Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц

Дмитриев, Денис Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц"

На правах рукописи

ДМИТРИЕВ ДЕНИС ВАЛЕРЬЕВИЧ

НЕПРЯМОЙ МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ДИАГНОСТИКЕ МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 7 ЯНВ 2011

2 7 Я1-!В 2011

Санкт-Петербург-2010

4842842

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения «Всероссийский научно — исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадем ии)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Трефилов Борис Борисович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Придыбайло Николай Дмитриевич

доктор ветеринарных наук, профессор Смоленский Владимир Иванович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская

государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится «3» февраля 2011 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «30» декабря 2010 г. и размещен на сайте Ырр: // spbgavm.ni

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Белова Лариса Михайловна

1. Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Болезнь, вызываемая метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у бройлеров, так и у несушек (В.Н.Ирза с соавт., 2003, 2005; И.А.Борисова, A.B. Борисов, 2009; Naylor et al., 1997; Cavanagh, 1999; Jones, 2004). Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезные экономические потери из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и ведет к снижению мясной и яичной продуктивности взрослой птицы (Naylor & Jones, 1993; Cook, 2000; Cook & Cavanagh, 2002). Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания.

Многообразие подтипов А, В, С, D возбудителя и вирулентных свойств метапневмовируса создают значительные сложности как в разработке, так и в эффективном использовании вакцин, а также затрудняет правильную своевременную постановку диагноза и не позволяет дать оценку этиологической роли вируса в патогенезе и течении болезни.

В системе мер, направленных на успешную борьбу с МПВИ, создание высокочувствительных и специфичных методов серологической диагностики имеет большое научное и практическое значение.

Разработаны различные аналитические методики для обнаружения антител к метапневмовирусу птиц с применением иммунофлуоресценции (Jones et al., 1986; Jones et al., 1986,1987; Majo et al., 1995), реакции нейтрализации (Baxter-Jones et al., 1987; Gough, Collins, 1989; Seal, 2000), ELISA (ИФА) (M. А. Волкова с соавт., 2003; Grant et al., 1987; Chettle, Wyeth, 1988). Однако, из всех перечисленных методик, иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее подходящим для тестирования сывороток от различных видов птиц (Cook, Cavanagh, 2002).

Учитывая очевидную перспективность ИФА, разработка отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу МПВИ гггиц в сыворотках крови кур является, безусловно, актуальной. Быстрота получения, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают ИФА наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным методом для мониторинговых исследований при изучении эпизоотологической ситуации по этой болезни в птицехозяйствах.

Цель и задачи работы. Целью исследований было разработать тест-систему на основе непрямого метода иммуноферментного анализа для выявления антител к метапневмовирусу в сыворотках крови кур и провести эпизоотологическое обследование некоторых птицеводческих хозяйств на метапневмовирусную инфекцию.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- получить высокоочищенный антиген метапневмовируса птиц для ИФА и специфическую гипериммунную сыворотку кур;

- определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции;

- установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при тестировании проб в одном разведении;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

- провести эпизоотологическое обследование в птицехозяйствах яичного и мясного направления;

- провести серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию птиц с применением разработанной тест-системы;

- разработать Методические указания по лабораторной диагностике МГ1ВИ птиц. . .

Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления количественной оценки специфических антител к метапневмовирусу подтипа В при тестировании сывороток крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочишенного антигена метапневмовируса птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией нейтрализации при МПВИ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотках крови кур к метапневмовирусу птиц.

Проведено эпизоотологическое обследование 6 птицеводческих хозяйств. Установлено ассоциированное течение МПВИ птиц с бактериальными и вирусными болезнями и показан синергизм во взаимодействии между возбудителями.

Практическая значимость работы. Полученные результаты научных исследований использованы при разработке нормативных документов: стандарта (СТО), инструкции по применению набора.

Практическая ценность разработанного диагностического набора для выявления антител к метапневмовирусу кур подтверждается положительными результатами широких производственных испытаний при проведении серологического контроля за распространением метапневмовирусной инфекции птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья против данной болезни; ретроспективной диагностики МПВИ птиц по приросту уровня специфических антител.

Утверждены Россельхозакадемией Методические указания, по лабораторной диагностике метапневмовирусной инфекции птиц.

Основные положения, выносимые на защиту;

- тест-система, разработанная на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к метапневмовирусу птиц в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;

- результаты сравнения разработанной тест-системы й реакции нейтрализации;

- данные эпизоотологического обследования птицехозяйств РФ;

- результаты серологического мониторинга на метапневмовирусную инфекцию птиц с применением разработанной тест-системы.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2007-2009гг.), на научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (24-25 августа, Санкт-Петербург, 2007г.); на второй всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина -теория, практика и обучение» (1-2 ноября, Санкт-Петербург, 2007); на научно-практической конференции «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц» (3-4 июня, Санкт-Петербург, г. Ломоносов, 2008 г.).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н. В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять научных работ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 167 источника, из которых 144 зарубежных.

2.Собственные исследования 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2006-2009 гг. в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения «Всероссийский научно - исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии) в соответствии с научно-технической программой НИР 08.07.05.

В работе использовали: патологические материалы для выделения вирусного изолята метапневмовируса птиц (МПВП) брали от цыплят 10-30-суточного возраста мясного и яичного направления из ЗАО «Птицефабрика Невская» и «Тульский бройлер»;свежие трупы, головы и трахеи с легкими от клинически больных или павших цыплят хранили при минус 10-20°С до проведения вирусологических исследований; тампоны с патологическим материалом (эксудатнвные выделения из верхних дыхательных путей, инфраорбитальных синусов) помещали в раствор Хенкса с антибиотиками.

Выделение вируса проводили путем перемежающихся пассажей на развивающихся СПФ куриных эмбрионах и культурах клеток или последовательных пассажей на клетках Vero.

Сыворотки, тестируемые в непрямом варианте ИФА. Исследовали образцы сывороток крови кур не содержащие макроскопических признаков бактериальной и грибковой контаминации.

Вирус. В работе использовали вакцинный штамм VC-03 (Picault Y.P.,1987) подтипа В, реизолированный из лиофилизированной вакцины Nemovak производства фирмы Rhone Merilux.

Вирус поддерживали в перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки (клетки Vero) и хранили при температуре минус 20 °С.

Диагностические наборы для выявления и оценки концентрации сывороточных антител к вирусу МПВИ птиц. Использовали набор для обнаружения антител к возбудителю метапневмовирусной инфекции птиц BioCek производства фирмы "Avian Rhinotracheitis Antibody Test Kii" (Holland); набор для определения антител к пневмовирусу иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ».

Инкубационные яйца и цыплята: яйца СПФ-кур, полученные из фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия); цыплята, инкубированные из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в условиях ГНУ ВНИВИП.

Культуры клеток: первично-трипсинизированная культура клеток СПФ куриных эмбрионов (ККЭ); перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки, клетки Vero ( НИИ гриппа АМН, Санкт-Петербург).

Питательные среды, сыворотки и растворы: питательная среда Игла MEM или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином; питательная среда ДМЕМ/Р12 с Hepes, жидкая; сыворотка крови крупного рогатого скота, неконсервированная для культур клеток; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор, 0,25% фирмы «US BIO»; всрсена раствор, 0,02%; Хенкса раствор фирмы «Hyclone». Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производства ООО «Биолот»;

Растворы и реактивы, необходимые для ИФА. Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 4198, ОАО «Реактив»; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, ч.д.а., ГОСТ 2493, ОАО «Реактив»; натрий хлористый (NaCI), х.ч., ГОСТ 4233, ОАО «Реактив»; фосфатно-цитратный буфер производства ООО «Биолот»; перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»; ортофенилендиамин (ОФД) производства фирмы Sigma; твин 20 (Р7949) производства фирмы Sigma; антивидовой иммунопероксидазный коньюгат против IgG курицы производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).

Культура клеток. Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани 10-суточных СПФ куриных эмбрионов по методике Dulbecco R. & Vogt М. (1954) в модификации Younger J.S. (1954).

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатическому действию (ЦПД) проводили в чувствительной клеточной культуре (ККЭ, клетки Vero) методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench Н. (1938) и выражали в lg ТЦЦ50 в 1,0 см3 (тканевая цитопатогенная доза).

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии (Н.И. Троценко с соавт., 2000).

Титр вируса и конечную точку нейтрализации вычисляли по Reed L.J. & Muench Н. (1938) на основании ЦПД в культуре клеток через 5-6 суток инкубации после инокуляции вируса. Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

За титр антител принимали то наибольшее разведение сыворотки, которое было способно ингибировать активность вируса, внесенного в указанной дозе, в 50% зараженной культуры.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливкиилпирролидоном (ПВП) (В.Д.Сергеев, И.К. Рождественский, 1988).

Иммуноанализ антител. Для сенсибилизации поверхности лунок антиген метапневмовируса птиц использовали в оптимальной концентрации, разведенный 0,01М ФБР, рН 7,3-7,5. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 18-20 часов при температуре 4-8°С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали трехкратно в объеме 0,2 см3 0,01М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,0-7,4. В качестве субстрата пероксидазы использовали 0,04 % раствор ортофенилендиамина (ОФД) в фосфатно-цитратном буфере рН 4,9-5,0 и 0,4 % раствор перекиси водорода. Для остановки реакции использовали 10% раствор серной кислоты и считывали поглощение (оптическую плотность) на иммуноферментном анализаторе «Пикон» при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Microsoft Excel.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного

анализа

2.2.1.1. Получение очищенного метапневмовируса кур. Метапневмовирус штамма VC-03 репродуцировали на клетках Vero и в

культуре клеток СПФ-эмбрионов кур. Активный и специфичный антиген метапневмовируса получали из культуральной вируссодержащей жидкости с титром не ниже 5,8±0,4 ТЦД50/см3. Предварительно клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием и осаждали клеточный детрит центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Затем вируссодержащий материал (ВСМ) концентрировали центрифугированием при 75000g в течение 1,5 часов. Осадок ресуспендировали в 5,0 см3 фосфатно-солевого буфера и очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС, обработанном 4% раствором поливинилпирролидона, путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и рН элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала. Результаты исследований показали, что очистка концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор 1000 А0, 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, позволяла получать очищенный вирус с концентрацией белка 60-80 мкг в 1,0 см3. Очистка вируса составляла 98,7%. Активность антигена метапневмовируса, сорбированного в лунках планшет для ИФА, сохранялась более 12 месяцев при хранении при 4-8°С.

2.2.1.2. Получение специфической положительной и отрицательной сывороток крови кур. Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Схема иммунизации была основана на введении нарастающих доз очищенного метапневмовируса. Экспериментально было показано, что оптимальным методом получения гипериммунной сыворотки крови кур является трехкратное введение птице очищенного метапневмовируса по схеме: двукратное введение антигена вируса подкожно в объеме 0,5 см3 с интервалом в 7 дней. Третья иммунизация через 7 дней внутрибрюшинно в объеме 1,0 см3. Через 14 дней после последней иммунизации кур тотально

обескровливали путем взятия крови из сердца. Активность полученной гипериммунной сыворотки определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток куриных эмбрионов в р-варианте. Гипериммунная специфическая сыворотка крови кур была высокоактивной и имела титр 8,0 Титр в ИФА составил 1:4000. Полученная сыворотка крови в лиофильно высушенном состоянии при хранении при 4-8С0 не теряла своей активности в ИФА в течение 12 месяцев.

Для получения отрицательной сыворотки крови использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к метапневмовирусу. Полученную сыворотку крови проверяли на отсутствие антител к метапневмовирусу в реакции нейтрализации. Результаты показали, что исследуемая сыворотка крови не содержала антител к метапневмовирусу птиц.

2.2.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к метапневмовирусной инфекции игиц 2.2.2.1.0пределение оптимальных концентраций и условий взаимодействия: компонентов. Оптимизацию параметров постановки реакции для выявления антител к метапневмовирусу птиц зели по иммуноспецифическим и неспецифическим компонентам диагностической тест-системы. Для получения активного твердофазного иммуноссрбента использовали планшеты зарубежных фирм. Рабочее разведение антигена было определено методом «шахматного» титрования на поверхности лунок полистироловых планшет в фосфатно-солевом буферном растворе, рН=7,3-7,5, в течение 16-18 часов при температуре 4°С с разведением контрольных сывороток 1:400. Оптимальной сенсибилизирующей дозой пневмовирусного антигена явилась концентрация 6-8 мкг на лунку в объеме 0,1см3. Оптимальное рабочее разведение лиофилизированного коммерческого конъюгата подбирали экспериментально. В наших экспериментах рабочее

разведение коньюгата составило 1:300-1:400. В качестве субстрата использовали ортофенилендкамин («Sigma») в концентрации 5 мг на 12 см3 фосфатно-цитратного буфера, рН=4,9-5,0. В процессе постановки реакции исследуемые и контрольные сыворотки, конъюгат инкубировали в термостате при 37° С в течение 30 минут. В качестве промывочной буферной системы, обеспечивающей специфичность иммуноферментного анализа, использовали 0,0IM калий-фосфатный буфер, рН=7,2-7,4, содержащий 0,5М хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20.

2.2.2.2. Определение диагностического титра сыворотки в ИФА. Диагностический титр в ИФА устанавливали методом «шахматного титрования» различных сывороток, начиная с разведения 1:100, при стандартной концентрации (6 мкг на лунку) сорбированного антигена. Показано, что разведение сывороток 1:400 дает возможность не пропустить слабоположительные сыворотки. При этом 20 сывороток крови из благополучных по метапневмовирусной инфекции хозяйств были отрицательными в ИФА, что подтверждает специфичность разработанной диагностической тест-системы. Установлено, что при обследовании птицеводческих хозяйств на метапневмовирусную инфекцию птиц целесообразно начинать постановку ИФА с разведения сыворотки 1:100 и считать разведение сыворотки 1:400 диагностическим титром на метапневмовирусную инфекцию.

2.2.2.3.Способ опосредованного расчета титра антител

2.2.2.3.1.0пределение коэффициентов линейной регрессии и допустимых значений оптической плотности контрольных сывороток.

Для определения конечного титра тестируемых сывороток по одному разведению использовали метод регрессионного анализа в компьютерной программе Microsoft Excel. Математические расчеты проводили для разведений сывороток 1:100, 1:400 и 1:800 (табл.1).

Таблица 1

Коэффициенты линейной регрессии и корреляции для исследуемых

разведений

Разведение А В Я

1:200 1,699784 3,500964 0,95983

1:400 1,384828 3,540067 0,96643

1:800 1,193248 3,580927 0,96469

А, В - коэффициенты линейной регрессии; Я - коэффициент корреляции.

Были найдены коэффициенты линейной регрессии для величин ^ в/Р и 18Т(рис.1).

н*. 11 У У*

-0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Ьвв/р

Рис. 1. График зависимости величин ^Т от ^ Б/Р для рабочего разведения сыворотки

Установлено, что наиболее высокое значение коэффициента корреляции определено для разведения сыворотки 1:400, которое и было принято за рабочее. Следует отметить, что математический метод определения рабочего

разведения сыворотки совпал с методом «шахматного титрования» сывороток при определении диагностического титра. Уравнение линейной регрессии Т = 1,384828(Б/Р) + 3,540067 для разведения сыворотки 1:400 было использовано для расчета числового значения титра. Полученное уравнение линейной регрессии будет достоверно для определенных значений оптической плотности отрицательной и положительной контрольных сывороток. Определение диапазона допустимых значений ОП-показателей отрицательного и положительного контролей является обязательным для разрабатываемой тест-системы ИФА. Стандартизация контрольных показателей позволяет в итоге получать корректные результаты анализа. На различных планшетах, более чем в 40 повторностях исследовали вариации ОП-показателей, как отрицательного, так и положительного контролей в разведениях 1:400. Статистическая обработка 40 таких значений показала, что ОП контрольных сывороток с 95% уровнем достоверности должна находиться в интервале от 0,420 до 0,930 для положительной и в интервале 0,065 до 0,150 для отрицательной контрольных сывороток.

2.2.2.3.2.0пределение пороговых показателей реакции, разграничивающих специфическое и нсспецнфическое взаимодействие. Для определения пороговых Б/Р-показателей, разграничивающих неспецифическую (отрицательную), сомнительную и специфическую (положительную) реакции исследовали более 20 проб сывороток крови кур, свободных от антител к метапневмовирусу, но имеющих уровень неспецифической реакции, превышающий отрицательный контроль. Для полученных значений ОП-показателей вычисляли Б/Р-отношения. Задачей исследований было установление максимального значения Б/Р для неспецифически реагирующих сывороток и нахождение минимального значения Б/Р для специфически реагирующих сывороток. В качестве пороговой величины для отрицательной реакции приняли Б/Р-показатель, который соответствовал нижней границе 95% доверительного интервала исследованной выборки значений ОП. Б/Р-показатель для отрицательной

реакции составил 0,2. Пороговой величиной, соответствующей минимальной ожидаемой положительной реакции считали значение S/P, установленное для верхней границы 95% доверительного интервала. Величина S/P для положительной реакции составила 0,24. Промежуточные величины 0,21-0,23 соответствовали зоне «сомнительных» результатов.

2.2.2.4. Оценка чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.

Оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы проводили относительно наборов для определения антител к метапневмовирусу птиц иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ» и «ВюС11ек»(табл.2) и сравнительным анализом результатов тестирования сывороток в ИФА и в реакции нейтрализации (табл.3).

Таблица 2

Результаты сравнительного изучения специфичности и чувствительности разработанной тест-системы с наборами других производителей

№ сыворотки ВНИВИП 1:400 длина волны 492 нм BioChek 1:500 длина волны 405 нм ВНИИЗЖ 1:400 длина волны 492 нм

ОП Рез. ОП Рез. ОП Рез.

+ контроль 0,569 0,687 0,637 0,547 0,552 0,607

- контроль 0.163 0,171 0,260 0,260 0,195 0,205

1 0,888 пол. 0,887 пол. 0,986 пол.

2 1,121 пол. 0.732 пол. 1,010 пол.

3 1,052 пол. 1,332 пол. 1,174 пол.

4 1,121 пол. 0,901 пол. 0,923 пол.

5 1,474 пол. 0,710 пол. 1,280 пол.

6 1,156 пол. 0,883 пол. 1,012 пол.

7 0,895 пол. 0,550 пол. 0,834 пол.

8 1,339 пол. 0,731 пол. 1,105 пол.

9 1,067 пол. 0,811 пол. 0,958 пол.

10 1,196 пол. 1,376 пол. 1,145 пол.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что при исследовании сывороток крови кур с помощью наборов ВНИВИП, ВНИИЗЖ и ВюСЬек получен 100 % положительный результат, что свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности «Набора для выявления антител к метапневмоЕирусу в сыворотках крови кур иммуноферментным методом».

Результаты тестирования сывороток в ИФА и реакции нейтрализации, которая является классическим тестом диагностики вирусных болезней, представлены в табл. 3. Параллельное тестирование 5 сывороток крови кур различной активности показало, что корреляция между результатами исследования в ИФА и РН составила 100%. С отрицательными сыворотками крови кур результаты иммуноферментной реакции были отрицательными (Р<(),05).

Таблица 3

Результаты сравнительного изучения серологических реакций

№ п/п Исследуемые сыворотки крови кур Активность сывороток Коэффициент корреляции, г

РН,1о& (групп.проба) ИФА

1. гипериммунная сыворотка (положительный контроль) 8,0 3884 3498 4083 3692 3470 1,0

2. отрицательная сыворотка (отрицательный контроль) 0,75 ... —. —

Таким образом, сравнительный анализ результатов тестирования сывороток в ИФА и РН также подтверждает высокую чувствительность И специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы. 2.2.3. Практическое применение разработанной иммуноферментной тест-

системы

2.2.3.1. Данные эпизоотологинеского обследования птицеводческих

хозяйствИзучение эпизоотической ситуации на птицефабриках различного

направления (ППЗ, промышленные) проводили с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к метапневмовирусу в сыворотке крови кур в комплексе с вирусологическими (выделение и идентификация вируса) и бактериологическими методами исследования.

В каждом хозяйстве анализировали эпизоотическую обстановку, выяснили условия, способствующие распространению и репродукции возбудителя, определяли источники инфекции, оценивали условия содержания, кормления птиц и комплектования стада.

Обследовано 8 птицеводческих хозяйств, в которых родительское стадо комплектуется суточным молодняком и/или племенным инкубационным яйцом. В 6 из обследованных хозяйств ранее была зарегистрирована метапневмовирусная инфекция, и в настоящее время проводится профилактическая вакцинация птицы живыми и инактивированными вакцинами разных фирм (производителей).

ЗАО «Птицефабрика Невская» яичного направления (промышленная), комплектуется суточным молодняком из Финляндии. Результаты проведенного клинического осмотра взрослого поголовья показали, что состояние кур-несушек было удовлетворительное, перьевой покров гладкий, блестящий, гребешки и сережки ярко-красные, птица была активна, яйценоскость составляла 90-95%. У отдельных особей наблюдали нарушения дыхания (вдох с открытым клювом и вытянутой шеей, хрипы), опухание инфраорбитальных синусов и подчелюстного пространства.

На вскрытии павшей птицы различных возрастов были зарегистрированы следующие патологоанатомические изменения: у цыплят до 10-15-суточного возраста - нерассосавшийся желток, пневмонии, энтериты; у павших кур-несушек 122-372-суточного возраста -инфраорбитальный синусит, ринит, геморрагический трахеит, фибринозный перикардит, энтериты. Среди цыплят в возрасте 1-15 суток в цехе

выращивания был отмечен повышенный отход с респираторными симптомами.

При бактериологическом исследовании из пораженных органов были выделены культуры Escherichia coli (инфраорбитальные синусы, легкие) с выраженными адгезивными свойствами и Salmonella spp. (сердце, печень), что свидетельствует о высокой инфицированное™ птиц патогенной кишечной палочкой и Salmonella spp. и указывает на неудовлетворительное санитарное состояние птицехозяйства.

При вирусологическом исследовании из патматериала (пораженные головы, трахеи и легкие) павшей птицы в клетках Vero и фибробластах куриных эмбрионов был выделен метапневмовирус птиц.

Пробы сывороток крови разновозрастной птицы (150-446 сут.) были исследованы на наличие специфических антител к метапневмовирусу с использованием разработанной иммуноферментной тест-сисгемы.

Результаты исследований представлены на диаграмме 1.

Диаграмма 1

Средние титры антител к метапневмовирусу___

1200C

10000

^ 8000

ЙбООО

i-1000 I-

2000 0

9365 яшв

6618 7260 * ¡¡¡¡и

5899

" ¡¡¡¡1

: л шв

150 200 300 360 446

Возраст птиц (сут)

Данные серологических исследований проб сывороток крови кур промышленного стада ЗАО «Птицефабрика Невская» Ленинградской области

показали высокие титры антител к МПВ птиц, и в возрасте от 150 до 446 сут. они равнялись от 5699±822 до 11259±948 при 100% выявлении, что свидетельствует о циркуляции вируса в стаде. Циркуляция вируса была подтверждена его выделением из патологического материала и идентификацией в перекрестной реакции нейтрализации и ИФА. Вирусный изолят принадлежал к метапневмовирусу подтипа А.

Птицефабрика «Тульский бройлер» мясного направления комплектуется импортным племенным материалом. Клинический осмотр цыплят-бройлеров, ремонтного молодняка и родителей показал удовлетворительное состояние. Однако у отдельных особей птиц разного возраста (1,5-2%) были отмечены инфраорбитальные синуситы, отек межчелюстного пространства (опухшая голова). Патологоанатомическое вскрытие показало наличие синуситов, коньюктивитов, трахеитов и пневмоний.

Птицефабрика «Тульский бройлер» мясного направления комплектуется импортным племенным материалом. Клинический осмотр цыплят-бройлеров, ремонтного молодняка и родителей показал удовлетворительное состояние. Однако у отдельных особей птиц разного возраста (1,5-2%) были отмечены инфраорбитальные синуситы, отек межчелюстного пространства (опухшая голова). Патологоанатомическое вскрытие показало наличие синуситов, конъюнктивитов, трахеитов и пневмоний.

Для лабораторных исследований были доставлены пораженные головы и трупы разновозрастной птицы.

При бактериологическом исследовании из опухших голов, легких цыплят и кур были изолированы 12 культур Escherichia coli, 5 культур Staphylococcus aureus и epidermidis и 2 культуры Proteus vulgaris.

При микоплазматологическом исследовании соскобов со слизистой неба и трахеи была выделена культура М. gallisepticum, а серологически были выявлены антитела к возбудителю в положительных титрах от 20 до 60% от исследованных проб.

Для проведения вирусологических исследований брали смывы и соскобы со слизистых инфраорбитальных синусов, неба и трахеи, далее готовили суспензии на растворе Хенкса с антибиотиками. Полученным материалом инфицировали перевиваемую линию клеток Vero и культуру клеток куриного эмбриона. По мере последовательных пассажей был отмечен усиливающийся цитопатический эффект в монослое культуры, который выражался округлением клеток в ограниченных участках монослоя, появлением в них цитоплазмагической зернистости на 3-4 сутки после заражения. Дегенерация клеток на 70-80% была отмечена на 6-7 сутки, затем в отдельных участках наблюдали образование синцития, как характерный признак ЦПД для метапневмовируса птиц.

Результаты серологических исследований на наличие специфических антител к метапневмовирусу в сыворотке крови птиц с помощью разработанной тест-системы представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты серологических исследований проб сывороток крови на наличие антител к метапневмовирусу птиц (п=23)

Наименование птицефабрики Уровень антител в ИФА, М ± т*

Возраст птицы после вакцинации (сут.)

1 250 360

Тульский бройлер 2643±413* 9918+1010 9913±830

Примечание: М — средняя арифметическая; т - средняя ошибка средней арифметической; п - число определений

Показано, что на птицефабрике «Тульский бройлер» средний титр антител у цыплят был 9918±1010, а в суточном возрасте средний титр антител составил 2643±413. что свидетельствует о циркуляции метапневмовируса в хозяйстве и коррелирует с выделением вируса.

При обследовании племенной птицефабрики «Ильичевская» наблюдали повышенную гибель цыплят в возрасте 1-45 суток. Для выяснения причин проводили бактериологические и вирусологические исследования.

При бактериологическом исследовании высевов из паренхиматозных органов и костного мозга были выделены 17 культур Escherichia coli и одна культура Proteus vulgaris.

При вирусологическом исследовании на клетках Vero из смывов со слизистой трахеи 22-суточных цыплят был изолирован метапневмовирус птиц, вызывающий синцитиальные образования в монослое клеток. Результаты, полученные по исследованию парных проб сывороток крови кур из п/ф «Ильичевская», представлены в табл. 5. Показано увеличение уровня специфических антител к МПВ в сыворотках крови птиц от 96 до 115-суточного возраста, в каждом исследованном корпусе. Средний титр антител в 96-суточном возрасте составил 728, 897 и 1385, а степень обнаружения их колебалась от 20% до 60%. В 115-суточном возрасте средний титр антител был 1026, 1085 и 1441, а степень обнаружения их варьировала от 60% до 90%, что свидетельствует о персистенции вируса в организме птицы.

Таблица 5

Результаты серологических исследований парных проб сывороток крови на наличие антител к метапневмовирусу птиц в ИФА (п=23), п/ф

«Ильичевская»

Номер корпуса птичника Возраст птицы (сут) Средний титр антител в ИФА, М±т* Количество положительных проб, %

31 96 728+38 20

115 1026+68 60

32 96 897+48 40

115 1085+84 70

30 96 1385+85 60

115 1441±93 90

Результаты вирусологических и бактериологических исследований патологического материала от птиц выше приведенных птицехозяйств представлены в табл. 6.

Таблица 6

Результаты вирусологических и бактериологических исследований

Наименование птицефабрики Дата обследования, год Выделенные вирусные агенты Возбудители бактериальных инфекций

Невская 2008 метапневмовирус, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного ларинготрахеита Escherichia coli Salmonella spp.

Тульский бройлер 2007-2008 метапневмовирус Escherichia coli, Staphylococcus aureus, epidermidis, M. gallisepticum, Proteus vulgaris

Ильичевская 2006 метапневмовирус Escherichia coli, Proteus vulgaris

Анализ эпизоотологического обследования птицехозяйств на метапневмовирусную инфекцию показал, что данная болезнь широко распространена в промышленном птицеводстве и часто осложняется ассоциированным течением с возбудителями бактериальных и других вирусных болезней. Смешанное течение двух и более инфекций приводит к проявлению значительного синергидного эффекта.

2.2.3.2. Серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию птиц в птицехозяйствах различных регионов РФ. В процессе ретроспективной диагностики на МПВИ птиц было исследовано 864 пробы сывороток крови птиц разных возрастных групп яичных и мясных кроссов, доставленных из 6 птицехозяйств, расположенных в различных

..территориально-административных регионах РФ. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Таблица 7

Результаты серологических исследований проб сывороток крови на наличие _ антител к метапневмовирусу птиц в ИФА (п= 16)___

Наименование птицефабрики Уровень антител в ИФА, М ± т*

Возраст птицы (суг)

1 20 35 80 150 200 300 360 446

«Псковская» 12016 14119 181118 153118 187111 199115 160116 150113 159119

«Юбилейная» 138±7 12719 14518 15818 593142* (25%) 710160 (37,5%) 850139 (56,25%) 984154 (85,4%) 998167 (97,6%)

«Оредеж» 133±7 126113 153114 147115 155112 139114 143116 168116 173117

«Приморская» 128112 138119 167114 178121 6381123 (27%) 923179 (40%) 947189 (58%) 988178 (87,9%) 992175 (98,4%)

«Каменская» 135115 157117 174113 183122 7121 115 (28%) 11821 232 (55%) 13251 183 (63,7%) 13861 172 (92,6%) 14351 184 (100%)

«Марийское» 863197 885174 958185 22561 112 41411 564 65251 505 97921 615 91631 608 101451 712

Показано, что птица на птицефабриках «Псковская» и «Оредеж» серонегативна. В сыворотке крови разновозрастной птицы в хозяйствах «Юбилейная», «Приморская», «Каменская» обнаружены специфические антитела к МПВ птиц и процент положительно реагирующих зависит от возраста птиц, а «Марийское» установлено 100% реагирующей птицы, что указывает на циркуляцию возбудителя в хозяйствах.

Апробация разработанной иммуноферментной тест-системы показала высокую чувствительность и специфичность при обнаружении антител к ■ метапневмовирусу птиц в сыворотках крови кур.

Таким образом, комплекс проведенных исследовательских работ позволил разработать иммуноферментную тест-систему для количественного •определения антител к метапневмовирусу птиц в сыворотках крови кур ■Методом последовательных разведений и методом одного разведения. Результаты практического применения иммуноферментной тест-системы

свидетельствуют о том, что данный экспресс-метод является высокочувствительным и специфичным для серологического контроля за распространением метапневмовирусной инфекции птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья против данной болезни и ретроспективной диагностики МПВИ птиц по приросту уровня специфических антител.

3. Выводы

1. Разработан метод концентрирования и очистки метапневмовируса птиц штамма VC-03 , репродуцированного на клетках Vero и в культуре клеток СПФ-эмбрионов кур, позволяющий получать препараты с титром инфекционности вируса выше, чем в исходной суспензии на 1,0-2,0 Ig ТЦЦ 50/см3 и очищенных от балластных белков на 98-99%.

2. Показан? возможность одноэтапной препаративной очистки метапневмовируса из вируссодержащей суспензии с помощью молекулярно-ситовой хроматографии на МПС.

3. На основе очищенного высокоактивного антигена МПВ птиц получены компоненты набора для определения антител к МПВ в сыворотках крови кур в иммуноферментном анализе.

4. Разработана тест-система на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к метапневмовирусу птиц в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении. Определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции. Установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, предложено уравнение опосредованного вычисления титра антител при тестировании проб в одном разведении.

5. При сравнительной оценке различных методов определения титров антител установлено, что их значения в ИФА и РН показывают прямую корреляцию, г-1,0.

6. Анализ эпизоотической ситуации в РФ по МПВИ птиц за последние годы свидетельствует о широком распространении болезни. Установлено, что МПВИ птиц протекает в ассоциации как с бактериальными, так и с другими вирусными болезнями.

7. Предложенный непрямой метод ИФА позволил провести серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию птиц в различных регионах РФ. Установлено, что при обследовании птицехозяйств методом ИФА обнаружены специфические антитела к МПВ в сыворотке крови кур в возрастающих титрах в зависимости от возраста птицы, что свидетельствует о субклиническом течении болезни и циркуляции вируса в птицехозяйствах.

4. Практические предложения

1. Полученные результаты научных исследований использованы при разработке нормативных документов: стандарта (СТО), инструкции по применению набора.

2.Утверждены Россельхозакадемией методические положения «Лабораторная диагностика метапневмовирусной инфекции птиц методом иммуноферментного анализа».

3.Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, работающих в области промышленного птицеводства.

5.Спнсок научных работ, опубликованных по материалам диссертации Статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию птиц с применением ИФА / Д.В. Дмитриев // Ветеринарная практика.- СПб, 2010.- №2(49). - С. 20-22.

Статьи, опубликованные в сборниках материалов различных конференций:

2. Ассоциированное течение пневмовирусной инфекции птиц / Д.В. Дмитриев // Вет. мед.- теория, практика и обучение: матер, второй всерос. научно-практ. конф. 1 -2 ноября 2007г. - СПб, 2007. - С. 23-25.

3. Пневмовирусная инфекция птиц (эпизоотология, диагностика) / Б.Б.Трефилов, Н.В.Никитина, Д.В. Дмитриев [и др.] // Актуал. пробл. вет. медицины: научно-практ. конгр. 24-25 августа 2007г. - СПб, 2007. - С. 210211.

4. Получение антигена пневмовируса птиц для иммуноферментного анализа / Н.В.Никитина, Б.Б.Трефилов, Д.В.Дмитриев [и др.] // Новое в диагн. и проф. бол. птиц: матер, научно-практ. конф. 3-4 июня 2008г. - СПб-Ломоносов, 2008. - С. 94-97.

5. Репродукция метапневмовируса в клеточных культурах I Б.Б. Трефилов, Н.В.Никитина, Д.В.Дмитриев // Актуал. пробл. ветеринарии и животноводства: матер, межрегион, научно-практ. конф.- Самара, 2010.-С.316-320.

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14 Тел.(812)233 46 69. Объем 1,0 у.пл. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Дмитриев, Денис Валерьевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц: распространение и экономический ущерб, вызываемый этой болезнью.

1.2. Характеристика рода М^арпеитоукш семейства Рагатухоутске.

1.3. Эпизоотологические особенности метапневмовирусной инфекции птиц

1.4. Иммунопатогенез болезни.

1.5. Клинические признаки и патологоанатомические изменения у птиц при метапневмовирусной инфекции.

1.6. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц.

1.7. Профилактика и меры борьбы с метапневмовирусной инфекцией птиц

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц"

s' . Актуальность, проблемы. Болезнь, вызываемая; метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у бройлеров, так и* у несушек (В.Н.Ирза с соавт., i.,2003, 2005; И.А.Борисова,. A.B. Борисов, 2009; Naylor et ah, 1997; Cavanagh,.1999; Jones, 2004). Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезные экономические потери из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и ведет к снижению мясной и яичной продуктивности ■ ■ ! j i взрослой птицы (Naylor & Jones, 1993; Cook, 2000; Cook & Cavanagh; 2002). Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, . например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания. :.

I >

Многообразие подтипов А, В, С, D возбудителя и вирулентных свойств мётапневмовируса создают значительные сложности как в разработке, так и в эффективном использовании вакцин, . а также затрудняет правильную своевременную постановку fj диагноза и не позволяет .дать оценку этиологической роли вируса в|патогенезе и течении болезни. . В.системе мер, направленных на успешную борьбу с МПВИ, создание-высокочувствительных и специфичных методов серологической диагностики . имеет большое научное и практическое значение.

• Разработаны различные аналитические методики для обнаружения антител к метапневмовирусу птиц с применением иммунофлуоресценции (Jones, et al., 1986; Jones et al., 1986, 1987; Majo et al., 1995), реакции, нейтрализации (В axter-Jones {et al., 1987; Gough, Collins, 1989; Seal, 2000), ELISA (ИФА) (M. А. ВолкЬва с соавт., 2003; Grant et al., 1987; Chettle, Wyeth,. 1988). Однако, ;•' из всех перечисленных методик, иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее подходящим для тестирования сывороток от различных видов птиц (Cook, Cavanagh, 2002).

Учитывая очевидную перспективность ИФА, разработка отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу МПВИ птиц в сыворотках крови кур является, безусловно, актуальной. Быстрота получения, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают ИФА наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным методом для мониторинговых исследований при изучении эпизоотологической ситуации по этой болезни в птицехозяйствах.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

- провести эпизоотологическое обследование в птицехозяйствах яичного и мясного направления;

- разработать Методические указания по лабораторной диагностике МПВИ птиц.

Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления количественной оценки специфических антител к метапневмовирусу подтипа В при тестировании сывороток крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочищенного антигена метапневмовируса птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией нейтрализации при МПВИ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотках крови кур к метапневмовирусу птиц.

Утверждены Россельхозакадемией Методические указания по лабораторной диагностике метапневмовирусной инфекции птиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты сравнения разработанной тест-системы и реакции нейтрализации;

- данные эпизоотологического обследования птицехозяйств РФ;

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять научных работ.

Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 167 источников, из которых 144 зарубежных.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Дмитриев, Денис Валерьевич

4. Выводы

1. Разработан метод концентрирования и очистки метапневмовируса птиц штамма VC-03, репродуцированного на клетках Vero и в культуре клеток СПФ-эмбрионов кур, позволяющий получать препараты с титром инфекционности вируса выше, чем в исходной л * суспензии на 1,0 - 2,0 lg ТЦД 50/см и очищенных от балластных белков на 98-99%.

2. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки * метапневмовируса из вируссодержащей суспензии с помощью молекулярно-ситовой хроматографии на МПС.

5. При сравнительной оценке различных методов определения титра антител установлено, что их значения в ИФА и РН показывают прямую корреляцию, г=1,0.

5. Практические предложения

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены Россельхозакадемией методические положения «Лабораторная диагностика метапневмовирусной инфекции птиц методом иммуноферментного анализа», предназначенные для ветеринарных врачей региональных, областных, зональных и специализированных лабораторий и научно-исследовательских учреждений ветеринарного и биологического профиля.

Материалы, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе со студентами и на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей, работающих в промышленном птицеводстве.

1.8. Заключение

Было весьма интересно наблюдать эволюцию малоизученной болезни индеек и кур, и изучить вклад различных ученых в эту проблему.

К несчастью неизбежным последствием интенсивного коммерческого приложения большинства исследовательских работ по МПВИ птиц является то, что значительная часть свободного обмена информацией, так необходимого науке убавилась. А также, в гонке по разработке коммерческих вакцин, многие важные аспекты инфекции не были изучены во всей глубине.

Важной особенностью метапневмовирусной инфекции у цыплят является плохое понимание болезни, которое заключает в себе роль вируса в развитии СОГ, его влияние на яичную продуктивность и качество, и его взаимодействие с другими респираторными и иммуносупрессивными вирусами. Необходимо больше узнать о иммунном ответе к метапневмовирусу у кур и индеек, включая вопрос о том, является ли вирус сам по себе иммуносупрессивным и какие из компонентов вируса наиболее значимы для разработки вакцины и ИФА технологии. Для быстрого обнаружения вируса необходимы улучшенные диагностические методики: кажется весьма вероятным, что они будут развиваться, главным образом, от ПНР методологии, сделанные более легкими в использовании и выполненные непосредственно для идентификации подтипов вируса. Типоспецифические МаЬэ также могли быть использованы для непрямой иммунофлуоресценции в трахеальных или назальных соскобах или срезах. Заслуживают внимания исследования по ЕЬ^Аэ (ИФА), поскольку эта методика способна выявлять антитела к одному или обоим полевым типам или к отдельным вакцинам и применяется для массовых серологических мониторинговых исследований.

Изучение роли свободноживущих птиц в переносе инфекции помогло бы нам понять географическое распространение болезни.

Поскольку метапневмовирус широко распространен в природе, контроль над заболеванием будет основан, главным образом, на вакцинации. По-прежнему будут использоваться традиционные живые аттенуированные или инактивированные вакцины, до тех пор, пока не будут разработаны их рекомбинантные аналоги.

2.Собственные исследования

Работа выполнена в 2006-2009 гг. в отделе вирусологии Государственного научного учреждения «Всероссийский научно — исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии) в соответствии с научно-технической программой НИР 08.07.05.

Л ; 2.1 Материалы и методы г 2.1.1. Материалы исследований

Патологические материалы для выделения вирусного изолята метапневмовируса птиц (МПВП) брали от цыплят 10-30-суточного возраста мясного и яичного направления из ЗАО «Птицефабрика Невская» и «Тульский бройлер».:

Свежие трупы, головы и трахеи с легкими от клинически больных или павших цыплят хранили при; минус 10-20°С до проведения вирусологических исследований. . .:

Тампоны с| патологическим материалом (эксудативные выделения из верхних дыхательных путей, инфраорбитальных синусов) помещали в раствор Хенкса с антибио тиками. Ц

Суспензию из патологического материала готовили по общепринятым методикам (В.Н.Сюрин с соавт., 1991).

Выделение! вируса проводили путем перемежающихся пассажей на развивающихся СПФ куриных эмбрионах 6-7 - суточного возраста и ,культурах клеток или последовательных пассажей на клетках Vero.

Вирус. В работе использовали вакцинный штамм VC-03 (Picault Y:P., 1987) подтипа В, реизолированный из; лиофилизированной вакцины Ñeinovak производства фирмы Rhone Merilux. .

- Вирус поддерживали : 'в перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышю! (клетки Vero) и хранили при температуре минус 20 С. . i: Сыворотки, тестируемые в непрямом варианте ИФА. Исследовали образцы сывороток крови кур не содержащие макроскопических признаков бактериальной и грибковой контаминации.

Диагностику мы: í

•'.i- 1

- набор для обнаружения антител к возбудителю метапневмовирусной инфекции птиц BioCekf.- производства фирмы "Avian Rhinotracheitis Antibody Test Kit" (Holland);

- набор для определения' антител к пневмовирусу иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»;

- набор для определения; антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»;

- набор для выявления антител к возбудителю реовирусной инфекции птиц иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»;

- набор для выявления антител к инфекционному энцефаломиелиту кур, иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ». i

Инкубационные яйца и цыплята:

- яйца СПФ-кур, полученные из фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия), 200 штук;

- цыплята, инкубированные из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в условиях ГНУ

ВНИВИП, 50 голов.

Культуры клеток:

- первично-трипсинизированная культура клеток СПФ куриных i эмбрионов (ККЭ);

- перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки, клетки Vero (НИИ гриппа'АМН, Санкт-Петербург).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы:

- питательная среда Игла MEM или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином;

- питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином;

- питательная!среда ДМЕМ/П2 с Hepes, жидкая;

1 " ¡

- сыворотка крови крупного рогатого скота, неконсервированная для культур клеток;

- сыворотка крови плодов коровы;

- трипсина раствор, 0,25% фирмы «US ВЮ»;

- версена раствор, 0,02%;1

- Хенкса раствор фирмы «Hyclone»;

- питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производства ООО «Биолот»;

- калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 4198, ОАО «Реактив»;

- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, ч.д.а., ГОСТ 2493,ОАО «Реактив»;

- натрий хлористый (NaCI), х.ч., ГОСТ 4233, ОАО «Реактив»;

- фосфатно-цитратный буфер производства ООО «Биолот»;

- перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»;

- ортофенилендиамин (ОФД) производства фирмы Sigma;

- твин 20 (Р7949) производства фирмы Sigma;

- анти видовой иммунопероксидазный коньюгат против IgG курицы производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва);

- микробиологические среды: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (среда Китт-Тароцци), агар Сабуро, производства ГНУ ВНИВИП.

2.1.2. Методы исследований

В качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла МЕМ/ДМЕМ и среду 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: бензинпенициллина 100

1 о

ЕД/см и стрептомицина сульфата - 100мкг/см

Раствор для диспергирования ткани состоял из 0,25% раствора трипсина, 0,02% раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2.

Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке при темперагуре 36-37° в течение 10-15 мин до полного расщепления» фрагментов ткани на отдельные клетки. По истечении указанного времени клеточную взвесь (надосадочную жидкость) сливали во флаконы с охлажденной смесыо сыворотки крови крупного рогатого скота до 10% и среды Игла (соотношение 1:1) с целью нейтрализации действия трипсина.

Суспензию клеток центрифугировали при 900-1000» об/мин в течение 15-20 минут. Из осадка клеточной массы готовили суспензию клеток в 5 ростовой питательной среде Игла с содержанием 650-750 тыс. кл./см .

Клеточную суспензию разливали в пробирки и матрасы по 2 и 220 см3 соответственно и инкубировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)°С. В течение 48 час на поверхности стекла формировался клеточный монослой.

Клетки Vero пересевали с интервалом 5-6 сут. бесцентрифужным методом. Для снятия монослоя клеток со стекла использовали растворы трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:9. Монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса, затем в матрас добавляли смесь растворов о трипсина и версена, прогретую до 37 С и инкубировали в термостате в течение 5-10 мин до начала отделения клеток от стекла.

Раствор версена с трипсином сливали, а клетки ресуспендировали в определенном объеме питательной среды. Клетки подсчитывали в камере Горяева, затем разводили ростовой питательной средой (среда ДМЕМ/Р12 с Hepes, до 10% фетальной сыворотки и антибиотиков) до необходимой концентрации (200-250 тыс.кл./см3). Разливали в пробирки по 1см3 и пластиковые матрасы, культивировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)° С.

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в чувствительной клеточной культуре (ККЭ, клетки Vero) методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями. Из культуральной вируссодоржащей жидкости готовили 10-кратные разведения 1 8

10" -10" на поддерживающей среде без добавления сыворотки.

Каждым разведением вируса заражали 4 пробирки с культурой клеток. Время контакта вируса, с клеточным монослоем составляло 30 минут при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляли по 1,8 см3 поддерживающей среды Игла MEM. Зараженные и контрольные культуры инкубировали при температуре 38°С. Ежедневно в течение 5-7 суток проводили учет ЦПД, выражая его по 4-крестовой системе.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench Н. (1938) и 2 выражали в lg ТЦД50 в 1,0 см (тканевая цитопатогенная доза).

РН ставили в культуре клеток со специфическими сыворотками, полученными от иммунизированной птицы. Вариантами реакции были:

1. Прямая РН с постоянной дозой гомологичной, сыворотки и десятикратным разведением вируса (а-вариант);

2. Прямая РН с постоянной дозой вируса 100 или 1000 ТЦД5о с двукратными разведениями гомологичной сыворотки ((3-вариант).

Техника постановки РН. Сыворотки перед началом исследований освобождали от термолабильных неспецифических ингибиторов подогреванием в водяной бане при температуре 5б°С в течение 30 минут. Смеси равных объемов вируса и сыворотки в* соответствующих разведениях выдерживали при комнатной температуре в течение 60 минут, а затем в объеме 0,2 см3 вводили в 4 пробирочные культуры с 1,8 см3 поддерживающей среды.

Титр вируса и конечную точку нейтрализации вычисляли по Reed L.J. & Muench Н. (1938) на основании ЦПД в культуре клеток через 5-6 суток инкубации после инокуляции вируса.

Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП) (В.Д. Сергеев, И.К. Рождественский, 1988). Макропористое стекло размером1 пор 1000А0 активировали концентрированной соляной кислотой (НС1) в соотношении 1:2 и выдерживали при температуре 20-22°С 1-2 суток, периодически встряхивая. После этого кислоту сливали и МПС однократно промывали дистиллированной водой, затем его заливали равным* объемом смеси Комаровского (6% раствор Н202 в 6М растворе НС1 в соотношении 1:1). Смесь с МПС нагревали на водяной бане при 56°С в течение 2 ч в вытяжном шкафу. Обработанное МПС промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и под вакуумом удаляли воздух из пор. Затем заливали двумя объемами 4% раствора ПВП в дистиллированной воде и перемешивали на качалке в течение 4-5 ч. Раствор сливали, а МПС отмывали от несвязанного ПВП дистиллированной водой до исчезновения желтой окраски. Колонку размером 80><2см заполняли модифицированным МПС и уравновешивали 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР), рЫ 7,3-7,5. После стабилизации колонки над поверхностью МПС оставляли слой буфера в 1 мм. После этого на МПС наслаивали вируссодержащую жидкость. Элюцию вируса осуществляли ФБР; рН 7,3-7,5 с использованием перистальтического насоса, прибора РЭППС-1М (регистратор измерений электропроводимости и процента поглощения света элюатом при жидкостной хроматографии» при длине волны 280 нм) со скоростью 0,7-1,0 см3/мин и собирали его отдельной фракцией. Выход очищенного вируса регистрировался на ленте самописца в своеобразном пике, затем большим пиком выделялись примесные белки.

Иммуноанализ антител. Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет для ИФА (Чехия) использовали очищенный антиген метапневмовируса птиц в оптимальной концентрации, разведенный 0,01М ФБР, рН 7,3-7,5. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 18-20 часов при температуре 4-8°С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали трехкратно в объеме 0,2 см3 0,0калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,0-7,4. Планшеты для ИФА с иммобилизированным антигеном метапневмовируса были пригодны для постановки реакции при хранении их при температуре 4-8°С в течение 12 мес.

В лунки с адсорбированным антигеном вносили по 0,1 см3 контрольные (положительную и отрицательную) и исследуемые сыворотки' крови кур в разведении 1:400. Планшет помещали в термостат при 37°С на 30 минут, содержимое лунок планшета удаляли, и планшет трехкратно отмывали в объеме 0,2 см3 от несвязавшихся антител.

В отмытые лунки планшета вносили по 0,1 см3 антивидового иммунопероксидазного конъюгата, специфичного к' ^О кур в рабочем разведении, термостатировали 30 минут при 37°С и отмывали лунки планшета трехкратно в объеме 0,2 см3 ФБРТ. Затем добавляли по 0,1 см3 субстратно-индикаторной смеси (0,04 % ортофенилендиамина и 0,4 % раствор перекиси водорода). Планшет помещали в темное место при комнатной температуре на 3-5 минут. Реакцию останавливали 0,05 см3 10 % Н2804 и считывали поглощение (оптическую плотность) на иммуноферментном анализаторе «Пикон» при длине волны 492 нм.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа

2.2.1.1. Получение очищенного метапневмовируса птиц

Важнейшим условием непрямого метода ИФА является получение высокоочищенных препаратов вируса.

Метапневмовирус штамма VC-03 репродуцировали на клетках Vero и в культуре клеток СПФ-эмбрионов кур. Клетки выращивали на культуральной среде, содержащей среду Игла ДМЕМ и среду №199, в соотношении 2:1, 10% сыворотки КРС для культуральных работ и смесь антибиотиков (пенициллина 100 ЕД/см и стрептомицина 100 мкг/см ). После образования монослоя клеток, его однократно промывали раствором Хенкса, инокулировали метапневмовирус из расчета 0,1-1 ТЦД50 на клетку и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем добавляли поддерживающую среду с антибиотиками без сыворотки. Первые признаки цитопатического действия (ЦПД) проявлялись через 48 часов в виде зернистости в цитоплазме клеток. Через 90-120 часов наблюдали полную дегенерацию клеточного пласта с образованием синцития. Затем клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием, культуральные матрасы встряхивали и клеточный детрит осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную вируссодержащую жидкость исследовали на инфекционную активность.

Определение инфекционного титра метапневмовируса проводили в пробирочной культуре клеток по ТЦД. Посевная концентрация клеток составила 750 тыс. кл/см . После формирования монослоя из пробирок удаляли ростовую среду, однократно промывали раствором Хенкса и вносили

1 /Г п вирус в разведениях от 10" до 10" , в объеме 0,2 см , по 4 пробирки на каждое разведение.

Результаты оценивали по ЦПД через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Рида и Менча. Инфекционный титр вируса составил 5,8±0,4 ^ ТЦД5о/см .

Для получения концентрированного вируссодержащего материала (ВСМ) был использован метод дифференциального центрифугирования. Вирус из предварительно осветленной культуральной жидкости осаждали при 75000 % в течение 1,0, 1,5 и 2,0 часов. Результаты исследований показали, что метод ультрацетрифугирования позволяет концентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус в течение 1,5 часов. Осадок л ресуспендировали в 5,0 см фосфатно-солевого буфера.

ВСМ очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и рН элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала.

Результаты исследований показали, что очистка концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор 1000А?, 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка.

По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и осадка. Степень очистки вируса оценивали по белку. Очистка вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Вторым показателем степени очистки вируса был его выход по инфекционной активности. Активность метапневмовируса до очистки соответствовала 5,8±0,4 ^ ТЦД 50/см , а после очистки вирус был с активностью 4,8±0,5 ^ ТЦД 50/см3. Таким образом, расчеты показали, что выход метапневмовируса по инфекционной активности составил 82,7%. Характерная для метапневмовируса птиц хроматограмма представлена на рис. 3. г X о со \ 1 1

СГ О / \ 1 * ' ! \ / \ 2 | \ У !

I фракции белка

Рис. 3. Хроматограмма очистки метапневмовируса птиц

- первый пик - вирусный белок (1);

- второй пик - примесный белок (2)

Колонка: 2 х 80см, объем вируссодержащей жидкости 1,0см3, объем очищенного вируса 12 см3

2.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови кур

Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней.

Иммунизацию проводили путем введения нарастающих доз очищенного метапневмовируса птиц по следующей схеме (табл. 1).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Дмитриев, Денис Валерьевич, Санкт-Петербург

1. Борисова И.А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против Нькаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц: автореф. дисс. .канд.биол.наук / И.А. Борисова // Владимир, 2008. 25с.

2. Борисова O.A. Метапневмовирусная инфекция птиц (обзор литературы) / О.А.Борисова, И.А. Борисова // Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ». 2007. - 77с.

3. Борисова И.А. Метапневмовирусная инфекция птиц / И.А.Борисова, A.B. Борисов // РацВетИнформ. 2009. - №12. -С.9 - 11.

4. Борисова, И.А. Антигенная активность экспериментальной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и пневмовирусной инфекции птиц / И.А. Борисова // Вет. патология. 2006. - №4 (19). - С. 144146.

5. Борисова, И.А. Пневмовирусная инфекция птиц /И.А Борисова, С.К. Старов // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2006. - Т.4. — С.281-296.

6. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа / Вербов В.Н. // Твердофазный иммуноферментный анализ: сб. науч. тр. / Ленингр. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.-Л., 1988.-Т.64.-С.3-27.

7. Виноходов, В.О. Синдром «опухшая голова» или введение в отоларингологию птиц / В.О. Виноходов // Ветеринария в птицеводстве.- 2003. №1 (7) - С.14-27.

8. Ганнушкин М.С. Курс эпизоотологии / М.С. Ганнушкин // М.: Сельхозгиз, 1952. 423с.

9. Ирза, В.Н. Проблемы респираторных заболеваний в современном птицеводстве / В.Н. Ирза, A.B. Борисов, В.В Дрыгин и др. // 1-й Междунар. ветер, конгресс по птицеводству. М., 2005. - С.14-22.

10. Ирза, В.Н. Серологический мониторинг по птичьему пневмовирусу (Avian Pneumovirus APV) в России / В.Н. Ирза, Т.В. Оковытая, В.В. Борисов и др. // Конференция по птицеводству. - Зеленоград, 2003. - С.222-223.

11. Капустин В.Н. Диагностика и профилактика пневмовируса у кур-несушек / В.Н. Капустин, В.Г. Лысый // Ветеринария и кормление 2005. - №5. - С.31

12. Каспарьянц С. Пневмовирусы птицы / С.Каспарьянц, А. Столляр, Preston Vet Kft // РацВетИнформ. 2009. - №11. - С.8-10.

13. Маслов Д.В. Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа: автореф. дисс. .канд.вет.наук./ Д.В. Маслов // СПб, 2006. 22с.

14. Оценка результатов прямого твердофазного иммуноферментного метода для определения антигенов / Г.В. Резапкин и др. // Вопросы вирусол.-1986. №5. - С.573-577.

15. Сергеев В.Д. Методические рекомендации по очистке и концентрированию аденовирусов птиц /Сергеев В.Д., Рождественский И.К. Л., 1988.-30с.

16. Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, 'Н.В. Фомина // М.: Агропромиздат, 1991. -С.376.

17. Трефилов Б.Б. Ассоциированное течение респираторных вирусных болезней птиц / Б.Б. Трефилов, Н.В.Никитина, Ф.М. Пунтус и др. // Матер.междунар. конгр. СПб. - 2009. - С.41-42

18. Трефилов Б.Б. Чувствительность клеточных культур к метапневмовирусу птиц /Б.Б. Трефилов, Л.Ю. Данко // Вопр. норм.-прав, регулир. в ветеринарии. 2010. - №1. - С.44-46.

19. Трефилов Б.Б. Пневмовирусная инфекция птиц (эпизоотология, диагностика) / Б.Б; Трефилов, Н.В. Никитина, Н.В. Денисов и др. // Актуал. пробл. вет. мед. (научно-практ. конгр. 24-25 августа 2007). СПб. - 2007. - С.210-211.

20. Троценко Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская // М.: «Колос»,2000. С.272.

21. A sequential histopathologic and immunocytochemical study of chickens, turkey poults and broiler breeders experimentally infected with turkey rhinotracheitis virus / .N. Majo, G.M. Allan, C.J. O'Loan et al. //Avian Dis. -1995. V.39. -P.887-896.

22. A serological survey of turkey rhinotracheitis virus infection in chickens in Japan / M. Tanaka, N. Kokumai, T. Obi et al. //J. Vet. Med. Sci.-1996. V.58. - P.689-691.

23. A serosurvey using enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies against poultry pathogens in Ostriches (Struthio camelus) from Zimbabwe / H.F. Cadman, P.J. Kelly, R. Zhou et al. //Avian Dis.-1994. V.38. -P.621-625.

24. A wild goose metapneumovirus containing a large attachment glycoprotein is avirulent but immunoprotective in domestic turkeys / R.S. Bennett, R. La Rue, D. Shaw et al. // J. Virol. -2005. -V.79. P. 14834-14842.

25. Ahmadian, G. Detection and characterization of processing encoded by the second ORF of the M2 gene of pneumoviruses / G. Ahmadian, P. Chambers, A.J. Easton // J. Gen. Virol. 1999. - V .80.- P.2011-2016.

26. Alexander, D.J. Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections / D.J. Alexander // Diseases of Poultry.-10th ed. Ames, Iowa, 1997. P.541-569.

27. Anon. Turkey rhinotracheitis of unknown aetiology in England and Wales: a preliminary report from the British Veterinary Poultry Association // Vet. Rec. -1985. V.117. -P.653-654.

28. Antibodies to TRT in chickens with swollen head syndrome / P.J. Wyeth, N.J. Chettle, R.E. Gough et al. //Avian Dis. 1987. - V.31. - P.286-287.

29. Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies / J.K.A. Cook, B.V. Jones, M.M. Ellis et al. // Avian Pathol.-1993. V.22. - P.257-273.

30. Arns, C.W. Swollen head syndrome in poultry flocks in Brazil / C.W. Arns, H.M. Hafez // Proc. 41st Western Poultry'Dis. Conf. Sacramento, California, 1992. - P.81-83.

31. Attempts to reproduce swollen head syndrome in specific pathogen free chickens by inoculating with Escherichia coli and/or turkey rhinotracheitis virus / K. Nakamura, M. Mase, N. Tanimura et al. // Avian Pathol. 1998 - V.27. - P.21-27.

32. Avian pneumovirus (APV) RNA from Wild and sentinel birds in the United States has genetic homology with RNA from APV isolates from domestic turkeys / H.J. Shin, M.C. Njenga, B.

33. McComb et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - V.38. - P.4282-4284.

34. Avian pneúmovirus in turkeys: have you seen it? / D.A. Senne, J.C. Pedersen, R.K. Edson, B. Panigrahy // Proc. 47 th Western Poultry Dis. Conf. -Sacramento, California, 1998. P.67-68.

35. Avian pneumovirus infection in broiler chicks inoculated with Escherichia coli at different time intervals I A.R. Al-Ankari, J.M. Bradbury, C.R. Naylor et al. // Avian Pathol. -2001. V.30.- P.257-267.

36. Avian pneumovirus infection in Minnesota turkeys: experimental reproduction of the disease / F.E. Jirjis, S.L. Noll, D.A. Halvorson et al. // Avian Dis. 2000. - V.44. - P.222-226.

37. Avian pneumovirus infection of laying hens: experimental studies / J.K.A. Cook, J. Chester, F. Orthe et al. // Avian Pathol.- 2000. V.29. - P.545-556.

38. Avian pneumovirus update / D.A. Senne, R.K. Edson, J.C. Pederson et al. // Proc. 134th Ann. Conf- Schaumburg, Illinois: Am. Vet. Med. Assoc., 1997. P.190.

39. Banet-Noach, C. Characterization of Israeli avian metapneumovirus strains in turkeys and chickens / C. Banet-Noach, L. Simanov, S. Perk // Avian Pathol. 2005. - V.34, N3. - P.220-226

40. Banet-Noach, C. Direct (non-vector) transmission of West Nile virus in geese / C. Banet-Noach, L. Simanov, M. Malkinson // Avian Pathol. 2003. - V.32. - P.489-494.

41. Baxter-Jones, C. A comparison of three methods for detecting antibodies to turkey rhinotracheitis virus. / C. Baxter-Jones, M. Grant, R.C. Jones et al. // Avian Pathol. 1989. - V.18. -P.91-98.

42. Baxter-Jones, C. A comparison of three methods for detecting antibodies to turkey rhinotracheitis virus. / C. Baxter-Jones, M. Grant, R.C. Jones // Avian Pathol. 1989. - V.18. - P.91-98.

43. Baxter-Jones, C. Immunofluorescence as a potential diagnostic method for turkey rhinotracheitis. / C. Baxter-Jones, G.P. Wilding & M. Grant // Vet. Rec. 1986. - V.119. - P.600-601.

44. Bell, I.G. Failure to detect antibody to turkey rhinotracheitis virus in Australia poultry flocks / I.G. Bell, D.J. Alexander // Austral. Vet. J. 1990. - V.67. - P.232-233.

45. Bennett, R.S. Detection of avian pneumovirus in wild Canada geese (Branta canadensis) and blue-winged teal (Anas discros) / R.S. Bennett, B. McComb, H.J. Shin et al. // Avian Dis. 2002. - V.46. - P.1025-1029.

46. Buys, S.B. A preliminary report on the isolations of a virus causing sinusitis in turkeys in Souch Africa and attemps to attenuate the virus / S.B. Buys, J.H. Du Preez // Turkeys- 1980. -V.28. P.36.

47. Buys, S.B. The isolation and attenuation of a virus causing rhinotracheitis in turkeys in South Africa / S.B. Buys, J.H. Du Preez & H.J. Els // Onderstepoort J. Vet. Res. 1989a. - V.56. -P.87-98

48. Buys, S.B. Swollen head syndrome in chickens: a preliminary report on the isolation of a possible aethiological agent / S.B. Buys, J.H. Du Preez & H.J. Els // J. of the South African Vet. Ass. 1989b. - V.60. - P.221-222

49. Cavanagh, D. Innovation and discovery: the application of nucleic acid-based technology to avian virus detection and characterization / D. Cavanagh // Avian Pathol. 1999. - V.30. -P.581-598.

50. Cavanagh, D. Pneumovirus-like characteristics of the mRNA and proteins of turkey rhinotracheitis virus / D. Cavanagh, T. Barrett // Virus Res. 1988 - V.ll. - P.241-256.

51. Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America / T.C. Peret, G. Biovin, Y. Li et al. //J. Infect. Dis. 2002. - V.185. - P.1660-1663.

52. Chettle, N.J. The use of an ELISA test to detect antibodies to turkey rhinotracheitis / N.J. Chettle, P.J. Wyeth // Brit. Vet. J. -1988. V. 144. - P.282-287.

53. Close relationship between TRT virus isolates / C. Baxter -Jones, J.K.A. Cook, J.A. Frazier et al. // Vet. Rec. -1987. -V. 120. P.562.

54. Cold adapted avian pneumovirus for use as live, attenuated vaccine in turkeys / D.P. Patnayak, B.R. Gulati, M.A. Sheikh et al. // Vaccine. 2003. - V.21. - P.1371-1374

55. Collins, M.S. Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies / M.S. Collins, W.J. Cox, N.J. Gettle // Avian Pathol. 1993. - V.22. - P.469-479.

56. Collins, M.S. Characterisation of a virus associated with turkey rhinotracheitis / M.S. Collins, R.E. Gough // J. Gen. Virol. -1988. V.69. - P.909-916.

57. Collins, M.S. Experimental infection of turkeys chickens, ducks, geese, guinea fowl pheasants and pigeons with turkey rhinotracheitis virus /M.S. Collins, W.J. Cox, N.J. Gettle // Vet. Rec. 1988. - V.123. - P.58-59.

58. Collins, M.S. Respiratory syncytial virus/ M.S. Collins, K. Mclntons, R.M. Chanoc // Fields Virology. 3rd ed. Philadelphia; -1996.- P.1313-1351.

59. Comparison of F-, G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus / M. H. Bayon-Auboyer, V. Jestin, D. Toquin et al. //Arch. Virol.-1999. V.144. - P.1091-1109.

60. Cook J.K.A. A live attenuated turkey rhinotracheitis vaccine. 1. Stability of the attenuated strain / J.K.A. Cook, M.M. Ellis, C.A. Dolby et al. // Avian Pathol. 1989. - V.18. - P.511-522.

61. Cook, J.K.A. Attenuation of turkey rhinotracheitis virus by alternative passage in embryonated chicken eggs and tracheal organ cultures / J.K.A. Cook, M.M. Ellis // Avian Pathol. 1990.-V. 19. - P.181-185.

62. Cook, J.K.A. Avian rhinotracheitis. / J.K.A. Cook // Revue Scientifique et Technique, Office International des Epizooties. -2000. L. 19. - P.602-613.

63. Cook, J.K.A. Detection and differentiation of avian pneumoviruses (metapneumoviruses)/ J. K. A. Cook, D. Cavanagh // Avian Pathol. 2002 - V.31 - P.117-132.

64. Cook, J.K.A. In vitro and in vivo studies in chickens and turkeys on strains of turkey rhinotracheitis virus isolated from the two species / J.K.A. Cook, S. Kinloch, M.M. Ellis // Avian Pathol. 1993. - Y.22. - P.157-170.

65. Cook, J.K.A. Preliminary antigenic characterization of an avian pneumovirus isolated from commercial turkeys in Colorado, USA. / J.K.A. Cook, M.B. Huggins, S.J. Orbell et al. // Avian Pathol. 1999. - V.28. - P.607-617

66. Cook, J.K.A. The pathogenesis of turkey rhinotracheitis in turkey poults inoculated with the virus alone or together with two strains of bacteria / J.K.A. Cook, M.M. Ellis, V.B. Huggins // Avian Pathol. 1991. - V. 119. - P.l81-185.

67. Droual, R. Swollen head syndrome associated with E. coli and infectious bronchitis virus in the Central Valley of California. / R. Droual & P.R. Woolcock // Avian Pathol. 1994. - V.23 -P.733-742.

68. Eterradossi, N. Discrepanciens in turkey rhinotracheitis ELISA results using different antigens / N. Eterradossi, D. Toquin, M. Guittet et al. // Vet. Ree. 1992. - V.131. - P.563-564.

69. Eterradossi, N. Evaluation of different turkey rhinotracheitis viruses used as antigens for serological testing following live vaccination and challenge / N. Eterradossi, D. Toquin, G. Bennejean // Vet. Med. 1995. - V.42. - P.175-186.

70. Evidence of avian pneumovirus spead among wild birds and domestic turkeys in central North America / R.S. Bennett, M.K. Njenga, J. Nezworski et al. // Avian Dis 2004 - V 48 - P.902-908.

71. Experimental and field evaluation of a live vaccine against avian pneumovirus / D.P. Patnayak, M.A. Sheikh, B.R. Gulati et al. // Avian Pathol. 2002. - V.31. - P.377-382.

72. Experimental infection of turkeys, chickens, ducks, geese, guinea fowl, pheasants, and pigeons with turkey rhinotracheitis virus / R.E. Gough, M.S. Collins, W.J. Cox , N J Chette //Vet. Ree. -1988. V. 123 - P.58-59.

73. Gerrard, C. Avian rhinotracheitis diagnostic kit. / C. Gerrard, A. Whitworth, N.J. Chettle et al. // Vet. Ree. 1990. -V. 126. - P.342.

74. Giraud, P. La rhinotracheite infectieuse de la dinde. Description et role d'un nouvel agent viral. / P. Giraud, M. Guittet, D. Toquin et al. // Receuil de Medecine Veterinaire. 1988. -L.164. - P.39-44.

75. Giraud, P. Turkey rhinotracheitis in France: preliminary investigations on a ciliostatic virus. / P. Giraud, G. Bennejean, M. Guittet et al. // Vet. Ree. 1986. - V.l 19. - P.606-607.

76. Gough, R.E. A.ntigenic relationships of three turkey rhinotracheitis viruses / R.E Gough, M.S. Collins // Avian Pathol. -1989. V. 18. - P.227-238.

77. Gough, R.E. Isolation of an avian pneumovirus from broiler chickens / R.E. Gough // Vet. Ree. 1994. - V.134. - P.353-354.

78. Grant, M. An enzyme linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of turkey rhinotracheitis infection / M. Grant, C. Baxter - Jones, G.P. Wilding // Vet. Ree. - 1987. - V.120 - P.279-280.

79. Hafez, H.M. Comparative investigation of turkey rhinotracheitis (TRT) virus isolates from different countries / H.M. Hafez // Dtsch. Tierarztl Wochenschr. 1992. - Bd.99. - S.486-488

80. Hafez, H.M. Rhinotracheitis der Puten: Ubersicht und Erfahrungen in der Bundesrepublik Deutschland. / H.M. Hafez // Wiener Tierärztliche Monatsschrift. 1991. - Bd.78. - S.195-200.

81. Hafez, H.M. Swollen head syndrome: clinical observations and serological examinations in West Germany / H.M. Hafez, U. Lohren // Dtsch. tierarztl. Wochenschr. 1990. - Bd.97. - S.322-324

82. Hafez, H.M. The role of pneumovirus in swollen head syndrome of chickens: review / H.M. Hafez//Arch. Geflugelkunde.- 1993. Bd.57. - S.181-185.

83. Herrman J.E. Quantitation of immunoglobulin adsorption to plastics / J.E. Herrman, M.F Collins. // J. Immun. Method.-1976. -V.10, №4. P.363-366.

84. High genetic diversity of the attachment (C) protein of human metapneumovirus / N. Ishiguro, R. Ebihara, X. Endo et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V.42. - P.3406-3414.

85. Infections rhinotracheitis in turkeys: antigenic differences revealed by ELISA / D. Toquin, N. Eterradossi, M. Guittel et al. // New and Evolving Virus Diseases of Poultry: Proc. seminar/ Europ. Comm. Brussels, 1994. - P.l 11-121.

86. Infectious agents associated with respiratory disease in pheasants / D.B. Welchman, J.M. Hiadbury, D. Cavanagh, N.J Aebischer// Vet. Ree. 2002. - V.150. - P.658-664.

87. Infectious bronchitis virus vaccine interferes with the replication of avian pneumovirus vaccine in domestic fowl / J. K. A. Cook, M.B. Huggins, S.J. Orbeil et al. // Avian Pathol. 2001.- V.30,N3. P.233-242.

88. Isolation of a pneumovirus from a Muscovy duck / D. Toquin, M.H. Bayon-Auboyer, N. Eteradossi et al. //Vet. Rec. -1999. V. 145. - P.680.

89. Isolation of a TR.TV like virus from chickens with swollen head syndrome / J.P. Picault, Giraud, P.Drouin et al. //Vet.Rec.-1987a. - V.121. - P.135.

90. Isolation of avian pneumovirus in US turkey flocks / S.M. Goyal, S. Chiang, A. Dar et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2000. -V. 12. - P.116-118.

91. Isolation of avian pneumoviruses from mallard ducks that is genetically similar to viruses uses isolated from neighboring commercial turkeys / H.J. Shin, K.V. Nagaraja, B. McComb et al. // Virus Res. 2002a. - V.83. - P.207-212.

92. Isolation of ortho- and paramyxovirus from wild birds in Northern Ireland during the 1997 Newcastle epizootic / D.A. Graham, A. German, D. Abernethy et al. // Vet. Rec. 1999. -V. 145. - 20-21.

93. Jing, L. Detection of turkey rhinotracheitis virus in turkeys using the polymerase chain reaction / L. Jing, J.K.A. Cook, T.D.K. Brown et al. // Avian Pathol. 1993. - V.22. - P.771-783.

94. Jones R.C. Experimental infection of laying turkeys with rhinotracheitis virus: distribution of virus in the tissues and serological response. / R.C Jones, R.A. Williams, C. Baxter-Jones et al. // Avian Pathol. 1988. - V.17. - P.841-850.

95. Jones, R.C. Avian pneumovirus infections: questions still unanswered / R.C. Jones // Avian Pathol. 1996. - V.23. - P.639-648.

96. Jones, R.C.' Demonstration of a candidate virus for turkey rhinotracheitis in experimentally inoculated turkeys / R.C. Jones, C. Baxter Jones, G.P. Wilding et al. // Vet.Rec. - 1986. - V. 119. - P.599-600.

97. Jones, R.C. Effect of cyclophosphamide immunosuppression on the immunity of turkeys to viral rhinotracheitis. / R.C. Jones, C.J. Naylor, A.I. Al-Afaleq et al. // Research in Veterinary Science. 1992. - V.53 - P.3 8-41.

98. Jones, R.C. Experimental infection of chickens with a ciliostatic agent isolated from turkeys with rhinotracheitis. / R.C. Jones, C. Baxter-Jones, C.E. Savage et al. // Vet. Rec. 1987.1. V.120. P.301-302.i

99. Jones, R.C. Respiratory viral diseases lessons to be learned? / R.C. Jones // Int. Poultry Prod. -2004. - V.12,N4. - P.l 115.

100. Juhasz, K. Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups / K. Juhasz, A.J. Easton // J. Gen. Virol-1994. V.75. -P.2873-2880.

101. Kapczynski, D.R. Immunization of turkeys with a DNA vaccine expressing either the F or N gene of avian metapneumovirus / D.R. Kapczynski, H.S. Sellers // Avian Dis.-2003. V.47. - P.1376-1383.

102. Ling, R. Sequence analysis of the 22K, SH and G genes of turkey rhinotracheitis virus and their intergenic regions reveals a gene order different from that of other pneumoviruses / R. Ling,

103. A.J. Easton, C.R. Pringle//J. Gen. Virol. -1992. V.73. - P.1709-1715

104. Ling, R. Turkey rhinotracheitis virus. In vivo and in vitro polypeptide synthesis / R. Ling, C.R. Pringle // J. Gen. Virol. -1988. V.69. - P.917-923.

105. Lister, S.A. Turkey rhinotracheitis: a review / S.A. Lister, D.J. Alexander// Vet. Bull. 1986. - V.56. - P.637-663.

106. Lu, Y.S. Swollen head syndrome in Taiwan-isolation of an avian pneumovirus and serological survey. / Y.S. Lu, Y.S. Skien, H.J. Tsai et al. // Avian Pathol. 1994. - V.23. - P.169-174.

107. Lwamba, H.C.M. Comparison of the full-length genome sequence of avian metapneumovirus subtype C with other paramyxoviruses / H.C.M. Lwamba, R. Alvarez, M.G. Wise et al. // Virus Res. 2005. - V.107. - P.83-92.

108. Maharaj, S.B. Isolation of an avian pneumovirus like agent from broiler breeder chikens in South Africa / S.B. Maharaj // Vet. Rec. - 1994. - V.134. - P.525-526.

109. McDougall, J.S. Turkey rhinotracheitis: preliminary investigations / J.S. McDougal, J.K.A. Cook // Vet. Rec. 1986. -V.118. - P.206-207.

110. Morley, A.J. Swollen head syndrome in broiler chikens / A.J. Morley, D.K. Thompson // Avian Dis. 1984. - V.28. - P.238-243.

111. Naylor, C.J. Exacerbation of Mycoplasma gallisepticum infection in turkeys by rhinotracheitis virus / C.J. Naylor, A.R. Al-Ankari, A.I. Al-Afaleq et al. // Avian Pathol. 1992. - V.21'. -P.295-305.

112. Naylor, C.J. Turkey rhinotracheitis: a review / C.J. Naylor, R.C. Jones // Vet.Bull. 1993. - V.63. - P.339-349.

113. Naylor, CJ. Demonstration of a virulent subpopulation in a prototype live attenuated turkey rhinotracheitis vaccine / C.J. Naylor, & R.C. Jones // Vaccine. 1994. - V.12. - P.1225-1230.

114. Neonatal avian pneumovirus infection in commercial turkeys / H.J. Shin, K.V. Nagaraja, M.C. Kumar et al. // Avian Dis. 2002c. - V.46. - P.239-244.

115. O'Brien, J.D.P. Swollen head syndrome in broiler breeders / J.D.P. O'Brien // Vet. Rec. 1985. - V.117. - P.619-620.

116. O'Loan, C.J. The detection of turkey rhinotracheitis virus antigen in formalin fixed, paraffin embedded tissue using a streptavidin-biotin-immunoperoxidase method / C.J. O'Loan & G.M. Allan // Avian Pathol. 1990. - V.19. - P.401-407.

117. O'Loan, CJ. Immunogold labelling of turkey rhinotracheitis virus / CJ. O'Loan, W.L. Curran & M.S. McNulty // J. of Vet. Med., series B. 1992. - V.39. - P.459-466.

118. Pages-Mante, A. Studies on swollen head syndrome in Spain /A. Pages-Mante // New and Evolving Virus Diseases of Poultry: Proc. Seminar/ Europ. Comm. Brussels, 1994. - P. 109.

119. Panigrahy, B. Experimental and serologic observations on avian pneumovirus (APV /turkey /Colorado/97) infection in turkeys / B. Panigrahy, D.A. Senne, J.C. Pedersen // Avian Dis. -2000. -V.44. P.17-22.

120. Paramyxoviridae / R.A. Lamb, P.L. Collins, D. Kolacofsky et al. N.Y.: Acad. Pres. 2000. - P.835-849.

121. Pathogenesis of avian pneumovirus infection in turkeys / F.E. Jirjis, S.L. Noll, D.A. Halvorson et al. // Vet. Pathol. 2002. - V.39, N2. - P.300-310.

122. Pathogenicy, transmissibility, and tissue distribution of avian pneumovirus in turkey poults /A.N. Alkhalaf, L.A.Ward, R.N. Dearth, Y.M. Saif// Avian Dis. 2002. - V.46. - P.650-659.

123. Patnayak, D.P. Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines / D.P. Patnayak, A. Tiwari, S.M. Goyal // Avian Pathol. 2005. - V.34, N2. - P.123-126.

124. Pattison, M. Observations on swollen head syndrome in broiler and broiler breeder chickens / M. Pattison, N. Chettle // Vet. Rec. 1989. - V.125. - P.229-231.

125. Pedersen, J.C. The sensitivity and specificity of a reverse transcription — polymerase chain reaction assay for the avian pneumovirus (Colorado strain) / J.C. Pedersen, D.L. Reynolds, A. All // Avian Dis. 2000. - V.44, N3. - P.681-685.

126. Picault J.P. Syndrome infectieux de gonflement de la tete (S.I.G.T.): bilan actuel des recherches etiologiques. / J.P. Picault, P. Drouin, J. Lamande et cie. // L'Aviculteur. 1986. - L.467 -P.43.

127. Picault J.P. Une etiologie commune avec la rhinotracheite infectieuse de la dinde / Picault J.P., Giraud P., Drouin P. et cie. // L'Aviculteur. L.481. - P.74.

128. Presence of avian pneumovirus type A in continental Europe during the 1980s / H.M. Hafez, M. Hess, C. Prusas et al. // J. Vet. Med. B. 2000. - V.47, N8 - P.29-33.

129. Pringle, C.R. Virus taxonomy // Arch. Virol. 1999. -V.144. - P.421-429.

130. Pringle, C.R. Pneumoviruses / C.R. Pringle // Virology A Practical Approach, Oxford, United Kingdom - 1985. - P.95-117.

131. Pringle, C.R. Virus taxonomy // Arch. Virol. 1998. -V. 143. - P.1449 - 1459.

132. Protection provided by a commercially available vaccine against different strains of turkey rhinotracheitis virus / J.K.A. Cook, M.B. Huggins, M.A. Woods et al. // Vet. Rec. 1995. -V.136. - P.392-395.

133. Protective efficacy of high passaged avian pneumovirus (APV/MN/turkey/l-a/97) in in.keys / B.R. Gulati, D.P. Patnayak, A.M. Sheikh et al. // Avian Dis. 2001. - V.45. - P.593-597

134. Quingzong, Y. Protection against turkey rhinotracheitis pneumovirus (TRTV) induced by a fowlpox virus recombinant expressing the TRTV fusion protein glycoprotein / Y. Quingzong, T. Barrett, T.D.K. Brown et al., // Vaccine. 1994 - V.12. -P.569-573.

135. Randhawa, J.S. Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus / J.S. Randhawa, S.D. Wilson, K.P. Tolley // J. Gen. Virol. -1996. V.77. - P.3047-1051.

136. Rima, B. Comparison of amino acid sequences of the major structural proteins of the paramixo- and morbilliviruses / B. Rima // Genetics and Pathogenicity of Negative Strand Viruses. Amsterdam: Elsevier, 1989. P.254-263.

137. Seal, B.S. Avian pneumoviruses and emergence of a new type in the United State of America / B.S. Seal // Anim. Hlth. Ris. Reviews. 2000. - V.l. - P.67-72.

138. Seal, B.S. Fusion protein predicted amino acid sequence of the first U.S. avian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other U.S. isolates / B.S. Seal, H.S. Sellers, R.J.

139. Meinersmann // Virus Res. 2000. -V.66. - P.139-145.i

140. Seal, B.S. Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demonstrate that the first U.S. avian pneumovirus isolate is distinct from European strains / B.S. Seal // Virus.Res. 1998. - V.58. - P.45-52.

141. Sequence analysis of the nucleocapsid and phosphoprotein genes of avian pneumovirus circulating in the US / A.M. Dar, S. Munir, S.M. Goyal et al. // Virus Res. V.79. - P.15-25.

142. Sequence and in vitro expression of the M2 gene of turkey rhinotracheitis pneumovirus / Q. Yu PJ. Davis, T.D.K. Brown, D. Cavanagh//J. Gen. Virol.-1992.-V.73.-P.1355-1363.

143. Serological evidence of avian pneumovirus infection in reared and free-living pheasants / E. Catelli, M.A. De Marco, M. Delogu et al. // Vet. Rec. 2001. - V.149. - P. 56-58.

144. Seroprevalence of avian pneumovirus in Minessota turkeys / S.M. Goyal, D. Lauer, K. Friendshuh et al. // Avian Dis. 1999. - V.47. - P.244-250. *

145. Specific detection of avian pneumovirus (APV) US isolates by RT-PCR / H.J. Shin, G. Rajashekara, F.F. Jirjis et al. //Arch. Virol. 2000. - V. 145. - P.1239-1246.

146. Stuart, J.C. Turkey rhinotracheitis (TRT) in Great Britain / Recent advances in turkeyscience. C. Nixey, T.C. Grey, eds. // Poultry Science Symposium Series №21. Butterworths, London: United Kingdom, 1989. P.217-224.

147. Subtyping of new Brazilian avian metapneumovirus isolates from chickens and turkeys by reverse transcriptase-nested-polymerase chain reaction / R.C.F. D'Arce, L.T. Coswig, R.S. Almeida et al. // Avian Pathol. -2005. V.34. - P.133-136.

148. Swollen head syndrome in broiler chickens in Morocco / El Houadfi, M. Hamam, J. Vanmarche et al:. // Pros. 40th Western Poultry Dis. Conf., Acapulco, Mexico 1991. - P.126-127.

149. The use of virus isolation, histopathology and immunoperoxidase techniques to study the dissemination of a chicken isolate of avian pneumovirus in chickens / E. Catelli, J.K.A. Cook, J. Chesher, S.J. et al. // Avian Pathol. 1998. -V.27. - P.632-640.

150. Toquin, D. Use of a related ELISA antigen for efficient TRT serological testing following live vaccination / D. Toquin, N. Eterradossi & M. Guittet // Vet. Rec. 1996. - V.139. - P.71-72.

151. Turkey rhinotracheitis (TRT) in Turkey flocks in Israelvirus isolation and serological response / Y. Weisman, C. Strengel,

152. R. Blumenkranz, Y. Segal // Proc. 37th Western Poultry Dis. Conf. Davis, California, 1988. P.67-69.

153. Turkey rhinotracheitis on a ciliostatic virus / P. Giraud, G. Bennejean, M. Guittet et al.//Vet. Ree.-1986. V.118. - P.81.

154. Turkey rhinotracheitis virus isolated from broiler chicken with swollen head syndrome in Japan / M.Tanaka, H. Takuma, N. Kokumai et al. // J. Vet. Med. Sei. 1995. - V.57. - P.939-941.

155. Wilding, G.P. Ciliostatic agent found in rhinotracheitis / G.P. Wilding, C. Baxter-Jones,M. Grant // Vet. Ree. 1986. -V.118. - P.735.

156. Williams, R.A. Development of a live attenuathed vaccine against turkey rhinotracheitis / R.A. Williams, C.E. Savage, R.C. Jones // Avian Pathol. 1991. - V.20. - P.45-55.

Информация о работе

Дмитриев, Денис Валерьевич
кандидата ветеринарных наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы