами крупного рогатого скота, агглютинировали эритроциты кур, морских свинок в титрах 1:32-1:256 и в меньшей степени взаимодействовали с эритроцитами барана и мыши (1:2-1:64). Определение влияния температурного фактора позволило отнести большую часть изолятов 1998 г. к термостабильным, сохраняющим активность ГА после 4ч. прогревания при 56° С. Лишь у двух штаммов гемагглютинирующая способность снижалась в 16 раз, чТ6 свидетельствовало об их термочувствительности. Все вирусы 1998 г. хорошо адсорбировались на поверхности формалннизнрованных эритроцитов кур и полностью элюировали с'них после 3 ч инкубации при 37°С, за исключением штамма А/Алматы/7/98, десорбировавшегося на 50%. По отношению к ингибиторам сывороток крови различных видов животных варианты А(ШЫ1) 1998 г. не проявили больших различий. Все изоляты был» чувствительными к ингибиторам нативных и прогретых (62°С, 30 мин) сывороток крупного рогатого скота, морской свинки, кролика в титрах 1:40-1:320, слабо взаимодействовали с нативной сывороткой- мыши. Все изоляты, за исключением А/Алматы/7/98 инактивировались у-ингибиторами сыворотки морской свинки. С сывороткой

кролика, прогретой при 100°С, взаимодействовали в незначительной степени штаммы А/Алматы/27/98, А/Алматы/29/98, А/Алматы/40/98, А/Алматы/45/98, А/Алл!аты/6/98.

Изучение эпидемического распространения и антигенного дрейфа вирусов гриппа А(Н1М1), циркулировавших в РК указывает на то, что они, уступая по своей эпидемической значимости вирусам А(НЗШ), остаются весьма актуальными возбудителями ОРЗ. Так, удельный вес гриппа А(ИШ1) в суммарной заболеваемости в 1994 и 1998 гг. составил 15,19% и 9,8%, соответственно. Исследование антигенных взаимосвязей казахстанских вариантов А(Н1Ы1) свидетельствует о существенной антигенной изменчивости вирусов этого сероподтипа Если в 1994 г. в РК циркулировали штаммы близкородственные эталону А/СССР/90/77, то в 1998 г. были изолированы А/Байерн/07/95-подобные вирусы. При этом следует отметить, что выраженнхч антигенная гетерогенность нзолятов 1998 г. сопровождалась гораздо меньшим разнообразием их биологических свойств.

Естественная изменчивость вирусов гриппа В на территории Казахстана. Из 20 штаммов вируса серотнпа В, выделенных в Казахстане в 1991 г. нами изучено 6, первичную идентификацию которых провели в РИГА с антительными ЭД. Казахстанские нзоляты вируса гриппа В 1991 г. выделения по специфичности ГА представляли собой практически однородную группу и наиболее активно реагировали с референс-штаммами В/Л ион/1847/79, В/Сннгапур/222/79, В/Чебоксары/409/86, В/Внктория/7/87. Исключение составил изолят В/Семнпалатинск/151/91, который, в отличие от других штаммов, активно реагировал с иммунной сывороткой к вирусу В/Ямагата/16/88. Для определения антигенных сайтов были изучены популяции антител к иммунодоминантным участкам ГА вируса В/Семнпалатинск/151/91 методом избирательной нммуносорбции. На рисунке 4 представлены результаты исследования антнсыворо^хн к вирусу гриппа В/Семнпалатинск/151/91. Как видно она в высокой степени реагировала со штаммом В/Ямагата/16/88 и в меньшей с вирусами В/Лнон/1847/79, В/Виктория/7/87 и В/Алматы/218/91. При адсорбции антисыворотки вирусами В/Лион/1847/79 и В/Виктория/7/87 сыворотка утратила свою антигемагглютинируюшую активность к вирусам, взятым для адсорбции, но активно взаимодействовала со штаммом В/Ямагата/16/88, что свидетельствовало о наличии общей антигенной детерминанты у этих вирусов.

Исследование сыворотки к изоляту В/Семипалатинск/151/91 методом иммуносорбщш (I схема иммунизации)

Здесь и далее в рисунках по оси абсцисс - тест-вирусы; по оси ординат -' »ратные разведения сыворотох, интибирующих 4-8 ГАЕ вирусов I- анти-В/Семипалатинск/151/91 до адсорбции II - ант-В/Сем1гпалатинск/151/91 адсорбирована В/Лиои/1847/79 Щ - а1гп|-В/Семипалатинск/151/91 адсорбирована В/Внктория/2/87 IV - аити-В/Сем11палатинск/151191 адсорбировала В/Ямагата/16/88

1 - В/Ли/40

2 - В/Лнон/1847/79

3 - В/Виктория/2/87

4 - В/Ямагата/16/88

• 5 - В/Семипалатинск/151/91 6 - В/Алма-Ата/218/91

Рисунок 4.

Адсорбция антисыворотки к вирусу В/Семипалатинск/151/91 вирусом В/Ямагата/16/88 приводила к утрате актигемагглютшшнсв ко всем использованным в реакции вирусам, кроме гомологичного. Таким образом, в антигенной структуре изучаемого изолята содержится оригинальный антигенный компонент, характеризующий его специфичность, условно обозначенный нами как III19. Для получения наиболее полной информации об антигенных детерминантах на молекуле ГА вируса гриппа В, были использованы МСА к отдельным сайтам ГА (таблица 9).

Таблица 9

Изученме антигенной структуры лзолятов вируса 1

гриппа В с помощью МСА

МСА к антигенным сайтам Измяты

ГА вируса гриппа В С/151 С/169 С/196 А/218 К/286

Т1 80 40 80 160 20

группоспецифитеские:

Г1, Г2, Г4 0 0 0 0 0

ГЗ 0 80 80 320 160

Г5 640 0 0 0 0

штамг юспецнфнческие:

IU1-I1114, Ш16-Ш18 0 0 0 0 0

Ш15 0 160 160 80 SO

Антигенная формула Т1 TI Т1 Т1 Т1

Г5 ГЗ ГЗ ГЗ ГЗ

Ш19 Ш15 Ш15 Ш15 1U15

На основании полученных результатов установлено наличие в ГА исследованных изолятов трех иммунологически значимых антигенных детерминант: тнпоспецифической (Т1) - антигенно стабильной, присущей всем изученным вариантам серотипа В; группоспеиифической (Г) - характеризующей родство вирусов, изолированных на протяжении близких лет; штаммоспецифнческой

(Ш) - наиболее лабильной, определяющей штаммовую специфичность вариантов. Полученные результаты указывают на то, что изоляты В/Ссмнпалатннск/169/91, В/Семипалатинск/196/91, Б/Алматы/218/91 и В/Караганда/286/91, помимо типоспецифической Т1, несут общую антигенную группоспецифическую детерминанту ГЗ, свойственную вирусам гриппа 19721983 гг. выделения и общую с вирусом В/Чсбоксары/409/86 штаммоспецифическую детерминанту Ш15. Изолят В/Семипапатинск/151/91 являлся дрейф-вариантом эталонного штамма В/Ямагата/16/88, сохраняя с ним родство по двум сайтам, но содержал качественно новую штаммоспецифическую детерминанту, не встречавшуюся ранее у вирусов гриппа В 1940-1988 гг., обозначенную нами как Ш19. Казахстанские штаммы проявляли высокую степень сходства с вариантами вируса гриппа А(НЗШ) 1987-1991 гг. выделения, связываясь с сыворотками к эталонным вариантам А/Гуандонг/39/89, А/Москиа/170/92, и в меньшей степени - с сывороткой к штамму А/Пекин/353/89. При постановке РТГА с сыворотками к эталонным вариантам вируса гриппа В отмечено, что изолированные варианты родственны штаммам В/Ямагата/16/88 и В/Семипалатинск/151/91. Таким образом, по специфичности ГА вирусы гриппа 1992 г. представляют собой гетерогенную популяцию, проявлявшую антигенную близость к вирусам гриппа В и А(НЗЫ2). При исследовании гетерогенной популяции изолятов с МСА к вирусам гриппа В 1940-1991 гг. выделения было установлено, что они не реагируют с антителами к ГА вариантов вируса 1940-1987 гг. и проявляют выраженное сродство к дрейф-вариантам 1988-1991 гг. выделения (таблица 10). Из таблицы видно, что штаммоспецнфические' антигенные детерминанты ГА изученных нами пирусой представляют собой две разнокачественные популяции вирусов. Первая включает ' вирусы, ГА которых характеризуется наличием новой штаммоспецифической детерминанты, не встречавшейся у ранее циркулировавших вирусов гриппа В и условно обозначенной нами как Ш20. К этой группе отнесены штаммы А/Ал маты/104/92, А/Алматы/195/92 и А/Алматы/378/92, с антигенной формулой Т1.Ш17.Ш20. Ко второй группе относятся варианты, обладающие общим антигенным сайтом 11117 с эталонным вирусом гриппа В/Ямагата/16/88'и имеющие антигенную формулу Т1.Ш17.Ш19. Для дальнейшего изучения антигенной структуры штаммов исходную

Таблица 10

Изучение антигенной структуры изолятов вируса гриппа В с помощью МСА

Изо- Л'ПЫ МСА к антигенным сайтам ГА вируса гриппа В Антигенная (формула

тнпо-спец. группо-специфнческие штаммо-специфические

Т1 Г1-ГЗ Г4 Г5 1111-16, Ш18 Ш17 Ш19

А/5 80 0 0 0 0 160 320 Т1.Ш17.Ш19

А/8 80 0 0 0 0 640 160 Т1.11117.11119

А/29 40 0 0 0 0 640 320 Т1.Ш17.Ш19

А/39 so 0 0 0 0 320 160 Т1.Ш17.Ш19

А/92 80 0 0 0 0 320 80 Т1.Ш17.Ш19

А/97 160 0 0 0 0 640 320 Т1.Ш17.Ш19

А/102 80 0 0 0 0 80 320 Т1.Ш17.Ш19

А/104 40 0 0 0 0 640 0 Т1.Ш17.Ш20

С/117 40 0 0 0 0 160 320 Т1.Ш17.Ш19

А/119 40 0 0 0 0 320 160 Т1.11117.11119

А/155 160 0 0 0 0 640 320 Т1.Ш17.Ш19

А/188 40 0 0 0 0 160 320 Т1.Ш17.Ш19

А/195 40 0 0 0 0 640 20 Т1.11117.11120

А/375 80 0 0 0 0 1280 80 Т1.Ш17.Ш19

А/378 80 0 0 0 0 640 20 Т1.Ш17.Ш20

гетерогенную популяцию отклошгровалн методом бляшек на культуре МДСК. Полученные бляшки по размерам делились на крупные (б) и Мелкие (м). Крупные бляшки представляли популяцию вируса гриппа, проявляющую антигенное родство с вирусами гриппа A(H3N2), мелкобляшечная популяция в высокой степени реагировала с вирусом гриппа В/Семипалатннск/151/91. Клоны вирусов были исследованы в РТГА с МСА к вирусам гриппа В 1940-1991 гг. для того, чтобы выявить степень качественных изменений, которые

произошли в ГА после клонирования (таблица 11). В антигенной структуре полученных клонов содержится общая антигенная детерминанта Г4, входящая в состав ГА эталонного вируса В/Ви1Сгория/7/87, не определяемая у тех же вариантов до клонирования, а также антигенная детерминанта Ш17, характеризующая специфичность эталонного штамма В/Ямагата/16/88.

Таблица 11

Антигенная структура изолятов вируса гриппа В после клонирования методом бляшек

Отклони рованные изоляты МСА к антигенным сайтам ГА вируса гриппа В Антигенная формула

типоспе цифи-ческие. группо-специфические штаммо-специфические

TI Г1-ГЗ Г4 Г5 U11-16, Ш18 Ш17 Ш19

А/5м 80 0 80 0 0 80 0 Т1.Г.4.Ш17

А/8м 80 0 640 0 0 80 0 Т1.Г.4.Ш17

А/29м 80 0 80 0 0 160 0 Т1.Г.4.Ш17

А/39м 80 0 80 0 . 0 80 0 Т1.Г.4.Ш17

А/97м 80 0 80 0 0 80 0 Т1.Г.4.Ш17

А/102м 80 0 160 0 0 320 0. Т1.Г.4.Ш17

А/188м 80 0 80 0 0 160 0 Т1.Г.4.Ш17

Приведенные результаты свидетельствуют о более широкой гетерогенности изолятов 1992 г., поскольку клоны, выделенные из бляшек, имели антигенную формулу Т1.Г4.Ш17, т. е. обладали свойствами старых вирусов гриппа В. Кроме того, изучение с МСА неклонированных вариантов показало, что они включали в состав ГА сайты Т1.Ш17.Ш19, содержащиеся в структуре вирусов гриппа В/Ямагата/16/88 и-В/Семипалатинск/151/91. Можно предположить циркуляцию в 1992 г. в РК двух популяций вирусов с различными антигенными свойствами. У ряда штаммов (А/Алматы/104/92, А/Алматы/195/92 и А/Алматы/378/92) была обнаружена новая, не встречавшаяся ранее штаммоспецифическая детерминанта, обозначенная как Ш20, которая выявила дальнейшую

изменчивость основного поверхностного антигена - ГА. Антигенная структура казахстанских штаммов вируса гриппа В представлена в таблице 12.

Таблица 12 .

Исследование антигенной структуры изолятов вируса гриппа В с помощью МСА

МСА к антигенным Изоляты

сайгам ГА вируса I II

гриппа D А/2 С/75 А/76 А/343 А/8 А/9 А/12 С/42

и 160 40 80 80 80 80 80 160

I руппоспецифические 0 0 0 0 0 0 0 0

Г1,Г2,Г4,Г5 ,

ГЗ 320 320 160 80 0 0 0 0

Шта м моспецифнчес-

кне Ш1-Ш17.Ш19 0 0 0 0 0 0 Q 0

Ш18 0 0 0 0 320 160 160 160

III20 320 160 320 160 640 320 640 320

Антигенная Т1 Т1 Т1 Т1 Т1 Т1 Т1 Т1

(¡юрмула ГЗ ГЗ ГЗ гз Ш18 11118 Ш18 ULI18

Ш20 Ш20 Ш20 Ш20 Ш20 Ш 20 Ш20 LII20

Как видно из таблицы 12, штаммы 1993 г. не были однородны в антигенном отношении и имели различия, обнаруживаемые МСА. Так изоляты В/Алматы/2/93, В/Сечипататинск/75/93, В/Алматы/76/93, В/Алматы/343/93 помимо типоспсцифической Т1, содержат общую антигенную 1руппоспецифическую детерминанту ГЗ, свойственную вирусам гриппа 19721984 гг. выделения и новый оригинальный антигенный компонент, характеризующий специфичность выделенных изолятов, обозначенный нами как Ш20. Иэоляты второй группы В/Алмзты/8/93, В/Алматы/9/93, В/Ал мата/12/93 и В/Семипалатинск/42/93 помимо общей типоспсцифической детерминанты Т1, свойственной всем вирусам гриппа .В, п качестве второго компонента содержали сайт Ш18, присущий российским изолятам 1991 г. В/Кострома/51/91 и

В/Новгород/64/91. Третья детерминанта Ш20, впервые обнаруженная у вирусов 1992 г. в. структуре ГА представляла собой сайт с новыми, ранее не встречавшимися у вирусов В свойствами. Варианты 1993 г. проянляли наибольшую гемагтлютшшрующую активность с эритроцитами кур, несколько ниже - с эритроцитами морской свинки, не связывались с эритроцитами барана, мыши и кролика. Изоляты 1993 г. оказались температурочувствптельными по ГА. Прогревание при 56® С в течение 30 мин приводило к полному исчезновению гемагглютинирующей активности у В/Алмагы/2/93, В/Алматы/8/93, В/Алматы/76/93, В/Алматы/343/93 и снижению титров в 4- 8 раз у остальных штаммов. Все были чувствительны по отношению к ингибиторам нормальных сывороток кролика, крупного рогатого скота и морской свинки, гемагглютинирующая активность их подавлялась в титрах 1:80-1:320.

Антигенные взаимосвязи 8 штаммов вирусов гриппа В, выделенных в феврале-марте 1995 ' г., исследовали в перекрестной ГГГА с набором поликлональных сывороток к эталонам вирусов гриппа В. Все штаммы в различной степени нейтролизовались сыворотками к вирусам 1940-1991 гг. Однако наибольшие титры отмечены с сывороткой к штамму В/Владивосток/9/95, что свидетельствует о сходстве казахстанских изолятов с этим вирусом. Для определения качественного состава антигенных сайтов эпидемические изоляты анализировали методом картирования с помощью МСА к отдельным антигенным детерминантам ГА вируса гриппа В 1940-1995 гт. (таблица 13). Как видно, все варианты содержали общую для вирусов гриппа В типоспецифическую детерминанту Т1 и штаммоспсцифические детерминанты Щ19 и Ш22. Ш22 - новая специфическая детерминанта, не встречавшаяся ранее у казахстанских штаммов, но выявленная в составе ГА российских изолятов 1995 г. Изоляты В/Алматы/310/95, В/Алматы/331/95, В/Алматы/368/95 в некоторой степени реагировали с МСА к Г5 и Г17. По-видимому, эта группа штаммов содержит в минорном количестве вирусы, подобные В/Ямагата/16/88 (антигенная формула Т1.Г5.Ш17), и представляет собой смесь 2 вирусов.

Наибольшей гемагглютинирующей активностью по отношению к вариантам вируса гриппа В 1995 г. обладачи эритроциты кур. Эритроциты морской свинки и мыши проявляли умеренную гемагглютинируюшую активность. С эритрйцитами кролика и барана штаммы вируса В не связывались, за исключением В/Алматы/368/95, который реагировал с

эритроцитами барана в титре 1:32. Штаммы 1995 г. имели терлостабильный ГА,

Таблица 13

Исследование антигенной структуры казахстанских нзолятов вируса гриппа В 1995 г.

МСА к антигенным сайтам ГА Изоляты

А/291 А/308 А/310 А/331 А/362 А/368 А/372 С/95

Т1 640 640 640 1280 160 160 80 640

Г5 20 0 20 20 0 20 0 0

Ш16 0 0 0 0 0 0 0 0

11117 0 0 20 20 0 20 0 0

11118 0 0 0 0 0 0 0 0

11119 640 1280 1280 1280 6-Ю 1280 80 640

Ш22 1280 1280 1280 1280 640 1280 320 1280

Антигенная формула Т1 Ш19 Ш22 Т1. Ш19 Ш22 X X Т1 Ш19 11122 X Т1 Ш19 Ш22 Т1 Ш19 Ш22

11 р и ы с ч а н и е: X - смесь двух вирусов с антигенными формулами Т1.Ш19.Ш22 и Т1.Г5.Ш17

даже при прогревании при 56° С в течение 3 ч титры вирусов в РГА практически не менялись. Исключение составит нзолят В/Атматы/291/95, обладавший термолабильным ГА Изученные изоляты этого года были" чувствительными к ингибиторам умеренной (сыворотка кролика) и высокой термостабильности (сыворотка морской свинки)- Варианты В/Алматы/291/95," В/Алматы/308/95, В/Алматы/310/95, В/Алматы/331/95 и В/Алматы/362/95 проявляли чувствительность к термолабнльным ингибиторам сыворотки барана. Все штаммы были ннгибнторорезистентнымн по отношению к сывороткам крупного рогатого скота и крысы, за исключением нзолятов В/Алматы/331/95, В/Алматы/362/95, гемагглютинирующая активность которых (1:40-1:640) подавлялась ингибиторами умеренной термостабильности, содержавшимися в сыворотке крысы.

В целом, по результатам проделанной работы, циркулировавшие в PK вирусы типа В можно отнести ко вторым по значимости, после вирусов сероподтипа A(H3N2), этиологическим агентам эпидемии гриппа. Отличительной особенностью этих возбудителей явилась их соцнркуляцня в составе смешанных популяций и выраженная мозаичность антигенной структуры ГА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении эпидемиологических исследований рекомендуется использовать диагностические тест-системы, приготовленные на основе метальной сенсибилизации эритроцитов и медицинской желчи в качестве стабилизирующего агента. Метод прост, хорошо воспроизводим и позволяет в РИГА быстро дифференцировать штаммы вирусов гриппа по типовой и подтнповой принадлежности.

2. Для более полного определения тонкой антигенной структуры ГА новых эпидемически актуальных изолятов вирусов гриппа и их взаимосвязей с ранее циркулировавшими вариантами могут применяться МСА к оригинальным сайтам казахстанских штаммов вирусов гриппа А и В.

3. Казахстанские штаммы вируса гриппа A(H3N2) А/Алма-Ата/186/88, А/Алма-Ата/215/88 (A.c. 1699160 N4819446, A.c. 1708838 N4801739) и В/Алматы/8/93 (положительное решение по заявке N970727.1 от 31,07.97.) могут использоваться при приготовлении иммунореагентов для изучения вновь выделяемых изолятов вирусов гриппа. Как референс-штаммы с известными антигенными и биологическими свойствами указанные дренф-варианть! рекомендуются для проведения широкого круга серологических, вирусологических и молекулярно-бнологических исследований.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведен эпидемиологический анализ заболеваемости гриппом населения PK в 1990-1998 гг. Установлено, что наиболее актуальными возбудителями в этот период явились вирусы сероподтипа A(H3N2), вызвавшие моноэтиологические эпидемии 1990, 1996 гг. и социркулировавшие в 1992 и 1997 гг. с вирусами ссротипя В. Вирусы гриппа A(H1N1), обусловили эпидемии в 1994 и 1998 гг. Вирусы гриппа В были основными этнологическими агентами в

эпидемические сезоны 1991, 1993, 1995 гг.

2. Показано, что уровень заболеваемости населения гриппом в областных центрах в 1990-1998 гт. колебался в пределах 1,8-10,8%. Наиболее поражаемым контингентом населения в указанные годы были дети до 14 лет, составлявшие свыше 70% общего числа больных.

3. Вирусы гриппа A(H3N2), выделенные в период с 1990 по 1997 гг. на территории Казахстана, были близкородственны референс-штаммам Л/Сычуапь/2/87, А/Москва/172/92 и А/Москва/7/94. В составе ГА эпидемических штаммов вируса A(H3N2) с помощью МСА обнаружены новые, ранее не идентифицированные антигенные сайты - II3.8, Н3.20, 21, 22, 113.26, 27. .. ' ' '

4. Возбудители гриппа В 1990-1995 гг. в РК относились к разновидностям эталонов П/СССР/100/77, В/Виктория/2/87, В/Ямагата/16/87. Наряду с этим, идентифицированы варианты, отличавшиеся от них по одному или двум антигенным сайтам. Установлено, что эпидемическая актуальность вирусов tpitnna В, выделенных в Казахстане в период 1990-1995 п\, обусловливалась наличием в структуре ГА штаммоспецифических антигенных детерминант I1I19, 11120, 11122.

5. Показано, что в 1994 г. на территории РК в активную эпидемическую циркуляцию впервые после 1979 г. возвратился вирус гриппа A(H1N1). Отмечена реверсия дрейф-вариантов этого сероподтипа к эталонам А/СССР/90/77 и А/Бразилня/11/78. Эпидемические штаммы вируса A(H1N1)

1998 г. имели общие антигенные сайты с вирусами А/СССР/90/77, А/Байерн/7/95 и новую штаммоспецифическую детерминанту ГА.

6. Выявлена выраженная гетерогенность популяций вирусов гриппа A(H3N2) по анп1гснным и биологическим свойствам. Наибольшая' гетерогенность антигенного состава вирусов указанного сероподтипа зарегистрирована в сезоне 1996 г,; штаммы этого сезона характеризовались 8 разнокачественными детерминантами ГА - НЗ.15,16, ИЗ. 19,20,21,22,23, Н3.27.

7. Впервые установлен факт циркуляции на территории РК эпидемически актуальных вариантов вирусои гриппа А и В с качественно новыми сочетаниями ранее идентифицированных антигенных сайтов ГА - ИЗ. 18,19,20 у вирусов A(H3N3) в 1992 г. В 1991, 1992 гт. изолированы штаммы вируса гриппа В, имевшие _ в своем составе детерминанты Т1.ГЗ.Ш15 и Т1.Г4.Ш17,

соответственно.

8. Естественный антигенный дрейф вирусов гриппа А и В проявляется в виде непрерывного процесса обновления состава антигенных детерминант ГА, связанного как с появлением оригинальных штаммоспецнфичсских сайтов, так и новыми сочетаниями ранее идентифицированных маркеров. Показано, чго некоторые из вновь возникающих штаммоспецнфичсских детерминант получают наибольшее распространение в последующих эпидемиях и в ходе эволюции становятся группоспецифическими.

9. Получены МСА к отдельных« антигенным детерминантах; ГА казахстанских вариантов вирусов гриппа А и В 1990-1998 гг., которые могут использоваться для картирования антигенной структуры ГА вновь возникающих эпидемических штамхюв.

10. Разработан метод приготовления антительных ЭД с помощью мстольной сенсибилизации и медицинской желчи в качестве стабилизирующею агента. Полученные иммунореагенты позволяют дифференцировать штаммы вируса гриппа по типовой и подтиповой принадлежности, превосхо-ят но чувствительности ранее применяемые эритроцитарные тест-системы и могут использоваться в качестве экспресс-днагностикумов для первичной идентификации гемапглютинирующих агентов, вызывающих ОРЗ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Жуматов К.Х. Антигенные детерминанты гемагтлютинина вируса гриппа типа В //Конференция вирусологов Казахстана. Тезисы докл. - Алма-Ата, 1982. -С. 110-111.

2. Жуматов К.Х., Исаева Е.И., Косяков П.Н. Антигенные детерминанты гемагтлютинина вирусов гриппа типа В//Вопр. вирусол. - 1983, N4. С. 35-39.

3. Жухмтов К.Х. Состав антигенных детерминант гемагтлютининоч вирусов гриппа типа В, выделенных в 1940-1975 гг.//Вопр. вирусол. - 1984, N5. С. 543-547.

Жуматов К.Х., Косяков П.Н. Их!муногснность антигенных детерминант гемагглютинина вирусов rpurfna типа В//Вопр. вирусол. - 19S5, N3. С. 302307. ■ '

5. Жуматов К.Х. Антигенная композиция гемагглютининов вирусов гриппа //Пнология вирусов гриппа //Сб. научи, тр. - Алма-Ата, 1937. - С. 72-90.

6. Жумлгоп К.Х., Булгакова С.Р. Использование культуры клето;: МДСК для изоляции и изучения антигенной структуры вирусов//Известия АН КазССР.

- 1988, N4. С. 16-23.

7. Д-нмыбасва Г.А., Жуматов К.Х. Изоляция вирусов гриппа млекопитающих животных н птиц от человека и нх сравнительное пзученне//Известия АЛ К-лСОР. - 1930, N5. С. 50-54.

8. Колывачова И.Л., Жуматов К.Х., Бейсембаевз Р.У. и др. Гетерогенность современных эпидемических штаммов вируса гриппа, циркулировавших в 1937-1988 гг. на территории Каэахстана//Здравоохранение Казахстана. -.1991, КЗ. С. 43-16.

9. Булгакова С.Р., Жуматов К.Х. Особенности репродукции вирусов гриппа А(Н1М1) на перевиваемых культурах клеток//У объедин. съезд гигиен., эпнлемиол., микробная., паразитол. и инфекц. Казахстана: Тезисы докл. -Алма-Ата, 1995. - С.

10. Саятов М.Х., Колыванова ИЛ., Жуматов К.Х. и др. Особенности антигенной композиции эпидемических штаммов А(НЗШ), изолированных в 1988 г. в г, Алма-Ате// V объедин. съезд гигиен., эпидемиол., микробиол., паразитол. и инфекц. Казахстана: Тезисы докл. - Алма-Ата, 1991. - С.160-162.

11.Колыванова ИЛ., Исаева Е.И., Бейсембаевз Р.У., Ниеткалиева С.А., Саятов М.Х., Багашева С.С., Жуматов К.Х. Антигенная структура вирусов гриппа А(НЗЫ2), изолированных в Казахской ССР в 1990 г.//Известия АН КазССР.

- 1991, N2. С. 42-46.

12. Саятов М.Х., Колыванова И.Л., Жуматов К.Х. И др. Изменчивость возбудителя гриппа А(НЗШ) в Казахстане//УШ объедин. съезд гигнен.,' микробиол., эпндемиол. и паразитол.: Тезисы докл. - Минск, 1991. - С. 78-79.

.3.Жуматов К.Х., Багашева С.С., Асанова С.Е. и др. Новый стабилизатор для приготовления антительных эритроиитарных днагностикумон//Изпсстия АН РК. - 1992, N6. С. 90-92.

4.А. с. N 1699160 СССР. Штамм вируса гриппа (А/Апма-Ата/186/88) для приготовления диагностических препаратов//Колыпанопа И.Л., Исаева Е.И., Жуматов К.Х. и др. Опубл. 10.01.90.

15.А. с. N 1708838. Штамм вируса гриппа А (А/Алма-Ата/215/88) для приготовления диагностических лрепаратов//Колыванова ИЛ., Исаева Е.И., Жуматов К.Х. и др. Опубл. 13.03.90.

16.Жуматов К.Х., Багашева С.С., Саятов М.Х. Новый метод приготовления антительных эритрощггарных диапюстикумов к вирусам гриппа//Докл. АН PK. - 1992, N4. С. 48-51.

!7.Ахматуллина Н.Б., рштов М.Х., Шуратов Е.Х., Березин В.Э., Ахмедсадыков H.H., Жуматов К.Х. Вирусология, иммунология, генетика, молекулярная биолопш. Русско-казахский терминологический словарь. - Алматы: Ана тш, 1993.- 245 с.

18. Жуматов К.Х., Багашева С.С., Кирющенко Т.В. и др. Способ приготовления

. антительных эритроцитарных диагн ости кумов для индикации вирусов//Вопр.

вирусол. - 1994, N5. С. 235-238.

19. Шахворостова Л.И., Булгакова С.Р., Жуматов К.Х. и др. Антигенная и биологическая характеристика вирусов гриппа В, выделенных в Казахстане в 1989г. - Алматы (Цеп. в КазГосИНТИ 29.07.94, N5195 - К94.)

20. Жуматов К.Х. Способ приготовления эритроцитарной тест-системы для индикации орто- н парамнксовирусоа //Международная научно-практическая конференция "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" - Тез. докл. - Степногорск, 1995. - ч. 1 С.85.

21. Шахворостова Л.И., Булгакова С.Р., Жуматов К.Х., Саятов М.Х. Характеристика вирусов гриппа В, выделенных в период эпидемий 1993 и 1995 гг. В.Казахстане - Алматы (Деп. в КазГосИНТИ 11.12.97, N8050 - Ка94) - 1998 - .в.1. - с.39.

22.Жуматов. К.Х., Шахворостова Л.И., Асанова С.Е. и др. Антигенные взаимосвязи и биологические свойства возбудителей эпидемии гриппа 19951997 гг. в Республике Казахстан - Алматы (Деп. в КазГосИНТИ 18.07.97, N7770 - Ка97) - 1997 - .в.5. - с.18-19.

23. Саятов М.Х , Исаева Е.И., Шахворостова Л.И., Алипова Т.А., Исмагулова Ж.А., Шаврина И.А., Жуматов К.Х. Идентификация сайтов в структуре гемагглютинина эпидемических вирусов гриппа A(H3N2) и полученных моноспецифических сывороток //Биотехнология. Теория и практика. - 1997, N2. С.58-62.

24.Саятов М.Х . Исаева Е.И., Исмагулова ЖА, Жуматов К.Х. н др. Новые сочетания антигенных детерминант в составе гемагглютининов вируса гриппа (НЗЫ2) эпидемического сезона 1997 г. // Известия МН-АН РК - 1997, 1Ч5-& С.66-71.

25. Жуматов К.Х. Антигенный дрейф гемагглютининов вируса гриппа серонодтипа А(НЗШ)//Биотехнология. Теория и практика. - 1997, N4. С. 1015.

26. Шахворостова Л.И., Исаева Е.И., Булгакова С.Р., Жуматов К.Х., Саятов М.Х. Штамм вируса гриппа В/Алматы/ЗОО/95 для приготовления диагностических препаратов //Новости науки Казахстана - 1998, N5. С.47-48.

27.Жуматов К.Х. Антигенная эволюция вирусов гриппа А(Н1М1)// Известия МН-АН РК - 1998, N2. С.18-25.

28. Исмагулоп А.Т., Жуматов К.Х., Курилова Д.И. н др. Особенности эпидемического гриппа В в Республике Казах стан//Мед. журнал. - 1998, N2. С.42-44. :

29. Жуматов К.Х., Исмагулова Ж.А., Курилова Д.И. и др. Характеристика эпидемии гриппа А(Н31М2) в Республике Казахстан (1979-1997)//Вестник КазГМУ. - 1998, N1. С.42-44.

30. Булгакова СР., Жуматов К.Х. Композиция антигенных детерминант гемагглютинина казахстанских изолятов вируса гриппа В 1991, 1993, 1995 гг. // Биотехнология. Теория и практика. - 1998, N5-6. С.35-37.

31. Жуматов К.Х. Обнаружение новых антигенных детерминант в структуре гемагглютинина вируса гриппа А с помощью моносиецифичсских сывороток // Биотехнология. Теория и практика. - 1998, N5-6. С.37-49.

32. Жуматов К.Х., Колыванова И .Л., Алипова ТЛ. Сравнительный анализ казахстанских изолятов вируса гриппа А(Н1М) с помощью моноклоналышх антител // Биотехнология. Теория и практика. - 1998, N5-6. С. 124.

33. Шахворостова Л.И., Саятов М.Х., Жуматов К.Х. и др. Штамм вируса гриппа А/Алматы/538/96 для приготовления диагностических препаратов // Новости науки Казахстана. - 1998', N2. С.75-77:

34. Жуматов К.Х. Антигенный полиморфизм гриппа А(НЗЫ2), циркулировавших в Казахстане в 1990-1997 гг. - Ал маты (Деп. в КазГосИНТИ 29.01.98, N8119 -Ка98)

35.Жуматов К.Х., Булгакова С.Р., Исмагулов А.Т., Исмагулова Ж. А. Особенности эпидемического сезона 1993 и 1995 гг. в Казахстане (Деп. в

. КазГосИНТИ 14.10.98, N8471 - Ка98).

36.Жуматов К.Х., Булгакова С.Р., Саятов М.Х. Антигенная вариабельность вируса гриппа В//Известия МН-АН РК. - 1998, N3. С.8-17

Тугсцршш >Хуыатов Кдйнлр Хамзаулы

Кдзлкстапда болшген А ашне В туиауыиып эпвдеиншшц впрустарышлс попупяцншшх куралш асзэпе аитигспд1К озгсрпшпп

Аягаш КР гургандарышщ грасшща 1990 - 1998 аск. аралытнда богряч Л гсвнс В тумаушшц эпндешшлыц ерекшел1ктершв талдлу жасалран.

Нэтежпспвде ел ышдаздыси А(НЗЫ2) екет аныкгалды, себеб1 ол 199С, 1992, 1995, 1997 жж. непзп коздырушысы болды. Ал 1993, 1995 жж. эпнде-миялар В сералт! шфусылын, 1994, 1998 жж. А шфусшшц кятысуимеп

отп. 1992 х. лрдлгс эпидемия кеаищс А(НЗМ2) жзне В Ифусгяры адтар аЛлл-лымда болды. I [ммуноссрбциллик талдау жэне ыонотондд аптид5не,нщ кемепмен эпндемиялыц манты бар шгаммдардыя ГА курашдада ханд штг-гевдл детсрыинзлттар: А(НЗ№) пнрусыэда - Н3.18; 113.20, 21, 22, 113.26; 113.27, йл В серотнтиде - Ш.19.Ш.20, Ш.22 аньпсталды.

Дуннежузшгс тожрСнедв 1998 жылдан кеШн алгаш рет Кялакстал территориясындд эгалоцдьщ А/СССР/90/77 уксас тушу Л(111>11) пнрусыньщ гчтндсмиялык айиальшра кдйта оралуы 1994 ж. байкалды. А(ШН1) пирусыншх 19У3 ж. Солптг-си казакстанды* нггаммдарыныи А/Байеры/07/95 референс-варианппса туистас екет белпт болды.

Туияу вирус ьшын гетерогеид! понуляшетсыпда ГА бурынга аникталран слнгтрдыгт срналасу репнщ жала юрпз1ггтар!С 1992 ж. Л(НЗЮ) тфусьпщя -11.18, 19, 20; 1991, 1992 жж. В серотишшц шфусында -Т1. П. Ш15, Т.1 Г4. 4117 шшкталды.

Кдзлкс ганда болишмг Л жэне В туиауы ппрустарыныи алтнгендш детермтшптарына ыоиотонд1 анпгдепе аяшеш, олардмн коыепмен жападан пайда болатыи эплдемиялыц вариантгардьт гемагппоттпггани! курамылдлгы алтнгеидж маркерлердщ картасын лдсаука болады.

Метол г.опъюгагы гпже медншшалык отп гурактандьфу ахенп ретшде иайдалатгу непзивде жаза тгщдетклис эритрощггарлы диагностику« злу пдга жчсалды. Алынган ит!у1гореаге1гг сезЬпилдыры жлгашан бурынга колда-нылыи келген эрнтроцнгп тесг-жуйелерден басим туседд жопе ол тумау вирусы штаммдарын тнгггерге, тяп тармакгарыка ажыратуга мумюндис береда. Сонымен катар оны гыные жолдарыньщ Ж1тп ©тетш ауруларьпг коздъфатын гемагглюппг-деунн агеттерд! аныктаКтыл экспресс- диагноста кум ретшде колдянута болады.

SUMMARY Zhumatov Kainar Khamzaevich Structure of population and antigenic variability of influenza A and B cpidemic viruses

circulating in Kazaklistan

The analysis of peculiarities of development of epidemic process among the population of the Republic of Kazaklistan in 1990-1998 period has been earned out for the first time. The A(H3N2) virus is shown to be the most active being the main agent in 1990, 1992, 1996, 1997. Epidemics in 1993, 1995 were caused mainly by viruses of serotype D, in 1994 and 1998 - by A(H1N1) viruses. In mixed cpidemic of 1992 season influenza A(H3N2) and B viruses cocirculated.

In hacmagglutinin structure of epidemically actual strains with the help of monospecific sera and immunosorbtion analysis are determinate new antigenic determinants: H3.18, H3.20, 21, 22; H3.26, H3.27 at A(H3N2) viruses and SI9, S20, S22 at serotype B viruses.

Returning of influenza A(H1N1) viruses to epidemic circulation in 1994. on the Kazakhstan territory was marked for the first time in world practice after 1989. Reversion of A(HIN1) strains in 1994 to standard virus A/USSR/190/77 was revealed. The antigenic structure of hacmagglutinin of A(HIN1) strains in 1998 was close to reference - variant A/Bayern/07/95.

In geterogcnic influenza virus populations new combinations of formerly identified sites of hacmagglutinin were detected - H3.I8, 19,-20 at A(I13N2) viruses in 1992 and T1.G3.S15, Tl.G4.S17 at serotype B viniscs in 1991, 1992.

Monospecific antitera to antigenic determinant of Kazakhstan influenza virus isolates were obtained suitable for mapping of antigenic marchers in hacmagglutinin structure of' arising epidemic variants. New method of preparing of antibody erythrocyte diagnostics with the help of methol and medical gall as conjugating and stabilizating substances respectively was invented. Indicated immunoreagents differentiate influenza virus strains according to their type and subtype origin and may be used as express test-systems for primary identification of hacmagglutinating agents causing acute respiratoric-diseases.