Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин

Крашенюк, Альберт Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин"

Р Г Б о« 1 п М1Р Ш5

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

На правах рукописи КРАШЕНЮК Альберт Иванович

РАЗРАБОТКА И ПРОИЗВОДСТВО НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ВИРИОННЫХ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН

специальность: 03.00.06 - вирусология, 03.00.04 - биохимия

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Г.И.АЛЕКСАНДРОВА доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент

РАМН К.П. ХАНСОН доктор медицинских наук, профессор В.Б. ДОЛТО-САБУРОВ

Ведущая организация - НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится " _1995 г. в Про час.

на заседании диссертационного совета ДО 74.48.01. при НИИ гриппа РАМН по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук(£97022, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17)

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа РАМН.

Диссертация в виде научного доклада разослана" " мярркъ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Е.Покровская

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВАЖ - вируссодержащая аллантоисная жидкость

ВФС - прсгиенная фармакопейная статья

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

МПК - макропористое стекло

МТЭ - математическая теория эксперимента

N - нейраминидаза вируса гриппа

НИИ ОЧБ - НИИ особо чистых биологических препаратов

ОЖГВ - очищенная живая гриппозная вакцина

ОРИД - одиночная радиальная иммунодиффузия

ПААГ - полиакриламидный гель

ПВП -поливинилпирролидон

ПЭЖХ - препаративная эксклюзионная жидкостная хроматография

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ФХ/1-1 - фильтрационно-хроматографическая линия, серия первая

ФХТ - фильтрационно-хроматографическая технология

Н1, НЗ - антигенные варианты гемагглютинина вируса гриппа

НА - гемагглютинин вируса гриппа

ЭЖХ - эксклюзионная жидкостная хроматография

ЭПР - экспериментально-производственный регламент

Работа выполнена в НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пастера МЗ РФ, в НИИ вакцин и сывороток МЗ РФ Санкт-Петербурга и НИИ гриппа РАМН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка новых технологий, включающих культивирование, выделение, очистку, анализ вирусов и вирусных белков для создания новых вакцин против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, СПИДа становится возможным благодаря интенсивному внедрению в биотехнологию и вирусологию современных методов исследований, ноиыл орйГ»й«аяы{ък приборов и методик управления этими процессами.

Открытие возможности управления клеточными процессами привело к тому, что клеточная инженерия в сочетании с микробиологическим синтезом, широким использованием современных методов биофизики и биохимии стали основой новой технологии.

Выпуск биотехнологической продукции в значительной мере определяется возможностями методов выделения веществ и соединений, вырабатываемых биологическими системами, а также последующей процедурой очистки и анализа конечного продукта. В условиях биотехнологического бума роль методов выделения, очистки и анализа биообъектов значительно возрастает. Это относится и к такой динамично развивающейся области, какой является вирусология.

В конце 70-х годов в России происходит становление новой отрасли биотехнологической промышленности - производство высокоочищенных вирусных вакцин. Это связано с успехами в области новых физико-химических методов выделения, очистки и анализа суспензий и субъединиц вирусов, которые могут быть отнесены к транспортным методам: микрофильтрация, хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование. Эти методы характеризуются щадящим воздействием на выделяемые объекты, что делает их практически незаменимыми при работе с лабильными объектами биотехнологических производств, а возможность масштабирования и управления предопределяет их прикладное значение.

Разработка и совершенствование транспортных методов фракционирования и анализа биологических макромолекул и надмолекулярных образований в значительной степени определяет прогресс в различных областях биотехнологии, вирусологии и биохимии.

Состояние проблемы. Проблема очистки вирусных суспензий и выделения вирусных белков является исключительно важной задачей. Современное развитие производства вакцин, качество вакцинных препаратов. диагностика, профилактика и лечение инфекционных заболеваний в значительной мере зависят от уровня развития методов и технологий получения очищенных вирусных суспензий и белков.

Принципиально важным является и вопрос выбора препарата для вак-

цинопрофилакгики (живой или инактивированный вирус), что, в свою очередь, определяет и способ очистки препарата.

При выборе методов очистки вирусных суспензий, их комбинации, мы исходили из состояния этой проблемы в России и за рубежом, где для этой цели используют различные варианты ультрацентрифугирования. В России к настоящему времени не налажен выпуск ультрацентрифуг, позволяющих обрабатывать крупные партии сырья (150-300 л ВАЖ *) за смену. В то же время, как в России, так и за рубежом в последние годы получили развитие мембранные методы разделения биомакромолекул и надмолекулярных образований, эксклюзионная хроматография низкого давления на макропористых кремнеземах, электрофорез. В Росси и за рубежом создана промышленная индустрия производства мембран, сорбентов для хроматографии. За рубежом налажен серийный выпуск различных мембранных приборов и устройств, нашедших широкое применение в различных областях науки, техники, медицины.

К началу нашей работы была разработана и внедрена в практику технология получения инакгивированной гриппозной вакцины (ИГВ) комбинацией методов адсорбции-элюции вирусов гриппа на куриных эритроцитах и эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ) на макропористых стеклах на предприятии НИИЭМ им. Пастера (Перадзе Т.В., Фридман Э.А., Пейсель З.Г., 1973), технология получения вакцины комбинацией методов адсорбционной хроматографии и ЭЖХ в НПО "Восток" (Бреслер С.Е., Ко-ликов В.М., Мчедлишвили Б.В., Молодкин В.М., 1976), разработана и внедрена методика концентрирования и очистки вируса гриппа на лавсановых ядерныхфильтрах(БреслерС.Е., Мчедлишвили Б.В.,Флеров Г.Н.,1979), внедрен в практику метод получения ИГВ в НИИВС (С.-Петербург) на ультрацентрифугах типа "К2" фирмы "Электронуклеоникс" (США) (Константинов В.К., Соколов Н.Н.,1979).

На рис.1 представлены две основные группы - инактивированные (ИГВ) и живые (ЖГВ) гриппозные вакцины.

Инактивированные гриппозные вакцины

Цельновирионные Идиотипические

Расщепленные Генно-инженерные

(сплит-вакцины)

Субъединичные Синтет11чеасие_

ол^пептидные^ Живые гриппозные вакцины Коммерческий препарат ^ищендая_живая_

(не очищен от примесных белков) гриппозная вакцина

Рис. 1 Схема основных типов гриппозных вакцин, используемых в практике (-) или находящихся в стадии экспери ментальной разработки (---).

*ВАЖ - вируссодержащая аллантоисная жидкость

Кроме того, в Одессе (Украина) был налажен выпуск живой гриппозной вакцины (ЖГВ) для интраназального применения взрослым и детям. Современный препарат представляет собой лиофильно высушенную ВАЖ, стабилизированную пептоном (Порубель Л.А., Париж Б.М.,1969). Следует отметить, что ЖГВ впервые предложена в 1937 г. акад. А.А.Смородинце-вым. В последующие годы наиболее значительные достижения в теоретическом и практическом плане по совершенствованию живых гриппозных вакцин были сделаны профессором Г.И.Александровой и ее сотрудниками - учениками и последователями акад. А.А.Смородинцева.

На основании анализа решения этой проблемы в России и за рубежом были выбраны в качестве универсального подхода к очистке различных вирусов в препаративных масштабах методы фильтрации и хроматогря-фии, оптимально дополняющие друг друга. Преимущество такого подхода состоит также в том, что оба метода относятся к группе транспортных методов разделения биомакромолекул, что теоретически позволяет разработать замкнутый технологический цикл крупномасштабного производства очистки вирусов, его технологической гибкостью, т.е. возможностью оперативного изменения параметров процесса, переналадки, возможностью его полной автоматизации.

В современной вирусологии большую роль играет возможность исследования индивидуальных вирусных белков, что определяется уровнем развития методов их выделения. Как правило, это гидрофобные белки, выделение которых является сложной технической задачей, особенно при условии сохранения их нативных свойств.

Для выделения гемагглютинина вируса гриппа (НА), как образца гидрофобного белка, был выбран метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в борат-полиольной системе, разработанный под руководством члена-корреспондента АН Украины Г.В.Троицкого. Электрофоретические методы обладают наибольшей разрешающей способностью для разделения белков, а метод ИЭФ занимает среди них ведущее положение.

Перспективным является изучение возможности использования элект-рофоретических методов для получения вирусных белков в условиях микрогравитации, нового направления биотехнологии - космического. Работы такого рода активно ведутся в США, Германии и России.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы является

Обоснование и разработка универсальной фильтрационно-хроматогра-фической технологии получения вирионных гриппозных вакцин.

Работа выполнена по общесоюзной проблеме "Грипп, гриппоподобные заболевания, их профилактика и лечение" (09.05).

Конкретные задачи. Работа посвящена изучению следующих вопросов:

1. Разработке методов предварительной очистки и концентрированию вирусных суспензий;

2. Разработке хроматографических методов очистки вирионов;

3. Обоснованию и разработке универсальной фильтрационно-хроматог-рафической технологии получения вирионных вакцин;

4. Разработке методов контроля технологического процесса очистки вирусных суспензий;

5. Разработке препаративного метода выделения гемагглютинина вируса гриппа;

6. Разработке технологии получения очищенной живой гриппозной вакцины (ОЖГВ) для интраназального применения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

При выполнении работы основное внимание уделялось экспериментальным исследованиям процессов выделения, очистки и анализа вирусов и вирусных белков мембранными, хроматографическими и электрофорети-ческими методами.

Впервые предложены новые безасбестовые фильтровальные материалы для осветления вируссодержащих суспензий - стекловолоконные и базальтоволоконные фильтры, обладающие высокими технологическими качествами.

Впервые установлено, что повышение гемагглютинирующей и инфекционной активности ингибиторочувствительных вирусов при различных способах очистки связано с удалением неспецифических ингибиторов ге-магглютинации.

Разработаны методики микро- и диафильтрации для концентрирования и очистки различных вирусов на мембранах различного типа и полых волокнах.

Впервые проведена оптимизация процесса очистки вирусов методом ЭЖХ на основе математической теории эксперимента, предложены для практики новые сорбенты на основе модифицированных макропористых кремнеземов (МПК), превосходящих промышленый образец.

Впервые исследованы сравнительные возможности различных хроматографических методов очистки вирусов ЭЖХ на МПК, биоспецифической. распределительной жидкостной хроматографии.

Впервые на основе комплексных исследований разработана универсальная фильтрационно-хроматографическая технология получения ИГВ. Новая технология позволяет получить препарат со стабильными технико-экономическими показателями, независимо от используемых штаммов вируса гриппа, применима для очистки и других вирусов. Разработаны вопросы аппаратурного оформления фильтрационно-хроматографической технологии получения ИГВ.

Впервые разработана методика потенциометрического иммунофильт-рационного анализа вирусных антигенов.

Впервые разработаны методы аналитического и препаративного выде-

ления вируса гриппа основных серотипов с помощью ИЭФ в борат-поли-ольных системах.

Впервые в условиях микрогравитации показана возможность выделения гидрофобных вирусных белков методами электрофореза, пригодных для получения ангисывороток (на примере НА вируса гриппа).

Впервые введено теоретическое положение о новой физико-химической характеристике вирионов - гидрофобности вирусной частицы и показано различие по этой характеристике для различных штаммов вируса гриппа.

Впервые установлена зависимость между гидрофобностью вирусных частиц и ил им.у.унсго;-:;;ссть:с.

Впервые высказано предположение о наличии гидрофобных лон вблизи рецепторной щели молекулы НА вируса гриппа.

Впервые на основе комплексного исследования вопросов очистки и выделения вирусов с учетом их биологических свойств и характера иммунного ответа на вакцинацию создана концепция "щадящей технологии" получения противогриппозных вакцин.

Впервые разработана технология получения очищенной живой гриппозной вакцины для взрослых.

Научно-техническая новизна результатов исследований подтверждена получением 23 авторских свидетельств, в которых реализованы основные положения работы.

Практическая значимость и теоретическая ценность работы.

Внедрение результатов исследований в промышленности, научно-исследовательской и учебной работе.

1. Разработаны методические требования к фильтрам для очистки ви-руссодержащих жидкостей от надмолекулярных образований (эритроцитов, фрагментов клеток и клеточных мембран и др.). Экспериментально исследованы свойства фильтровальных материалов различной композиции на основе стекло- и базальтоволокна для очистки вирусных суспензий. С 1984 г. Косинская бумажная фабрика начала промышленный выпуск картонов для осветления биологических жидкостей в биотехнологическом производстве.

2. Методика предочистки вирусных суспензий на стекловолоконных фильтрах внедрена на предприятии НИИЭМ им.Пастера при получении ИГВ по фильтрационно-хроматографической технологии (регламент №21081), на предприятии НИИВС С.-Петербурга при производстве ИГВ для взрослых по фильтрационно-седиментационной технологии (регламент №130-79, ведомость изменений 3, утверждена ГУ ПБВП 24.02.84 г.), за 1984-85 гг. выпущено 45 млн. доз ИГВ; в Томском НИИВС при производстве инактивированной вакцины против клещевого энцефалита (изменение №1 к регламенту производства вакцины клещевого энцефалита куль-турапьной инактивированной №235-81, утв.6.12.1985 г.).

3. Разработана и внедрена в практику фильтрационно-хроматографи-ческая технология получения ИГВ для взрослых (регламент №210-81). С 1982 г. на предприятии НИИЭМ им.Пастера выпущено 9197 тыс.доз вакцины, экономический эффект от выпуска вакцины за 5 лет (1983-1987 гг.) составил 490,3 тыс.руб.

4. Разработана и внедрена технология получения высокоочищенной гриппозной вакцины для детей иммунносорбционным методом (лабораторный регламент получения вакцины гриппозной хроматографической очищенной жидкой инакгивированной для детей N»169, утв. 10.06.1981 г.). С 1985 г. на предприятии НИИЭМ им.Пастера выпущено 3707,5 тыс. доз вакцины, экономический эффект от ее выпуска составил за три года (1985-1987) 843,0 тыс.руб.

5. На основе МТЭ выполнена и экспериментально подтверждена оптимизация очистки вирусной суспензии методом ЭЖХ, что создает предпосылки увеличить выход целевого продукта-вируса в промышленных условиях и повысить степень его очистки.

6. Усовершенствованные методики позволяют оптимизировать процесс мембранного разделения и хроматографической очистки вирусов, повысить степень очистки целевого продукта.

7. Разработан принципиально новый ультрафильтрационный метод иммунного потенциометрического анализа, позволяющий осуществить индикацию вирусных антигенов на уровне чувствительности иммунофермен-тного анализа.

8. На основе разработанной фильтрационно-хроматографической технологии получения очищенных вирусных суспензий сформулированы требования и разработано техническое задание на изготовление фильтраци-онно-хроматографической линии ФХЛ-1. В НТО АН СССР изготовлены две линии ФХЛ.

9. Разработанный метод вьихеления гемагглютинина на основе изоэлек-трофокусирования (ИЭФ) был использован для получения гемагглютини-нов Н1. НЗ на установке 'Таврия" в условиях микрогравитации.

10. Проведены исследования санитарно-гигиенических свойств фильтровальных и сорбционных материалов, позволившие получить сертификат на использование полисульфонамидных мембран, стекловолоконных фильтров и макропористого стекла, модифицированного стиролом, для получения вирусных вакцин и препаратов крови.

11. Материалы о взаимосвязи между гидрофобностью и имуногеннос-тью вирусов использованы на кафедре микробиологии Крымского медицинского института, начиная с 1985 г. в лекциях и практических занятиях по курсу вирусологии для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов.

12. На основе предложенной концепции "щадящей технологии" получения гриппозных вакцин разработана технология получения очищенной жи-

вой гриппозной вакцины (ОЖГВ) для интраназального применения. Разработаны ЭПР и ВФС на "Вакцину очищенную живую аллантоисную сухую для интраназального применения".

Личный вклад автора. Настоящая работа представляет собой обобщенные результаты исследований и разработок автора от идей до их практического внедрения автором и руководимыми им коллективами в течение последних 15 лет, с 1979 по 1985 гг. в НИИЭМ им.Пастера и с 1985 г. по 1994 г. в НИИ вакцин и сывороток Санкт-Петербурга. Автором сформулирован круг задач исследования, проведена постановка научных экспериментов, разработаны технологические процессы, проведен анализ теоретических и экспериментальных результатов, осуществлено внедрение раз-&аботан,чыА мет.дпв, технологий и теоретических разработок в практику здравоохранения и подготовку специалистов высшей школы. Значительная часть работы выполнена в соавторстве с различными научными коллективами и авторами, что нашло отражение в соответствующих публикациях.

Апробация исследований и разработок. Основные результаты диссертации, представленные в публикациях, докладывались и обсуждались на 4-ой (1978), 6-ой (1982) и 7-ой (1984) научно-практических конференциях молодых специалистов НИИЭМ им.Пастера; итоговых научно-практических конференциях НИИЭМ им.Пастера в 1977,1979,1981 гг.; на 1-ом (1979,Дзержинск), 2-ом (1982,Черноголовка), 3-ем (1984,Рига) Всесоюзном симпозиуме "Молекулярная жидкостная хроматография"; на заседании комиссии по электрофорезу Совета по хроматографии при Президиуме АН СССР (1982, Ялта); на 1-ой Всесоюзной конференции по применению хроматографии в биологии и медицине (1983,Москва); на заседании комиссии по мембранным методам разделения Совета по хроматографии при Президиуме АН СССР (1983,Ленинград); на семинаре по строению и функции белков Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР (1982,Москва); на XVI коференции Федерации Европейских биохимических обществ - ФЕБО (1984,Москва); на межинститутском семинаре "Липосомы, их использование в биологии" (1985, Ленинград); на Всесоюзном семинаре по хроматографической очистке вирусов и белков в МГУ им. М.В.Ломоносова (1986, Москва); на 1-ом Городском семинаре по выделению и анализу вирусов и белков (1986, Ленинград); на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии" (1987,Ленинград); на научной конференции Одесского НИИ вирусологии и эпидемиологии им.-И.И.Мечникова и Одесского предприятия по производству бакпрепаратов (1987,Одесса); на совместном заседании кафедры микробиологии, вирусологии и проблемной лаборатории Крымского мединститута (1988, Симферополь); на 1-ом Всесоюзном симпозиуме по препаративной хроматографии физиологически активных веществ (1988,Ленинград,Ольгино); на Всесоюзной конференции "Проблема повышения качества и разработка

новых лекарственных форм вакцинных препаратов" (1981 .С.-Петербург); на международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИД (1991 .Ленинград); на Пленуме Проблемной комиссии РАМН "Профилактика и терапия гриппа и ОРЗ в целях снижения заболеваемости и смертности населения России" (1993,С.-Петербург); на конференции "Вакцинация-94", Зеленогорск, СПб.

ОСНОВНЫЕ ОБОБЩАЮЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Предлагается новая физико-химическая характеристика вирионов -гидрофобность, характеризующая свойства поверхности вирионов и топологию гидрофобных зон их поверхности, сродство к различным поверхностям (рецепторам чувствительных клеток, сорбентам и т.д.).

2. Существует взаимосвязь между гидрофобностью вирусов и их биологическими характеристиками - иммуногенностью и сродством к ингибиторам гемагглютинации. Более гидрофобные вирусы являются более им-муногенными и обладают более выраженным сродством к ингибиторам гемагглютинации.

3. При реализации любой технологии очистки вирионов необходимо учитывать неоднородность вирусной популяции по различным критериям, главным из которых является гидрофобность. Отсутствие учета этого обстоятельства может привести к ухудшению качества препарата - снижению его иммуногенности и ухудшению технико-экономических показателей производства препаратов.

4. При выборе любой технологии важно учитывать главное - не денатурировать рецепторный аппарат вируса, что ограничивает выбор физико-химических методов их очистки. К наиболее перспективным из них относятся - фильтрация, микрофильтрация, коагуляция, ЭЖХ, распределительная жидкостная хроматография в двухфазных системах водорастворимых полимеров, электрофорез. Показана универсальность фильтрационно-хро-матографической технологии очистки вирионов.

5. На основе комплексного исследования вопросов очистки и выделения вирусов с учетом их биологических свойств и характера иммунного ответа на вакцинацию разработана концепция "щадящей технологии" получения противовирусных вакцин, на ее основе разработана технология получения очищенной живой гриппозной вакцины для интраназального применения.

Публикации. Материалы диссертации изложены в 78 печатных работах, в том числе в 23 авторских свидетельствах.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. Использовали штаммы вирусов гриппа А и В, рекомендованные ГИСК им.Л.А.Тарасевича МЗ РФ для производства ИГВ и ЖГВ. Использовали также штаммы, выделенные сотрудниками отдела вирусоло-

гии Института экспериментальной медицины РАМН, НИИ гриппа МЗ РФ, института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН. Названия вирусов даны в соответствии с классификацией ВОЗ (1971 г.).

Куриные эмбрионы. Основной моделью для культивирования вирусов были 10-11-дневные куриные эмбрионы постоянного стада кур породы Леггорн, кросс хайсекс браун или безлейкозной линии кур породы русская белая, сублинии 6525 и 6027. В препаративных опытах использовали ВАЖ, полученную в условиях промышленного производства ИГВ на предприятии НИИЭМ им.Пастера, НИИВС г.С.-Петербурга и НПО "Восток" концерна "Биопрепарат".

Опредйпрнир гемяггпютинируюшей и инФекнионной активности bhdv-сов ('роводили общепринятыми «етпдами.

Экспериментальные животные. Исследования проводили на беспородных мышах, кроликах породы "шиншилла", полученных из питомника "Рапполово", содержащихся на стандартном рационе вивария; белых крысах и беспородных собаках.

Приготовление иммунных сывороток. Сыворотки к белкам аллан-тоисной жидкости получали путем иммунизации коз, баранов, кроликов. Животных иммунизировали по единой схеме. Сыворотки к НА вируса гриппа получали по методу Shild и соавт. (1978).

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) ставили общепринятым методом, нейраминидазную активность определяли тиобарбитуро-вым методом (по Aminoff), антинейраминидазную активность синтетических ингибиторов нейраминидазы определяли по величине константы по-луингибирования К|50, выраженную в моль/л. Концентрацию белка определяли с помощью колориметрических методов: по Lowry, нингидриновым методом и по Bredford в собственной модификации.

Овальбумин и неовальбуминовые компоненты определяли методом непрямой гемагглютинации с антительным диагностикумом (РИГА). Метод разработан Ф.Н.Носковым и А.Б.Жебруном (1979).

ВАЖ контролировали на наличие посторонних вирусов. Групповой Гс-антиген вирусов лейкозно-саркомной группы определяли в РСК по методике Научно-исследовательского Ветеринарного института птицеводства "НИИВИП", наличие эндогенного вируса лейкозо-саркомы контролировали в реакции молекулярной гибридизации*.

Качественный анализ белков выполнен по методу Ornstein и Devis в 7,5% ПААГ. Анализ вирусных белков - электрофоретически по Laemmly в условиях восстановления дисульфидных групп, с содержанием детергента ДСН 1% в буферном растворе.

Одиночная радиальная иммунодиффузия (ОРИД) выполнена по методу Shild и соавт. (1975). В качестве антисывороток и стандартных ан-

* В этой работе принимали участие сотрудники ВНИВИП С.В.Борисенко,

А.Г.Корнильева.

mit-'HOB использовали препараты, полученные из ГИСК имЛ.А.Тарасеви-ча от рук.лаборатории Н.И.Донской. Иммунодиффузию по Оухгерлони проводили для выявления примесных белков ВАЖ в очищенных вирусных суспензиях. Использовали антисыворотки трех видов животных-продуцентов коз, баранов, кроликов. Для повышения чувствительности метода ОРИД использовали радиоиммунодиффузию и метод вторых антител, меченых I131. Мечеными антителами кроликов к иммуноглобулинам барана обрабатывали иммунопреципитат. Результат регистрировали с помощью рентгеновской пленки РТ-4.

Префильтрацию, микрофильтрацию, стерилизующую фильтрацию проводили на аналитических приборах ФМ-02-1000, ФК01, полупроизводственной установке ФТ01 (разработка НТО АН СССР). Препаративные опыты осуществляли на установках типа УФА, УГФ (НТО АН СССР), СОКРА (НИИ ОЧБ). Стерилизацию технических средств и фильтровальных материалов осуществляли первомуром.

Эксклюзионная жидкостная хроматография (ЭЖХ) выполнена по рекомендациям работы Детермана. Использовали стеклянные колонки собственной конструкции. Хроматограммы регистрировали с помощью прибора РЭППС-1М. В качестве носителей использовали стандартные сорбенты отечественного производства, зарубежные образцы, а также носители, разработанные в ЛТИ им. Ленсовета и ИВС АН СССР.

Высокоэффективная эксклюзионная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Выполнена на титановых колонках dy = 8x300 мм. Использован отечественный хроматограф ХЖ-3301, разработанный в СКБ АН СССР. Использовали перистальтический насос "Минипамп" (ЧССР).

Аффинная хроматография выполнена на различных носителях, включая активированную сефарозу и модифицированные кремнеземы "МПК".

Распределительная жидкостная хроматография. Использовали метод Р.-О. Альбертсона на системе "ПЭГ-600-декстран 500Т", "ПЭГ-600-сульфат декстрана 500Т", а также систему "фиколл 400Т-дестран 40Т", предложенную Заславским Б.Ю. и соавт.

Препаративная эксклюзионная жидкостная хроматография (ПЭЖХ) выполнена на препаративных колонках из титана или стекла объемом 2-4 л. Препаративный хроматограф входил в состав фильтрационно-хроматог-рафической линии ФХЛ-1, разработанной и изготовленной в НТО АН СССР. Хроматограф позволяет вести очистку вирусной суспезии на 6 последовательно включаемых колонках, снабженных предколонками, в автоматическом режиме.

Зонный электрофорез проводили для анализа примесных компонентов в вакцинах с разным способом приготовления. Использовали колонку и высокочувствительный денситометр собственной конструкции.

Изоэлектрофокусирование проводили по методу, разработанному в Крымском медицинском институте под руководством чл.-корреспондента

АН Украины Г.В.Троицкого. Метод был усовершенствован в части состава буферных систем для выделения и очистки вирусов и вирусных белков. Использовали аналитические и препаративные варианты метода. Конструкция аналитических колонок предложена Г.Ю.Ажицким, препаративных -П.Д. Решетовым.

Планирование экспериментов проводили на основе математической теории эксперимента (МТЭ) и выполнена на основе программ, разработанных Г.И.Разореновым и Т.С.Разореновой. Анализ экспериментальных данных выполнен на ЭВМ "Хьюлитт Паккард" (США).

Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюден-та-Фишера по правилам вариационной статистики. Для каждой серии опы-юи вычисляли среднее ависЬметическое М. и соеднюю квадратичную ошибку п, значения которых М-n приведено во всех таблицах. Для определения достоверности разницы между результатами, вычисляли значение t-пока-затель достоверности средних величин. Использовали также метод ускоренного вычисления величины М по Muller, суть которого состоит в том, что средняя квадратичная ошибка рассчитывается по простой формуле: M=V х сп , где V - разность между наибольшим и наименьшим значением величин, сп - коэффициент, найденный по таблице с учетом числа измерений, п - число опытов.

1. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ СУСПЕНЗИЙ

Любая технология получения еирионных гриппозных вакцин должна включать обязательные стадии: очистку от надмолекулярных образований, очистку от примесных белков, стерилизацию, стабилизацию очищенного материала.

Основным физико-химическим методом разделения и очистки, применяемым практически при любом производстве вирусных препаратов, остаются осветление (предочистка) и глубокая очистка от примесей методами хроматографии или седиментации. Процесс получения высокоочищен-ных вакцин - это проблема оптимального сочетания различных методов. Наименее изученной и разработанной является стадия осветления - очистка вируссодержащих жидкостей от надмолекулярных образований. Для осветления ВАЖ использовали фильтрацию и высаливание. Наиболее технологичной операцией является фильтрация. Предочистка ВАЖ от надмо-пекулярных образований (эритроцитов, клеточного детрита) определяет течение последующих тонких разделительных стадий, реализуемых уже ла молекулярном уровне.

Целью исследования являлось изучение характеристик и свойств имевшихся и вновь созданных отечественных префильтров, разработка тре-юваний к технологии их получения, оценке санитарно-гигиенических свойств материалов. Исследовали следующие характеристики префильт-

ров: сорбцию различных вирусов на префильтрах из синтетических и природных материалов, проницаемость для исходной ВАЖ и ВАЖ, подвергнутой коагуляции, количество белка в ВАЖ и спектры мутности до и после фильтрации.

$00_700 «до

Рис. 2 Спектр мутности ВАЖ до и после фильтрации, штамм Х/Ленинг-рад/1/54/1(НЗТ2).

1 - картон-Т; 2 - картон 11в; 3 - стекловолокно; 4 - стекловолокно 2.

Получено на приборе "Бресогс! иУ-МБ, М-40"

Обозначения: по оси абцисс - длина волны в нм; по оси ординат - величина оптической плотности.

В процессе взаимодействия наблюдали существенные различия во взаимодействии вирусов с различными префильтрами. Наиболее значительные потери наблюдали на асбестосодержащих фильтрах, практически не сорбировали вирусы стекповолоконные и базапьтоволоконные фильтры и различные виды картонов. В процессе исследования выдавали рекомендации для коррекции технологии производства фильтров. Таким образом, разработан картон для префильтрации биологических жидкостей (КФБЖ) на основе стеклянных волокон, разработаны ТУ-13-7308001-691-84 на этот материал. Разработан также фильтр с переменной пористостью и повышенной грязеемкостью, эффективно задерживающий липиды. На оба материала получены авторские свидетельства: а.с.СССР N1158643, а.с.СССР N1254226, а.с.СССР N1632039.

1.1. ВЫСАЛИВАНИЕ ПРИМЕСНЫХ БЕЛКОВ ВАЖ СУЛЬФАТОМ АММОНИЯ.

Префильтрация позволяет удалить надмолекулярные образования, однако значительная часть примесных белков остается в растворе. Высаливание позволяет осаждать белки в широком диапазоне рН и концентраций солей, не денатурирует белки, нейтральные соли могут быть легко удалены диализом или диафильтрацией, это простой и экономичный способ.

Важным обстоятельством, вытекающим из опытов по высаливанию является повышение гемагглютинирующей активности (ГА), что связано по

Рис.3 Анализ проб исходной ВАЖ (-) и после ее высаливания сульфатом аммония (—) ,(-.-.-).

Использование осветляющей фильтрации позволяет удалить 12-14,8% примесных белков, высаливание в комбинации с фильтрацией 40,7- 84,4%, при 100%-ом сохранении ГА вируса. Очистка возрастает с увеличением концентрации сульфата аммония (СА), однако большие концентрации СА (15% и более) приводили к потере инфекционной активности вируса.

Увеличение ГА в процессе высаливания объясняется удалением неспецифических ингибиторов гемагглютинации, ассоциированных с вириона-ми. Это подтверждается следующими фактами:

1. Наличием ингибиторов гемагглютинации в незараженной, алланто-

нашему мнению с улапе-НИЙМ НРОПРИмфиЧвССИ*

ингибиторов гемагглютинации (инфекционной активности), присутствующих в аллантоисной жидкости.

В таблице 1 приводятся материалы по высаливанию ВАЖ сульфатом аммония с предварительным концентрированием ВАЖ методом микрофильтрации в 60-50 раз для разных штаммов вируса гриппа. Эффективность высаливания примесных белков ВАЖ контролировали методом ЭЖХ низкого давления.

иеной жидкости (собственные данные и данные литературы); отсутствием деструкции вирионов при концентрации соли до 10%, о чем свидетельствуют результаты сохранения инфекционной активности вирионов после ЭЖХ в пробах до и после высаливания - профили ГА таких проб совпадали. В больших объемах ВАЖ (50,0-120,0 л) высаливание было также эффективно, как и в аналитических опытах, что позволило включить ее как этап в фильтрационно-хроматографическую технологию получения ИГВ, регламент N210-81.

Таблица 1

Влияние высаливания на гемагглютинирующую активность вирусов. Концентрация сульфата аммония - 5,6%.

Исходная ВАЖ ВАЖ после высаливания

Объем л. 1/титр в Выход по РГА

Объем, л 1/титр в РГА

РГА (в %)

X// енинград/1/54/ (4(H3N2)

0,76 256 0,076 8000 312

0,50 2048 0,050 80000 390

1.18 16 0,20 256 177

1,80 512 0,14 16000 248

0,40 1024 0,12 128000 375

А/Уфа/771/76(Н1М1)

0,65 128 0,12 16000 150

0,55 128 0,12 32000 150

2,00 128 0,20 32000 250

14,00 512 0,30 64000 270

А/Техас/1 /77(H3N2)

13,00 512 1,20 8000 144

4,50 64 0,45 1024 160

4,50 512 0,34 16000 232

5,00 512 0,28 32000 350

2,90 512 0,22 16000 242

В/Л енинград/14/76

0,53 64 0,12 32000 150

0,66 64 0,15 Nib-4(H3N2) 4096 145

0,50 256 0,10 64000 500

1.2. ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРИОНОВ МЕТОДОМ МИКРОФИЛЬТРАЦИИ.

Микрофильтрация является мягким и наиболее щадящим методом концентрирования и очистки вирионов, ее, как правило, проводят в комбинации с диафильтрацией.

Мембраны, используемые для концентрирования и очистки вирусов, должны отвечать следующим требованиям: узкая дисперсия распределе-

Рис. 4 Анализ эффективности методом ЭЖХ различных добавок в фосфатный буферный раствор на диафильтрацию вирусной суспензии. Штамм А/Киев/59/79Р(Н1Ы1).

*.*.* -ФБР; -о-о- -ФБР+10% этанол; .-.- -ФБР+0.1М КСЫБ; .....ФБР+0.5М глицерин; _ -ФБР+1,ОМ глюкоза.

Из полученных результатов следует, что промышленное концентрирование вирионов возможно лишь при обеспечении одновременной очистки от балластных белков. Этот эффект может быть достигнут при работе фильтрационных аппаратов в режиме тангенциальной подачи концентрируемой суспензии (Черкасов А.Н.,1986) в условиях непрерывной регенерации мембран, в режиме разрушения слоя концентрационной поляризации обратным током фильтрата (Рейфман Л.С.,1986), либо периодической диафильтрацией. Нами предложен способ разрушения слоя концентрационной поляризации с помощью модифицированного буферного раствора, используемого для диафильтрации.

Из анализа материалов рис.4 следует, что наиболее эффективны добавки в буферный раствор для разрушения слоя концентрационной поля-

} там

« О0ВМ4Я1 А.*."»».».'^^; С.

ния по размерам пор, большая пористость (суммарная площадь пор), низкая адсорбционная активность по отношению к вирусу. Было исследовано несколько типов мембран (таблица 2). Использовали тупиковые или тангенциальные режимы ультрафильтрации, одновременно с ростом титра наблюдали концентрирование балластных веществ. Эффективность концентрирования вирусов зависела от материала мембран.

ризации, снижающие гидрофобные взаимодействия между вирусами и белками хаотропные ионы, глицерин, глюкоза.

Таблица 2

Результаты очистки инфекционного вируса гриппа ультрафильтрацией на установке СОКРА1

Штамм Тип мембраны Величина Кол-во Очистка от Выход ви- Выход ви-

пор (А) опытов белка (% руса в РГА руса по ИА3

к исходу) (%к исходу2) 1дЭИД5о

А/17/Ф(НЗК2) МФА-МА-1 800-1000 2 94,0 16,040,0 -0,25--0,5

Биопор-Т(поли- 300 5 95,0-98,0 130,0--160,0 0-+0,5

амидоимидная)

УПМЗ/85 300-500 2 80,0-89,6 95,-100,0 +0,4-+0,5

УПМ4/85 220 3 977-997 30,0-100,0 0--Н175

А/Н/32 (Н1М1) УПМ4/85 220 2 95,0-96,5 42,0-100,0 +0;25-+0,8

А/17/42/3(НЗ№) -II- -//- 2 70,0-72,4 120,0-170,0 +А,6-+0,8

А/Техи/1/77 УПМЗ/85 300-500 3 60,0-79,0 62,0-67,0 0- +0,25

(НЗК2)

А/47/Ф(НЗ№) Биопор-Т(попи- 300 3 58,5-86,2 43,0-100,0 +Ю

амидоимидкая)

УПМЗ/85 300-500 3 49,0-70,0 39,0-71,0 -0,5-+1,77

АЛ7Ф(НЗЮ) ч ЛЯФ 1000 3 57,0-61,0 160,0- 93,3 -1,0-+0,53

1 - материалы получены совместно с Лукьяновой Э.Г., Филлиповой М.Л.,

Громо вым В.И.- сотрудником НИИ ОЧБ

2 - в таблице приводятся крайние значения результатов;

3 - отношение величин инфекционной активности препарата до и после

ультрафильтрации.

4 - лавсановые ядерные фильтры

Разработанные на мембранных приборах и установках методики пре-фильтрации, концентрирования при одновременной диафильтрации и стерилизующей фильтрации вирусных суспензий позволили разработать и технически реализовать фильтрационно-хроматографическую и фильтра-ционно-седиментационную технологию выделения и очистки вирионов гриппа, клещевого энцефалита, других вирусов.

1.3. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ТЕХНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ФИЛЬТРОВАЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ.

Автоклавирование - наиболее часто используют в промышленной биотехнологии для стерилизации оборудования. Автоклавирование многорамных систем затруднено из-за значительной разницы в температурных условиях внутри и снаружи аппаратов для диафильтрации. Кроме того, полимерные материалы, из которых выполнены высокопроизводительные аппараты для облегчения конструкции, от многих циклов автоклавирова-ния теряют форму, "текут", кроме того, автоклавирование может менять свойства фильтровальных материалов, применяемых для ультрафильтрации.

Был исследован химический процесс стерилизации технических сродстз и фильтровальных материалов с использованием первомура. Первомур представляет собой систему, в которой из исходных ингредиентов муравьиной кислоты (НСООН) и перекиси водорода (Н2О2) - образуется над-муравьиная кислота (Шапилов О.Д.,1970).

Стерилизации первомуром подвергали полупрепаративный тонкоканальный фильтр ФТ-01 и препаративную установку УФА. В зависимости от этапа очистки используют аппарат, укомплектованный стекловолоконны-ми фильтрами (КФБЖ) или полисульфонамидными мембранами (ПСА). После контакта первомура с внутренними поверхностями аппарата и фильтровального материала длительностью не менее 10-15 мин. (спороцид-ный эффект препарата проявляется в течение 3-х мин.). Эксперименты по стерилизации УФА показали, что надмуравьиная кислота удаляется полностью после 10-кратной отмывки. В то же время Н2О2 полностью отмыть не удается, что, по-видимому, связано с наличием застойных зон в аппарате УФА. Для ФТ-01 достаточно 20-кратной отмывки, чтобы полностью удалить следы Н2О2, в то же время, 20-кратная отмывка аппарата УФА лишь снижает концентрацию Н2О2 до 0,0002%.

Установлено, что эффективность отмывки зависит от типа использованного фильтровального материала. Тонкие (0,1-0,15 мм) мембраны ПСА отмываются быстрее, чем глубинные фильтры КФБЖ, что объясняется, по-видимому, различием в адсорбционной емкости материалов.

Опыт промышленного применения аппаратов типа ФТ-01 ,УФА, СОКРА в НИИЭМ им.Пастера, НИИ вакцин и сывороток показывает, что стерилизация технических средств, фильтровальных и сорбционных материалов первомуром является технологичным и экономичным способом в промышленных условиях. Способ внедрен в производство ИГВ - "Регламент производства инактивированной гриппозной вакцины жидкой (фильтрационно-хроматографический метод), №210-81, НИИЭМ им.Пастера.

2. РАЗРАБОТКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОЧИСТКИ ВИРИОНОВ.

2.1. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ВИРИОНОВ ГРИППА НА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СИАЛОПРОТЕИДАХ.

Для выделения вируса гриппа из ВАЖ использовали метод, предложенный (Becht Н. и Rott R. 1972). Аффинную хроматографию проводили на иммобилизованном фетуине. В этих экспериментах удалось очистить вирус в 1000-1500 раз за один хроматографический цикл, при выходе вируса около 70%, при конечной концентрации овальбумина 0,03 мкг/мл.

Различия в выходе для разных штаммов вируса гриппа при десорбции связаны, вероятно, с различным сродством НА этих вирусов к фетуину. Афинная хроматография на других сиалопротеидах (тиреоглобулине, сывороточной холинэстеразе) давала сходные результаты. Однако наибольшую адсорбционную емкость по отношению к вирусу имели сорбенты с иммобилизованным фетуином.

Однако использование аффинной хроматографии на иммобилизованных сиалопротеидах для препаративной цели является неперспективным делом из-за высокой сложности метода, низкой его производительности. В то же время метод является уникальным для исследования штаммовых различий вирусов по их сродству к клеточным рецепторам. Фетуин является аналогом клеточного рецептора. Сорбенты на его основе позволяют изучить гетерогенность вирусной популяции одного штамма по их сродству к фетуину. В эксперименте удалось десорбировать вирионы с высоким сродством к фетуину (0,2-0,7% от общего пула десорбированного вируса).

2.2 ХРОМАТОГРАФИЯ ВИРИОНОВ ГРИППА НА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ИНГИБИТОРАХ НЕЙРАМИНИДАЗЫ.

Аффинные сорбенты на основе ингибиторов нейраминидазы теоретически должны быть универсальными, т.е. пригодными для любых штаммов вируса гриппа. В качестве ингибитора использовали М-(р-аминофенил) оксаминовую кислоту (ПАФОК). Присоединение ингибитора нейраминидазы к носителю, модифицированному гамма-аминопропилтриэтоксиси-ланом (АГМ-9) проводили с помощью глютарового диальдегида или хлористого цианура. Активность ингибиторов определяли по величине К|50. В качестве носителя использовали МПК, а также сорбент "Инсолмер" (Чехия). Эффективность модификации существенно зависела от пористости сорбента. Во всех опытах по аффинной хроматографии на иммобилизованных ингибиторах нейраминидазы отмечается чрезвычайно низкий вы-

Синтез ингибиторов нейраминидазы и аффинных сорбентов на их основе выполнен О.Д.Шапиловым и В.Г.Каюмовым в НИИЭМ им.Пастера

ход вируса при десорбции (0,26-11,8%). В некоторых опытах десорбиро-вать вирус вообще не удалось, несмотря на жесткие условия десорбции. Полученные результаты позволяют говорить о необратимой адсорбции вируса на аффинном сорбенте или иммобилизации вирусов.

В результате опытов с аффинным сорбентом на иммобилизованной ПАФОК установлено, что можно иммобилизовать вирусы гриппа различных штаммов с эффективностью от 14 до 99,2%. Эффективность иммобилизации существенно зависит от типа носителя, способа получения сорбента, штамма вируса и способа его адсорбции (колоночный или суспензионный метод). При этом вирус сохраняет функциональную активность поверхностных антигенов. Показано, что вирус, иммобилизованный на сообенга "Биоглас-500" (БиоРад, США), ¿¡или при дсссрбции " ^ес^и* условиях по рН и ионной силе сохранял нейраминидазную активность.

Обнаруженное свойство необратимой адсорбции вирусов различных штаммов на аффинном сорбенте с ингибитором нейраминидазы может быть использовано для иммобилизации вирусов. Этот приём используется при выделении чистых антител к вирусным антигенам и может найти применение для истощения сывороток от антител, выделения очищенных ингибиторов, гемагглютинации и иных целей.

Причиной необратимой адсорбции вирусов на иммобилизованных ингибиторах нейраминидазы является, вероятно, многоточечные контакты вирионов с поверхностью адсорбентов, что обеспечивает высокую прочность взаимодействия вирусных белков с сорбентом (большая энергия взаимодействия).

2.3.ХРОМАТОГРАФИЯ ВИРИОНОВ ГРИППА НА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКТИНАХ.

Исследовали возможность использования различных лектинов в качестве лигандов для аффинного выделения различных штаммов вируса гриппа. Иммобилизация лектинов выполнена на макропористом стекле или се-фарозе-4В. Хроматографию проводили колоночным или суспензионным методом.Хроматографические колонки были снабжены водяными рубашками для термостатирования процесса. Десорбцию проводили растворами различных Сахаров глюкозы, лактозы, Р-маннозы, Э-фукозы, Ы-ацетил-галактозамина, альфа-метил-О-маннозида, Ы-ацетилглюкозамина, галак-тозамина, глюкозамина солянокислого. В десорбированной суспензии вируса определяли содержание общего белка, овальбумина, неовальбу-миновых компонентов*.

Иммобилизация лектинов выполнена на макропористом стекле или се-фарозе-4В. Иммобилизовывали следующие лектины:

"Диагностикум для определения неовальбуминовых компонентов в РИГА был разработан и любезно предоставлен нам доктором медицинских наук А.Б.Жебруном из НИИЭМ им.Пастера.

1/дар »

яг

«56 138 М 32 16 8 4

, Адсорбцм

I мрзгов

I Отша

* т 1 & ■ &

»крус* 0.01М «ЕР иггом.

С« л»«

^"лзЬ—ТЛ—'-от

Оби* иоцт,1а

1/т«р а РГ1

256 Ш 64

зг

16 8

орб- Отиош

цм | С-4вс

ЛДо

!пд

Д»сарбфи »«руса 0,01И «ЕР на |0,Э1 ииггоа«

/Ц ' Д тэт

Обьем злвцки.их

Рис.5 Аффинная хроматография вируса N¡5-4 (НЗ№)(А) и №Ь-6 (Н1-N1X8) на иммобилизованном лектине клещевины (токсине).

Лектин фасоли (Phaseolus vulgaris);

Лектин гороха (Pisum sativum);

Лектин сои (Glycine max);

Лектин клещевины-эффектор (Ricinus communis I);

Лектин клещевины-токсин (Ricinus communis II);

Лектин конковалии-конкавапин A (Canavalia ensiformis);

Лектин белой акации (Robinia pseudoaccacia);

Лектин караганы (Caragana arborescens);

Лектин пшеницы (Triticum vulgaris);*

На рис.5 приведены хроматограммы очистки вируса гриппа двух штаммов на иммобилизованном лектине клещевины.

В опытах по аффинной хромятсграфт» на ИММОоилизонанных пектинах показана возможность достижения высокой степени очистки вируса от примесных белков. Эта очистка достигается в том случае, если удается подобрать условия элюции вируса.

Наиболее важным результатом опьпа по аффинной хроматографии на иммоблизиованных лектинах является обнаружение специфичности действия лекгинов в отношении различных штаммов вируса гриппа. Из 9-ти исследованных нами лекгинов все 9 сорбировали вирус Níb-6 (HINI). Емкость по вирусу для некоторых лекгинов различалась в 2,58 раза (1520 и 587 ГАЕ/мл соответственно для лектина белой акации и клещевины-Н). Вирус элюировал на 100% с лектина клещевины-И в присутствии 0,5 М лактозы и не элюировал в тех же условиях с лектина белой акации. Это позволяет говорить о возможности исследования структуры углеводных детерминант поверхностных гликопротеинов вируса гриппа. Лектин кле-щевины-ll является галактозоспецифическим лектином (DGal; Dgal N Ac). Специфичность лектина белой акации не установлена, известно лишь, что он не связывает моно- и дисахариды. Результаты опытов на иммобилизованном лектине сои позволяют выявить еще одну возможность лектинов. Штамм А/Тсха с -1/77/( Н 3 N 2) является одним из родительских штаммов для рекомбинанта Nib-4(H3N2). Штамм АДехас/1/77(НЗЫ2) элюировал с высоким выходом 0,1М лактозой при t=+4 - +37 °С, а штамм Nib-4 (H3N2) апю-ировать в тех же условиях не удалось. Лектин сои является галактозозави-симым лектином (DGal; а,р DGal N Ас).

Таким образом, с помощью лектинов можно контролировать изменения в составе углеводных цепочек, входящих в состав поверхностных гликоп-ротеидов, происходящие при рекомбинации вирусов. Сопоставление этих данных с результатами других биологических характеристик вирусов (реп-родуктивность, иммуногенность, вирулентность, гидрофобность) может дать дополнительную информацию о связи между структурой поверхностных гликопротеинов и свойствами вирусов.

* Лектины были любезно предоставлены нам М.Д.Луциком из Львовского медицинского института

2.4. ОЧИСТКА ВИРИОНОВ ИММУНОАФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Работа выполнена совместно с сотрудниками НИИЭМ им.Пастера Ф.С.Носковым и А.Б.Жебруном. Для очистки вируса использовали антитела к овальбумину, иммобилизованные на твердом носителе. Этот подход оказался более перспективным, чем использование антител к целевому продукту-вирусу. Результаты доочистки гриппозных вакцин иммуноаффин-ной хроматографией позволяли достичь снижения содержания овальбу-мина до концентрации 0,03 мкг/мл и ниже. Полученные в этих экспериментах результаты легли в основу технологии получения гриппозной вакцины для детей (а.с.СССР №1167789). Этот вариант технологии, в дальнейшем усовершенствованный сотрудниками НИИЭМ им.Пастера (Полянская М.Ю., Бичурина М.А. и сотр.,1984), позволил разработать высоко-очищенный препарат вирионной инактивированной гриппозной вакцины для детей. На предприятии НИИЭМ им.Пастера налажен выпуск этого препарата с 1983 г.

2.5. ОЧИСТКА ВИРИОНОВ ЭКСКЛЮЗИ0НН0Й ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА МАКРОПОРИСТЫХ КРЕМНЕЗЕМАХ.

Впервые применение макропористых стекол для хроматографической очистки вирусов было выполнено в США Халлером в 1965 г., хотя приоритет получения МПК принадлежит С.П.Жданову. В России подобные материалы (силохромы, макропористые стекла, силикагели) также выпускаются промышленностью. Эти носители обладают свойствами, необходимыми для использования в технологических процессах: они термо- и химически стабильны, механически прочны, обладают жестким осмотичесю-устойчивым каркасом; структура пор сорбентов не изменяется под влия нием используемых в хроматографии элюентов, устойчивы к микробиоло гическому воздействию, легко регенерируются, стерилизуются, подвер гаются направленным химическим модификациям, могут быть использо ваны многократно.

В России работы по хроматографии вирусов на пористых стеклах был1 начаты по инициативе профессора С.Е. Бреслера. Разработка методо; химического модифицирования макропористых кремнеземов расширил, возможности их применения для хроматографии. Широкому распростра нению хроматографии на МПК препятствует их высокая адсорбционна активность, способная вызвать необратимую адсорбцию биополимеро (белков, гликопротеидов, а также вирусов). Эта особенность сорбенто исключает осуществление истинного эксклюзионного механизма при хрс матографии гидрофильных полимеров. Для преодоления указанного не достатка сорбентов этого класса проводят модификацию их поверхносп чтобы уменьшить адсорбционную емкость. Большой вклад в решение это проблемы внесли В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвили (1986).

2.6. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ СИСТЕМЫ

"ВИРУС-ПРИМЕСИ".

Использовали макропористое стекло МПС-2000В-ГХ (ТУ-38-101832-80) с удельной поверхностью 25-55 м2/г и удельным объемом пор 1,7-2,5 см/г производства ГОЗ ВНИИНП (Нижегородский опытный завод Всероссийского НИИ по переработке нефти). Сорбент был модифицирован гли-цидолом*, стиролом, методом молекулярного наслаивания** и поливинил-пирролидоном (ПВП). ВАЖ предварительно концентрировали в 10 раз микрофильтрацией перед хроматографией. Для моделирования вязкости ис-плп».?<>еали сод Хроь^сгрйч>ич«»ли« иаздег.ение регистрировали с помощью проточного аысокйчуиовигельного денситометра, разработанного в лаборатории биофизики и биохимии НИИЭМ им.Пастера.

Изучали влияние высоты колонки (Н), скорости элюции буферного раствора (I), вязкости и объема проб, вводимых в колонку. Влияние указанных факторов на разделение компонентов при хроматографии исследовали в "точечном эксперименте", т.е. при варьировании одного из факторов (например, вязкости проб), остальные факторы были постоянными. Схема хроматографического разделения концентрата ВАЖ с указанием некоторых хроматографических характеристик приведена на рис.6.

Рис.б Схема хроматограммы и основные хроматографические характе-

Обозначения: Уе - объем выхода вируса, V/ - ширина пика, Кв - критерий разделения пиков; Кв=(Ьп-11т)Л1п

*Синтез сорбентов, модифицированных глицидолом выполнен Алферовой

Л.В. и Куреньгиной Т.Н. из ИВС РАН.

**Синтез сорбентов стиролом и методом молекулярного наслаивания осуществлен Волковой А.Н. из Технологического института им.Ленсовета, (зав.кафедрой проф. Яковлев В.И.)

ристики.

Полученные результаты свидетельствуют о различной степени влияния исследованных факторов на эффективность разделения системы "вирус-примеси". Для исследованных сорбентов весьма важным является выбор оптимальной величины рН, ионной силы и состава элюирующего буферного раствора, а также введения ограничения на вязкость анализируемого материала. Представляется также целесообразным поиск оптимального режима хроматографии на основе полученных результатов с использованием математической теории эксперимента (МТЭ), т.к. в "точечном эксперименте" трудно исследовать влияние любого из факторов на разделение в широком диапазоне их значений. Кроме того, невозможно получить информацию о взаимном влиянии изученных параметров на интегральную характеристику разделения пиков - величину Кв , удельной активности, и степень очистки вирусной суспензии. Учитывая, что эффективность ЭЖХ на МПК зависит от многих факторов, необходимо оптимизировать этот процесс.

2.7. ОПТИМИЗАЦИЯ РЕЖИМА ЭЖХ ВИРУСОВ НА МОДИФИЦИРОВАННЫХ МПК.

Цель применения математической теории эксперимента (МТЭ) поиск оптимальных условий проведения ЭЖХ с целью максимальной очистки вирионов от примесных компонентов. Был поставлен 4-х факторный эксперимент по оптимальному плану второго порядка МТЭ*.

Постоянными величинами в опыте являлись следующие факторы: сорбент и его гранулометрический состав, вирусный штамм, вязкость исходной концентрированной вирусной суспензии. Эффективность ЭЖХ оценивали по двум группам откликов. К первой относили хроматографические характеристики: степень разделения - Кв , число тарелок - N.

высота экспериментальной теоретической тарелки - ВЭТТ.

|1п-ьт

Кв= -; М=(РхУеМ); ВЭТТ=Н/Ы

где Уе - объем выхода (элюции) пика, и/ - ширина пика, Н - высота слоя сорбента, рис.6.

Вторая группа откликов характеризует степень очистки вирусной суспензии от примесных компонентов: концентрация овальбумина и неоваль-буминовых компонентов в пике вируса, общий белок, степень очистки вируса в %, титр вируса в РГА, выход вируса в %. В результате обработки эксперимента получены математические модели для откликов в виде 4-х факторных полиномов 2-го порядка:

'Математический аппарат к данному эксперименту разработан Г.И.Разореновым, Т.И.Разореновой

4 4 ц

У=Ь + £ ь,.х.+ £ Ь, .-х, + £ Ь-.-х^ 0 1-1 1 1 л.,^113 0 1=1 11 1 .

где Ь0, Ь;, Ьц, b¡j - коэффициенты влияния факторов Х| (и взаимодействий Х||, Х|() на критерии - отклики. Кроме того, было найдено оптимальное сочетание переменных факторов, дающее максимальную очистку и выход вируса при ЭЖХ на МПК.

Для достижения цели оптимизации была построена математическая модель, связывающая отклики с комплексом переменных факторов. После обработки результатов эксперимента по алгоритму МТЭ получены полиномиальные модели второго порядка. кптпруе о ^сдиропанпьи ¡¡временных имеют зид:

Кв - критерий разделения пиков (У^;

У-1 = 0,52 + 0,92 х Н - 0,45 х I + 0,5 х Н х I - 1,5 х Н2;

Концентрация неовальбуминовых компонентов (НОК) - мкг/мл ВАЖ(Уо);

У2 = 0,56+ 0,083 х Н - 0,077 х Н х УУ+ 0,108 х I х рН- 0,66 х рН2 - 0,66 х УУ2;

Концентрация общего белка в пробе - мкг/мл (У3 );

У3 = 0,0024+0,00041 х 1-0,00056 х рН-0,00064 х УУ+0,00056 х Н х рН+

+0,0008 х Н х УУ + 0.00054 х рН х УУ;

Степень очистки вирусной суспензии в % (У4);

У4 = 99,607+0,143 х Н-0,13 х рН-0,15 х W+0,17 х Н х W-0,17 х Н2

Число теоретических тарелок - N (У5);

У5 = 110,1+55,4 х Н-8,8 х 1+12,9 хН х 1 - 3,7 х Н2 + 9,5 х I2 +19,7 х УУ2; Высота эквивалентной теоретической тарелки - ВЭТТ (У6); У6 = 2,7 - 0,46 х ! + 0,55 х Н х I - 1,13 х Н2 + 0,053 х№2; Титр вируса в РГА - концентрация вируса (У7) У7 = 6,17 + 0,22 х I - 0,22 х I х рН - 0,44 х Н2 - 0,44 х рН2 + 0,31 х УУ2; Выход целевого продукта - вируса - в % (Уд); У8 = 94,19 - 7,53 х Н + 8,06 х рН - 6,4 х Н х УУ - 4,7 х I х рН -- 4,95 хрНхУУ -17,51 х I2 - 27,5 х рН2 + 21,9 х УУ2. Кроме того, была проведена глобальная оптимизация процесса ЭЖХ, целью которой является поиск условий получения вирусной суспензии с минимальным содержанием овальбумина (при заданном выходе целевого продукта-вируса, равном 90%). Эта задача была решена и проведена экспериментально на хроматографе ХЖ-3301. Задача поиска экстремума сводилась к нахождению минимального значения целевой функции при следующих ограничениях на параметры очистки и качество препарата общий белок, мкг/мл £ 360

содержание неовальбуминовых компонентов (НОК) мкг/мл >3,0 удельная активность й 330,0 степень очистки, % > 99,7 выход по РГА, % > 90,0

При решении задачи оптимизации был найден наилучший режим про-

ведения хроматографической очистки: Н - 45 см, I - 0.15М, рН - 8,3, Уэл - 50 мл/час-см2 . На экспериментальной установке были проведены проверочные опыты, которые позволили получить вирусную суспензию с параметрами, близкими к расчетным и предсказанным на основе МТЭ: общий белок-27 мкг/мл, содержание овапьбумина - 0,14 мкг/мл, выход по РГА - 81,7%.

Аналогичным образом были решены задачи по оптимизации ЭЖХ на МПК, модифицированных ПВП, стиролом и глицидолом.

Перспективным способом модификации поверхности МПК является метод молекулярного наслаивания, заключающийся в послойном наращивании оксидных слоев одного или нескольких элементов на поверхности твердой матрицы, химически связанной с нею. Для получения заданного количества титаноксидных слоев операция взаимодействия с ОН-группа-ми поверхности, гидролиз хлор-иона в полученных продуктах проводился требуемое число раз. Полученные сорбенты устойчивы в диапазоне рН 2,0-9,0, при этом значительно снижался переход кремния в раствор. До испытания сорбентов в ЭЖХ исследовали их сорбционную активность по отношению к овапьбумину и вирусам гриппа.

Оптимальными свойствами для ЭЖХ обладали сорбенты, полученные в результате 3-4-кратной модификации МПК титаноксидными группами и овальбумином, что признано изобретением (а.с. №1124977 СССР). . Кроме того исследован новый ряд сорбентов на основе МПК с целью иммобилизации белков и вирусов для проведения аффинной хроматографии.

3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМ "ФИКОЛ-ДЕКСТРАН" ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОФОБНОСТИ ВИРУСОВ ГРИППА.

В связи с важностью параметра "гидрофобность" вирусов была предпринята попытка определения этой величины количественно. Одним из подходов было использование двухфазных систем "фикол-декстран".

Эта система, предложенная Заславским Б.Ю. и соавт. (1982), была использована нами для определения гидрофобности различных штаммов вируса гриппа. Преимуществом этой системы является то, что компоненты этой системы пренебрежительно мало взаимодействуют с биологическими объектами исследования.

Коэффициент распределения полиэлектролита с суммарным зарядом Z определяется формулой:

In К = In К0 + - хДТ (1)

кхТ

где е- заряд электрона, AT - межфазная разность потенциалов, К0 -коэффициент распределения полиэлектролита при AT =0. Согласно Jo-chanson С. (1970), коэффициент К° в уравнении (1) следует рассматри-

вать как характеристику относительной гидрофобности распределяемого объекта.

Таким образом, общепринятая в настоящее время точка зрения состоит в том, что распределение биологических частиц и макромолекул в двухфазных системах водорастворимых полимеров при фиксированных условиях в основном определяется двумя характеристиками распределяемого вещества: суммарным зарядом и относительной гидрофобностью. Это позволяет нам экспериментально оценивать относительную гидрофобность при условии, что разность потенциалов между фазами равна 0.

Коэффициент распределения (К) определяли по формуле: Нин ■

К = --I?)

где Ыин - количество вируса в интерфазе, Ынф - количество

вируса в нижней фазе.

Количество вируса определяется как количество гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) в данной фазе: (ГАЕ)=обьем фазы(мл) х 1/титр в РГА. Количество вируса в интерфазе определяли из уравнения: ГАЕИН = ГАЕг - (ГАЕнф + ГАЕвф) (3)

где ГАЕг - количество вируса в гомогенной (т.е. еще не разделившейся на фазы) системе, ГАЕнф и ГАЕвф - количество вируса в верхней и нижней фазах системы после ее расслоения.

Для оценки относительной гидрофобности штаммов-антиподов по признаку ингибиторочувствительности или авидности сравнивали между собой их коэффициенты распределения - К. Согласно теории К растет с ростом гидрофобности объекта распределения. Схема опытов по распределению вирусов в двухфазных системах приведена на рис.7.

В создаваемые двухфазные системы добавляли предварительно очищенную и сконцентрированную вирусную суспензию.

Использовали следующие ш гаммы:

1. Штамм 2/1-А1/Виктория/35/72/50(НЗЫ2). Вариант с повышенной им-муногенностью. Получен из штамма А/Викгория/35/72/50 методом имму-нопресса.

2. Штамм 5/2-А/Виктория/35/72/50(НЗМ2). Вариант с пониженной им-

муногенностью. Получен из штамма А/Виктория/35/72/50 методом имму-нопресса.

3. Штамм 4/11-А/Хабаровск/74/77(Н1М). Вариант с пониженной иммуно-генностью. получен методом иммунопресса из штамма А/Хабаровск/74/ 77.

4. Штамм 4/1-А/Хабаровск/74/77(Н!№). Варианте повышенной иммуно-генностью. Получен из штамма А/Хабаровск/74/77. Штамы №№1-4 получены из Одесского НИИ вирусологии и эпидемиологии им. И.И.Мечникова, из лаборатории доктора медицинских наук Г.С.Скрипченко.

5. Штамм А/Хабаровск/74/77(Н1М1), ингибиторорезистентный - И.Р.

6. Штамм А/Хабаровск/74/77(Н1М), ингибиторочувствительный - И.Ч.

7. Штамм АДехас/1/77(НЗЫЗ), И.Р.

8. Штамм А/Гехас/1/77(НЗ№), И.Ч.

9. Штамм В/Ленинград/369/75, И.Ч.

10. Штамм В/Гонконг/5/72, И.Р. Этот штамм отличался меньшей авид-

ностью к антителам, чем штамм В/Ленинград/ 369/75. Штаммы №№ 510 получены из НИИ гриппа РАМН, из лаборатории д.м.н. А.А.Со-мининой и выращены на культуре клеток почки поросенка.

Т.о. материалом для исследования являлись штаммы-антиподы по признаку ингибиторо-чувствительности,авид-ности к антителам или иммуногенности.

Рис.7 Схема постановки опыта по распределению вирусного материала в

двухфазной системе. Обозначения: А - гомогенная система (фазы еще не разделились); В -система, разделившаяся на фазы.

Вирусы 1 и 2 - штаммы-антиподы по биологическому признаку.

Необходимо отметить, что применение достаточно грубого метода определения концентрации вируса (РГА) снижает точность получаемых результатов, что влечет за собой необходимость в большом числе параллельных опытов (5-7). Кроме того, из-за диссоциации комплекса "вирус-

"Декстран - м.м. 40000, "Loba-Chemie", Австрия Фиколл - м.м. 40000, "Farmacia", Швеция Автор выражает признательность д.м.н. А.А.Сомининой и д.м.н. Г.С.Скрип-ченко за возможность работать с упомянутыми штаммами вирусов гриппа.

ингибитор гемагглютинации" коэффициенты распределения (К) могут быть определены некорректно (см. стр.16). Для исключения этих проблем в ряде случаев исследовали распределение по фазам некоторых вирусов, используя для определения концентрации вирусов метод ОРИД (одиночная радиальная иммунодиффузия). Использовали моноспецифические анти-гемагглютининовые сыворотки к штаммам (Н1Ы1) и (НЗЫ2). Рабочее разведение сывороток составило 1:30. Моноспецифические сыворотки реагировали как с исходным вирусным антигеном, так и после его распределения в фазах полимерной системы, что позволило определить концентрацию антигена в мкг/мл.

Материалы по определению величины К исследованных вирусов приведены в таблице 3.

Таблица 3

Характеристика гидрофобности штаммов-антиподов методом РЖХ в системе "фиколл-декстран" (концентрация полимеров соответственно

25 и 20 вес%).

Штаммы К (по данным РГА) N ± п К (по данным ОРИД) N ± m

2/1-А(Виктория)35/72/50(НЗЫ2) 5/И-А(Виктория)35/72/50(НЗЫ2) н.о. н.о. 0,16±0,01 0,06+0,003 Р<0,01

4/1-А(Хабаровск)74/77(НШ1), И.Ч. 4/Н-А(Хабаровск)74/77(Н1Ы1), И.Ч. 10,7±0,85 1,0±0,05 Р<0,001 5,6±0,39 н.о.

А(Хабаровск)74/77(Н1М),И.Ч. А(Хабаровск)74/77(Н1 N1 ),И.Р. 1,4+0,08 0,4±0,02 Р<0,001 н.о. 2,3±0,11

A(Texac)1/77(H3N2),H.4. A(Texac)1/77(H3N2),H.P. В(Гонконг)5/72 1,5±0,15 1,7±0,10 Р<0,01 1,8±0,11 7,9+0,42 5,9±0,15 Р<0,01 н.о.

В(Ленинград)369/75 4,5±0,32 Р<0,001 н.о.

Примечание: н.о. - не удалось определить.

Из таблицы следует, что ингибиторочувствительные штаммы оказались более гидрофобными, чем ингибиторорезистентные. Ни один из опытов не дал обратной зависимости между признаком чувствительности к ингибиторам и гидрофобностью.

Результаты опытов со штаммами с различной иммуногенностью (пара 4/1 и 4/И-А/Хабаровск/74/77(Н1 N1) и 2/1 и 5/11-А(Виктория)35/72/50(НЗЫ2) говорят о том, что более иммуногенные штаммы являются и более гидрофобными.

Сравнение величин К, полученных разными методами, позволяет сделать заключение о достоверном различии по признаку гидрофобности у исследованных штаммов-антиподов.

Поскольку свойство чувствительности к ингибиторам гемагглютинации связано с НА вируса гриппа, вероятно, гидрофобность вируса определяется прежде всего степенью гидрофобности его НА. Действительно, количество молекул НА в 4-6 раз превосходит количество молекул ЫА, поэтому основные физико-химические характеристики вириона (р1, заряд, гидрофобность) будут, вероятно, определяться свойствами этого гликопротеи-на (статистический подход).

При сравнении величин К следует отметить наиболее существенное е( различие у штаммов - антиподов 4/1 и 4/11-А (Хабаровск)74/77(Н1№1), ко торые различались по иммуногенности в 24,2 раза, а по гидрофобности • в 10 раз. Штаммы Викторианской разновидности различались по иммуно генности в 9,4 раза, а различие по гидрофобности составило 2,7 раза Исследование зависимости между гидрофобностью и иммуногенностьк этих штаммов представляет особый интерес, поскольку штаммы с высо кой и низкой иммуногенностью получены из одной исходной вирусной по пуляции методом иммунопресса (Скрипченко Г.С., 1983).

По-видимому, естественная вирусная популяция представляет собо! гетерогенную смесь вирионов с различной степенью гидрофобности. Ус тановление зависимости между гидрофобностью вирусов и их иммуно генностью может иметь фундаментальное значение и открыть новые под ходы к технологии получения вирусных вакцин.

Наибольший биологический интерес представляет связь признака "гил рофобность" и "иммуногенность"*, "гидрофобность" и "сродство к ИНГИ биторам гемагглютинации".

Предложенная новая характеристика физико-химических свойств вир^ сов или физико-химический маркер вирусного штамма, определяемый ке "гидрофобность", должен быть в значительной степени связан с биолог* ческими свойствами штамма, что связано с той ролью, которую игран: гидрофобные взаимодействия в живой природе.

*Под "иммунногенностью" мы понимаем наиболее часто употребляемо определение данного термина - способность организма продуцироват противовирусные антитела под воздействием вируса.

Из анализа полученных результатов следует, что более гидрофобные штаммы являются более иммуногенными и более чувствительными к ингибиторам гемагглютинации.

Можно предположить, что вблизи рецепторного "кармана" тяжелой цепи НА имеются гидрофобные (рецепторные) зоны, с которыми могут взаимодействовать комплементарные участки рецептора или ингибитора гемагглютинации, граничащие с гидрофильной "головкой" сиаловой кислоты молекулы рецептора. Такие гидрофобные зоны вблизи рецепторного "кармана" могут иметь различную протяженность и представлять собой трехмерное стерическое образование. Топология таких рецепторных зон является конформационным понятием. Аналогию таким зонам можно найти вблизи активного нентсм ^»еоментов. гле они играют важную ропь в процессе ферментативного катализа (Кабачник М.И.,1964).

При определенных условиях культивирования вирусов протяженность таких гидрофобных зон может меняться (уменьшаться или увеличиваться), что будет влиять на прочность связи с рецептором "клеточным" или ингибитором (сывороточным) НА, т.е. изменится константа ассоциации в системе "гемагглютинин-рецептор", что приведет к появлению в репродуктивной системе либо ингибиторорезистентных, либо ингибиторочувстви-тельных клонов вируса гриппа (исходная вирусная популяция представляет смесь различных по этому признаку вирионов).

Хорошо известен на практике способ получения ингибиторорезистентных штаммов для диагностических целей путем выращивания вирусов гриппа в среде, обогащенной сывороточными ингибиторами.

Обнаруженная зависимость между иммуногенностью и гидрофобнос-тью вирусов гриппа на клонированных популяциях вирионов требует дальнейшего исследования по расширению штаммовых разновидностей вируса гриппа.

В этой связи представляют большой интерес материалы, полученные нами совместно с Г.А.Сухановой в лаборатории молекулярной биофизики Института биологии Карельского филиала РАН (рук. д.ф.-м.н. А.И.Кяйвя-ряйнен). Методом ЯМР замороженных растворов проведен сравнительный анализ свойств двух штаммов вируса гриппа: Х(Ленинград)54(Н1М1) и А(Ленинград) 385/80(НЭЫ2). По данным А.И.Нифонтовой (1984) штамм с антигенной формулой (НЗЫ2) был более иммуногенным, чем штамм <Н1 N1) (средние геометрические титры соответственно: 1:158 и 1:97). Поданным ЯМР гидратная вода у штамма (НЗЫ2) эффективнее, чем у вируса (Н1 N1), вымораживается и вытесняется тяжелой водой при ее концентрации 5%, т.е. гидратация штамма (НМ1) более, чем на 70% была выше по сравнению со штаммом (НЗЫ2). По данным А.И.Кяйвяряйнена (1984) эти различия обусловлены, в основном, повышенным содержанием в (Н1Ы1) внутренней воды. Меньший свободный объем в случае (НЗЫ2) означает большую жесткость его поверхностных структур (в том числе и антигенных де-

терминант) и, следовательно, более высокую иммуногенность. Кроме того, более эффективное вытеснение обычной водой из гидратной оболочки - (H3N2) тяжелой водой,- по сравнению с(Н1N1), указывает на большую гид: рофобность и вероятность адсорбции на клеточных рецепторах у H3N2. . -Обнаруженное, нами явление-зависимости между гидрофобностью и иммуногенностью вирусов позволило предсказать, какие из вновь полученных вирусных рекомбинантов будут иметь большую иммуногенность еще до того, как она была определена в эксперименте на животных. Для штаммов А(Новошахтинск)3/86/17 (H1N1) и А(Новошахтинск)8/86/17(Н1Ы1) установлено, что ингибиторочувствительный штамм А(Новошахгинск)3/86/ 17(H1N1) имел коэффициент распределения в 2 раза (К = 0,8) выше, чем \интбитарорезистентныйл1ггамм:А(Новошахтинск)8/86/17(НШ1), и был более иммуногенным. Эти данные получены совместно с М.Л.Филлиповой в лаборатории д.м.н. Полежаева НИИ гриппа РАМН.*(76)

Другим практически важным аспектом является обнаружение нами снижения гидрофобности в 2-3 раза вирусных штаммов после их обработки формалином в процессе получения ИГВ. Ранее работами Э.А.Фридман, Т.М.Бохневич (1976) было показано снижение имуногенности вирусов под действием формалина. Теперь становится ясным механизм снижения им-муногенности вирусов после обработки их формалином.

Существенный вклад в анализируемую проблему внесли исследования Пономаренко А.И. и соавт.(1990), выполненные в лаборатории члена-корреспондента РАМН Каверина В.Н. из Института вирусологии РАМН через 6 лет после опубликования наших данных.

Методом олигонукпеотидного картирования РНК гена НА было обнаружено, что высоко- и низкоиммуногенные вирионы, полученные из вакцинного штамма А(Виктория)35/72/50(НЗЫ2) (см. таблицу 3) отличаются от родительского штамма и друг от друга.

С целью более детального изучения этих отличий проведено секвени-рование РНК гена НА. Показано, что в гене НА высокоиммуногенного варианта по сравнению с генами исходного и низкоиммуногенного вариантов произошли 3 значащие нуклеотидные замены, следствием которых являются аминокислотные замены в молекуле НА: аспарагина-137 на серии, глицина-158 на валин и серина-193 на аргинин (рис.8).

При сопоставлении результатов работы Пономаренко А.И. и соавт. (1990) с локализацией антигенно активных областей на молекуле НА (Wiley D.C. и соавт.,1981), видно, что замены в 137-м и 145-м положениях приходятся на область антигенной детерминанты А, замены в положениях 158-м и 193-м - на область детерминанты В. Измененные у высокоиммуногенного варианта 137-я и 193-я аминокислоты находятся на участках молекулы НА, стимулирующих пролиферацию Т-Хелперов и Т-цитотоксических клеток

'Приношу глубокую благодарность д.м.н. Полежаеву Ф.Н. за любезно предоставленные штаммы вируса гриппа.

соответственно (Lamb J.R., Green N.,1983;

Underwrood P.A.,и соавт.,1987). Кроме того, оказалось, что почти все обнаруженные замены расположены в области рецепторного кармана молекулы НА, контактирующего с клеточным рецептором (рис.9).

Так, 137-я аминокислота, замещенная у высокоиммуногенного варианта в соответствии с моделью Wiley D.C., Skehel I.I. (1987), участвует в формировании переднего края рецепторного кармана, и при контакте с клеточным рецептором располагается напротив карбоксилата сиаловой

кислоты клеточного рецептора. 158-й аминокислотный остаток также располагается в области рсцегггорного «-армяна, но «я ei о (¡¿хттисшслож-ной стороне. У высокоиммуногенного варианта произошла замена глицина-158 с полярной R-группой на валин, R-группа которого неполяр-на. Такое замещение, вероятно, может привести к повышению локальной гидрофобности соответствующей области рецепторного кармана, что согласуется с нашей гипотезой о влиянии "гидрофобных зон" вблизи рецепторного кармана вирусного НА на иммуногенные свойства вируса. 193-й аминокислотный остаток располагается в задней стенке рецепторного кармана (Wiley D.C. и соавт.,1986). Замена серина-193 на аргинин, как у высокоиммуногенного варианта, по данным Wiley D.C., Skehel 1.1.(1987), помещает длинную,гибкую боковую цепь аргинина в положение, где она может выступать внутрь рецепторсвязывающего кармана и участвовать в полярных взаимодействиях с рецептором. В отличие от серина у аргинина есть две метиле-новых группы, которые могут усиливать гидрофобное взаимодействие с молекулой рецептора. Кроме того, есть данные (Kendal А.Р., Сох N.l.,1985), что замены на участке 188-193-й аминокислот тяжелой цепи молекулы НА существенно влияют на эпидемические потенции вируса гриппа.

Рис.8 Схематическое изображение трехмерной структуры НА вируса гриппа no Wilson J. и соавт.,(1981) А,В,С и Д - предположительное расположение соответствующих антигенных областей Wiley D.C. и соавт.,(1981); темными кружками с цифрами отмечены расположение и номер замещенных аминокислот у высокоиммуногенного (стрелка в скобках направлена вверх) и низкоиммуногенного (стрелка направлена вниз) вариантов вируса гриппа А/Виктория/35/72/50(НЗЫ2), Поно-маренко А.И. и соавт.,(1990).

Рис. 9 Расположение некоторых аминокислот молекулы НА вируса гриппа X-31(H3N2) в области рецепторсвязывающего кармана для сиаловой кислоты клеточного рецептора Wiley D.C. и соавт.(1987). Заштрихованы аминокислоты, замещенные у высокоиммуногенного варианта вируса гриппа А(Виктория)35/72/50(НЗМ2), Пономаренко А.И. и соавт.(1990).

В литературе описаны мутанты вируса гриппа сероподтипа A(H3N2), отличающиеся от исходного вируса только одной аминокислотной заменой в области рецепторного кармана молекулы НА {Underwood P.A., и со-авт.,1987). Среди описанных мутантов есть вирусы с 145, 158 и 193-й аминокислот. Эти вирусы имели измененные рецепторсвязывающие характеристики по сравнению с исходным вирусом. В частности, замена серин-193 на аргинин повышала сродство вируса к клеточному рецептору, а замена 145-й аминокислоты понижала сродство вируса к рецептору.

Вышеизложенные факты позволяют предполагать наличие прямой корреляции между гидрофобностью вируса гриппа, его иммуногенностью и рецепторсвязывающей активностью (чувствительностью к ингибиторам) его НА. Это согласуется с данными Скрипченко Г.С., Власовой А. Г., (1987); Скрипченко Г.С., Рыбаковой Т.М.,(1987) о зависимости между иммуногенностью вируса и прочности его связи на эритроцитах.

Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что вирусы с повышенной и пониженной иммуногенностью отличаются друг от друга по величине гидрофобности и в основе этих отличий лежат, по-видимому, аминокислотные замены в определенных локусах молекулы НА. Возможно, это позволит ввести в практику оценки вакцинных штаммов новую характеристику - гидрофобность вирионов.

4. ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА УНИВЕРСАЛЬНОЙ ФИЛЬТРАЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРИОННЫХ ВАКЦИН.

Разработка проблем, связанных с предочисткой вирионов методами коагуляции, фильтрации, микрофильтрации, а также их глубокой очисткой методами ЭЖХ позволили логично объединить эти операции для получения высокоочищенной вирусной суспензии. Получаемые при этом параметры очищенной вирусной суспензии соответствовали требованиям, предъявляемым к препарату "инактивированная гриппозная вакцина" по концентрации нирионои. содержанию овальбуминя и концнж раций общего белка (ТУ 42 КВС). Это послужило основанием для разработки оригинальной технологии получения ИГВ, получившей название "фильтрацион-но-хроматографической" (A.c. № 921254 СССР). К моменту разработки новой технологии получения ИГВ уже был налажен выпуск препарата "Гриппозная хроматографическая инактивированная гриппозная вакцина жидкая (ТУ 42.14-78). Препарат получали по "элюатно-хроматографической технологии". Развитие крупномасштабного производства вакцины по этой технологии сдерживал один из этапов - этап предварительной очистки и концентрирования вирионов методом адсорбции-элюции на куриных фор-мализированных эритроцитах. Это обстоятельство также затрудняло и создание высокопроизводительных средств получения ИГВ в крупных масштабах.

Разработанная технология получения ИГВ отвечает следующим требованиям:

1. Обеспеченность приборами и реактивами отечественного производства;

2. Высокий выход целевого продукта;

3. Минимальная длительность и непрерывность цикла наработки;

4. Возможность эффективной химической стерилизации всех коммуникаций;

5. Применение методов очистки, минимально воздействующих на вирион с учетом сохранения наиболее гидрофобного пула вирионов;

6. Простота обслуживания, экономическая эффективность предлагаемой технологии, возможность создания управляемого крупномасштабного производства.

Технология разработана НИИЭМ им.Пастера, ИБХ АН СССР им. М.М.Шемякина, НТО АН СССР. Основные этапы новой технологии:

1. Предварительная очистка ВАЖ через несорбирующие вирус фильтровальные материалы.

2. Концентрирование ВАЖ в 10-20 раз с помощью высокопроизводительных полисульфонамидных мембран.

*В современном варианте технологии коагуляцию применяют на этапе исходной ВАЖ, совмещая ее с префильтрацией.

3. Коагуляция примесных белков, включая удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации .

4. Отделение осадка коагулированных белков.

5. Эксклюзионная жидкостная хроматография. Преимущества новой, разработанной нами технологии:

1. Высокий выход целевого продукта, до 70-80% вместо 50-60% при существующей технологии.

2. Исключение стадии приготовления формалинизированных эритроцитов и забора куриной крови. Исключение возможности попадания эритро-цитарных белков в целевой продукт.

3. Исключение стадии очистки с помощью куриных эритроцитов.

4. Использование отечественных материалов и оборудования.

5. Сокращения цикла очистки до 1-2 суток вместо 14 при существующей технологии.

6. Возможность использования ВАЖ с низким титром в РГА.

7. Принципиальная возможность создания замкнутого технологического цикла с автоматизированным управлением процесса.

8. Возможность резкого уменьшения доли ручного труда.

9. Быстрый и эффективный метод стерилизации технических средств, фильтровальных и сорбционных материалов препаратом "первомур".

Ю.Оптимизация процесса ЭЖХ по основным параметрам.

На основании решения Ученого Совета НИИЭМ им.Пастера от 28.05.80 г. (протокол №10) инакгивированная гриппозная вакцина (фильтрационно-хроматографический метод получения) была испытана на 60 добровольцах. Вакцина была изготовлена из производственного штамма вируса А/ Техас/1/77 (НЗЫ2), серии 20,21,22. Контроль вакцин проведен согласно ТУ 42.14.149.78. Испытания показали высокую иммуногенность препарата (100%-ная сероконверсия при 8-256-кратном нарастании титра антител во второй сыворотке привитых по сравнению с первой). Вакцину вводили внугрикожно в объеме 0,2 мл.

Новая технология нашла отражение в производственном регламенте "Вакцина гриппозная хроматографическая инактивированная жидкая (филь-трационно-хроматографический вариант)", утверждена главным управлением по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР 29.10.1981 г. Регламент №210-81. С 1982 г. предприятие НИИЭМ им.Пастера приступило к выпуску ИГВ по фильтрационно-хроматографической технологии. За прошедшее время выпуск ИГВ составил по годам: 1982 г. -119 тыс.доз; 1983 г. - 2343,0 тыс.доз; 1984 г. - 2472,0 тыс.доз; 1985 г. -1234,0 тыс.доз; 1986 г. -1529,0 тыс.доз; 1987 г. - 1500,0 тыс.доз. Итого за 6 лет выпущено 9197 тыс.доз с экономическим эффектом от выпуска вакцины 490,0 тыс. руб.

Для реализации фильтрационно-хроматографической технологии в НТО АН СССР была раработана и изготовлена фильтрационно-хроматографи-ческая линия (ФХЛ-1). При создании линии учтены следующие требования: 38

1. Возможность модульного исполнения, что позволяет использовать линию для разных технологических вариантов получения ИГВ и других вакцин.

2. Замкнутость гидравлических коммуникаций, позволяющих изолировать вируссодержащую жидкость от контактов с окружающей средой, создает возможность химической стерилизации всех коммуникаций.

3. Возможность использовать сочетание методов фильтрации, микрофильтрации и ЭЖХ, взаимно дополняющих друг друга. Недостаток метода ЭЖХ - разбавление хроматографической пробы компенсируется пред-

ВЭрИТ9?!!:"0- |/пимаитпапиа14 ампирипи п^поиомм

4. Возможность использовать в ФХЛ комплектующие фильтрационные и сорбционные материалы отечественного производства, имеющие ТУ и сертификаты на токсикологическую безопасность.

5. Возможность быстрой химической стерилизации всех коммуникаций препаратом первомур.

6. Возможность обработки за рабочий день 150-200 л ВАЖ.

Рис.10. Общий вид фильтрационно-хроматографической линии ФХЛ-1.

Основные технические идеи, заложенные в конструкции ФХЛ-1, основаны на наиболее прогрессивной фильтрационно-хроматографической технологии получения ИГВ. Основные модули ФХЛ-1 были оптимизированы с учетом опыта практической реализации технологии в НИИЭМ им.Па-стера, НИИВС С.-Петербурга.

ФХЛ-1 состоит из 8 унифицированных передвижных стоек, на которых размещается исходная ВАЖ, блоки префильтрации и микрофильтрации, блоки коагуляции и очистки от коагулянта, препаративный хроматограф и блок инактивации. Контроль и управление всей линией осуществляется с

пульта, на котором имеется мнемосхема управления процессом.

На ФХ/1-1 и ее элементах были реализованы самые различные схемы очистки вирусных суспензий. Наибольший эффект был достигнут при получении вакцины по схеме: "префильтрация - микрофильтрация - ЭЖХ" с использованием в начале процесса или после этапа концентрирования метода коагуляции. Некоторые результаты испытания ФХЛ-1 при получении ИГВ в промышленных условиях приведены в таблице 4.

Таблица 4

Количественные показатели обработки ВАЖ по отдельным стадиям технологического процесса, НИИ вакцин и сывороток С.-Петербурга, 26.01.85 г., ФХЛ-1.

Параметры

Концен- Степень

о о трация очистки

О4 >

Стадии технологическ процесса б а. СО О. ь- S < Объем (л) общего белка (мг/мл) овальбумина (мкг/мл) CL О С =1 о X СО по белку (в%) по овальбуми! (в%)

Исходная ВАЖ 512 120,0 3,4 1250,0 - - -

Коагуляция и

префильтрация 512 130,0 1,5 590,0 100,0 52,0 50,0

Стерилизующая

фильтрация 512 130,0 1,75 630,0 100,0 0 0

Диафильтрация 12000 5,0 26,5 10000 100,0 32,0 35,0

Гель-фильтрация 4096 10,0 0,12 0,4 70,0 99,9 99,9

Уф-инактивация 4096 10,0 0,12 0,4 100,0 0 0

Стерилизующая

фильтрация 1750 7-° 1.7 0,1 32,0 0 99,9

Значительный интерес представляют материалы по использованию ФХЛ 1 для получения ИГВ в режиме высокоэффективной жидкостной хроматог рафии (ВЭЖХ), Работа выполнена в НИИ вакцин и сывороток С.-Петер бурга и имела следующие особенности:

1. За основу очистки ВАЖ была взята фильтрационно-хроматографи ческая технология, дополненная новыми элементами.

2. Новыми элементами в технологии являлись: введение дополнитель ной стадии очистки путем центрифугирования ВАЖ, очистка вирусной сус

пензии методом ВЭЖХ на сорбенте МПС-2000В-ГХ ПВП с размером зерна 40 мкм (0,04 мм).

Проведено 10 препаративных опытов с таким сырьем с объемом ВАЖ по отдельным сериям от 50 до 107 л, титр в РГА колебался в пределах 1:128 - 1:256. В результате очистки ВАЖ не удалось достичь вакцинных параметров либо по величине титра в РГА, либо по степени очистки.

Анализ процесса очистки по отдельным стадиям показал, что главным "виновником" является ВЭЖХ, которая не обеспечивает требуемых параметров очистки вирусной суспензии и выхода вируса по РГА. Так выход вируса по РГА после ВЭЖХ колебался в пределах 10,2 - 28,8%, т.е. не превышал 30%. В то жё* время ЭЖХ на сорбенте МПС-2000В-ГХ ПВП с размером зерна 0,1 - 0,315 мм на том же материале давала выход по целевому продукту 70% и более. Т.е. разработка препаративной ВЭЖХ вирусных суспензий еще ждет своего решения. В то же время ЭЖХ низкого давления в оптимизированном варианте, предложенном нами, вполне пригодна для решения задачи по препаративной очистке вирусной суспензии.

Результаты испытания элементов, узлов и всей ФХЛ-1, фильтрационно-хроматографической технологии на базе НИИЭМ им.Пастера, НПО "Восток" и НИИ вакцин и сывороток С.-Петербурга в течение 1982-1985 гг. показали:

1. Возможность очистки значительных объемов ВАЖ в минимальные сроки (в течение рабочего дня), префильтрация ВАЖ на стекловолоконных фильтрах КФБЖ на аппарате УФА без потерь вируса с очисткой от надмолекулярных образований в объемах до 300,0 л, стабильного концентрирования и диафильтрации на мембранах "УПМ" очищенной ВАЖ в тех же объемах до титра 1:16000 - 1:32000г стерилизующей фильтрации на фильтрах МФА исходной ВАЖ и гель-фильтрата.

2. Возможность осуществления наработки ИГВ и других вакцин (клещевого энцефалита) на элементах ФХЛ-1 фильтрационно-хроматографичес-ким методом, фильтрационно-седиментационным методом по регламенту №310-79.

3. Принципиальную возможность создания замкнутого технологического цикла производства вакцин с автоматизированным управлением и контролем процесса наработки.

По фильтрационно-седиментационной технологии в НИИ вакцин и сывороток с использованием фильтровального оборудования ФХЛ-1. стекловолоконных фильтров КФБЖ и ультрацентрифуг "К-2" было выпущено в 1984-1985 гг. около 45 млн. доз ИГВ.

Накопленный опыт эксплуатации ФХЛ-1, ее фильтрационных и хрома-тографических элементов показал, что фильтрационно-хроматографичес-кая технология вследствие универсальной возможности этих методов может стать основой для большинства промышленных технологий производ-

ства инактивированных и живых очищенных вирусных вакцин.

К настоящему времени она уже использована для очистки различных штаммов вируса гриппа, паротита, аденовирусов болезней птиц, вирусов болезни Ньюкастл, клещевого энцефалита, Сендай, кори, вируса Гамбо-ро.

В каждом конкретном случае требуется подбор подходящих мембран и сорбентов, режимов диафильтрации и хроматографии для получения очищенных вирусных суспензий с учетом свойств вирусов. Проведение каждой из стадий требует оптимизации на основе МТЭ. Плодотворность такого подхода показана на примере вируса гриппа.

В настоящее время в России выпускаются различные фильтровальные и сорбционные материалы для префильтрации и микрофильтрации, а также сорбционные материалы и оборудование для реализации фильтраци-онно-хроматографических методов очистки.

Важнейшим условием, однако, для подобной работы является положение о сохранении поверхностных структур вирионов и сохранение гидро-фобности пула вирусов, что следует из концепции "щадящей технологии" получения вирусных препаратов.

5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ОЧИСТКИ ВИРУСНЫХ СУСПЕНЗИЙ.

5.1. РАЗРАБОТКА ИММУНОПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА.

Кроме рекомендованного ВОЗ метода стандартизации ИГВ по весовому содержанию НА в ОРИД необходим метод оперативного контроля выхода целевого продукта-вируса. Кроме РГА, широко используемой для этих целей, нами предложен новый метод - иммунопотенциометрический.

Иммунопотенциометрический анализ (ИПА) состоит в возможности оперативной регистрации первичной стадии биоспецифических взаимодействий, происходящих на полупроницаемой мембране, в частности, электрохимическим измерением результатов этого взаимодействия. Приборы такого типа получили в зарубежной литературе название - "иммуносенсо-ры". Идея ИПА сравнительно проста. Антигены и антитела в водных растворах являются полиэлектролитами, несущими электрический заряд, величина и полярность которого определяются их изоэлектрической точкой и ионным составом среды. Вследствие этого, если один из участников иммунной реакции (антиген или антитела) связан с поверхностью мембраны, а другой находится в растворе в свободном состоянии, то при их взаимодействии происходит изменение заряда поверхности. Величина (или скорость) этого изменения зависят от концентрации исследуемого компонента. Если поместить такую мембрану между двумя электродами, то возникающая между ними разность потенциалов будет пропорциональна кон-

центрации образовавшегося иммунного комплекса.

При нашем методическом участии в НТО АН СССР был разработан им-

мунопотенциометр, состоящий из иммунофильтрационного датчика и регистрирующей аппаратуры (A.c. №1147153 СССР).

Чувствительность иммунофильтрационного датчика определяется совокупностью самых различных факторов:

1. Геометрией измерительной ячейки (отношение ее объема к площади мембраны)

2. Поверхностной плотностью иммобилизованных антител

каморе

4. Кинетикой образования иммунного комплекса.

В предлагаемом методе проведение анализа возможно в двух режимах статическом, осуществляемом вводом пробы при нормальном давлении и динамическом, производимом при повышенном давлении, приводящем к

Рис. 11 Сигнал на введение в ячейку гриппозной вакцины, титр в РГА1:2048,

штамм N¡6-4 (НЗЫ2)

Обозначения: на оси абцисс - время регистрации реакции "антиген-антитела"; по оси ординат - величина сигнала в мВ.

1 - разведение вакцины 1:1000

2 - разведение вакцины 1:1000000

Результаты по определению аналитических возможностей ИПА свидетельствуют о возможности его использования для контроля процессов получения гриппозных вакцин. Кроме того, возможности метода позволя-

ультрафильтрации растворителя через мембрану элетрода и локальному увеличению концентрации (концентрационной поляризации) исследуемого вещества вблизи поверхности мембраны. В первом случае лимитирующей стадией является, очевидно, диффузия антигена к поверхности мембраны, во втором -кинетика образования иммунокомплекса.

Ipena.nuK.

ют применять его при решении задач иммунодиагностики, химических ана лизов и связанных с ними проблем.

Для определения примесных компонентов ВАЖ в вакцине были исполь зованы методы диск-электрофореза, радиальной иммунодиффузии (ОРИД) радиальной иммунодиффузии со вторыми меченными I131 -антителами зонный электрофорез (ЗЭ). С помощью ЗЭ удалось определить примеси которые не определялись при диск-электрофорезе в ПААГ, рис. 12,13.

Таким образом, сегодня мы располагаем достаточно большим арсена лом средств для анализа высокоочищенных вирусных суспензий и вакцин

ИЧракцки

Рис.12. Электрофореграммы, полученные методом зонного электро фореза.

Обозначения А - электрофореграмма исходной ВАЖ;

Б - электрофореграмма ИГВ.

6. РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТИВНОГО МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА.

Выделение НА вируса гриппа преполагает решение трех последовательных технологических задач:

1. Получение высокоочищенной вирусной суспензии;

2. Дезинтеграция вирионов;

3.Выделения НА с сохранением его нативности.

Наиболее сложной представляется задача выделения НА с сохранением его нативности, поскольку выделение НА для аналитической цели (например, исследования аминокислотной последовательности) можес идчи с нарушением нативности молекулы НА.

Рис.13. Электрофореграммы различных образцов ИГВ.

Высокоочищенную вирусную суспензию получали фильтрационно-хро-матографической технологией. Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) проводили в искусственном рН-градиенте на основе борат-полиольных систем. Принцип метода разработан на кафедре биохимии Крымского медицинского института под руководством чл.-корр.АН Украины профессора Г.В.Троицкого и усовершенствован нами для выделения гидрофобных белков. В этой работе в разное время принимали участие сотрудники кафедры биохимии Крымского медицинского института Г.Ю.Ажицкий, В.Ф. Петренко, Г.В.Загорулько, Ю.Л.Криворутченко.

Аналитическое ИЭФ в борат-полиольной системе проводили в колонках конструкции Г.Ю.Ажицкого объемом 50,0 мл с водяным охлаждением. В аналитических экспериментах подбирали условия по фокусированию бел-

ков и ферментов, получению стабильных рН-градиентов. Для повышения надежности экспериментов опыты проводили параллельно на двух колонках.

Для получения поверхностных антигенов вируса гриппа НА и ЫА, вирусную суспензию дезинтегрировали неионным детергентом нонидет Р-40 в концентрации 1 %. Исходный буферный раствор: трис-борная кислота (0,1М по борной кислоте с рН=8,2). Готовили 8 проб градиента, к каждой из которых добавляли глицерин и №Р-40 до 0,1%. Готовили пробы с рН: 4,755,10-5,25-5,75-6,30-6,96-7,25-7,60. Пробу - вирусный дезинтеграт диали-зовали против пробы градиента с рН=5,75 и встраивали в градиент в соответствии с плотностью пробы и рН. ИЭФ проводили в течение 20-72 часов при градиенте потенциала 16 -70 В/см. Использовали препаративные колонки объемом 500,0 мл конструкции П.Д.Решетова с внутренним и наружным охлаждением. После завершения ИЭФ содержимое колонки извлекали с помощью перистальтического насоса сверху, фракциями по 5070 мл. Регистрацию электрофореграмм проводили на высокочувствительном проточном денситометре при ¿.=280 нм. В каждой фракции определяли величину рН, гемагглютинирующую активность, концентрацию оваль-бумина и неовальбуминовых компонентов, общий белок.

6.1.Препаративное выделение НА вируса гриппа с антигенной

формулой Н1, НЗ и штамма В/Ленинград/14/76.

Материалы по фокусированию НА вируса гриппа В/Ленинград/14/76 приведены в таблице 10 и рис.15, на котором показана воспроизводимость трех последовательных опытов. НА штамма В/Ленинград/14/76 для данной буферной системы имел р1 6,06±0,1. Анализ на содержание примесных компонентов показал, что очистка НА составила: по общему белку в 1,52-3,58 раз (отношение величин удельной активности исходного де-зинтеграта и очищенной фракции НА); по овальбумину - 1-10,0 раз; по неовальбуминовым компонентам - в 8-2560 раз. Максимальная гемагглю-тинирующая активность находилась в одной-двух фракциях. Выход НА по гемагглютинирующей активности составил в этих опытах 8,7-50% (23,36±9,25); по белку - 4,5 -14% (9,35±2,13) или в абсолютных величинах 5,6-18 мг (11,0212,77). Это значительно меньше, чем содержание НА в вирионах. По данным литературы содержание НА в вирионах составляет примерно 25-30% от всех белков вириона.

Положение ЫА в этих опытах было обнаружено в более щелочных зонах рН-градиента, в области рН=7,92-8,35. Наличие нейраминидазной активности в области рН=6,35-6,7 (опыт В-1) может быть связано с недостаточным временем для фокусирования М - 45 часов, в остальных опытах время ИЭФ составляло 68-72 часа и нейраминидаза обнаруживалась в более щелочной области, как указано выше.

J» фракция Объем, мл Титр В РГА pH Концентрация Активы. НА (Е595Н^ Удельная активность'"* Колич-во ГАЕ*** Выход в ГАЕ (в Ж)

Белка (МКГ/МЛ) Овальбумина (мкг/мл) КОК* В РИГА По общему белку По оваль-бумину Па НОК

Исходт Л Д93ИНТЕ грант

40,0 116000 6,65 2500,0 10,0 1:40960 0,07 6,4 1600,0 0»::i9 640000 100,0

1 ! Анализируемые фракции

I 70,0 - 8,20 42,5 - 1:64 0,04 - - - - -

2 50,0 - 8,20 30,0 - 1:4 0,05 - - - - -

3 15,0 16 6,15 27,5 - 1:4 0,04 0,58 - 1,0 240 0,04

4 40,0 32 7,92 42.5 - 1:4 0.04 0,75 - 3,0 1280 0,2

5 ; 17,0 64 7,49 50,0 - 1:8 - 1,28 - ¡3,0 I08S 0,17

в 25,0 8 6,90 30,0 - 1:512 - 0,27 - 0.02 100 0,02

7 25,0 32 6,70 20,0 - 1:2 0,06 1,60 - If> 0 800 0,12

в 50,0 йгв 6,35 32,5 - 1:16 0,05 3,94 - 3.0 6400 1.0

9 50,0 2048} 5,95 130,0 0,62 1:80 - 15,75 3303,20 35.6 102400 16,0

10 50,0 512 5,30 62,5 2,5 1:640 - 8.19 204,80 а.a 25600 4,0

II 55,0 64 5,30 113*0 2,5 1:1280 - 0,57 25,60 0,05 3520 0,55

12 55.0 32 5,20 100,0 2,5 1:1280 - 0,32 12,80 0.02 1760 0,28

13 60,0 128 5,00 108,0 3,0 1:1280 - 1,18 42,66 0,1.0 7680 1,20

(проба

с "пробки) Выход РГА по балку - 6,5 мт(6,5%; Итого: 150868 23,8'

Примечание -*НОК - неовал ьбуминовые компоненты; **- удельная активность - отношение величины 1/Т'итр в РГА к концентрации белка (овальбумина, НОК) в пробе; - подчеркнуто значение максимальной гемаг глютинирующей активности во фракциях рН градиента; *** - произведения 1/Титр в РГА на объем пробы (в мл); Условия ИЭФ (=45часое;и=800 В;1=92 А; Дезинп грлты - 1 % нонидет Р40

Материалы по фокусированию НА вируса гриппа А/Киев/59/79(Н1Ы1 Для НА этого штамма р! составила 6,04±0,08. Максимальная гемагглют* нирующая активность находилась в одной фракции. Выход НА по тема! гпютинирующей активности составил в этих опытах 35-60% 50,0-7,58; п белку в абсолютных величинах 4,4-16,45 мг (11,15±3,65 мг). Активность N обнаруживалась также в более щелочной зоне рН 7,8-8,09.

А 6

Рис.14 Воспроизводимость результатов препаративных опытов по выд лению НА из штаммов В/Ленинтрад/14/76 (Б) и А/Киев/59/79/Р (Ы1Н1) (,

Обозначения : 1 - градиент рН(-);

2 - поглощения при Х.=280 нм;

3 - титр в РГА (.....)

Использование для дезинтеграции катионного детергента ЦТАБ с ц лью последующего выделения НА к успеху не привело. Выход НА был край! низким и составил 1,9%, а вся гемагглютинирующая активность была о> наружена в верхнем электродном буферном растворе. Причиной тако результата, по нашему мнению, является взаимодействие ЦТАБ с НА сдвиг его р! в более щелочную сторону. Это привело к миграции НА катодный буферный раствор с рН 8,2. Методом рефокусирования контр лировали правильность определения р1.

Для штамма А/Ленинград/385/80Р(НЗИ2) для используемой буферж системы р1 НА составила 6,85±0,35, т.е. он имел более щелочную изото

ку, чем НА из штамма В/Ленин град/14/76 и А/Киев/59/79/(Н1Ы1). Максимальная гемагглютинирующая активность фокусировалась в одной фракции. Выход НА по гемагглютинирующей активности составил в этих опытах 8,4+16,6 (12,5±4,1); по белку 8,7-17,8 (13,25±4,55) или в абсолютных величинах 1,4-0,4 мг (0,9+0,5). Активность ЫА обнаружена в зоне рН 7,8-8,2.

Выделенные препараты анализиро-

ВЯПИ НЯ ГПДйрЖЯМИР ппмиргмкгкгпипп.

нентов аллантоисной жидкости, которые идентифицировали с помощью ОРИД. Использовали баранью гипериммунную сыворотку против пула белков аллантоисной жидкости. При чувствительности ОРИД на уровне 1,0 мкг/мл аллантоисные белки в препарате не определялись. Анализ образцов НА, выделенных методом ИЭФ, с использованием диск-электрофореза в ПААГ приведен на рис.15.

Рис.15 Анализ образца НА, выделенного методом ИЭФ.

Обозначения 1 - реперные белки с различной молекулярной массой;

2 - образец НА, НА1 - тяжелая цепь; НА2 - легкая цепь.

Идентификацию НА осуществляли также в ОРИД с помощью референс-сыворотки к НА вируса гриппа из штамма А/Викгория/3 /75(НЗЫ2-Э) из Национального института биологических стандартов и контроля в Лондоне. Выявлено наличие НА во всех образцах препарата, полученных из штамма с антигенной формулой (НЗЫ2-Э). Реакция НА из штамма с антигенной формулой Н1Ы1) и В/Гонконг) была отрицательной, что говорит о специфичности сыворотки по отношению к НА.

Доказательством нативности и чистоты выделенных НА является не только их активность с моноспецифическими сыворотками в ОРИД, но и возможность использования их как антигенов для получения моноспецифических сывороток. На выделенные препараты были получены моноспецифические кроличьи и козьи сыворотки. Сыворотки оказались достаточно активными и специфическими и могли быть использованы для иммуно-диффузионных реакций.

Изучение возможности выделения НА различных штаммов вируса гриппа методом ИЭФ в борат-полиольных системах позволяет считать этот метод перспективным для выделения НА. Весьма привлекательной стороной метода является возможность одномоментно с ГА получать и ЫА

г П

4 ,Л

ЗОЫ ;, .

- -

О / ЙМ / ЯМ*'

зокс!-*

■1

I I » г

ч* ан1

(рис.16). Обычно в практике препаративной и аналитической работы для разделения этих белков используют еще дополнительный метод или каскад методов.

ОД

тз—

I Дкгтл

К7ГИ<М*

■иммппя

гИш'мня

НУГЯЛЫХ

З.РоПП« 4.$Ы(АЛИММ 5. Нг^ЯЛТМ

^ЛЯГ*" /кмгхи^м/ I А Л

4. К«Н|{КТГИГа»*1Щ |Я Г V < В « Й < усе я ) * н

ИАГОС

Г-0-»

г Э«Мв>М»1АЛ ХГ«НАТ|ГГАТМ> кикгктщРМАНявА |им<я*и

< V ( П V Я И/ДММСТЯА*V

«лицеями »ягчяоД

>Азиитг*|ЯЯ МГ7<И*& схасяиц Я л 4МАЛ Я )

НЯ-

40. >*<М»

-^НА+ЫА -

ид/мл акт «ия/

41. УлНМ^ЯЛИ'Л | ЯЛ

"О ■: -^Нй,

ЁЗ

tt.iAtl.Tr»- (У^ЯтиЦМ«* Н Ст(Г.ДИ)А,

"ТО

ре м ■ i

<Н«вГ0Г9А.

»< t

* **

».ЛяНплнлл <Г*Я А

мпягмм.

Рис.16 Схема выделения гемагглютинина вируса гриппа и получения ан-

тигемагглютининовых сывороток.

Различный выход препаратов НА связан, по нашему мнению, с различием в их гидрофобности, способности к агрегации в изоточке. Наиболее гидрофобные образцы НА, т.е. наиболее склонные к агрегации будут давать и самый малый выход (в наших опытах это НА из штамма А/Ленинг-рад/385/80Р(НЗЫ2), выход которого составил 13,25±4,55%). Выход НА из штамма Д/Киев/59/79(НМ1), менее гидрофобного, составил 50±7,58%.

Уникальной возможностью повысить выход НА в опытах по ИЭФ является проведение этого метода в условиях микрогравитации, т.е. космического полета.

Выделение гемагглютинина вируса гриппа элетрофоретичес-кими методами в условиях микрогравитации. Из выполненных к настоящему времени экспериментов по электрофорезу в невесомости в СССР с 1982 г. основным объектом исследования был НА вируса гриппа.

Этот выбор связан с большим научным и практическим интересом к одному из поверхностных гликопротеидов вируса гриппа, его ролью в индукции противогриппозных антител, играющих защитную роль при возникновении вирусной инфекции в организме человека. Решение проблемы выделения высокоочищенного НА вируса гриппа важно с точки зрения изучения его структуры, возможностью кристаллизации, открывает возможность для выделения других гидрофобных и мембранных белков, выделение которых до настоящего времени является сложной биологической задачей. 5Р

С точки зрения практического использования НА важным моментом является возможность его использования для получения моноспецифических сывороток, которые могут быть использованы для стандартизации гриппозных вакцин в ОРИД, а также как исходный материал для конструирования диагностических препаратов на его основе радиоиммунологического, иммуноферментного, иммунофлюоресцентного и других методов.

Препараты НА вируса гриппа впервые были выделены с использованием метода ИЭФ на установке "Таврия" А.Александровым в 1983 г. на орбитальном комплексе'"Салют-Союз". В 1984 году во время работы экспедиции псссщс»ип борту орбитальной стапщп: "Сап:ат-7я-"Сал:от Т-11"-"Ссюз Т-12" С.Сазицкой на модернизированной установке Таврия". И о 1985 г. на борту орбитального комплекса "Салют-7" - "Союз Т-13" - "Союз Т-14" на установке "ЭФУ-Робот" В.Васютиным.

6.2. Результаты работы по выделению гемагглютинина Н1 и НЗ на установке "Таврия" методом ИЭФ.

В 1983 г. во время полета В.Ляхова и А.Александрова впервые в мире в условиях микрогравитации на установке Таврия" были очищены методом ИЭФ препараты НА вируса гриппа из двух штаммов - Х/Ленинград/54/ R(H1N1) и А/Ленинград/385/eOR (H3N2).

Источником для выделения НА служили дезинтеграты вирионов гриппа. Вирусную суспензию очищали фильтрационно-хроматографическим методом, инактивацию осуществляли УФ-облучением в проточном устройстве. Дезинтеграцию вируса проводили нонидетом Р-40 в течение 1 часа при 20-22°С. Перед процессом ИЭФ дезинтеграт окрашивали бром-феноловым синим, обогащенную фракцию использовали для очистки в условиях микрогравитации.

Работа была проведена в ходе двух сеансов 25 октября 1983 г. и 6 ноября 1983 г. Ввод препаратов проводился вручную в центральной области рабочих камер. На колонках №1 и 13 в трех зонах по оси камеры были установлены жидкокристаллические датчики для регистрации тепловых полей и контроля температурных режимов по методике, разработанной С.Е.Савицкой. После окончания работ укладка с 8 шприцами, содержащими выделенные фракции НА, была возвращена на Землю для биохимических и иммунохимических анализов.

Отмечено повышение гемагглютинирующей активности препаратов НА после ИЭФ в условиях микрогравитации. Методом диск-электрофореза в ПААГ показано наличие тяжелой (НА1 ) и легкой цепей (НА2), что указывает на достоверность белка. Примеси иных белков отсутствовали._

Выражаю глубокую благодарность летчикам-космонавтам СССР А.П. Александрову, С.Е. Савицкой, В.А. Джанибекову, A.A. Сереброву, В.В. Васютину, а также О.В. Митичкину, А.Н. Лепскому за помощь в выделении ГА вируса гриппа в условиях микрогравитации.

Для исследования антигенности и качества полученных препаратов Н/ изучали возможность получения антисывороток на их основе. Коз имму низировали препаратами НА с полным адьювантом Фрейнда. Общее ко личество антигена, пошедшего на иммунизацию составило для штаммо Х/Ленинград/Я54(Н 1N1) и А/Ленинград/385/80Я(НЗ№) соответственн около 10 и 30 мкг. Контроль сывороток проводили в РТГА и ОРИД. Исполь зовали стандартные антигены из ГИСК им.Тарасевича, любезно предос тавленные Н.И.Лонской. Для определения антигенности препаратов Н, использовали также сыворотки ГИСК им. ЛАТарасевича.

Обобщенные данные по определению весового содержания НА в пре паратах до и после очистки в условиях микрогравитации с использована ем антисывороток ГИСК им.Л.А.Тарасевича и антисывороток, получении нами на "космические" препараты приведены в таблице 6. Из этих данны следует, что процесс ИЭФ приводил к увеличению концентрации НА > Ленинград/54П(Н1 N1). Снижение концентрации НА А/Ленинград/385/eOF (H3N2) при ИЭФ может быть связано с агрегацией этого белка вблизи ег изоэлектрической точки и адсорбцией на стенках электрофоретическо установки 'Таврия".

Выход НА Х/Ленинград/й54(Н1 N1): в колонку вводили 4 мл препарата концентрацией 77,5 мкг/мл, получили 2,7 мл препарата с концентрацие НА 112,8 мкг/мл. Выход составил - 97,50%.

Выход НА А/Ленинград/385/80Я(НЗМ2): в колонку вводили 4 мл препг рата с концентрацией НА 97,1 мкг/мл, получили 2,7 мл препарата с koj центрацией НА 28,4 мкг/мл. Выход составил 19,5%.

Более низкий выход НА (H3N2) по сравнению с (H1N1) связан, по наш< му мнению, с большей гидрофобностью этого гликопротеида, его arpen цией вблизи pl и адсорбцией на границе раздела фаз "жидкость - твердс тело".

Специфическую активность сывороток проверяли в РТГА с гомологи1 ными и гетерологичными антигенами. Сыворотки к антигену X/ЛeнингpaJ 54(H1N1) имели титр в РТГА к гомологичному антигену 1:2560 и 1:1280 титр 1:320 к гетерологичному антигену-вирусу А/Ленинград/385/80Р( H3N2 Сыворотки к антигену А/Ленинград/385/eOR имели титр к гомологичнок антигену 1:5120 и 1:2560 соответственно и 1:320 к гетерологичному атт гену-вирусу А/Киев/59/79(Н1М). Установлено, что полученные нами ct воротки не содержали антител к овальбумину и белкам аллантоисной жи; кости, что подтверждает высокий уровень очистки НА.

Сыворотки "работали" в ОРИД в разведении 1:10-1:50, наиболее четк! результаты были отмечены при разведении сывороток 1:30, что и бьи выбрано нами за рабочее разведение.

Таблица 6

Параметры очистки и выхода препаратов гемагглютинина

Анализируемые параметры До очистки После очистки Краткость очистки Выход препарата (в%)

Гемагглютинин Х/Ленинград/П54(Н1Н1)

Титр в РГА 1:64 1:512

Концентрация овальбумина, •«г/мп 0,) 2я п-7 ГА

Величина удельной активности 0,82 4,57 5,57

Концентрация гемагглютинина, мкг/мл Содержание овальбумина на 1 мкг гемаг глютинина 77,50 0,0016 112,8±6,78 0,00034 4,70

Гемагглютинин А/Ленинград/385/80В{НЗМ2)

Титр в РГА 1:128 1:1024

Концентрация овальбумина, мкг/мл 0,50 0,038±0,012 19,50

Величина удельной активности 1,32 36,57 27,7

Концентрация гемагглютинина, мкг/мл 97,10 28,40

Содержание овальбумина на 1 мкг гемаг глютинина 0,005 0,001 5,0

Примечание: величина удельной активности - отношение величины обратного титра в реакции гемагглютинации к концентрации НА. Этот параметр характеризует препарат по величине гемагглютинирующей активности на 1 мкг гемагглютинина.

Следует отметить, что активность ОРИД полученных нами сывороток превосходила активность сывороток, представленных нам английскими специалистами для аналогичных целей (сыворотки из национального института биологических стандартов и контроля в Лондоне* ). Рабочее разведение этих сывороток составило 1:10. Поскольку схемы получения сы-

*Сьторотка представлена профессором Дж.Шилдом (Лондон)

вороток были одинаковы, причина может быть связана с качеством антигена. Английские специалисты использовали НА, полученный путем бро-мелиновой обработки, что отщепляет от НА гидрофобный фрагмент, инкорпорированный в мембрану вириона. Сыворотки были лиофилизирова-ны на предприятии НИИЭМ им.Пастера, при этом падения их активности отмечено не было.

Лиофилизированные сыворотки были использованы для решения некоторых прикладных задач по стандартизации ИГВ в НИИЭМ им.Пастера, при контроле технологического процесса получения ИГВ в НИИ вакцин и сывороток (Санкт-Петербург), при контроле процесса препаративного выделения НА вируса гриппа, а также при разработке субъединичной гриппозной вакцины для детей в НИИ вакцин и сывороток Санкт-Петербурга.

6.3. Выделение гемагглютинина вируса гриппа на установке "ЭФУ-Робот".

Исследование на установке "ЭФУ-Робот" явились развитием исследований по получению высокоочищенных препаратов НА вируса гриппа в условиях микрогравитации. В отличие от предыдущих исследований применяли новые варианты электрофореза - зональное изоэлектрофокусиро-вание (ЗИЭФ) и ступенчатый электрофорез с изоэлекгрической точкой в борат-полиольных системах; новый вариант электрофоретического аппарата - автоматизированная установка "ЭФУ-Робот", позволяющая автоматически, без участия оператора проводить ввод и отбор проб из электро-форетической камеры, использован новый детергент 0-14 ("дезинтегрон-0") отечественного производства для количественного анализа НА в ОРИД (A.c. СССР №1387408).

Зональное изоэлектрофокусирование является новой модификацией ИЭФ с использованием 3-х ступенчатого рН-градиента борат-полиольной системы. Ступенчатый электрофорез с изоэлекгрической точкой проводится в той же системе, что и при ЗИЭФ, но при обратной полярности на электродах.

Конкретными задачами в экспериментах по очистке НА являлись

1. Получение двух опытных партий "на двух колонках" суперочищенного препарата НА вируса гриппа НЗ для последующего лабораторного исследования и оценки возможности его практического использования.

2. Отработка новых методов очистки белков на основе электрофореза.

3. Отработка и испытание автоматических средств расконсервации и формирования буферной системы. Исследования влияния режимов этих операций на выход целевого продукта.

На анализ после возвращения на Землю было представлено содержимое двух колонок, 7 фракций. Из анализа результатов проб следует, что во всех исследованных образцах (кроме пробы 5) было обнаружено снижение содержания овальбумина. В пробах 4,6,7 выявить овальбумин не

удалось (при чувствительности диагностикума по овапьбумину 0,015 мкг/ мл). Если предположить, что концентрация овальбумина в этих пробах составляет 0,007 мкг/мл (в действительности она может быть и ниже), то кратность очистки по овапьбумину в исследованных пробах будет колебаться в пределах 5,2-149,0 раз. Достигнутые параметры очистки НА для проб 4,6,7 в натурных условиях получены впервые. Выход целевого продукта для колонки 1 составил 10,85%, для колонки 2 - 12,0%.

Имеющиеся материалы подтверждают полученные ранее результаты высокой степеу! очистки препаратов в условиях микрогравитации. Пока-

каций электрофореза и 11ЗФ в борат-полиольньк системах для очистки белков в вариантах зонального изоэлектрофокусирования и ступенчатого электрофореза с изоэлектрической точкой.

Новым фактом является преимущество нового отечественного детергента 0-14 перед зарубежным N1-97, используемым при постановке ОРИД с целью определения весового содержания НА (не дает артефактов).

Итоги этих исследований говорят о перспективности использования новой автоматизированной системы "ЭФУ-Робот" и новых вариантов разделения белков.

7. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОЙ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ (ОЖГВ) ДЛЯ ИНТРАНАЗАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ.

7.1. Основные положения концепции "щадящей технологии" получения вакцины.

За последние 20 лет наиболее быстрыми темпами шли работы по созданию и усовершенствованию инактивированных гриппозных вакцин. В России возникла за это время новая отрасль биотехнологии - производство высокоочищенных гриппозных вакцин. Однако сегодня нельзя говорить о серьезном контроле над этой инфекцией, хотя и разработаны конкретные планы борьбы с ней (Труды НИИ гриппа РАМН, 1970-1993 г.г.).

Технологические достижения были беспристрастно проэкзаменованы эпидемиологическими наблюдениями, которые еще раз убедительно показали, что проблема гриппа - это проблема прежде всего биологическая, которая нами еще плохо изучена.

Живая гриппозная вакцина (ЖГВ) имеет ряд существенных преимуществ перед инактивированным препаратом, заключающихся в более активной стимуляции местного секреторного и клеточно-опосредованного иммунитета, более выраженной иммунологической памяти. Применение ЖГВ наиболее перспективно для ограничения самой массовой инфекции, о чем свидетельствуют выводы симпозиумов и конгрессов последних лет, посвященных этой проблеме (Кейстоун, США, 1985; Коршевиль, Франция,

1992; Санкт-Петербург, 1992).

Однако до сих пор препараты ЖГВ выпускаются по технологии 30-х годов (исключая метод получения штаммов), что не позволяет в полной мере раскрыть их преимущество перед инактивированными вакцинами. Именно здесь должен быть реализован принцип "биология дает заказ технологии", а не наоборот.

В чем необходимо совершенствовать технологию получения ЖГВ?

1. Очистка препарата от примесных белков при сохранении достаточно высокого уровня инфекционной активности вируса в дозе. Это связано с необходимостью исключения аллергизации белками аллёнтоисной жидкости, а также ассоциации вируса с примесными белками хозяина. Последняя может протекать путем неспецифического взаимодействия "белок-белок" либо специфического взаимодействия гемагглютинина вируса гриппа с ингибиторами инфекционной активности аллантоисной жидкости. Предотвращение этой ассоциации (или ее уменьшение) должно привести к более эффективному взаимодействию вируса с клетками эпителия слизистой верхних дыхательных путей, повысить приживляемость вируса.

2. При выборе технологии очистки необходимо главное - не денатурировать рецепторный аппарат вируса и элементов его репликативной системы, что значительно ограничивает перечень возможных физико-химических методов очистки. К наиболее перспективным нами отнесены фильтрация, микрофильтрация, эксклюзионная жидкостная хроматография, распределительная хроматография в двухфазных системах водорастворимых полимеров, электрофорез.

Очистка необходима для удаления из исходных вирусных суспензий примесных компонентов, которые могут влиять на инфекционную активность вирионов, понижая ее в процессе хранения очищенных препаратов - различных протеиназ, липаз, гликозидаз, РНК-аз. Наиболее опасны с этой точки зрения последние из-за их чрезвычайно высокой активности.

4. При реализации любой технологии очистки необходимо учитывать неоднородность вирусной популяции по различным критериям, главны*/ из которых является гидрофобность, так это свойство вирусов определяет основное качество вакцин - иммуногенность.

5. Очистка вирионов должна предусматривать сохранение и невирион-ных структур (ранних вирусных белков), вклад которых в иммуногенносп препарата может быть весьма существенным, как, например, в случае флавивирусов. Ни одна из современных технологий получения инакгиви-рованных вакцин не учитывает этого обстоятельства.

6. Для исключения контаминации ЖГВ предлагается использовать эмбрионы линий кур, устойчивых к вирусу птичьего лейкоза.

7. Технология применения препарата (его аппликация) в случае живы) вакцин должна воспроизводить путь попадания уличного вируса в организм человека и учитывать особенности микроокружения вируса.

Таковы общие черты концепции "щадящей технологии" получения вакцины, которые необходимо учитывать при конструировании современной живой гриппозной (и иных) вакцин. Наиболее существенной чертой этой концепции является представление зависимости между гидрофобностью вирусов и их иммуногенностью.

Это позволяет по-новому взглянуть как на саму технологию получения вирусных вакцин, так и на процесс взаимоотношений в системе "хозяин-паразит" с учетом выдвинутого акад. Беляковым В.Д. положения о саморегуляции эпидемического процесса (В.Д.Беляков и соавт., 1987). В этой сйяэи няи^опыпий шансы на пеосистенцию в человеческой популяции ■имеют наименее гидрофобные клоны вирусов/обладающие меньшей иммуногенностью по сравнению с более гидрофобными клонами.

7.2. Основные элементы получения ОЖГВ для интраназального применения.

Для получения ОЖГВ нами были использованы все разработки и технологические алгоритмы, которые оправдали себя при получении ИГВ филь-трационно-хроматографическим методом (1982).

В результате проведенной работы создана технология получения ОЖГВ для лиц с 15 лет и старше. Технология позволяет удалить от 80 до 99% белка аллантоисной жидкости при высоком уровне сохранения инфекционной активности вируса.

Впервые проведено нормирование содержания общего белка и оваль-бумина в препарате ЖГВ. Концентрация белка аллантоисной жидкости в прививочной дозе вакцины не превышает 10 мкг, овальбумина - 5 мкг при уровне биологической активности вируса не менее 106'25ЭИД5(у0.1 мл-Изучена возможность очистки вируса гриппа типа А1, А2 и В методами микрофильтрации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Полученные результаты подтвердили возможность очистки вируса с высоким технологически выходом независимо от штамма (таблицы 7,8, рис. 18,19 ).

Предложены протекторы для стабилизации очищенной ЖГВ на основе гидролизатов эритроцитарных белков крупного рогатого скота. В силу их доступности, стандартности они могут быть использованы в крупномасштабном производстве ОЖГВ, обладая существенным преимуществом перед пептоном, табл.9,10.

Установлена зависимость содержания белка и овальбумина в ВАЖ от рациона питания кур. Введение в рацион добавок типа БВК (паприна) приводило к резкому увеличению количества белка и овальбумина в ВАЖ, что влияло на эффективность очистки вируса и приводило к попаданию паприна в вакцину. Учитывая аллергизирующее действие паприна на организм человека, необходимо исключить эти кормовые добавки из рациона питания кур-несушек.

о—"О*

1. Двстлтл

Хугины* умегионо!

ПЧ КГ А* ПНЯ

2. Иноитлзи**

КТГИИЫ*

эпктионо*

3-Зскгтис

4. ГА Я И*

ВАЖ.

6. К(я11н1гигамия

5. ^йА+*л»тга«и л 6. К(Я11нтготм1М£ 7.А)вМ1Н111 е. Стсгклимгттмя _ Та ж (игусиой »пггсного чкншш гдлшпирго

стслеяжя МКЩКТГАТА МГТСКСГО ЦвщТяТГАТА

г—т

4Ш-

,АТГГ

I. ЛиО+ЯЯШЛЯ Я.ЗДМЙМ 13. С**АГА.

* »* кпииц *' с г'я к'а "".....ампул' " «гш агата . ткмкл

i лпгпли п гей агата иагкигожа

Рис.17 Схема получения ОЖГВ микрофильтрационным методом.

Хроматографический анализ фракции сахарозного градиента после ультрацентрифугирования

2Г Ь Л гЬ "3 1о~1с "3—Гь~1с

10 ¿0 Рис.18, А

Условия анализа

- колонка стальная 8x300 мм

- сорбент МПС 2000В-ГХ, размер частиц 100 мкм

- объем пробы 115 мкл

- элюция ФБР + 0.15М N801, рН=7,2

- детектор СФД-3

и К < г<»

Обозначения А - фракция с содержанием сахарозы 35%

КРИС.18А Б- 38%

В - -"- 41%

Г - 43%

Д - 45,5%

Е - -"- 48,5%

Ж - 50,5%

Хроматографический анализ т5руесодержащпх жидкостей -промежуточных продуктов при получении живой очищенной гриппозной вакцины по ультрафильтрационной технологии

»»ад

n^liil I г

ULa/XJJ

ft-a--пг-й- ь to bt iü к

KHK

Pitc.18, 5

Условия анализа

- колонка стальная 8x300 мм

- сорбент МПС 2000 В-ГХ, размер частиц 100 мкм

- объем пробы 115 мкл

- элюция ФБР+0.15М NaCI, рН=7,2

- детектор СФД-3

Обозначения А - исходная ВАЖ

Б - осветленная ВАЖ В - диафильтрованная ВАЖ Г - концентрат

Д - концентрат диафильтрованный

* Материалы с использованием ВЭЖХ получены при участии В.Н. Чече-вичкина

Таблица 7

Очистка инфекционного вируса гриппа методом микрофильтрации на различных фильтровальных материалах

Тип мембран Величина пор, нм Число опытов Концентрирование Диафильтрация

Штамм очистка по белку, % сохранение ви- Р?АВ изменение IÍAlg3HHgQ в 0,2 мл очистка по белку, * сохранение вирусе по РТА, % изменение НА 16 ЭВД50 в 0,2 мл

А/47Ф (H3N2) МФА-МА Ж Биопор Т УПМ 4/85 80-100 30 22 2 5 3 75,0 88,5-93,0 81,5-90.3 16-50 26-53 п-юо (-0,5)- 94 -(+0,75) (0)-(+0,35)95-98 (0)-(+0,75)97,7--99,7 16-40 130-160 30-100 (0)-(-0,65) (0)-(+0,8) (0)-(+0,75)

А/Н/32/ /б(Ш) УПМ 4/85 22 2 86,5 57-100 (0)4+0,4) 95,0-96,5 42-100 (+0,25)-"(+1.0)

А/17/42/ УПМ 4/85 /3(H3N2) 22 2 28,0-59,0 100 +0,76 70,0-72,4 120-170 (+1.0)--(+1,5)

А/Техас/ УПМ 3/85 /1/77 (H3N2) 23-30 3 43,0-50,0 62-67 (0)-(+0,2) 60-80 62-95 (+0,4)-: -(+0,5)

А/47Ф (H3N2) Биопор Т УПМ 3/85 ядерные фильтры 30 23-30 3 3 71,8-77,7 58,0-76,7 39-71 50-100 58,5-86 2 (0)-(+I,0) 49.Ó--70,0 (0)-(+0,25) 92,3-97,75 100,0 39-71 30-100 (0)-(+1,0) (0)-(+1.0) (+СГ.5)--(+1,25)

А/НШ/3/ /86/17 (HINI) Биопор АМ 100 18 ; 85,2-99,9 40-139 (0)-(+1,98)

Таблица 8

Сохранение биологической активности инфекционного вируса гриппа при очистке и концентрировании

в градиенте плотности сахарозы

Штамм Исходная ВАМ Очишенкый вирусный концентрат ' ¡чистка П ) белку в % Изменение ^эи^о/о. ИА 2мл

объем мл ГА НА о,2киг° белок МКГ/ /мл ОА мкг гаг X сахарозы ооъ-ем, ил ГА ИА 1вэвд&0 в 0,2мл оелох мкг/мл ОА МКГ/МЛ руса по РГА, В %

1 г 3 4 5 6 7 8 9 10 и 12 13 14 ~ 15

500.0 256 8,5 0,54 510,0 40.5 42.5 5,6 4.в 4096 4096 Ю.25 10.0 0,174 20.0 ээ.з 93,3 + 1.75 +1,5

В/60/32 450,0 512 8,9 0,87 500,0 40,0 ю.о 1боэо 9.7 0.304 16,0 69,0 99,2 +0,8

450.0 256 9,0 0,48 62,5 38-43 10.0 10000 9.0 0.32 1,25 100,0 98,78 0

450,0 128 9,1 0,73 и.о. 41.5 44,5 10,0 3,8 4096 2048 9,3 9,75 0,94 Н.о 71,0 97,14 +0,2 +0,65

450.0 512 а.4 0.7Э 500,0 41,0 45,5 20,0 10000 9.8 Ю.О 0,94 20,0 10,0 100,0 94,28 + 1 .4 +1 ,6

А/47Т (Н1Ы1) 450.0 256 8,25 0,80 500,0 41,0 46,5 1д*2 10000 8,25 10,5 1.49 20,0 20,0 100,0 91,80 0 +2,25

450.0 256 9,5 0,80 500,0 41,6 43,5 9,0 10000 4,2 5000 10,0 10,5 0,587 10,0 10,0 26,0 97,49 +0,5 .'• +1,0

450,0 1024 8.5 Н.О. 1000,0 41,0 44,0 10000 9,5 10,5 Н.О. 40,0 20,0 25,0 н.о. + 1 ,0 +2,0

1100,0 256 И.О. 2,24 2000,0 41-44 30.0 6400 6400 и.о. 0,84 80,0 40,0 96,6 99,2 н-о.

А/473 (КЗ N2) 1100,0 512 9.5 0.71 1000,0 41 ,0 44,0 46,0 15,0 15.0 10,0 Н.О. 8,03 10,3 10,3 1,071 40,0 20,0 20,0 н.о. 94,74 -0.67 +0,8 +0,8

1100,0 12В 7,28 0,250 500,0 41 ,0 44,0 45.5 15,0 20,0 15,0 6400 5400 3200 8,53 0.306 2,0 235.8 96.66 + 1 .25

А/Закарпатье/ /17/89 №N2) 1100,0 256 9,48 0,875 1000,0 41 ,0 43,0 47,0 10,0 6400 12,0 6400 8,0 12800 11.5 9,66 8,62 2,047 40,0 20.0 20,0 86,30 93.9 +2.02 +0,18 -0,86

Таблица 9

Сохранение инфекционной активности ОЖГВ при лиофильной сушке

№№ Штамм Стабилизирующая 1д ЭИДбо в 0,1 мл

Опыта среда до сушки после сушки

1. А/НШ/3/86 Сборн. среда* 7,5 7,5

(Н1Ы1)

Гидролизин 8,0 7,25

Пептон 7.9 7,5

2. А/НШ/3/86 Сборн.среда 7,5 7,0

(Н1Ж)

Гидролизин 7,5 7,5

Пептон 7,7 7,7

Полиамин 7,3 7,0

Аминосол 7,3 6,25

Аминостерил 7,5 7.0

■ Инфузамин 7,5 7.0

3. В/14/28,Я Сборн.среда 8.0 6,24

Гидролизин 8.0 6,56

Пептон 8.0 7,0

4. В/14/28,И Сборн.среда 7,5 6,75

Гидролизин 7,5 6.62

Пептон 7,3 6.7

Аминостерил 7,25 6,74

Аминосол 7,25 5.47

Полиамин 7.5 6,74

5. А/47Б (НЗЫ2) Гидролизин 8.0 7,42

Аминостерил 8,25 7,08

Аминосол 7.9 6,5

Полиамин 8,0 6,9

* Среда на основе аргинина, глютамина, метионина и лактозы

Таблица 10

Сохранение инфекционной активности очищенной живой григоозноЯ аэкцины при хранении

Вакцина стаоилиз. среда j ! Lg3W50 0,1 мл тосле суш-<и lg3«UgQ s 0,1 мл после хранения (в месяцах)

12 13 14 15 16 17 I* 19 20

А/НШ/3/66/17(HINI) акоп.серЛ сер.6 -„- сер.7 сер.6 -„- сэр.9 -„- сер.10 -я- сер.IX -я- сер.12 -я- сер.13 -я- сэр.14 сер.15 ееорн.среда, ГЛ Сборн.среда — Я — ""я— "Я" -Я- -Я- . гд s.ee 6,7 6,7 6,64 6.93 6.94 6,83 6,ВЗ 6,94 7,42 6,82 е,5 6,25 6,33 6,33 6.75 7,0 :i.5 6,25 6,25 5,25

А/НШ/3/86/17(НШ) аксп.-произвол.серия I гд 6,75 6,5

A/47S(H3N2) cep.I -„- сер. 2 -я- сер.З гд 7,5 6,9 7,0 7,С 6,5 6,5

A/47T(KINI) cep.I сер.2 "я" 6.5 6,5 6,5 6,5

В/14/5/1 cep.I -я- сер.2 Сборн?среда 6,56 6,62 6,0 6.0

Примечание: * - Гидролизия

Согласно требованиям ВОЗ для производства ЖГВ должны использо ваться эмбрионы, свободные от посторонней флоры (СПФ-эмбрионы). < этой целью была изучена репродуктивная способность вакцинных штам мов вируса гриппа на эмбрионах кур породы русская белая (линии 6027,650; и смешанная), устойчивых к вирусу лейкозы-саркомы птиц. Установлено что эти эмбрионы обеспечивают накопление вируса гриппа в таких же ко личествах, что и эмбрионы промышленной породы кур леггорн, в то ж» время русская белая характеризуется меньшей гибелью эмбрионов поел! заражения вирусом, что обеспечивает больший выход биомассы, а такж< обеспечивает более точное определение инфекционной активности виру са при титровании вследствие своих генетических особенностей (А.с. ССС1 №1714834).

Было проведено определение Гс-антигена вируса лейкоза птиц в эмб рионах кур породы русская белая линий 6502,6027 и смешанной в РСК I методом ДНК-зондов (рис.19). Проведена селекция птицы на основание полученных результатов для создания промышленного стада. Приготовле но 18 лабораторных серий ОЖГВ из штаммов А1.А2 и В на эмбрионах ку{ породы русская белая. Все серии отконтролированы в ГИСК им.Л.А.Тара севича и ВНИВИП (Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарные институт птицеводства) на наличие Гс-антигена, антиген не обнаружен.

Показана принципиальная возможность использования этих эмбрионос в качестве исходного сырья, не содержащего вирус лейкозо-саркомноь группы, для получения детской вакцины, что соответствует требования*. ВОЗ.

Для оценки реактогенности ОЖГВ разработана принципиально нова? лабораторная модель оценки аллергенности на модели собак, сенсибилизированных к овальбумину (А.с.СССР N1703121).

Три экспериментальных серии вакцины из штамма А/НЩ/3/86/17(Н1 N1, были использованы для изучения прививочных свойств ОЖГВ на 20 добровольцах в клинике НИИ гриппа РАМН и на 100 добровольцах в ограниченном опыте.

11 10 9 876.54 3 2 1

■ш&я " - --

> **

Анализ очистки вирусных суспензий методом диафиль-трации с помощью диск-электрофореза в полиакриламид-ном геле

Рис.19 Диафильтрация на мембране Биопор АМ.

Обозначения

2 - исходная ВАЖ

3 - осветленная ВАЖ

4 - концентрат

5 - концентрат, диафильтрованный против фосфатного буфера 7 - овальбумин 5-кратной кристаллизации

9 - ВАЖ, диафильтрованная против фосфатного буфера

10 - концентрат диафильтрованной ВАЖ

11 - концентрат диафильтрованной после диафильтрации ВАЖ 1,6,8 - пустые дорожки

1 2 3 4 5 6 7

8 19 20 21 22 23 24

26 27(1) 27(2) 28 29 30 31

32 33 34 35 36 37 38

39 40 41<1) 41(2) 42 43

к+ к+

Схема размещения проб на пластине

Рис.20 Протокол опыта гибридизации ДНК-зонда с пробами исследуемых молекул ДНК (образцы крови эмбрионов кур породы русская белая, линии 6027 и 6502). Использовали нитроцеллюлозный фильтр фирмы "Шляйхер и Шуль" (ФРГ).

Обозначения: образцы 1 -25 -пробы крови кур породы русская белая линии 6027 и гибридов линий 6027x6502; образцы 26-43 -пробы крови эмбрионов кур породы русская белая линий 6027 и 6502; К+ -положительный контроль,КДНК вируса миелобластоза (32Р).

Примечание: высокая оптическая плотность в области проб №24 и 43 -артефакт при печатании позитива с рентгеновской пленки (см. оригинал рентгеновской пленки в архиве работы в лаборатории живой гриппозной вакцины и биофизических методов исследования ЛенНИИВС). Темная полоса в нижней части снимка также артефакт.

Работа выполнялась при участии следующих научных коллективов

1. Отдел эпидемиологии НИИ гриппа РАМН (Рук.проф.Шадрин A.C.);

2. Специализированная клиника НИИ гриппа РАМН (Рук.к.м.н. Якушин А.И.);

3. Лаборатория генетики и вакцинных штаммов (Рук.,д.м.н. Полежаев Ф.И.);

4. Лаборатория диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН (Рук.,д.м.н.Соминина А.И.);

5. Лаборатория клинической иммунологии 1-го медицинского института им.акад.И.П.Павлова (С.-Петербург);(Рук.,к.м.н. Тотолян A.A.);

6. Лаборатория живой гриппозной вакцины и биофизических методов исследований НИИ сакцп:; я сыпсрстсх С. Петербурга {Рук .к.м,;;, Кряшс-нкжА.И.).

Цель исследования. Сравнительное изучение прививочных свойств иммуногенности, реактогенности, приживляемости ОЖГВ и коммерческой вакцины (КЖГВ) из рекомбинантного штамма А/Новошахтинск/3/86/ 17(H1N1) с целью решения вопроса о целесообразности усовершенствования технологического варианта при производстве ЖГВ для взрослых. Решались в сопоставлении с КЖГВ следующие задачи

1. Изучение реактогенных свойств ОЖГВ при однократной и двухкратной аппликации;

2. Изучение иммуногенных свойств ОЖГВ:

а) оценка показателей секреторного иммунитета;

б) оценка показателей гуморального иммунитета;

в) оценка показателей клеточного иммунитета;

3. Оценка свойств приживляемости ОЖГВ.

4. Изучение аллергизирующих свойств вакцины с использованием комплекса клинико-лабораторных методов при однократной и двухкратной иммунизации.

Исследование проведено в два этапа

1 этап - изучение прививочных свойств вакцины и проведение углубленного клинического обследования ограниченного числа (3 группы по 20 человек), привитых ОЖГВ, КЖГВ и плацебо в специализированной клинике НИИ гриппа РАМН.

2 этап - изучение безвредности, реактогенности, антигенной активности и длительности сохранения поставкцинального иммунитета у привитых ОЖГВ, КЖГВ и плацебо в условиях проведения испытаний на ограниченной группе привитых (3 группы по 100 человек).

Краткая характеристика препаратов.

1. ОЖГВ из штамма А/Новошахтинск/3/86/17(Н1М1) (три серии препарата, №№13,14,15) с инфекционной активностью: 10 6-24-10 6-62- 10 6-41ЭИД 50/0,1 мл с остаточным содержанием белка: 5,7 - 11,0 - 10,0 мкг/мл; содержание овальбумина: 10,0 - 0,125 - 5,0 мкг/мл.

2. Референс-препарат - КЖГВ из штамма А/Новошахгинск/3/86/17(НШ1) производства Одесского предприятия бакпрепаратов с инфекционной ак-

тивностью: 10 7-30 ЭИД 50/0,1МЛ- содержание овапьбумина 2000 мкг/мл,

3. Плацебо - физиологический раствор (0,85% раствор хлористого нг трия).

Организация и проведение испытаний. Исследование вакцины выод нено на основании Программы, утвержденной Комитетом МИБП при М СССР от 18 сентября 1989 г. (Протокол №14).

Основание для испытаний ОЖГВ. 1. Приказ МЗ СССР N2655 от 15.08.88

2. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины гриппозной алла» тоисной очищенной живой сухой для интраназального применения (Реш« ние НТС ЛенНИИВС от 25.09.89, протокол №13).

3. Заключение ГИСК им.Л.А.Тарасевича о соответствии эксперименташ ных серий вакцины требованиям НТД.

Заключение по итогам испытаний ОЖГВ в специализированной клинм ВНИИ гриппа МЗ СССР (табл. 11-16).

1. Результаты проведенного клинического исследования свидетельству« об ареактогенности как ОЖГВ, так и КЖГВ, приготовленных из штамма / Новошахгинск/3/86/17( Н1N1).

2. Исследования не выявили отрицательного влияния ОЖГВ на функщ-ональное состояние сердечно-сосудистой системы, белковообразовател! ную и ферментативную функцию печени, состав периферической крови

3. Отмечено достоверное снижение числа эозинофилов, эозинофил! но-лимфоцитарного индекса периферической крови у добровольцев, пс лучивших ОЖГВ, что свидетельствует о меньшей аплергезирующей спс собности этой вакцины по сравнению с КЖГВ.

4. Установлено, что очистка препарата ЖГВ способствовала снижени индукции антител у привитых к овальбумину в 4 и более раз, а к неовал! буминовым компонентам - в 15 раз по сравнению с привитыми КЖГВ.

5ч У обследованных лиц, вакцинированных ОЖГВ и КЖГВ, по сравнени с контрольной группой были выявлены следующие общие изменения: пс вышение поглотительной и секреторной активности фагоцитирующих кле ток (5-49 сутки), повышение уровня 1дЕ (8-49 сутки), повышение у част обследованных лиц 1дЕ, специфического к овальбумину.

6. Только у лиц, вакцинированных КЖГВ, было выявлено снижение ко» центрации 1дА и ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов) в сыворотк крови и повышение миграционной активности фагоцитирующих клеток.

7. Только у лиц, вакцинированных ОЖГВ, было выявлено преимуществе» но повышение концентрации секреторного иммуноглобулина А в назал» ных смывах.

Таблица 11.

Распределение клинических реакций у лиц, привитых очищенной и коммерческой живыми гриппозными вакцинами из штамма А/НШ/3/86/17(Н 1N1)

Препарат Кол-во чел. Повышение температуры тела Интоксикация Катаральные явления Клинические реакции

ПГТ г»** >->1 .С ~ -37,5° и 1 , и и выше кая тае« тяж. К№? ДНЙЙ тяж. КИЙ срс дне Я тяж.

ОЖГВ С.15 20 I - - - 2 - 2 -

КЖГВ 20 2 - I - 2 - 3 -

Плацебо 19 I - - - 3 - 3 -

Итого 59 4 - I - 7 - 8 -

Таблица 12

Результаты исследования показателей периферической крови у добровольцев, привитых ОЖГВ, КЖГВ и получивших плацебо

Показатели крови Препарат Величина показателя —

До вакцинации (фон) поело вакцинации

5-Я день 8-й день 28-й день 49-Й день

Эозино$шш % ОЖГВ КЖГВ Плацебо 3.1 2,9 3.2 2,8, 3,8 2,82 2,57 3,8 2,7 2,27 3,4 2,8 2,3 3,3 2,7

Лимфоциты % ОЖГВ КЖГВ Плацебо 43,4 38,8 42,6 44,1, 42,8 45,5 43.8 39.9 43,5 39.7 35,2 39,7 42,2 38,0 39,2

Э/л индекс СЖГВ 0,07 0,07 0,05 0,05 0,06

КЖГВ 0,07 0.1 0,11 0,09 0,09

Плаце-

бо 0,076 0,07 0,07 0,07 0,07

Таблица 13

Результаты изучения антител к овапьбумину в РИГА в сыворотках крови добровольцев, привитых КЖГВ и ОЖГВ

Препарат Исходный Всего Из них давших диагностический прирост

титр обследо- антител

антител вано (чел) абс. %

КЖГВ 52 II 21,8*

<1/2 14 0 —

>1/2 38 II 28,9

01ГВ 77 4 5,2*

<1/2 24 - -

>1/2 53 4 7,0

Плацебо 48 4 8,3

<1/2 II - -

>1/2 37 4 10,8

Примечание: * - статистически достоверные различия между сравниваемыми показателями (р<0,05)

Таблица 14

Результаты изучения иммуногенной активности вакцин из штамма А/Н/3/86(Н 1N1) с рекомбинантом вируса гриппа Р7 при двух кратном

интраназальном введении (индукция антинейраминидазных антител)

Препарат Исходные титры антител Всего обследов. лиц Из них давших диагностический прирост титров антител Индекс прироста титров антител

абс. X

ОЖГВ с.13 <1:20 >1:40 26 13 8 I 30,8 7.7 1,7

ОЖГВ с.14 <1:20 >1:40 34 7 24 I 70,6 14,3 4,6 1,2

ОЖГВ с.15 <1:20 >1:40 15 2 9 I 60,0 I 50,0 4,0 . 1,0

ОЖГВ суммарно по 3-м сериям <1:20 >1:40 75 22 41 3 54,7 13,6 3,2

КЖГВ <1:20 >1:40 45 27 19 5 42,2 18,5 2,6

Плацебо <1:20 >1:40 44 25 4 I 9,1 4,0 1,4

Таблица 15

Результаты изучения иммуногенной активности вакцин, приготовленных из вируса гриппа А/НШ/3/86(Н1М1) с антигеном вируса гриппа А/624/86(Н1Ы1) при двухкратном введении взрослым людям

Препарат Исходные титры антител Всего обследов. лиц из них давших диагностическ. прирост титров антител аос. | % СГТ1 СГТ2 индекс прироста титров антител

ИА-6,24- ЪРЩо/ /0,1мл ожгв сер.13 овальбу- мин-Ю мкг/мл 0 9 6 66,7 0 14,29 14,29 1:10 10 2 20,0 10 22,9 2,29 1:20 16 2 12,5 20 28,1 1,4 >1:40 4 - -

ИА-6,6- 1вЭИД50/ /0,1мл ОЖГВ сер Л 4 овальбу- мин- -0,125 мкг/мл 0 15 12 80,0 0 18,2 16,2 1:10 8 2 25,0 10 21,38 2,13 1:20 II I 9,0 20 30,9 1,54 >1:40 7 - -

ИА-6,4- ОЖГВ сер.15 овальбу-мин-5мкг /мл 0 6 2 33,3 0 5,8 5,8 1:10 7 I 14,3 10 18.0 1,8 1:20 4 2 50,0 20 56,2 2,8 >1:40 II - -

ОЖГВ суммарно по трем сериям 0 30 20 66,6 0 13,8 13,8 1:10 25 5 20,0 10 20,6 2,06 1:20 31 5 16,2 20 30,1 1,5 >1:40 II - -

ИА-7,3- кжгв овальбу-мин-2000 мкг/мл 1 0 32 14 43,75 0 8,4 8,4 1:10 19 9 47,4 10 25,7 2,57 1:20 14 3 21,4 20 25,12 1,25 >1:40 12 I 8,3 34,67 46,7 1,34

Плацебо 0 20 2 10,0 0 2,9 2,9 1:10 27 - -1:20 16 - ->1:40 II - -

Таблица 1

Сравнительное изучение иммуногенной активности вакцин из штамма А/НШ/3/86(Н1М1) с использованием в РТГА нативного и очищенного вируса гриппа А/325/88(Н11М1)

Препарат Исхода, титры антител Всего об-сле- ДОВ. лиц А/325/88 (очищенный) Всего об-следов. лиц А/325/88 (нативный)

Из них давших прирост титров антител Индекс прироста титров антител Из них давших прирост титров антител Индекс прироста титров антител

абс. % абс %

ОЖГВ с.15 <1:20 >1:40 48 15 22 I 45.8 6,7 4,3 49 14 15 30,6 2,8

КЖГВ <1:20 >1:40 44 10 18 40,9 3,1 42 12 18 I 42,7 8,3 2,8 1.1

Плацебо <1:20 >1:40 40 12 4 10,0 1,6 39 13 I 2,6 1,3

Таблица 1

Сравнительные характеристики ОЖГВ и КЖГВ

Показатель ОЖГВ КЖГВ

Сероконверсии, % 72-100 ' 1 37-52

- к гемагглютинину

- к нейраминидазе 54-71 18-42

Повышение секреторных 1§А, % 53 28

Аллергазирупцая способность:

- эозинофильно-лимфоцитарный 0,05 0,104

индекс

- сероконверсии, %:

к овальоумину 5,5 30,0

к другим белкам 0 15

Заключение по итогам испытаний на ограниченной группе привитых. (3 группы по 100 человек), табл,17.

1. Показатели реактогенности ОЖГВ соответствуют требованиям,

предъявляемым к живым гриппозным вакцинам.

2. Иммунизация ОЖГВ по сравнению с КЖГВ вызывает примерно оди-

наковую выработку антигемагглютининов, но индуцирует более выраженный иммунный ответ к нейраминидазному компоненту вируса (в 1,7 раза), что будет способствовать большей защищенности организма привитых в поствакцинальный период.

3. Повышение чувствительности РТГА путем использования очищенных

антигенов при анализе сывороток привитых ОЖГВ,- вероятно,-ласт возможность перейти от двухкратной вакцинации к однократной, поскольку позволяет выявить больший процент сероконверсий среди привитых ОЖГВ.

По мнению Нобелевского лауреата Дж.Мельника живая аттенуирован-ная гриппозная вакцина появится на американском рынке не ранее 1995 г. (Бюлл.ВОЗ,1989,67,2,1-10).

ВЫВОДЫ

1. Впервые на основе комплексных исследований разработана универсальная хроматографическая технология (ФХТ) получения инактивирован-ной гриппозной вакцины. Полученная вакцина отвечает требованиям ТУ на этот препарат (регламент N210-81).Новая технология позволяет получить препарат со стабильными технико-экономическими показателями, независимо от используемых штаммов вируса гриппа. Показана универсальность технологии очистки и на других вирусах.

2. Впервые предложен новый материал для осветления вируссодержа-щих суспензий - стекловояоконные и базальтоволоконные фильтры, обладающие высокими технологическими качествами: инертность по отношению к вирусам, возможность стерилизации термическим и химическим способом, экологическая безопасность, низкая стоимость.

3. Впервые установлено, что при высаливании примесных белков ВАЖ может происходить повышение гемагглютинирующей активности вирусов. Высказано предположение и приведены доказательства в пользу того, что наблюдаемое явление связано с диссоциацией комплексов "вирус(НА) -ингибитор гемагглютинации".

4. Изучена возможность использования мембран различного типа для концентрирования и очистки вирусов. Показано, что микрофильтрация ВАЖ может быть эффективно осуществлена на синтетических полисульфона-мидных, лавсановых ядерных фильтрах, полимерных пленках на основе поливинпирролидона и метилметакрилата. Впервые показано, что эти мембраны не токсичны, что позволяет их использовать при производстве вакцин.

5. Исследованы сравнительные возможности различных хроматогра-фических методов очистки вирусов. Предложены новые сорбенты на основе иммобилизованных сиалопротеидов и лектинов для биоспецифической хроматографии (афинной хроматографии). Получено три новых сорбента на основе МПК модифицированного стиролом, глицидолом, тита-ноксидом. Новые сорбенты имеют преимущество перед МПС-2000В-ГХ, модифицированным поливинипирродилодоном - промышленным вариантом сорбента.

Биоспецифическая хроматография в варианте иммуносорбции реализована в производстве в "Лабораторном регламенте получения вакцины гриппозной хроматографической жидкой инактивированной для детей" N1694, утв. 10.06.81.

6. Впервые на основе математической теории эксперимента (МТЭ) оптимизированы режимы ЭЖХ. Найдены наилучшие условия протекания технологического процесса (с учетом ионной силы и рН элюирующего буферного раствора, скорости элюции и других параметров) методом глобальной оптимизации с использованием полученных функциональных моделей в качестве целевой функции и функций-ограничений. Теоретические модели подтверждены практическими результатами ЭЖХ.

7. Впервые на основе разработанной ФХТ сформулированы требования к аппаратурному оформлению этой технологии и в НТО АН СССР выпущены две фильтрационно-хроматографические линии (ФХЛ) для реализации ФХТ в условиях крупномасштабного производства. Предложенные методы и режимы стерилизации нашли применение при промышленном производстве ИГВ.

8. Впервые разработан новый метод иммунофильтрационного анализа при непосредственном использовании процесса ультрафильтрации с регистрацией первичной стадии биоспецифических взаимодействий, происходящих на полупроницаемых мембранах.

9. Экспериментально-теоретически обосновано положение о новой физико-химической характеристике вирионов - гидрофобности. Гидрофоб-ность вирусной частицы, характеризует поверхностные свойства вирионов, топологию гидрофобных зон поверхностных структур, сродство к различным поверхностям. Экспериментально установлена корреляционная связь между гидрофобностью вирусов и их биологическими характеристиками - иммуногенностью и сродством к ингибиторам гемагглютинации. Показано, что более иммуногенные и ингибиторочувствительные штаммы являются более гидрофобными. Высказано предположение о наличии гидрофобных зон вблизи рецепторного "кармана" молекулы НА.

10. Впервые разработаны методы аналитического и препаративного выделения НА вируса гриппа основных серотипов с помощью ИЭФ в бо-рат-полиольных системах.

Впервые в условиях микрогравитации на установке "Таврия" методом

ИЭФ был выделен НА. На препараты НА получены высокоактивные и специфические сыворотки, нашедшие применение в практике. Подтверждена возможность выделения высокоочищенных гидрофобных белков в условиях микрогравитации с сохранением его нативных свойств, что показывает перспективность нового направления - космической биотехнологии получения особо чистых биопрепаратов.

Впервые на установке "ЭФУ-Робот" - новое поколение автоматических аппаратов после "Таврии", были получены уникальные по чистоте препараты НА.

11. Впервые на основе комплексного исследования вопросов очистки и выделения вирусов с уютом их биологических свойств ¡1 характера иммунного ответа на вакцинацию сформулирована концепция "щадящей технологии получения противовирусных препаратов". На ее основе разработана технология получения очищенной живой гриппозной вакцины для ин-траназального применения, которая с 1992 года выпускается на предприятии НИИ вакцин и сывороток С.-Петербурга.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Крашенюк А.И.,Жебрун А.Б.,Каюмов В.Г.,Власов Г.П., Глушенкова В.Р.,Носков Ф.С. О возможности выделения вирусов гриппа методом аффинной хромотог-рафии.-В кн. Специфическая профилактика гриппа.-Л.,Труды ин-та им.Пасте-ра, 1979,т.52. с.148-151

2. Крашенюк А.И.,Жебрун А.Б.,Каюмов В.Г., Михальченко Л.В., Носков Ф.С.,Власов Г.П..Глушенкова В.Р. Выделение вируса гриппа методом аффинной хромо-тографии.-В кн. Молекулярная жидкостная хроматография. Тезисы докладов 1 Всесоюзной конференции по жидкостной молекулярной хроматографии.-Черноголовка, 1979,с.54-55

3. Носков Ф.С.,Жебрун А.Б.,Галко Н.В.,Вашукова С.С., Макарова Н.Г.,Чистиков А.В-..Нестерчук Л.Б.,Рожкова Л.В..Крашенюк А.И.,Бояр Г.А.,Гребельский А.С.,Ша-пилов О.Д.,Богомолова Н.Д. Разработка научных основ иммунопрофилактики клещевого энцефалита.-Заключительный отчет НИИЭМ им.Пастера МЗ РСФСР, 1979-1980 г.г.-Задание ГКНТ СССР N198 от 15 мая 1979 г.,32с.

4. Корнев Н.Р„Каюмов В.Г.,Крашенюк А.И. Высокочувствительный проточный ден-ситометр.-Лабораторное дело. 1980,N2, с.118-119.

5. Крашенюк А.И.Каюмов В.Г. Радиоиммунологинеский метод вирусологии.-В кн. Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекций.-М.,1981,с.56-62

6. Кашкина Г.Б.,Крашенюк А.И.,Васильева Х.А.,Бойчук Л.М. Применение двух фазных систем водорастворимых полимеров для концентрирования вирусов кори и паротита.-Вопросы вирусологии,1981, N6.C.607-611.

7. Носков Ф.С.,Жебрун А.Б.,Баяр Г.А.,Крашенюк А.И.,Шапилов О.Д. Эритроцитар-ные диагностикумы из чистых антител.-В кн. Реакция непрямой гемагглютина-ции.-Л. Труды ин-та им.Пастера,1981,т.56,с.З-12.

8. Крашенюк А.И.,Камфорин Л.Е. "научные редакторы". Структуры поверхностных антигенов миксовирусов.-Библиографический указатель отечественной и зарубежной литературы за 1975-81 г.г.-Л.,1981,с.З-26.

9. Перадзе Т.В.,Носков Ф.С.,Крашенюк А.И.,Жебрун А.Б.,Богомолова Н.В.,Пейсель З.Г\,Бохневич Г.М..Ермолаев А.И..Фридман А.Л..Михайлова Г.Н. Нифотова А.И.,Захаренко И.В.,Фридман Э.А.,Бичурина М.А.,Чистяков А.В.,Хохлов А.С.,Ре-шетов П.Д.,Жигис Л.С..Павленко В.А..Александров М.Л.,Рейфман Л.С.,Гомолиц-кий В.Н.,Нефедов П.П.,Калинина И.К. Производственный регламент вакцины гриппозной хроматографической инактивированной жидкой (метод фильтраци-онно-хроматографический),N210-81,утв.29.09.1981 г.Внедрен на предприятии НИИЭМ им.Пастера, МЗ РСФСР.

10. Носков Ф.С.,Жебрун А.Б.,Бичурина МА.Полянская М.Ю.,Крашенюк А.И.,Роза-ева Н.Р.,Каплун И.Я.,Слатин Е.А.,Пейсель 3.Г.,Фридман А.Л.,Ермолаев А.И.,Нифотова А.И.,Бохневич Г.М..Фридман Э.А. Лабораторный регламент получения вакцины / гриппозной хроматографической очищенной жидкой инактивированной для детей,N169,утв. 10.06.1981 г.Внедрен на предприятии НИИЭМ им.Пас-тера.МЗ РСФСР.

11. Носков Ф.С..Крашенюк А.И.,Жебрун А.Б.,Каюмов В.Г..Шапилов О.Д.,Васильева Л.В.,Розаева Н.Р.,Негряну Г.Р. Разработка метода препаративного выделения гемагтлютинина вируса гриппа. Заключительный отчет НИИЭМ им.Пастера

МЗ РСФСР, 1979-1981 г.г.-Тема 098, Nroc. регистрации 79064434.60с.

12. Крашенюк А.И.,Рождественская В.О.,Малафеева Л.К..Пастухова Е.А.,Лейви A.A.,Негряну Г.М.,Копьева М.Л..Чернорицкая И.С.'Совершенствование технологии получения препаратов гаммаглобулина.-Заключительный отчет НИИЭМ им.Пастера МЗ РСФСР. 1980-1982 г.г.-Тема 106, Nroc. регистрации 80011193, 57с.

13. Крашенюк А.И.,Копылова H.A.,Разоренов Г.И.,Жебрун А.Б.,Носков Ф.С. Оптимизация режимов хроматографического разделения окмпонентов системы "вирус-примеси" с помощью многофакторного анализа. Тезисы 11 Всесоюзного симпозиума па молекулярной жидкостной хроматографии.-Черноголовка, 1982, с. 79.

14 Крашенюк А.И..Шапилои ОД.Каюмоз В.Г..Васильева Л.В.,Нос*ов Ф.С. деление и очистка вируса гриппа методом бмоспецифичесхой хроматографии на иммобилизованных синтетических лигандах-ингибиторах нейраминидазы.-Там же,с.78-79.

15. Носков Ф.С.,Волкова А.Н.,Крашенюк А.И..Яковлев В.И.,Жебрун А.Б. Очистка вирусов на модифицированных кремнеземах методом гель-хроматографии.-Там же,с.80.

16. Крашенюк А.И.,Копылова H.A.,Алферова Л.В.,Куреньгина Т.Н. Влияние различных физико-химических факторов на хроматографическоеразделение системы "вирус-примеси".-В кн.Этиология и специфическая профилактика гриппа.-Л."Труды ин-та им.Пастера,1982,т.59,с.88-93

17. Носков Н.С.,Галко Н.В.,Вашукова С.С..Макарова Н.П..Чистяков А.В.,Гребельс-кий А.С.,Камалов И.И..Соколова Е.Д.,Жебрун А.Б..Крашенюк А.И.,Нестерчук Л.Б.,Шапилов О.Д.,Баяр ГА.Рожкоза С.А..Богомолова Н.В. Разработка хрома-тографической концентрированной инактивированной вакцины против клещевого энцефалита.-Заключительный отчет НИИЭМ им.Пастера МЗ РСФСР,1980-1982 г.г.-Тема 107, Nroc. регистрации 81034855, 48с.

18. Гуричева З.Г..Ротенберг В.В..Калинин Б.Ю..Крашенюк А.И..Богомолова Н.В .Ша-пилов О.Д. Санитарно-химическая оценка полисульфонамидных мембран.-Гигиена и санитария, 1983,N3, с.57-59

19. Волкова А.Н.,Крашенюк А.И.,Миренкова Т.А..Яковлев В.И., Носков Ф.С. Изучение адсорбции-десорбции вирусов гриппа на титансодержащем сорбенте.-Рукопись депонирована в ВИНИТИ 16. 11.82,N5625-82,Деп.,4с.-Библиографический указатель ВИНИТИ "Депонированные рукописи", 1983,N3,б/о 276.

20. Крашенюк А.И. Исследование вирусов и вирусных белков методом электрофореза в линейном градиенте рН.-В кн. Хроматография в биологии и медици-не.Тезисы докладов 1 Всесоюзной конференции.-М.,1983,с.58-59

21. Крашенюк А.И..Ноское Ф.С.,Рейфман Л.С.,Нефедов П.П., Гомолицкий В.Н., Подоплекина Л.Е.,Унгер Г.Н.Прасолова Г.П., Тымчишин П.В. Совершенствование технологии крупномасштабного производства инактивированной вакцины клещевого энцефалита.- -Там же,с.166-167.

22. Павленко И.В.,Крашенюк А.И. Разделение вирусов и примесных компонентов методом противоточной хроматографии в водных полимерных системах.-Там же,с. 177.

23. Павленко И.В.,Крашенюк А.И..Нефедов П.П.,Рейфман Л.С., Сальникова Т.А.,-Шумкова Л.В..Цыганков А.М.,Смородинова И.П. Очистка вируса кори с исполь-

зованием двухфазного распределения и высокоэффективной жидкостной хроматографии.-Там же, с.177-178.

24. Крашенюк А.И.,Скрипченко Г.С.,Ржанова С.А. Использование метода эксклю-зионной жидкостной хроматографии для изучения относительной гидрофобно-сти вирусов гриппа. Тезисы 111 Всесоюзного симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии.-Рига, 1984,с. 162-163.

25. Павленко И.В..Крашенюк А.И.,Сальникова Т.А.,Брезгун А.А.,Смородинова И.П. Исследование концентрирования вируса кори с помощью двухфазных систем водорастворимых полимеров.-Вопросы вирусологии, 1985.N6.C.732-736.

26. Крашенюк А.И.,Богомолова Н.В.,Гомолицкий В.Н.,Рейфман Л.С.,Шапилов О.Д-.,Носков Ф.С. Санитарно-химическая оценка условий стерилизации технических средств и фильтровальных материалов, применяемых при производстве инактивированных вирусных вакцин.-Гигиена и санитария, 1985,N10.с.33-35.

27. Подоплекина Л.Е..Кириленко В.П.Дымчишин П.Н.,Хасаншин Г.Р.,Камалов И.И..Соколова Е.Д.,Крашенюк А.И.,Гребельский А.С.,Рейфман Л.С.,Калинина И.К.,Головешкин В.Т.,Нефедов П.П. Изменение 1 к "Регламенту производства вакцины клещевого энцефалита культуральной инактивированной N235-8ГУтв.6.12. 1985г.Срок введения с 1.01.1985г.Внедрено на предприятии Томского НИИВС Минмедбиопрома СССР.

28. Носков Ф.С.,Бичурина М.А.,Жебрун А.Б.,Полянская Н.Ю., Каплун И.Я.,Розаева Н.Р.,Крашенюк А.И..Ланская Н.И..Фридман Э.А. Совершенствование методов контроля чистоты и активности инактивированных гриппозных вакцин.-Вопро-сы вирусологии, 1985,N4,c.409-412.

29. Подоплекина Л.Е.,Федоров Ю.В.,Чавандина Л.И.,Тымчишин П.Н.,Унгер Г.Н.,Пра-солова Г .П., Бекетова Э.М.,Васильева Г.А., Явья А.Р.,Мирютова Т.Л.,Кириленко В.А.,Носков Ф.С.,Крашенюк А.И.,Соколова Е.Д.,Рейфман Л.С.,Калинина И.К.,-Гомолицкий В. Н. Совершенствование технологии изготовления вакцины клещевого энцефалита.-В кн. Медико-биологические препараты и иммунологическая реактивность организма. Материалы 22-й Итоговой научной конференции Томского НИИ вакцин и сывороток и / кафедры микробиологии Томского медицинского института.- -Томск, 1985,с.4-6.

30. Камалов И.И.,Соколова Е.Д.,Крашенюк А.И.,Рожкова Л.В., Никонова А.Н.,Нос-ков Ф.С.Изучение антигенных свойств и иммуногенности фракций инактивированной вакцины против клещевого энцефалита, полученных методом микрофильтрации и хроматографии.-Там же,с.6-8.

31. Камалов И.И..Соколова Е.Д..Крашенюк А.И.,Подоплекина Л.Е..Бекетова З.П.,Носков Ф.С.Пути совершенствования вакцины против клещевого энцефалита.-В кн.: Сборник трудов Омского НИИ природно-очаговых инфекций и инвазий. -Омск, 1985,с. 15-34.

32. Денисова И.И..Крашенюк А.И.,Ажицкий Г.Ю.,Шараева Т.К.,Умовская Е.А.,Ха-зенсон Л.Б.,Носков Ф.С. Выделение и очистка лактопероксидазы из коровьего молока.-Вопросы медицинской химии,1986,N1,c.116-119.

33. Крашенюк А.И.,Лукьянова Л.Г.,Филлипова М.Л.,Трекало В.Ю.,Крупкина Г.А.,-Замыслов В.Ю.,Петрушков А.В.,Лихолитов А.И.,Садковкин В.П. Изучение возможности очистки инфекционного вируса гриппа с целью усовершенствования технологии получения живой гриппозной вакцины.-Заключительный отчет Лен-НИИВС Минмедбиопрома СССР, 1985-86 г.г.-Тема 15/86, Nroc. регистрации 01.85.0059758.

34. Крашенюк А.И.,Константинов В,К.,Рейфман Л.С.,Лукьянова Э.Г.,Филиппова М.Л..Канарский A.B. Изучение фильтроваальных материалов для предварительной очистки вирусных суспензий.-В кн.: Современные направления в развитии технологии производства и повышения качества электроизоляционных и фильтровальных материалов на целлюлозной основе. Материалы Всесоюзной научно-технической конференции. -Волжск.1936, с. 117-119.

35. Крашенюк А.И..Лукьянова Э.Г.,Филиппова М.Л.,Трекало В.Ю.,Замыслов В.Ю.-.Петрушков А.В.,Лихолитое А.И.,Садковкин В.П. Изучение возможности очистки инфекционного вируса гриппа с целью усовершенствования технологии получения живой гриппозной, вакцины.Заключит, отчет ЛенНИИВС Минмедбиоп-рома СССР. 1985-86. Тема N15/86, Nroc. регистрации 01.85.0059758.

36. Крашенок А.'И.,Константине" Б,к,,Рейфман Л.С..Лукьянова ¿¡.Г.,шили1нкма М.Л..Канарский A.B. Изучение фильтровальных материалов дл г.редиаритель-ной очистки вирусных суспензий.-В кн.: Современные направления в развитии технологии производства и повышения качества электроизоляционных и фильтровальных материалов на целлюлозной основе. Материалы Всесоюзной научно-технической конференции. Волжск, 1986,117-119.

}7. Кривошеин Ю.С.,Криворутченко Ю.Л..Крашенюк А.И.,Трекапо Б.Ю. Использование новых детергентов для солюбилизации гемагглютинина вируса гриппа и его получение.-В кн.: Актуальные вопросы биотехнологии. Материалы Всесоюзной научной конференции (14-16 января 1987 г., Ленинград).-М.,1987,с.76-77.

¡8. Крашенюк А.И..Кривошеин Ю.С.,Криворутченко Ю.Л.,Ажицкий Г.Ю.,Лепский А.Н.,Митичкин О.В.,Васютин В.В..Троицкий Г.В. Анализ препаратов гемагглютинина вируса гриппа, полученного / в условиях микрогравитации на борту орбитальной станции "Салют".-Там же,с.78-79.

19. Лукьянова Э.Г..ФИлиппова М.Л.,Трекало В.Ю.,Крашенюк А.И. Методические подходы к решению проблемы очистки инфекционного вируса гриппа.-Там же,с.81-82.

Ю. Крашенюк А.И. Концепция "биологизации" технологии в разработке противовирусных препаратов.-В кн.: Материалы научной конференции "Актуальные вопросы получения и использования биополимеров в биотехнологии". Ленинградский НИИ вакцин и сывороток, Л.,ДЕП N7033-B87,1987,56-60.

■1. Крашенюк А.И. Исследование гидрофобности вирусов гриппа методом распределительной жидкостной хроматографии. Там же, 61-68.

•2. Кривошеин Ю.С..Крашенюк А.И.,Митичкин О.В.,Лепский А.Н., Зайцева H.A. Очистка гемагглютинина вируса гриппа, выделенного с помощью детергента "деэинтегрона", в условиях невесомости на борту орбитальных станций "Салют" и "Мир".-В кн.: Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства. Физико-химические свойства и применение ПАВ.Часть 11. Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции г.Шебекино,1988, с.810,ДСП.

3. Крашенюк А.И.,Нефедов П.П.Рейфман Л.С.,Цыганков А.М., Носков Ф.С.,Разоренова Т.А. Очистка вирусных суспензий методом препаративной жидкостной хроматографии.-В кн.: Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах."Наука",Л., 1988,4-5.

4. Абышев А.З.,Энтона Н.Н.,Нежинская Г.И.,Крашенюк А.И., Колотмнская Т.М..Лукьянова Э.Г.,Трекало В.Ю. Применение липосом и синтетических полимеров для получения антигемагглютининовых сывороток.-В кн.: Актуальные пробле-

мы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактериальных препаратов,(тезисы докладов).Пермь, 1988,155-157.

45. Крашенок А.И..Филиппова М.Л.,Волкова Г.Г.,Лукьянова Э.Г.,Трекало В.Ю.,Сад-ковкин В.П.,Лихолитов А.И.,Крупкина Г.А.,Гускин Я.Р.,Говердовский Б.А.,Пуль-вер О.А. Совершенствование технологии производства центрифужной инакти-вированной гриппозной вакцины. Заключит, отчет ЛенНИИВС Минмедбиолро-ма СССР, 1986-1988. Тема N0286.0048862,ДСП.

46. Кривошеий Ю.С.,Крашенюк А.И.,Митичкин О.В.,Лепский А.Н., Зайцева Н.А. Очистка гемагглютинина вируса гриппа, выделенного с помощью дезинтегрона в условиях невесомости на борту орбитальных станций "Салют" и "Мир".-В кн.: Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства. Физико-химические свойства и применение ПАВ. Часть 11 .Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции. -Белгород, 1988.C.310. ДСП.

47. Крашенок А.И.,Нефедов П.П.,Рейфман Л.С.,Цыганков A.M., Носков Ф.С.,Разоренова Т.С. Очистка вирусных суспензий методом препаративной жидкостной хроматографии.-В кн.: Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах.Тезисы докладов 1 -го Всесоюзного симпозиума, Ленинград, 11-13 октября 1988,-Л. Наука,Ленинградское отделени-е,1988,с.4-5.

48. Krashenjuk A.!.,Goretskaya T.I. Concentration and purification of Newcastledisease virus by microfiltration and exclusion liquid chromatography. Acta virologica, 1988,353-357.

49. Шапилов О.Д.,Каюмов В.Г.,Крашенюк А.И. Спектрофотометрический способ определения аминогрупп на поверхности кремнеземов.-Аналитическая химия. -1988.T.38,N3,c.564-566.

50. Крашенок А.И. Безлейкозные куриные эмбрионы - перспективное сырье для получения вирусных вакцин и исследований методами генной инженерии. Бюллетень ВНИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных, выпуск 113, Л.,1989.24-27.

51. Соколова А.И.,Крашенок А.И.,Лукьянова Э.Г.,Батракова В.П.,Шлякова М.В.,Бо-рисенко С.В.,Корнильева А.Г. Генетический контроль чувствительности биологических систем к репродукции вирусной инфекции.-Там же,с.24-27.

52. Лукьянова Э.Г.,Филиппова М.Л.,Громов В.И.,Жемков В.П., Иванов Н.Б.,Трека-ло В.Ю.,Крашенок А.И. Очистка инфекционного вируса гриппа методом микрофильтрации. Вопросы вирусологии,1989,2,240-243.

53. Крашенок А.И.,Суханова Г.Н. Связь между иммуногенностьо различных штаммов вируса гриппа и их физико-химическими свойствами по данным ЯМР.-Е кн.: Соврменные проблемы эволюционной биохимии и происхождения жизни.-Всесоюзная конференция.Тезисы докладов.-Петрозаводск,1989,с.107-108.

54. Степанов А.И..Кирилок С.Д..Крашенок А.И. Связь между иммуногенностьк различных штаммов вируса гриппа и их физико-химическими свойствами пс данными турбидиметрии.-Там же, с. 136.

55. Крашенок А.И..Лукьянова Э.Г.,Филиппова М.Л.Дрекало В.Ю.,Ким Ф.И.,Черка сов А.Н.,Громов В.И.,Жемков В.П..Иванов Н.Б.,Лапыкин Ю.В.,Мчедлишвил1< Б.В.,Флеров Г.Н. Экспериментально-производственный регламент вакцины грип позной очищенной аллантоисной живой сухой для интраназального введения. Министерство медицинской промышленности СССР.Утверждена директоре^

ЛенНИИВС И.В.Нынем 27 сентября 1990 г.

56. Крашенюк А.И.,Лукьянова Э.Г.,Филиппова М.Л.,Трекало В.Ю. Временная фа-макопейная статья. Вакцина гриппозная аллантоисная очищенная живая сухая для интраназального введения взрослым.ВФС 42-316ВС-92. Срок введения установлен с 15 февраля 1992 г. Утверждена Заместителем Председателя Госкомитета Санэпиднадзора при Президенте РФ Онищенко Г.Г.Фармакопейный Комитет,7с.

57. А.с.СССР N921254. Способ получения противогриппозной вакцины.Носков Ф.С..Крашенюк А.И.,Решетов П.Д.,Жигис Л.С., Хохлов А.С.,Жебрун А.Б.,Пей-сель З.Г.,Фрилман А.Л..Ермолаев А.И.,Алесандров М.Л.,Рейфман Л.С.,Гомолиц-.КИЙ,В.Н. Не Г^ДГ. и ЛТ1ГП ПР.Ч..1981.

58. А.с.СССР N875665. Сиоооб получения "Г^-гссрбента воптпя А.Н..Кваше-нюк А.И..Яковлев В.И.,Носков Ф.С.,Иванова Л.В..Зиновьева Т.А.,Васильева Л.В.-Не подл .опубл. в откр. печ.,1981.

59. А.с.СССР N999596. Способ очистки ингибиторочувствительных вирусов.Крашенюк А.И.,Решетов П.Д.,Жигис Л.С.,Хохлов А.С.,Фридман Э.А.,Жеб-рун А.Б.-Не подл.опубл. в откр.печ., 1982.

60. А.с.СССР N975795. Способ концентрирования и очистки вирусных суспензий. Решетов П.Д.,Жигис Л.С.,Хохлов A.C..Носков Ф.С.,Крашенюк А.И.,Жебрун А.Б-..Чистяков A.B.,Зотин В.В. Опубл. в 5.H.,1982,N43.

61. А.с.СССР N1024501. Способ выделения лактопероксидазы.Крашенюк А.И..Денисова И.И.,Ажицкий Г.Ю.,Умовская Е.А., Носков Ф.С.,Хазенсон Л.Б.-Опубл. в Б.И.,1983,N23.

62. А.с.СССР N1009473. Способ получения иммуносорбеита для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки.Волкова А.Н.,Жебрун А.Б.,Иванова Л.В..Федотова Н.Б.Трекало В.Ю..Яковлев В.И..Носков Ф.С..Крашенюк А.И.-Опубл. в Б.И., 1983,N13.

63. А.с.СССР N1147153. Способ определения концентрации белковых веществ или вирусных частиц.Александров М.Л.Деровский В.Б.,Рейфман Л.С.,Полякова Т.И..Нефедов П.П..Крашенюк А.И.,Косксп Ф.С.-Не подл.опубл. в откр.печ., 1984.

64. А.с.СССР N1144371. Способ выделения и очистки вируса гриппа.Волкова А.Н-.,Крашенюк А.И.,Носков Ф.С.,Яковлев В.И..Федотова Н.Б., Сорочкина Р.Б.,Чистяков А.В.,Алесковский В.Б.,Постнов В.Н.-Не подл.опубл. в откр.печ.,1984.

65. А.с.СССР N1124977. Способ получения сорбента. Волкова А.Н.,Крашенюк А.И..Федотова Н.В..Яковлев В.И.-Опубл. в Б.И., 1984,N43.

66. А.с.СССР N1128956. Способ получения иммуносорбеита.Волкова А.Н..Крашенюк А.И..Нагорная Л.В.,Трекало В.Ю.,Федотова Н.В..Яковлев В.И.-Опубл. в Б.-И.,1984,N46.

67. А.с.СССР N1104849. Способ выделения вируса гриппа из вируссодержащей жидкости.Волкова А.Н..Крашенюк А.И..Федотова Н.Б.,Бех Г.М..Яковлев В.И.,-Носков Ф.С.,Жебрун А.Б.-Не подл, опубл. в откр.печ.,1984.

68. А.с.СССР N1167789. Способ получения инактивированной вирионной гриппозной вакцины.Носков Ф.С.,Жебрун А.Б.,Фридман Э.А.,Перадзе Т.В..Вичурина М.А.,Полянская Н.Ю.,Чубарова Н.И.,Крашенюк А.И.,Пейсель З.Г.-Неподл. опубл. в откр.печ., 1985.

69. А.с.СССР N1158643. Фильтровальный картон для очистки биологических жидкостей и способ его получения.Канарский А.В.,Платицина Н.В.,Стребкова Л.Н.,Гайденко В.Н..Рейфман Л.С.,Крашенюк А.И.,Константинов В.К.,Чистяков A.B.-Опубл. в B.H.,1985,N20.

70. А.С.СССР N1376559. Способ очистки вирусной суспензии по А.И.Крашеню-ку.Крашенюк А.И.-Не подл.опубл. в откр.печ., 1987.

71. A.O.CCCP N1257895. Способ выделения противогриппозных антител.Волкова

A.Н.,Крашенюк А.И..Федотова Н.Б.Дрекало В.Ю.,Нагорная Л.В.,Ржанова С.А.-Не подл.опубл. в откр.печ., 1986.

72. А.с.СССР N1244226. Способ приготовления фильтровального волокнистого материапа.Канарский А.В.,Фляте Д.М.,Платицина Н.В.,Спиридонов А.Л.,Рейф-ман Л.С.,Крашенюк А.И.,Константинов В.К.-Опубл. в Б.И.,1986,N26

73. А.с.СССР N1297298. Способ получения кремнеземного сорбента для хроматографии вирусов.Алферова Л.В.,Куреньгина Т.Н.,Крашенюк А.И.,Зотин

B.В.,Фирсов С.Л.,Носков Ф.С.ДСП, 1986.

74. А.с.СССР N1387408. Средство для дезинтеграции вирусов гриппа.Кривошеин Ю.С.,Рудько А.Н.,Криворутченко Ю.Л.,Ажицкий Г.Ю.,Митичкин О.В.,Лепский А.Н-.,Крашенок А.И.ДСП,1987.

75. А.с.СССР N1632039. Способ очистки вирусной суспензии от надмолекулярных образований.Крашенюк А.И.,Филиппова М.Л., Абышев А.З.,Дитмар И.А..Канарский А.В.,Платицина Н.В.,Рейфман Л.С..Лукьянова Э.Г.ДСП.1990.

76. А.с.СССР N1571067. Штамм вируса гриппа А/НШ/3/86/17 (H1N1) для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взролых и детей.Гаврилов

A.A..Полежаев Ф.И.,Маликова Э.В.,Васильева Р.Н.,Дриневский В.Н.,Нацина

B.К..Дорощенко Е.М.,Меркурьева Л.А.,Юхнова Л.Г.,Лонская Н.И.,Бардина Е.Е., Смородинцева Е.А..Литвинова О.М.,Масленникова И.И.,Крашенюк А.И.Опубл. в Б.И. 22,15.06.90.

77. А.с.СССР N1714834. Способ получения вирусной биомассы. Дмитриев Н.Г..СО-колова А.Н.,Крашенюк А.И.,Прохоренко П.Н., Коровин Р.Н.,Зеленский В.П.,Кор-нильева А.Г.,Погребняк Л.Л., Борисенко C.B..Батракова В.П.,Лукьянова Э.Г..Т-рекало В.Ю.. Филиппова М.Л.,Носков Ф.С..Брянцева Е.Н.,Пейсель З.Г.,Слатин Е.А.,Тулев Ю.В..Федорова С.М.ДСП,1991.

78. А.с.СССР N1703121. Способ контроля аллергенности живых гриппозных вак-цин.Трофимов В.И.,Крашенок А.И..Данилов Л.Н., Сергеев В.С.,Бондаренко В.П.,Лукьянова Э.Г.,Трекало В.Ю., Филиппова М.Л. Опубл. в Б.И. N1.07.01.92.

АВТОР

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений....................................................................1

Общая характеристика работы.....................................................3

Научная новизна..........................................................................6

Объекты и методы исследования...............................................10

1. Разработка методов прсдззр^тельнпй очистки и

концентрирования вирусных суспензий................................13

1.1. Высаливание примесных белков важ сульфатом аммония. ..15

1.2. Очистка и концентрирование вирионов методом микрофильтрации................................................................17

1.3. Стерилизация технических средств и фильтровальных материалов..........................................................................19

2. Разработка хроматографических методов

очистки вирионов.................................................................20

2.1. Аффинная хроматография вирионов гриппа на

иммобилизованных сиалопротеидах.....................................20

2.2 Хроматография вирионов гриппа на иммобилизованных

ингибиторах нейраминидазы................................................20

2.3.Хроматография вирионов гриппа на иммобилизованных лектинах...............................................................................21

2.4. Очистка вирионов иммуноаффинной хроматографией.........24

2.5. Очистка вирионов эксклюзионной жидкостной хроматографией на макропористых кремнеземах.................24

2.6. Влияние различных хроматографических факторов на хроматографическое разделение системы "вирус-примеси"..................................................................25

2.7. Оптимизация режима эжх вирусов на модифицированных МП К......................................................26

3. Использование систем "фикол-декстран" для определения

гидрофобности вирусов гриппа............................................28

4. Обоснование и разработка универсальной фильтрационно-

хроматографической технологии получения

вирионных вакцин................................................................37

5. Разработка методов контроля технологического процесса

очистки вирусных суспензий................................................42

5.1. Разработка иммунопотенциометрического метода

определения вируса гриппа.................................................42

6. Разработка препаративного метода выделения

гемагглютинина вируса гриппа.............................................45

6.1.Препаративное выделение НА вируса гриппа с антигенной формулой Н1, НЗ и штамма В/Ленинград/14/76...................46

6.2. Результаты работы по выделению гемагглютинина

Н1 и НЗ на установке "Таврия" методом ИЭФ.......................51

6.3. Выделение гемагглютинина вируса гриппа

на установке "ЭФУ-РОБОТ"..................................................54

7. Разработка технологии получения очищенной

живой гриппозной вакцины (ОЖГВ) для

интраназального применения...............................................55

7.1. Основные положения концепции "щадящей технологии" получения вакцины...............................................................55

7.2. Основные элементы получения ОЖГВ для интраназального применения...............................................57

Выводы.....................................................................................73

Список работ.............................................................................76

Оригинал-макет и тираж изготовлены в АО "Контакт-Плюс" Заказ по тел.: 164-6472

Информация о работе

Крашенюк, Альберт Иванович
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург, 1995
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология