Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение методов диагностики метапневмовирусной инфекции птиц

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение методов диагностики метапневмовирусной инфекции птиц"

НИКОНОВА Зоя Борисовна

005010635

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ

03.02.02 «Вирусология»

9 ОЕЗ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир-2012

сч

005010635

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заместитель директора

по качеству ФГБУ «ВНИИЗЖ» Старов Сергей Константинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кафедры биологии Владимирского государственного университета им. А.Г. и

Н.Г. Столетовых (ВлГУ), г. Владимир

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией культуры клеток с музеем клеточных штаммов Г осударственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), г. Покров

Стрижаков Александр Анатольевич

Юрков Сергей Григорьевич

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково. '

Защита диссертации состоится />> февраля 2012 г. в /Г часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан января 2012 г.

Учёный секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций «

доктор биологических наук Г А.П. Пономарев

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц

- респираторное заболевание, характеризующееся воспалительными процессами верхних дыхательных путей кур и индеек всех возрастов. Заболевание контагиозно, однако уровень смертности обычно не превышает 25% [5]. Экономический ущерб от МПВИ обусловлен повышенной выбраковкой некондиционной птицы, снижением прироста живой массы и яичной продуктивности.

Возбудителем заболевания является метапневмовирус птиц (МПВ птиц или Avían Metapneumovirus, aMPV) семейства Paramyxoviridae. Геном вируса представлен линейной несегментированной молекулой неинфекционной РНК и содержит 8 генов. Выделяют четыре подтипа метапневмовируса птиц: А, В, С и D. Вирусы подтипов А и В распространены в Европе, Азии, Африке, Южной и Северной Америке, тогда как МПВ птиц подтипа С циркулирует преимущественно у индеек в США [5]. Метапневмовирус птиц подтипа D был выявлен лишь однажды во Франции [9].

В птицеводческих хозяйствах России отмечают случаи респираторных заболеваний у кур и индеек различной степени тяжести. Поскольку клинические признаки и патологоанатомические изменения при МПВИ непатогномичны, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам.

1.2. Степень разработанности проблемы. Вопросам диагностики МПВИ птиц посвящены работы ряда зарубежных авторов [3, 4, 6, 7], однако разработанные ими методы имеют недостатки. Предложенная М.Н. Вауоп-Auboyer с соавт. одношаговая ОТ-ПЦР для выявления генома МПВ птиц всех 4 подтипов уступала по чувствительности подтипоспецифическим «nestecb-ПЦР [4]. Разработанные О. Guionie с соавт. подтипоспецифические ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) для выявления МПВ птиц обладали недостаточной специфичностью [6]. Учитывая широкое распространение МПВ

птиц подтипов А и В в мире, в том числе и в России, необходимо было разработать чувствительные и специфичные методы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса данных подтипов.

Молекулярную диагностику МПВИ птиц в птицеводческих хозяйствах России проводят с 2001 г. [2] с помощью ОТ-ПЦР (ген G), предложенной С. Naylor с соавт. [3] и D. Cavanagh с соавт. [7]. В 2001-2005 гг. геном МПВ птиц подтипов А и В выявили у птицепоголовья 3 и 9 хозяйств, соответственно. Однако филогенетические связи изолятов вируса изучены не были.

В работе Е.А. Лазуткиной и Б.Ф. Бессарабова изучены клинические признаки и патологоанатомические изменения при МПВИ у цыплят-бройлеров в условиях птицефабрики [1]. При этом выделение вируса и изучение его свойств при экспериментальном заражении птиц не проводили.

1.3. Цели и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка методов лабораторной диагностики МПВИ птиц, их применение для изучения распространения МПВ птиц в хозяйствах России, а также изучение свойств изолятов вируса. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. С помощью разработанных методов исследовать пробы патологического материала, полученные из птицеводческих хозяйств, на наличие МПВ птиц.

3. Изучить свойства полевых изолятов МПВ птиц.

4. Провести анализ гибридом с целью отбора клонов, продуцирующих специфические моноклональные антитела к МПВ птиц.

5. Разработать метод определения активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток, на основе твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител.

6. Установить филогенетические связи изолятов МПВ птиц, выявленных в 2005-2010 гг.

1.4. Научная новизна исследований. Разработаны подтипоспецифические методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР-РВ (ген в) и метод для одновременного выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР (ген И).

Создана база нуклеотидных последовательностей фрагментов генов в и N изолятов МПВ птиц, выявленных у кур и индеек из хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья в 2005-2010 гг.

Впервые определены полные последовательности генов Б, Р н N семи полевых изолятов МПВ птиц подтипа В, выделенных от кур из хозяйств России и Украины в 2007-2010 гг.

Разработан твердофазный непрямой «сэндвич»-вариант ИФА с использованием моноклональных антител для оценки активности антигена МПВ птиц, полученного в различных культурах клеток.

1.5. Практическая значимость работы. С помощью разработанных методов ПЦР на наличие генома МПВ птиц подтипов А и В исследовано 965 проб патологического материала от кур и индеек, поступивших в 2005-2010 гг. из птицеводческих хозяйств России и стран ближнего зарубежья. Установлено преобладание изолятов вируса подтипа В. Полученные результаты послужили обоснованием выбора штамма МПВ птиц подтипа В для производства вакцин против МПВИ птиц в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Разработанный метод твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА использовали для оценки качества вируссодержащего сырья на различных этапах изготовления диагностических тест-систем.

1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов

размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов диагностики МПВИ птиц на основе ПЦР и ИФА, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению биологических свойств изолятов МПВ птиц.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам 6, 7, 8, 10 паспорта специальности.

1.7. Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (г. Москва, 2011 г.), VII Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика-2010» (г. Москва, 2010 г.), Международных научно-практических конференциях молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2008 г. и 2010 г.), на заседаниях ученого совета ФГБУ ВНИИЗЖ в период с 2005 по 2010 гг.

1.8. Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту. Методы ОТ-ПЦР (ген N) и ОТ-ПЦР-РВ (ген G) для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В.

Результаты исследования проб патологического материала из птицеводческих хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья в 2005-2010 гг. на наличие МПВ птиц.

Изучение биологических свойств изолята МПВ птиц подтипа В aMPV/B/02/2007 при экспериментальном заражении цыплят.

Анализ моноклональных антител на специфичность к МПВ птиц и

разработка с их использованием твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для оценки активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток.

Результаты филогенетического анализа изолятов МПВ птиц по фрагментам генов в и N. Анализ полных последовательностей генов С, Р и N семи полевых изолятов МПВ птиц, выделенных в трахеальной органной культуре в 2007-2010 гг.

1.10. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы включает 12 отечественных и 177 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 23 рисунками.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2005-2011 гг. в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

1.11. Лнчнын вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали: канд. биол. наук Щербакова Л.О., канд. биол. наук Волкова М.А., канд. биол. наук Колосов С.Н., а также ст. науч. сотр. Московского научно-исследовательского института медицинской экологии (МНИИМЭ), канд. биол. наук Сологуб В.К.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы

2.1.1. Образцы патологического материала. В работе исследовали приготовленные в фосфатно-буферном растворе 10-20%-ные суспензии трахей, легких, носовых раковин кур и индеек из хозяйств России, стран ближнего зарубежья и от экспериментально инфицированных цыплят.

2.1.2. Штаммы микроорганизмов. Использовали вакцинные штаммы

МПВ птиц подтипа А (#8544) и подтипа В (PL21, VC03/50), выделенные от птиц из хозяйств России, а также изолят aMPV-A и вакцинный штамм PV03-B МПВ птиц подтипов А и В, соответственно, из коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ». Проверку специфичности методов проводили с использованием референтных штаммов вирусов инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека, а также реовируса, аденовирусов птиц серотипов 1-12, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma sinovia и изолята вируса лейкоза птиц подгруппы J.

2.1.3. Сыворотки и пероксидазные конъюгаты антител. Использовали сыворотки крови кур с антителами к МПВ птиц, нормальные сыворотки крови кур, а также антитела козы к иммуноглобулинам курицы («Synbiotics», США) и антитела к иммуноглобулинам мыши (НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи, г. Москва), конъюгированные с пероксидазой хрена.

2.1.4. Культуры клеток. Культивирование МПВ птиц проводили с использованием трахеальной органной культуры (ТОК), культур клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и почки зеленой мартышки Vero.

2.1.5. Животные. При экспериментальном заражении использовали цыплят породы белый леггорн, свободных от антител к МПВ птиц. Моноклональные антитела в составе асцитической жидкости получали с использованием белых мышей линии BALB/c.

2.2. Методы

2.2.1. Выбор праймеров и TaqMan-зондов осуществляли с помощью программ Primer Express, версия 3.0 («Applied Biosystems», США) и «Oligo», версия 3.3. Синтез осуществляла фирма НПО «Синтол» (г. Москва).

2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот с сорбентом NucleoS+ (ООО «Биоком», г. Москва).

2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ проводили с использованием системы «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Состав реакционной смеси: 5 мкл 5-

кратного буфера для ПЦР, 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл водного раствора 10 мМ dNTP, по 10 пмоль каждого из двух праймеров, 5 пмоль TaqMan-зондэ, по 1 ед. ферментов ревертазы и Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл РНК и вода до конечного объема 25 мкл. Температурный режим реакции: 50°С - 20 мин, 95°С - 5 мин и 40 циклов: 95°С - 10 с; 55°С — 35 с; 72°С - 15 с.

2.2.4. ОТ-ПЦР. Состав реакционной смеси для обратной транскрипции: по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 2 мкл 10 мМ dNTP, 4 мкл 5-кратного ревертазного буфера и 1 ед. ревертазы, 12 мкл раствора суммарной РНК. Смесь инкубировали 40 мин при 42°С, затем прогревали 3 мин при 95°С. ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Состав реакционной смеси для ПЦР и «nested»-nUP: 3 мкл кДНК, по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл 10 мМ dNTP, 5 мкл 5-кратного буфера для ПЦР, 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы и 11,5 мкл воды. Проводили 35 или 25 циклов амплификации, соответственно, при следующем температурном режиме: 94°С - 20 с; 53°С - 30 с; 72°С - 40 с. Учет результатов реакции проводили методом электрофореза в 1-2% агарозном геле с 0,001% бромистого этидия.

2.2.5. Очистку продуктов ПЦР проводили с использованием стекловолокнистых фильтров GF/F («Whatman», США) и 80% этанола с помощью вакуумного насоса.

2.2.6. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems»).

2.2.7. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили в программе BioEdit, версия 7.О.5.З. Построение дендрограмм проводили с помощью алгоритма Neighbor-Joining пакета программ MEGA, версия 4.0.

2.2.8. Выделение МП В птиц в трахеальной органной культуре. Трахеальную органную культуру готовили из трахей эмбрионов кур категории SPF на 19-21 сутки инкубации. Эксплантаты трахеи культивировали в 24-луночных культуральных планшетах. Вируссодержащий материал вносили в

объеме 50-100 мкл на один эксплантат трахеи и инкубировали в течение 1,0-1,5

ч. Затем инокулят удаляли и вносили 0,5-1,0 мл среды DMEM/F-12 («Sigma-Aldrich», США). Через 3-5 суток после инфицирования отбирали эксплантаты трахеи вместе с культуральной жидкостью. Для выделения МПВ птиц проводили 3 последовательных пассажа.

2.2.9. Определение титра инфекционной активности вируса в культурах клеток проводили по методу Кербера с использованием 10-кратных разведений вируссодержащего материала.

2.2.10. Культивирование гибридом in vitro проводили в питательной среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки плодов коров. В качестве «фидерных» клеток использовали перитонеальные макрофаги мыши, которые высевали в лунки культуральных планшетов или флаконов за 1-2 суток до внесения гибридом в концентрации 150-200 тыс. клеток в мл.

2.2.11. Культивирование гибридом in vivo. Мышей линии BALB/c с массой 16-18 г праймировали путем введения внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана («Sigma-Aldrich»), Через 10-14 суток в брюшную полость вводили не менее 10б гибридных клеток в объеме 0,5 мл. Через 10-20 суток отбирали асцитическую жидкость с моноклональными антителами (мкАТ).

2.2.12. Иммуноцитохнмический анализ (ИЦХА) проводили в инфицированной МПВ птиц культуре клеток Vero. Клетки фиксировали метанолом. Вносили исследуемые препараты мкАТ, а затем антитела козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве хромогена использовали З-амино-9-этилкарбазол.

2.2.13. Непрямой твердофазный вариант ИФА (н-ИФА). Тестирование мкАТ в н-ИФА методом последовательных двукратных разведений проводили по общепринятой методике. Для сенсибилизации планшетов использовали концентрированные препараты МПВ птиц подтипов А и В.

2.2.14. Непрямой твердофазный «сэндвич»-вариант ИФА (с-ИФА). Моноклональные антитела в составе асцитической жидкости сорбировали в

лунках полистироловых планшетов. После блокирования 1% раствором бычьего сывороточного альбумина, в лунки вносили двукратные разведения исследуемого материала, затем детекторные антитела (гипериммунные сыворотки крови кур с антителами к МПВ птиц) и на заключительном этапе -меченные пероксидазой хрена антитела козы к иммуноглобулинам курицы.

В качестве хромогена в н-ИФА и с-ИФА использовали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Результат реакции учитывали, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. Титром антител или антигена считали последнее разведение, ОП которого было больше или равно удвоенному среднему значению ОП отрицательного контроля.

2.2.15. Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов определяли среднее арифметическое при количестве опытов (п) и стандартное отклонения (а) среднего арифметического.

3. Результаты собственных исследований

3.1. Разработка ОТ-ПЦР (ген IV). В качестве гена-мишени при разработке метода ОТ-ПЦР для одновременного выявления генома МПВ птиц подтипов А и В использовали консервативный ген И, имеющий 76% сходства нуклеотидных последовательностей между вирусами данных подтипов. Были выбраны 2 пары праймеров (Б1 и 11805 для обратной транскрипции и ПЦР, Р37 и 11736 для «пе.ч1ес!»-ПЦР), фланкирующие фрагменты гена N длиной 824 н. и 719 н., соответственно. Специфичность ОТ-ПЦР (ген И) подтвердили с использованием проб, содержащих различные штаммы и изоляты МПВ птиц, а также другие инфекционные агенты птиц. Значение аналитической чувствительности ОТ-ПЦР (ген К) составило 2,0±0,4 1ц ТЦД5о/мл и не уступало значению чувствительности ОТ-ПЦР (ген в).

3.2. Разработка ОТ-ПЦР-РВ (ген в). В качестве гена-мишени при разработке методов ОТ-ПЦР-РВ для выявления МПВ птиц подтипов А и В использовали ген й. Сходство его нуклеотидных последовательностей между вирусами подтипов А и В составляет 56-61%, что позволило выбрать

подтипоспецифические праймеры и ТацМап-зонды с наименьшей вероятностью перекрестных реакций. Специфичность разработанных ОТ-ПЦР-РВ (ген в) была продемонстрирована с использованием МПВ птиц подтипов А и В, а также проб, содержащих другие инфекционные агенты птиц. Положительные результаты получили только для проб, содержащих МПВ птиц

соответствующего подтипа. Аналитическая чувствительность обоих методов ОТ-ПЦР-РВ (ген О) составила 1,0±0,3 ТЦД50/мл и не уступала

чувствительности методов ОТ-ПЦР-РВ, предложенных О. втоше с соавт. [6].

3.3. Исследование образцов патологического материала на наличие генома МПВ птиц в 2005-2010 гг. С использованием разработанных методов исследовано 965 проб патологического материала от птиц из 182 птицефабрик 50 регионов России и некоторых стран ближнего зарубежья. Геном МПВ птиц подтипа А выявили в 5 пробах от кур из 2 птицефабрик, расположенных в Костромской и Ленинградской областях. Геном МПВ птиц подтипа В выявили в 156 пробах от кур и индеек из 62 птицефабрик, расположенных в 31 регионе России, а также Украине и Беларуси. Наиболее часто вирус выявляли у бройлеров в возрасте 20-40 суток. Наибольшее количество случаев выявления МПВ птиц отмечали в феврале-апреле и сентябре-декабре (рис. 1). Подобная зависимость описана для МПВИ птиц в США, где пики заболеваемости приходятся на апрель-май и октябрь-декабрь [8].

35

30

25

20

15

10

5

0

28 28 29 Н ~1

23

17 и

13 14 н □ %случаев выявления МПВ птиц

п 10"

II II

11 I 11

/У А/^//////

Рис. 1. Соотношение случаев выявления МПВ птиц и количества исследований, приходящееся на каждый месяц в период с 2005 по 2010 гг.

Пробы патологического материала от индеек исследовали также на наличие генома МПВ птиц подтипа С с помощью ОТ-ПЦР-РВ (ген БН), предложенной О. Ошоше с соавт. [6]. Геном МПВ птиц подтипа С за рассматриваемый период выявлен не был.

3.4. Выделение МПВ птиц проводили в ТОК. Репродукция вируса в клетках мерцательного эпителия приводила к цилиостазу через 7-10 суток после инфицирования. В 2007-2010 гг. было выделено 7 полевых изолятов МПВ птиц подтипа В (табл. 1).

Таблица 1

Выделенные в ТОК изоляты МПВ подтипа В

_________________________________________________________(п=3)

№ Изолят Регион выделения Хозяин Возраст птиц (сутки) Контаминация другими вирусами Титр инфекционной активности после 3 пас. в ТОК (lg ЦД,,/мл)

1 aMPV/B/02/2007 Калужская обл. Бройлеры 20-30 нет 4,58±0,12

2 aMPV/B/07/2008 Брянская обл. Бройлеры 24 ИБК' н.и/

3 aMPV/B/10/2008 Волгоградская обл. Бройлеры 32-38 илц- ни

4 aMPV/B/05/2009 Украина Бройлеры 38-39 нет 4,58±0,12

5 aMPV/B/14/2009 Белгородская обл. Бройлеры 32 нет 4,92±0,12

6 aMPV/В/12/2010 Респ. Мордовия Несушки 153,315 нет 4,88±0,13

7 aMPV/B/22/2010 Белгородская обл. Бройлеры 29 ИБК ни.

Примечания:' - инфекционный бронхит кур;инфекционная анемия цыплят; '-не исследовали.

Специфичность изолятов вируса подтверждали методом ОТ-ПЦР. Выделенные в ТОК изоляты МПВ птиц были адаптированы к культурам клеток ФЭК и Vero. После 3 последовательных пассажей контаминация изолятов aMPV/B/07/2008, aMPV/B/10/2008 и aMPV/B/22/2010 вирусами ИБК и ИАЦ была исключена методом ПЦР, объяснением чего может служить их низкая способность к репродукции в культурах клеток ФЭК и Vero. Всего провели по 10 пассажей каждого изолята МПВ птиц в данных культурах клеток.

3.5. Характеристика моноклональных антител к МПВ птиц. Совместно с сотрудниками МНИИМЭ в 2009 г. была получена панель гибридом с использованием штамма PV03-B МПВ птиц. Первичные препараты 28 мкАТ были получены в виде культуральных жидкостей. В результате

анализа специфичности мкАТ методами ИЦХА и н-ИФА положительный результат с антигеном МПВ птиц подтипа В был получен для мкАТ 801, 11П, 12Б2,13Е2, с антигеном вируса подтипа А - только для мкАТ 13Е2 (табл. 2).

Таблица 2

Результаты определения специфичности мкАТ с антигенами МПВ птиц

подтипов А и В

________________________________________________(п=1)

№ мкАТ Подкласс мкАТ Результат ИЦХА с МПВ птиц подтипа Титр мкАТ в н-ИФА с антигеном МПВ подтипа

А в А В

1 8Э1 2а отриц. положит. отриц. 683±241

2 1ІИІ 1+2Ь отриц. положит. отриц. 107±30

3 1202 1 отриц. положит. отриц. 512±0

4 13Е2 1 положит. положит. 85±30 107±30

Примечание: за титр в н-ИФА принималась величина, обратная разведению антител.

3.6. Разработка непрямого с-ИФА. Для оценки активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток, необходимо было разработать метод непрямого с-ИФА. В качестве улавливающих антител использовали мкАТ к МПВ птиц в виде асцитических жидкостей. Пригодность мкАТ 801, 11Р1, 12D2,13Е2 оценивали с антигенами МПВ птиц подтипов А и В (табл. 3).

Таблица 3

Результаты подбора мкАТ для использования в качестве улавливающих антнтел в непрямом с-ИФА с различными антигенами МПВ птиц

(п=3)

№ Штамм / изолят МПВ птиц Подтип вируса Титр антигена в с-ИФА с мкАТ

801 ИЯ! 1202 13Е2

1 аМРУ-А А отриц. отриц. отриц. 64±0

2 #8544 А 2±0 5±2 2±0 213±60

3 РУОЗ-В В 427±121 85±30 213±60 171±60

4 РЬ21 В 213±60 32±0 107±30 43±15

5 УСОЗ/50 В 2±0 53±15 2±0 53±15

6 аМРУ/В/02/2007 в 27±8 213±60 53±15 128±0

7 аМРУ/В/07/2008 в 213±60 128±0 107±30 171±60

8 аМРУ/В/10/2008 В 7±2 27±8 7±2 43±15

9 аМРУ/В/05/2009 в 427±121 43±15 213±60 213±60

10 аМРУ/В/14/2009 в 53±15 7±2 64±0 53±15

11 аМРУ/В/12/2010 в 5±2 43±15 отриц. 107±30

12 аМРУ/В/22/2010 в 1024±0 128±0 853±241 1024±0

Примечание: титр антигена в с-ИФА представлен как величина, обратная разведению исследуемого образца.

Иммобилизованные на твердой фазе мкАТ 13Е2 специфически связывались со всеми исследованными антигенами вируса обоих подтипов и были выбраны в качестве улавливающих антител в с-ИФА.

Установлено, что при исследовании антигенов МПВ птиц подтипов А и В в непрямом с-ИФА в качестве детекторных антител необходимо использовать гипериммунные поликлональные сыворотки крови кур с антителами к вирусу того же подтипа.

Специфичность разработанного метода непрямого с-ИФА определили с использованием гетерологичных антигенов, активность которых не превышала фоновый уровень, полученный в реакции с нормальной культурой клеток. Значение чувствительности метода в отношении различных штаммов и изолятов МПВ птиц составило в среднем 4,0±0,3 1§ ТЦДзо/мл. Каждый образец антигенсодержащего материала исследовали в непрямом с-ИФА в трех повторностях. Отклонения в титрах не превышали величину одного 2-кратного разведения, что свидетельствует о воспроизводимости результатов метода.

Метод непрямого с-ИФА использовали для оценки качества вируссодержащего сырья на различных этапах изготовления диагностических тест-систем.

3.7. Изучение биологических свойств изолята аМРУ/В/02/2007 МПВ

птиц. Биологические свойства изолята аМРУ/В/02/2007, выделенного от цыплят-бройлеров одной из птицефабрик Калужской области, были изучены при экспериментальном заражении. Вирус вводили цыплятам в возрасте 7 суток интраназально, орально и на конъюнктиву в дозе 3,6 ЦД50/мл на цыпленка. К инфицированным цыплятам экспериментальной группы подсаживали неинфицированных цыплят контактной группы и содержали их совместно в течение 28 суток (срок наблюдения).

У птиц экспериментальной и контактной групп наблюдали конъюнктивиты и риниты (мутные пенистые выделения из носовых щелей при легком надавливании). При патологоанатомическом исследовании отмечали

точечные кровоизлияния в слизистых носовых полостей, отечность и геморрагические поражения конъюнктивы, скопление слизи в ротовой полости и трахее. Геном изолята МПВ птиц аМРУ/В/02/2007 был выявлен методом ОТ-ПЦР в оральных смывах цыплят экспериментальной группы в период со 2 по 7 сутки, контактной группы - с 4 по 10 сутки после инфицирования. Вирус репродуцировался только в эпителии верхних дыхательных путей (носовых раковин и трахеи), где его выявили методом ОТ-ПЦР. В других органах геном вируса выявлен не был. Вирусспецифические антитела выявили в сыворотках крови цыплят экспериментальной и контактной групп, начиная с 10 и 18 суток после инфицирования, соответственно.

3.8. Филогенетический анализ нзолятов МПВ птиц. Для филогенетического анализа вариабельного гена в изолятов вируса подтипа А использовали фрагмент длиной 268 н. (нуклеотиды 137-404 ОРС гена в), подтипа В - 361 н. (нуклеотиды 47-407 ОРС гена в). Для анализа нуклеотидных последовательностей консервативного гена N МПВ птиц подтипов А и В использовали фрагмент 719 н. (нуклеотиды 37-755 ОРС гена К). Все выявленные нами изоляты МПВ птиц имели отличия от вакцинных штаммов #8544, РУ03-В, РЬ21 и УСОЗ/50.

У кур одной из птицефабрик Ленинградской области в 2007, 2008 и 2010 гг. выявили идентичные между собой изоляты МПВ птиц подтипа А аМРУ/А/01/2007, аМРУ/А/01/2008 и аМРУ/А/01/2010. Отличия нуклеотидных последовательностей данных изолятов от опубликованных в ОепВапк последовательностей вируса подтипа А для фрагментов генов в и N составили 1,1 -3,0% и 0,8-1,6%, соответственно.

Большинство выявленных в 2005-2010 гг. изолятов МПВ птиц относились к подтипу В. Уровень отличий нуклеотидных последовательностей фрагментов генов в и N изолятов МПВ птиц подтипа В по сравнению с опубликованными в ОепВапк последовательностями вируса составил 0,3-6,7% и 0,5-3,4%, соответственно. Изоляты МПВ птиц подтипа В были генетически родственны

евразийским и африканским штаммам вируса и имели более значительные отличия от вирусов из Бразилии, за исключением изолята аМРУ/В/ВгагП-05/ШР-01, прародителем которого мог быть вакцинный штамм европейского происхождения.

Установлена способность МПВ птиц к длительной персистенции среди птицепоголовья отдельных хозяйств. Например, у кур одной из птицефабрик Московской области в 2006 г. и 2010 г. были выявлены изоляты МПВ птиц, сходство нуклеотидных последовательностей фрагмента гена в которых составляло 99,7%. В одном из хозяйств Ростовской области в 2009 г. у бройлеров был дважды выявлен изолят МПВ птиц, имеющий 99,4% сходства последовательности фрагмента гена в с вирусом, выявленным в 2007 г.

В результате филогенетического анализа фрагмента гена в было показано разделение изолятов МПВ птиц подтипа В на 6 кластеров (рис. 2). Достоверными на основании значений бутстрэп-анализа (>70%) можно считать кластеры 2 и 3, выделение остальных кластеров основано на топологии филогенетических связей. Результаты филогенетического анализа фрагмента гена N подтвердили существование кластеров генетически близких изолятов МПВ птиц.

Изолят аМ Р\'7В/07/2009 из Брянской области не был отнесен к кластеру

3, однако генетически был наиболее близок к изолятам данного кластера по результатам анализа фрагментов генов С и N.

Идентичные между собой по последовательности фрагмента гена в изоляты аМР У/В/02/2007, аМРУ/В/10/2007, аМРУ/В/11/2007 и аМРУ/В/24/2009 из Калужской области не были отнесены ни к одному из выделенных кластеров. В результате филогенетического анализа фрагмента гена N было установлено их родство с изолятами кластеров 2 и 4.

Н— 87:

Jl- vco. П vco3/t L 2119 (L

. Lipetskaya/ch/06/2009 18/2009 36/2009' .. Lipetskaya/ch/35/2009" н-izJ В ryanskaya/ch/0 7/2008 19/2009 L_ Lipe1sKaya/cW25/20fl) 25/2010 - Tverskaya/ch/17/2009 22/2TJ09 _ Moskovskaya/ch/30/20D9 02/2010 Tverskaya/ch/04/2010 " Moskovskaya/ch/01/2006 r_ MoskovshayaicW13/2010

L---- MoskovsKaya/ch/12/2009

rl _ Moskovskaya/ch/07/2Q06 LL 0rlovskaya/ch/04/2008 I, II 0riovskaya/ch/02/2006 ] 1 0rtevskaya/thro5/2005 82. Kurskaya/ch/02/2009 —1 KurSKaya/ch/0p/2009_

cluster 1

Hungary/657/4 (L 34033) - 872S (L34034)

VC03/56 (vaccine A viffa RTI)

VCO3/6061O (AB548428)

- 2119(134031)

Kaluzhskaya/ch/02/2007 10/2007 11/2007 24/2009

lsr/1708/02 i-Avr70o^e0'~ “

>skovskaya/ch/11/2010 20/2010 - Moskovskaya/06/2010 ' • ' '4/2007 С-----

„ Tulskaya/ch/0 4/2007 05/2007 06/2007 13/2007 55. TulsKaya/tu/04/2006 H9/2007 ~ ~

1 Tvilskaya!Hif01f2007~0^/2007 0S/2007 14/2007 05/2008. aMPV/chicken/Nigeria/NIR89/2006 {AM490057) ~

— Bryanskaya/Ch/07/2009

. Samarskaya/ch/25/2009 17 S.imarskaya/ch/06/2008 —-I P&n2ensHayaich/23/2010 I— Samarskaya/ch/r''"’"', ,.lordoviya/ch/33/2009 с ..-J Mordoviya/ch/32/2009"

I Mordoviya/ch/12/2010 I— Belc}o»odsHayn>chM4/2009

cluster 2

л. BelgoroHsknya/ch/08( KursKayafch/32/2010 I Belgorodskaya/ch/07/2010 — Belgorodskaya/ch/22/2010 Saratovskaya/ch/02/2008 —З— SaratovsKaya/ch/27/2010 '«5 Ukraine/chl05J2009 ^ Ukrame/tu/29/2009 Ukraine/ch/20/2009 Lipetskaya/ch/03/2006

12 Volgogradskaya/ch/16/2010 “1 Voigogradskaya/chi 15/2010

------ Belarus/eh/03/2010

. Rostovskaya/ch/01/2008 11/2008 Rostovskaya/ch/12/2007

— Rostovskaya/ch/17/2010

— Krasnodarsky/ch/06/2006

---- Dagestan/br/33/2010

— Volgogradskaya/ch/10/2G08_11/2Q09

04— Rostovskaya/cW30/2010

‘И Rostovskaya/cWQ1/2010 • 1—Rostovskaya/ch/10/2009 27/2009

---- Moskovskaya/tu/08/2006 ” •

— Nizhegorodskaya/13/2009

---- VaroslavsKaya/ch/23/2009

PL21 (vaccine Nemovaci

---------- Kostromskaya/14/2010

____ aMPWB/Brazl-05/uSP-01 (DQ78639BI

,— Vladimirskaya/ch/26/2009 •—>— Vladimirskaya/ch/07/2007 I— Vladimirskaya/chl03/2009 I— lvar>ovskaya/ch/16/2009 05/2010 , Komi/08/2009 ~

1----- Komi/21/2010

I i— Bashkortostan/09/2008 ~T_ Permskyichi19/2010 24/2010

X

7Л- Ulyanovskaya/ch/05/2006 82j— Tatarstan/ch/04/2009 34/2009

1 Tatarstan/ch/09/2010~

. Tatarstan/ch/09/2010~

- Chuvashiya/ch/01/2009

cluster 3

cluster 4

cluster 5

..— unuvasniya/cn'uiuuus

- I— Kwgenskayalch>10l2010 CJ Chelyabinskaya/15/2009 Ml Cheiyabinskaya/ch/28/2009_37/2009

----------' aMPV/8/BrezH-05/USP-02 (DQ786397)

eMPV/B/Brazl-05/USP-04 (DQ786399) 8MPV/B/Brazrl-0S/USP-03 (00786399) aMPV/B'Brazil-07/USP-05 (EU140746) eMPV/B/Brazil-07/USP-06 (ЕЛ4074Л aMPV/B/Brazil-07/VSP-Vd (BV140749) aMPV/B/Brazil-06/USP-07 (EU140748) aMPV/chicken/B/Brazil/23-t>7T/20Q7(FJ8289S0} aMPV/chicken/B/Brazil/2 7A-07/200 7 (FJ828952) aMPV/chicken/B/Brazil/23-07P/2007 (FJ828951)

- aMPV/chicken/B/BraziV25A-07/206? (FJ828953)

Рис. 2. Филогенетическое положение изолятов МПВ птиц подтипа В,

установленное на основе анализа участка гена С (361 н.)

Примечание: для опубликованных в ОелВапк последовательностей в скобках указаны номера.

В большинстве случаев изоляты МПВ птиц каждого из кластеров выявляли в смежных регионах (рис. 3).

Регионы:

1 - Московская обл. (6)

2 - Тверская обл. (I)

3 - Ярославская обл. (I)

4- Ивановская обл. (1)

5- Владимирская обл. (2)

6- Тульская обл. (3)

7- Калужская обл. (1)

8- Костромская обл. (2)

9- Нижегородская обл. (2)

10- Peen. Мордовия (3)

11 - Пензенская обл. (1)

12 - Липецкая обл. (2)

13 - Орловская обл. (2)

14- Брянская обл. (2)

15 - Курская обл. (2)

16- Белгородская обл. (3)

17 - Воронежская обл. (1)

18- Краснодарский край (2)

19- Ростовская обл. (6)

20 - Волгоградская обл. (3)

21 - Саратовская обл. (1)

22 - Респ. Чувашия (1)

23 - Самарская обл. (2)

24 - Респ. Татарстан (I)

25- Респ. Башкортостан (1)

26- Челябинская обл. (2)

27 - Курганская обл. (1)

28 - Пермский край (1)

29- Респ. Коми (1)

30- Ульяновская обл. (1)

31 - Ленинградская обл. (1)

32 - Дагестан (1)

Рис. 3. Регионы России, в которых в 2005-2010 гг. были выявлены изоляты МП В птиц подтипов А (□) и В (•)

Примечания: Случаи выявления изолятов МПВ птиц обозначены цветом в соответствии с принадлежностью вируса к определенному кластеру (дендрограмма на рис. 2).

Для каждого региона в скобках указано количество хозяйств, в которых были выявлены изоляты МПВ птиц.

Особенности географического распространения генетически сходных изолятов МПВ птиц можно объяснить существованием для отдельных регионов единого источника возбудителя, которым мог быть полевой изолят или вакцинный штамм вируса. Например, вероятным прародителем изолятов МПВ птиц кластера 5 мог быть вакцинный штамм PL21. Вопрос о происхождении большинства российских изолятов МПВ птиц остается открытым. Метапневмовирус птиц и антитела к нему выявляли в хозяйствах России, начиная с 2001 г., т.е. до распространения вакцинации против МПВИ птиц [2]. Предположительно, это могли быть эндемичные или занесенные с племенной птицей из стран Европы изоляты МПВ птиц.

3.9. Анализ полных последовательностей генов G, F и N изолятов МПВ птиц. Гены G и F кодируют поверхностные гликопротеины вируса,

являющиеся его главными антигенными детерминантами. Ген N кодирует внутренний консервативный белок вируса - нуклеопротеин.

Филогенетические отношения изолятов МПВ птиц аМРУ/В/02/2007 аМРУ/В/07/2008, аМРУ/В/10/2008, аМРУ/В/05/2009, аМРУ/В/14/2009,

аМРУ/В/12/2010 и аМРУ/В/22/2010 были сходными при анализе последовательностей всех трех генов в, Р и N вируса. Высокий уровень сходства был установлен для изолятов аМРУ/В/05/2009, аМРУ/В/14/2009, аМРУ/В/12/2010 и аМРУ/В/22/2010 из Белгородской области, Республики Мордовия и Украины. По результатам проведенного ранее филогенетического анализа фрагмента гена в перечисленные изоляты вируса входили в состав кластера 3 (дендрограмма на рис. 2). Таким образом, была подтверждена достоверность полученных ранее результатов.

Уровень отличий нуклеотидных последовательностей полных генов в, Р и N изолятов МПВ птиц между собой и от опубликованных в ОепВапк последовательностей составил 0,7-6,6%, 0,7-2,8% и 1,2-2,6%, соответственно. Сайт разрезания белка Р0 на две биологически активные субъединицы Р1 и Р2 всех проанализированных нами изолятов вируса представлял консервативную для МПВ птиц подтипа В последовательность ИККК/РУЪ.

Полные последовательности трех генов семи изолятов МПВ птиц подтипа В были опубликованы в международной базе данных ОепВапк (номера Ж651915-ЛЧ651921 для гена С, номера №792492 и 1Р810661-Л?810666 для гена Б, номера Ж651922-Ш651928 для гена К).

4. Выводы

1. Разработаны высокоспецифичные методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР (ген И) и ОТ-ПЦР-РВ (ген в), аналитическая чувствительность которых составила 2,0±0,4 и 1,0±0,3 1§ ТЦД5о/мл вируса, соответственно.

2. С помощью разработанных методов в 2005-2010 гг. геном МПВ птиц подтипа А выявили в 5 пробах от кур из 2 птицефабрик России, подтипа В

- в 156 пробах от кур и индеек из 62 птицефабрик, расположенных в России, Украине и Беларуси. Геном МПВ птиц подтипа С не выявили.

3. Выделены 7 изолятов МПВ птиц подтипа В. При экспериментальном заражении изолят вируса аМРУ/В/02/2007 репродуцировался в эпителии верхних дыхательных путей цыплят, вызывал риниты, конъюнктивиты и гуморальный иммунный ответ.

4. В результате анализа из панели гибридом был выбран клон, секретирующий моноклональные антитела, специфичные к различным антигенам МПВ птиц подтипов А и В.

5. Разработан непрямой твердофазный «сэндвич»-вариант ИФА с использованием моноклональных антител для оценки активности антигенов МПВ птиц подтипов А и В, полученных в различных культурах клеток. Чувствительность метода составила 4,0±0,3 ТЦДзо/мл.

6. Установлены филогенетические связи изолятов МПВ птиц на основе анализа фрагментов генов в и N. Показано разделение изолятов МПВ птиц подтипа В на кластеры генетически родственных вирусов, выявляемых преимущественно в смежных регионах. Установлена способность МПВ птиц к длительной персистенции среди птицепоголовья отдельных хозяйств.

7. Впервые определены полные последовательности генов в, Р и N семи изолятов МПВ птиц подтипа В, выделенных от кур из хозяйств России и Украины. Филогенетические связи между изолятами были сходными при анализе последовательностей всех трех генов и соответствовали установленным ранее для фрагментов генов в и N.

5. Практические предложения

В результате проведенных исследований разработаны следующие нормативные документы:

«Методические указания по выявлению генома метапневмовирусов птиц подтипов А и В методом полимеразной цепной реакции (ген И)» (утверждены 20.12.2010 г.);

«Методические указания по выявлению метапневмовирусов птиц подтипов А и В с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (утверждены 05.02.2010 г.);

«Методические указания по выделению и определению титра инфекционной активности метапневмовирусов птиц подтипов А и В с использованием трахеальной органной культуры» (утверждены 21.09.2010 г.);

«Методические указания по выявлению антигена метапневмовируса птиц в твердофазном непрямом «сэндвич»-варианте иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител» (утверждены 29.08.2011 г.).

Данные методические указания прошли комиссионные испытания, были одобрены ученым советом, утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» и рекомендованы для использования при проведении диагностических и научных исследований.

6. Список использованной литературы

1. Лазуткина Е.А., Бессарабов Б.Ф. Клинические признаки, патологоанатомические и гистоморфологические изменения при синдроме опухшей головы у цыплят-бройлеров // Материалы III междунар. вет. конгр. по птицеводству.-М., 2007.-С. 111-116.

2. Молекулярная диагностика респираторных заболеваний кур -инфекционного бронхита и пневмовирусной инфекции в России / Ю.А. Бочков, Л.О. Щербакова, Г.В. Батченко [и др.] // Диагностика инфекционных заболеваний: сб. тез. IV Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2002. - С. 324-327.

3. Appearance of type В avian pneumovirus in Great Britain / C. Naylor, K. Shaw, P. Britton, D. Cavanagh // Avian Pathol. - 1997. - Vol. 26. - P. 327-338.

4. Comparison of F-, G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus / M.H. Bäyon-Auboyer, V. Jestin, D. Toquin [et al.] // Arch. Virol. - 1999. - Vol. 144. -P. 1091-1109.

5. Cook J.K.A. Avian rhinotracheitis // Rev. Sei. Techn. Off. Intern. Epiz. -

2000. - Vol. 19, № 2. - P. 602-613.

6. Laboratory evaluation of a quantitative real-time reverse transcription PCR assay for the detection and identification of the four subgroups of avian metapneumovirus / O. Guionie, D. Toquin, E. Sellal [et al.] // J. Virol. Methods. -2007.-Vol. 139.-P. 150-158.

7. Longitudinal field studies of infectious bronchitis virus and avian pneumovirus in broilers using type-specific polymerase chain reactions / D. Cavanagh, K. Mawditt, P. Britton, CJ. Naylor // Avian Pathol. - 1999. - Vol. 28. -P. 593-605.

8. Molecular epidemiology of subgroup С avian pneumoviruses isolated in the United States and comparison with subgroup A and В viruses / H. Shin, K.T. Cameron, J.A. Jacobs [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, № 5. - P. 16871693.

9. Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup / M.H. Bayon-Auboyer, C. Amauld, D. Toquin, N. Eterradossi // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. - P. 27232733.

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение биологических свойств изолята метапневмовируса птиц aMPV/B/2-07 / З.Б. Хлебовец, А.Э. Меньщикова, М.Е. Качалова, И.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Ветеринарная патология (перечень ВАК). -2007. -№ 4 (23). - С. 141-146.

2. Выявление и типирование метапневмовирусов птиц в Российской Федерации / З.Б. Хлебовец, А.С. Пронин, И.А. Борисова, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. -Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 317-324.

3. Выявление метапневмовирусов птиц в Российской Федерации с помощью молекулярно-биологических методов / З.Б. Хлебовец, JI.O.

Щербакова, Д.Ю. Козлов, Н.С. Мудрак, A.B. Борисов, В.В. Дрыгин // Сб. тр. V Между нар. вет. конгр. по птицеводству. - М., 2009. - С. 114-118.

4. Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома метапневмовируса птиц / З.Б. Никонова, Н.Г. Зиняков, Н.С. Мудрак,

A.B. Борисов, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Молекулярная диагностика - 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - М., 2010. - Т. 2. -С. 154-156.

5. Выделение полевых изолятов метапневмовируса птиц в трахеальной органной культуре / З.Б. Никонова, С.П. Лазарева, Н.С. Мудрак,

B.В. Дрыгин // Ветеринарна медицина. Вип. 95: м1жвщ. тем. наук. зб. - Харьк1в, 2011.-С. 122-124.

6. Изучение особенностей персистенции и тропизма пневмовируса птиц подтипа А с помощью полимеразной цепной реакции / З.Б. Хлебовец, Л.О. Щербакова, Т.Б. Манин, Г.В. Батченко, В.В. Дрыгин, С.К. Старов // Сб. тр. I Междунар. вет. конгр. по птицеводству. - М., 2005. - С. 93-97.

7. Выявление патогенных микоплазм и вирусов у кур с клиническими признаками респираторной инфекции и теносиновитом на птицефабриках России / A.B. Спрыгин, Е.В. Овчинникова, З.Б. Никонова Н.Г. Зиняков, Т.И. Ерошина, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин // БИО. - 2011. -№3 .-С. 19-20.

8. Обоснование выбора подтипа пневмовируса птиц в качестве антигена инактивированной вакцины / A.C. Пронин, Н.И. Герасимова, М.А. Волкова, З.Б. Хлебовец, И.А. Борисова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2006. - Т. 4. - С. 323-328.

8. Список сокращений ИЦХА - иммуноцитохимический анализ мкАТ - моноклональные антитела МПВ - метапневмовирус МПВИ - метапневмовирусная инфекция

п. — нуклеотиды

н-ИФА - непрямой вариант иммуноферментного анализа

ОП - оптическая плотность

ОРС - открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

с-ИФА - «сэндвич»-вариант иммуноферментного анализа

ТПДл, - 50%-ная тканевая цитопатическая доза

ФЭК - фибробласты эмбрионов кур

ЦД5о - 50%-ная цилиостатическая доза

aMPV - avian Metapneumovirus

dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты

SPF - свободный от специфических патогенов

Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 80 экземпляров, январь 2012 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никонова, Зоя Борисовна, Владимир

61 12-3/502

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

На правах рукописи

НИКОНОВА Зоя Борисовна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ

03.02.02 Вирусология

/ /у Л / /X

/''//X

¡г* и

/ / /

Научный руководитель -СТАРОВ Сергей Константинович

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

На правах рукописи

НИКОНОВА Зоя Борисовна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ

03.02.02 Вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -СТАРОВ Сергей Константинович

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГТЦ - гуанидинтиоционат

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ИАЦ - инфекионная анемия цыплят

ИБК - инфекционный бронхит кур

ИФА - иммуноферментный анализ

ИЦХА - иммуноцитохимический анализ

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер

кДНК - ДНК-копия с РНК-матрицы

мкАТ - моноклональные антитела

МПВ - метапневмовирус

н. - нуклеотиды

н-ИФА - непрямой вариант иммуноферментного анализа ОП - оптическая плотность ОРС - открытая рамка считывания ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в

режиме реального времени

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РЭК - развивающиеся эмбрионы кур

с-ИФА - «сэндвич»-вариант иммуноферментного анализа

СПК - сыворотка плода коров

ТБЕ - трис-боратный буфер

ТБС-Т - солевой трис буфер с добавлением твин-20

ТМБ - 3,3',5,5"-тетраметилбензидин

ТЦД5о - 50%-ная тканевая цитопатическая доза

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ФЭК - фибробласты эмбрионов кур

ЦД50 - 50%-ная цилиостатическая доза

ЦПД - цитопатическое действие

aMPV - avian Metapneumovirus

dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты

SPF - свободный от специфических патогенов

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................12

1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц........................................................12

1.1.1. Исторические и эпизоотологические данные...................................12

1.1.2. Патогенез..............................................................................................14

1.1.2.1. Клинические признаки................................................................15

1.1.2.2. Тропизм вируса и патологоанатомические изменения............17

1.1.2.3. Иммунитет при метапневмовирусной инфекции птиц............18

1.1.3. Специфическая профилактика............................................................20

1.2. Характеристика МПВ птиц........................................................................22

1.2.1. Классификация.....................................................................................22

1.2.2. Строение и состав................................................................................25

1.2.3. Свойства................................................................................................29

1.2.4. Устойчивость к физическим и химическим факторам....................30

1.2.5. Цикл репродукции...............................................................................32

1.3. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц.................................33

1.3.1. Молекулярные методы диагностики..................................................33

1.3.2. Выделение вируса................................................................................36

1.3.3. Серологические методы диагностики................................................38

1.3.4. Гибридомная технология............................ ........................................39

1.4. Заключение по обзору литературы.............................................................40

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................42

2.1. Материалы и оборудование........................................................................42

2.1.1. Образцы патологического материала................... .............................42

2.1.2. Штаммы микроорганизмов.................................................................42

2.1.3. Сыворотки и пероксидазные конъюгаты антител............................42

2.1.4. Последовательности МПВ птиц из базы данных ОепВапк.............43

2.1.5. Ферменты и дезоксинуклеозидтрифосфаты.....................................44

2.1.6. Праймеры..............................................................................................45

2.1.7. Животные..............................................................................................46

2.1.8. Культуры клеток..................................................................................46

2.1.9. Среды для культивирования...............................................................46

2.1.10. Химические реагенты, растворы, буферные смеси........................47

2.1.11. Оборудование.....................................................................................48

2.1.12. Расходные материалы........................................................................49

2.1.13. Коммерческие наборы.......................................................................50

2.2. Методы исследований.................................................................................50

2.2.1. Выбор праймеров и TaqMan-зондов..................................................50

2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот........................................................50

2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ...........................................................................................50

2.2.4. Обратная транскрипция и ПЦР..........................................................50

2.2.5. Очистка продуктов ПЦР......................................................................51

2.2.6. Секвенирование....................................................................................52

2.2.7. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей...52

2.2.8. Выделение МПВ птиц в трахеальной органной культуре...............52

2.2.9. Электрофорез белков и иммуноблоттинг..........................................53

2.2.10. Иммуноцитохимический анализ......................................................54

2.2.11. Приготовление перитонеальных макрофагов мыши.....................54

2.2.12. Культивирование гибридом ш vitro.................................................54

2.2.13. Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений. ..55

2.2.14. Культивирование гибридом ш vivo..................................................55

2.2.15. Замораживание, размораживание и хранение гибридом...............56

2.2.16. Определение титра инфекционной активности вируса в культурах клеток и органов..........................................................................56

2.2.17. Непрямой твердофазный вариант ИФА..........................................56

2.2.18. Непрямой твердофазный «сэндвич»-вариант ИФА.......................57

2.2.19. Статистическая обработка результатов...........................................57

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................58

3.1. Разработка ОТ-ПЦР (ген 14) для выявления генома МПВ птиц подтипов АиВ....................................................................................................58

3.2. Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома МПВ птиц подтипов АиВ....................................................................61

3.3. Исследование образцов патологического материала на наличие генома МПВ птиц в 2005-2010 гг......................................................................66

3.4. Выделение МПВ птиц в трахеальной органной культуре.......................72

3.5. Изучение биологических свойств изолята аМРУ/В/02/2007 МПВ птиц.......................................................................................................................75

3.6. Использование моноклональных антител в твердофазном непрямом «сэндвич»-варианте ИФА для выявления антигена МПВ птиц.......................................................................................................................78

3.6.1. Характеристика моноклональных антител к МПВ птиц.................79

3.6.2. Разработка твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антигена МПВ птиц.............................................................82

3.7. Анализ последовательностей фрагментов генов в и N изолятов МПВ птиц.............................................................................................................88

3.8. Анализ полных последовательностей генов в, Б и N изолятов МПВ птиц.......................................................................................................................98

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................110

5. ВЫВОДЫ..........................................................................................................114

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.............................................................115

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................116

8. ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................136

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц -респираторное заболевание, характеризующееся воспалительными процессами верхних дыхательных путей и инфраорбитальных синусов кур и индеек. Заболевание высококонтагиозно, однако уровень смертности обычно не превышает 2-5% [56, 101]. При коинфицировании другими патогенами {Escherichia coli, Mycoplasma sp., Pasteur ella sp., Bordetella avium, Ornitobacterium rhinotracheale, вирусы инфекционного бронхита кур, герпеса индеек и некоторые другие) уровень смертности может возрастать до 25% и более [59, 69, 114, 184]. Экономический ущерб от МПВИ обусловлен повышенной выбраковкой некондиционной птицы, снижением прироста живой массы и яичной продуктивности. Вызываемая вирусом иммуносупрессия может снижать эффективность вакцинации против других заболеваний [86, 148, 178].

Возбудителем заболевания является метапневмовирус птиц (МПВ птиц или Avian Metapneumovirus, aMPV) семейства Paramyxoviridae. Геном вируса представлен линейной несегментированной молекулой неинфекционной РНК и содержит 8 генов: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (Р), матриксный белок (М), гликопротеин слияния (F), второй матриксный белок (М2), малый гидрофобный белок (SH), гликопротеин прикрепления (G) и РНК-зависимая РНК-полимераза (L) [54].

Выделяют четыре подтипа метапневмовируса птиц: А, В, С и D [23, 115, 141, 163]. Вирусы подтипов А и В распространены в Европе, Азии, Африке, Южной и Северной Америке [55, 56], тогда как МПВ птиц подтипа С считали эндемичным для США [121, 163, 164]. Однако, имеются единичные сообщения о выявлении МПВ птиц подтипа С у диких птиц во Франции [110] и Южной Корее [94]. Метапневмовирус птиц подтипа D был выявлен лишь однажды во Франции [141].

В птицеводческих хозяйствах России отмечают случаи респираторных заболеваний у кур и индеек различной степени тяжести. При постановке

диагноза учитывают эпизоотическую ситуацию, клинические признаки болезни, патологоанатомические изменения и результаты лабораторных исследований. Поскольку клинические и патологоанатомические признаки МГТВИ у птиц непатогномичны, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам, разработка и совершенствование которых является актуальным направлением исследований.

Степень разработанности проблемы. Вопросам молекулярной диагностики МПВИ птиц посвящены работы ряда зарубежных авторов [25, 52, 57, 69, 122, 128], однако некоторые из разработанных методов имеют недостатки.

Значительные отличия последовательностей МПВ птиц подтипов А, В, С и Б осложняют выбор универсальной системы праймеров. Предложенная М.Н.В Вауоп-АиЬоуег с соавт. одностадийная ОТ-ПЦР с праймерами N<1 и № для выявления генома вируса всех четырех подтипов [52] уступала по чувствительности подтипоспецифическим «пез1ес1»-ПЦР. Учитывая широкое распространение МПВ птиц подтипов А и В в мире, в том числе и в России, необходимо было разработать ОТ-ПЦР для одновременного выявления генома вируса данных подтипов.

В лабораторной диагностике широко используют ПЦР в режиме реального времени. Ошоше О. с соавт. сообщали о создании подтипоспецифических ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) для выявления МПВ птиц каждого из четырех подтипов [122]. Однако авторы указывали на перекрестное реагирование МПВ птиц различных подтипов на поздних стадиях реакции. В связи с этим целесообразно было разработать подтипоспецифические системы праймеров и ТацМап-зондов для выявления МПВ птиц, лишенные данного недостатка.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» молекулярную диагностику МПВИ птиц проводят с 2001 г. [8, 166] с помощью ОТ-ПЦР (ген О) для выявления и дифференциации МПВ птиц подтипов А и В, предложенной С. Ыау1ог с соавт. [25] и Б. Cavanagll с соавт. [128]. В результате проведенных

исследований в 2001-2005 гг. геном МПВ птиц подтипов А и В был выявлен у птицепоголовья 3 и 9 хозяйств России, соответственно. При этом филогенетические связи изолятов вируса остались неизученными.

В работах Е.А. Лазуткиной и соавт. представлены результаты изучения клинических признаков и патологоанатомических изменений при МПВИ у цыплят-бройлеров в условиях птицефабрики [5, 6]. При этом выделение вируса и изучение его свойств при экспериментальном заражении птиц не проводили.

Для выделения МПВ птиц подтипов А и В рекомендуют использовать трахеальную органную культуру (ТОК) [135]. Масштабное культивирование МПВ птиц проводят в культурах клеток почки зеленой мартышки (Vero), фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и некоторых других. В связи с этим возникла необходимость в разработке метода оценки содержания различных антигенов МПВ птиц в культуре клеток на основе иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител, обеспечивающих высокую специфичность метода. В литературе о существовании подобного метода не сообщалось.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка методов лабораторной диагностики МПВИ птиц, их применение для изучения распространения МПВ птиц в хозяйствах России, а также изучение свойств изолятов вируса.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. С помощью разработанных методов исследовать пробы патологического материала, полученные из птицеводческих хозяйств, на наличие МПВ птиц.

3. Изучить свойства полевых изолятов МПВ птиц.

4. Провести анализ гибридом с целью отбора клонов,

продуцирующих специфические моноклональные антитела к МПВ птиц.

5. Разработать метод определения активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток, на основе твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител.

6. Установить филогенетические связи изолятов МПВ птиц, выявленных в 2005-2010 гг.

Научная новизна исследований. Разработаны подтипоспецифические методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР-РВ (ген в) и метод для одновременного выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР (ген К).

Создана база нуклеотидных последовательностей фрагментов генов О и N изолятов МПВ птиц, выявленных у кур и индеек из хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья в 2005-2010 гг.

Впервые определены полные последовательности генов в, Б и N семи полевых изолятов МПВ птиц подтипа В, выделенных от кур из хозяйств России и Украины в 2007-2010 гг.

Разработан твердофазный непрямой «сэндвич»-вариант ИФА с использованием моноклональных антител для оценки активности антигена МПВ птиц, полученного в различных культурах клеток.

Практическая значимость работы. С помощью разработанных методов ПЦР на наличие генома МПВ птиц подтипов А и В исследовано 965 проб патологического материала от кур и индеек, поступивших в 2005-2010 гг. из птицеводческих хозяйств России и стран ближнего зарубежья. Установлено преобладание изолятов вируса подтипа В. Полученные результаты послужили обоснованием выбора штамма МПВ птиц подтипа В для производства вакцин против МПВИ птиц в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Разработанный метод твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с использованием моноклональных антител использовали для оценки

качества вируссодержащего сырья на различных этапах изготовления диагностических тест-систем.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В

соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов диагностики МПВИ птиц на основе ПЦР и ИФА, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению биологических свойств изолятов МПВ птиц.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам 6, 7, 8, 10 паспорта специальности.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (г. Москва, 2011 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика-2010» (г. Москва, 2010 г.), Международных научно-практических конференциях молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2008 г. и 2010 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период с 2005 по 2010 гг.

Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 1 статью в издании, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

Методы ОТ-ПЦР (ген !чГ) и ОТ-ПЦР-РВ (ген О) для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В.

Результаты исследования проб патологического материала из птицеводческих хозяйств Росси�