Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц"

На правах рукописи

БОЧКАРЕВ ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

16 МАЙ 2013

Санкт-Петербург-2013

005058021

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения Всероссийский научно -исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Трефилов Борис Борисович, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий отделом вирусологии и ОБП ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии

Алиев Алаутдин Серажутдинович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», профессор кафедры микробиологии, вирусологии

и иммунологии

Ирза Виктор Николаевич, доктор ветеринарных наук, ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных», заведующий лабораторией эпизоотологии и мониторинга

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «16 » мая 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан « 15 » апреля 2013 г., размещен на сайте ВАК Минобрнауки РФ и Мрр: // spbgavm.ru.

Ученый секретарь ^Х^У" У

диссертационного совета /\ —/ Белова Лариса Михайловна

1. Общая характеристика работы Актуальность темы. Интенсификация птицеводства способствует возникновению и распространению инфекционных болезней. Плотный график вакцинаций, большая концентрация птицепоголовья, персистенция возбудителей вирусных и бактериальных болезней и другие факторы, подавляющие иммунную систему птиц, завоз новых кроссов ведут к появлению новых болезней, изменению вирулентности возбудителей инфекционных болезней, а также к проявлению уже изученных болезней вирусной и бактериальной этиологии (Б.Ф. Бессарабов, 2001; Gough, 2004).

К числу малоизученных вирусных болезней, появившихся во второй половине 20 века в РФ, необходимо отнести метапневмовирусную инфекцию птиц (М.А. Волкова с соавт., 2005; Botchkov et al., 2002).

Для профилактики этой болезни в птицехозяйствах применяют атгенуированные вакцины Nobilis RTV 8544 и Nemovac VC03 метапневмовируса птиц.

Метапневмовирусы, как и другие биологические объекты, обладают свойствами, передаваемыми по наследству. Наряду со свойствами общими для всех вирусов, имеются признаки, которые могут быть выражены в разной степени у вариантов одного и того же вируса. Эти свойства, играющие основную роль в дифференциации штаммов (вирусов), носят название генетических признаков.

Так как генетические признаки являются отражением особенностей вирусного генома, изменение их может служить показателем эффективности различных экспериментальных воздействий на генетический материал вируса, включая химический и физический мутагенез.

Установлено, что вирулентные и атгенуированные штаммы вируса могут различаться по ряду генетических признаков, тщательное их изучение приобрело особое значение для отбора природно-ослабленных и искусственно полученных вакцинных вариантов.

Усовершенствование имеющихся методов контроля и научно-практическая разработка новых методов контроля вакцинных штаммов метапневмовируса птиц в процессе изготовления и применения вакцин против этой болезни, как и других биопрепаратов, должно складываться из следующих основных направлений:

а) применение современных методов оценки производственных штаммов, характеризующих их иммунобиологические особенности - детальная проверка генетических признаков, их вариабельности в организме и в культурах клеток;

б) применение высокочувствительных и стабильных клеточных культур, не содержащих контаминирующих агентов для контролей производственных штаммов и вакцин;

в) использование иммунных типоспецифических сывороток (не гипериммунных и не гамма-глобулинов) для типирования производственных штаммов и эталонов для контроля иммуногенной и антигенной активности производственных серий вакцин.

При этом изучение и разработка критериев и методов контроля атгенуированных штаммов метапневмовируса птиц являются актуальными при производстве вакцин.

Цели и задачи исследования. Целью исследований было изучить иммунобилогические свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц и их стабильность в процессе исследований.

В соответствии с поставленной целью были выдвинуты следующие задачи:

- изучить патогенные свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц;

- изучить признаки вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, связанные с особенностями их внутриклеточной репродукции и выявляемые in vitro;

- изучить признаки вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, обусловленные свойствами поверхностной структуры вируса;

- составить паспорт на вакцинные штаммы метапневмовируса птиц.

Научная новизна. Впервые изучены генетические признаки вакцинных штаммов 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц, показано их различие и доказана необходимость использования их для контроля при производстве вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц.

Показана возможность культивирования и динамика накопления вакцинных штаммов в различных биологических системах. Установлено различие в антигенной специфичности штаммов вируса.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследований послужили основанием для составления паспорта на вакцинные штаммы 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц.

Разработаны и утверждены Россельхозакадемией методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц». Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

результаты изучения патогенных свойств вакцинных штаммов метапневмовируса птиц;

- генетические признаки вакцинных штаммов, связанные с их внутриклеточной репродукцией;

- генетические признаки вакцинных штаммов, обусловленные свойствами их поверхностной структуры.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2010-2012), на Международном агропромышленном конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и зоотехнии» (Санкт-Петербург, 2012); Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства: материалы Межрегиональной научно-практической конференции (Самара, 2011).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает 200 источников, из которых 167 зарубежных.

2. Собственные исследования

Работа выполнена в 2009-2012 гг. в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения Всероссийский научно -исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии) в соответствии с научно-технической программой НИР 08.07.01.05. 2.1 Материалы и методы При выполнении работы использовали следующие материалы:

Вирус: вакцинный штамм 8544 подтипа А метапневмовируса птиц (Wilding G.P., 1986), Nobilis (Голландия); вакцинный штамм VC-03 подтипа В метапневмовируса птиц (Picault Y.P., 1987), Nemovac Rhone Merieux (Франция). Вирусные штаммы поддерживали в перевиваемой линии клеток Vero и хранили при температуре минус 20°С.

Инкубационные яйца, эмбрионы и цыплята: яйца СПФ-кур, фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия), 450 штук; эмбрионы СПФ-кур, фирмы «Lohmann Tierzucht», 300 штук; цыплята, инкубированные из яиц СПФ-кур фирмы «Lohmann Tierzucht» в ГНУ ВНИВИП, 150 голов.

Культуры клеток: первично-трипсинизированная культура фибробластов СПФ эмбрионов кур (ФЭК); перевиваемая культура клеток почки зеленой африканской мартышки, клетки Vero (институт гриппа АМН, Санкт-Петербург).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: питательная среда

Игла MEM и ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда №199,

жидкая, с L-глутамином; сыворотка крови крупного рогатого скота,

6

неконсервированная для культур клеток; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор, 0,25% фирмы «US BIO»; версена раствор, 0,02%; Хенкса раствор фирмы «Hyclone». Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производства ООО «Биолот».

2.1.2. Методы исследований

Культуры клеток: первично-трипсинизированная культура клеток СПФ куриных эмбрионов, клетки Vero ( НИИ гриппа АМН, Санкт-Петербург).

Инкубационные яйца и цыплята: яйца СПФ-кур, полученные из фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия); цыплята, инкубированные из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в условиях ГНУ ВНИВИП.

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию

(ЦПД) проводили в чувствительной клеточной культуре (ФЭК, клетки Vero) методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench Н. (1938) и выражали в lg ТЦЦ50 в 1.0 см3.

Определение терморезистентности. Вируссодержащую жидкость

разливали в пробирки по 1,0 см3, а затем помещали в водяную баню с температурой 5б°С. Инактивацию проводили в течение 5, 10 и 30 мин. По истечению указанных сроков пробирки с материалом немедленно охлаждали при температуре таящего льда. После чего проводили титрование прогретого и непрогретого вируса в клетках Vero. На основании результатов опытов определяли снижение титра вируса после обработки и выражали отношением: lg Vt/Vo , где V„ - титр вируса до обработки; V, - титр вируса после обработки в течение определенного времени.

Константу скорости инактивации вычисляли, пользуясь формулой: К = 2,3 Pt/Po : t , где 2,3 - основание натуральных логарифмов; Р0 - исходный титр вируса; Р, - титр обработанного вируса по времени; t - время обработки вируса (мин).

Определение чувствительности к действию формальдегида н димерэтиленимина (ДЭИ). Действие формальдегида и ДЭИ изучали в конечной концентрации 0,02, 0,04 и 0,1%. Инактивацию вируса проводили при температуре 37 С в течение 24ч при рН 7,2-7,4 в режиме постоянного перемешивания. В процессе инактивации через 6, 12, 18 и 24ч отбирали пробы вируссодержащей суспензии параллельно с контролем для определения инфекционного титра в клетках Vero. По окончании времени обработки формальдегид нейтрализовали бисульфитом натрия, а ДЭИ - 2 М раствором тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,03 М. Снижение титра вируса после обработки выражали отношением Ig V/VD.

Определение RctTC признака. RctTC признак штаммов вируса, определяли по методу, М.Беньеш-Мельник, Дж.Л. Мельник (1961), в основе которого лежит вычисление разности между титрами изучаемых штаммов вируса при 37 и 34°С или 37 и 40°С. Так, rct34°" /rct4a«7- разница титров вируса / в lg ТЦДо/см3/ при 37 и 34°С больше 4; rct34-+ / rct40° 7 - разница титров вируса при 37 и 34°С меньше 2; rct340± / rct40o±/ -разница титров вируса при 37 и 34°С от 2,1 до 4. Получение интерферона. Интерферон получали в клетках Vero, зараженных вакцинными штаммами МПВ птиц в дозах 0,01; 0,1 и 1,0 ТЦД50 на клетку. Через различные сроки после инокуляции отбирали пробы культуральной жидкости из матрацев.

Определение титра интерферона. Для определения биологической активности интерферона готовили 2-кратные разведения его на среде Игла MEM. Активность интерферона учитывали через 48 часов после внесения вируса-индикатора при полной дегенерации контрольных культур. Ингибирующее действие интерферона определяли по подавлению цитопатогенного действия вируса в опытных и, проявляющихся четко выраженной клеточной дегенерацией в контрольных пробирочных культурах. Титром интерферона считали последнее его разведение, ингибирующее в 50% клеточных культур ЦПД индикаторного вируса.

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический

метод, описанный в руководстве по вирусологии (Н.И. Троценко с соавт., 2000)..

8

Вируснейтрапизующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сыворотки.

За титр антител принимали то наибольшее разведение сыворотки, которое было способно ингибировать активность вируса, внесенного в указанной дозе, в 50% зараженной культуры.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали непрямой метод ИФА, разработанный в ГНУ ВНИВИП на подтип А и В метапневмовируса птиц.

Антигенную специфичность (Ag-признак) и степень нейтрализации штаммспецифичпой антисыворотки (An-признак) вируса изучали по методу McBride W.D. (1959) в модификации Gard S. (1960).

Получение штаммспецифической сыворотки. Гипериммунные сыворотки к изучаемым штаммам меташгевмовируса получали на 20-суточных СПФ-цыплятах в камеральных условиях.

2.2. Результаты собственных исследований

Оценка пригодности вирусного штамма в качестве вакцинного может базироваться только на основе изучения комплекса биологических свойств (генетических признаков), среди которых одни могут иметь главное, а другие второстепенное значение.

2.2.1. Изучение иатогенности для куриных эмбрионов (Р Сье- признак)

Опыты по изучению патогенности вакцинных штаммов 8544 и VC-03 метапневмовируса птиц проводили на СПФ куриных эмбрионах. Заражение 6-7 - суточных эмбрионов проводили в желточный мешок и 9 - суточных - в аплантоисную полость оттитрованным вирусом в дозе 4,0 lg ТЦД50 в 0,2 см3.

Культивирование вакцинных штаммов МПВ на 6-7 - суточных эмбрионах при заражении в желточный мешок показало, что они вызывали гиперемию различной интенсивности кожного покрова павших эмбрионов, отставание их в развитии. Обнаруживали инъекцию кровеносных сосудов желточного мешка.

9

Сердечная мышца эмбрионов была бледного цвета. Вакцинные штаммы вируса при заражении в аллантоисную полость не вызывали гибель 9-суточных СПФ куриных эмбрионов в течение пяти пассажей.

Данные культивирования штаммов при заражении в желточный мешок показали усиление их патогенности с увеличением числа пассажей. Гибель эмбрионов наступала между 72 и 144 часами культивирования. Результаты определения инфекционной активности штаммов МПВ в зависимости от числа пассажей представлены в табл. 1. Таблица 1

Инфекционный титр вакцинных штаммов, культивируемых на куриных эмбрионах, в клетках Vero

Штамм вируса Инфекционный титр вируса, lg ТЦД50 / см3

Число пассажей

1 2 3 4 5

8544 2,33' 2,48 3,11 3,66 4,08

VC-03 2,67 2,76 3,39 3,76 4,58

Примечание: * - инфекционный титр в десятичных логарифмах.

Данные титрования, приведенные в таблице 1, показывают, что в процессе культивирования вакцинные штаммы МПВ птиц адаптировались к куриным эмбрионам при заражении в желточный мешок, и происходило их накопление в значительных титрах. Однако инфекционная активность штаммов существенно не различалась. Штаммы 8544 и УС-03 МПВ птиц характеризовались как РсЬе1.

2.2.2. Изучение патогенности для цыплят (Рсь- признак) При изучении патогенности вакцинных штаммов 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц опыты ставили на 2-суточных цыплятах мясного направления, которых инфицировали подкожно, внутривенно, интратрахеально и интраназально. Множественность заражения составляла 4,0 ^ ТЦД50 в 0,1см3. Результаты опытов, приведенные в таблице 2, показывают, что изучаемые штаммы 8544 и УСОЗ МПВ птиц при подкожном и внутривенном инфицировании не вызывали клинического проявления болезни цыплят и характеризовались как РсЬ 5С~ и РсЬ ¡~ штаммы.

Сравнительная характеристика по патогенности вакцинных штаммов 8544 и УС-03 МПВ для 2-суточных цыплят при различных способах инфицирования

Штамм вируса Множественность заражения, 18ТЦД50/0,2 см3 Метод заражения

п/к в/в и/тр и/наз

заболело заражено заболело заражено заболело заражено заболело заражено

8544 VC03 4.0 4,0 0/30 0/30 0/30 0/30 3/30 3/30 3/30 3/30

Контроль 0,85% NaCl 0/30 0/30 0/30 0/30

Примечание: п/к- подкожный; в/в- внутривенный; и/тр- интратрахеальный; и/наз- интраназальный.

При интратрахеальном и интраиазальном заражении вакцинньми штаммами 8544 и VC-03 через 6-7 суток у 10% цыплят отмечали слабовыраженные клинические признаки болезни в течение недели, в виде угнетения, снижения аппетита, скучивания у источника тепла и чихания. Исходя из полученных данных, штаммы 8544 и VC-03 обозначили как Pch ir и Pch ¡n\

Из каждой подопытной группы по 2 цыпленка на 9 и 20 сутки после заражения были убиты, и из слизистой трахеи и хоан был взят материал для обнаружения антигена в «сэндвич» варианте ИФА. В результате исследований были выявлены антигены вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц.

2.2.3. Биологические признаки метапневмовируса, связанные с особенностями внутриклеточной репликации

2.2.3.1. Изучение цитопатогенной активности вакцинных штаммов метапневмовируса. Опыты по изучению способности метапневмовируса птиц к репродукции в клеточных культурах проводили в первично-трипсинизированной культуре фибробластов 10-11 - суточных куриных эмбрионов и клетках Vero с множественностью заражения 0,1-1,0 lg ТЦД50 на клетку при температуре (37,5 ± 0,5)° С.

Репликация вакцинных штаммов 8544 и VC-03 сопровождалась цитопатическим эффектом с первого пассажа, и этот феномен обнаруживался через 48-72 часа после инокуляции клеток. Штаммы 8544 и VC-03 вируса индуцировали развитие острой формы вирусной инфекции в культуре куриных фибробластов и клетках Vero различным латентным периодом в зависимости от штамма вируса. Полную дегенерацию и гибель клеток куриных эмбрионов отмечали на 6-7 сутки, а клеток Vero - на 4 - 5 сутки

после инфицирования с образованием разной величины синцитиальных формаций.

Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что в культуре фибробластов куриных эмбрипнш! и клетках Vero вакцинные штаммы 8544 и VC-03 накапливались в высоких титрах. Способность штаммов к репликации была выше в клетках Vero на 0,5 lg ТЦЦо/см5, чем в культуре фибробластов. Инфекционная активность штаммов не изменялась от числа пассажей.

Таблица 3

Инфекционные титры вакцинных штаммов МПВ птиц в клеточных культурах

Титры вируса, lg ТЦД50/СМ3, M±m*

Штамм вируса Культура Число пассажей

клеток 1 3 5 10

8544 ФЭК 5,25 ±0,1* 5,2 ± 0,15 5,33 ± 0,2 5,25 ±0,3

КлеткиУего 5,5+ 0,25 5,66±0,3 5,55+0,25 5,67±0,4

VC-03 ФЭК Клетки Vero 5,75±0,1 6,25 + 0,2 5,66±0,2 6,3 ± 0,2 5,52 ±0,15 6,15 + 0,1 5,75 +0,25 6,33 ± 0,2

Примечание: М+т - среднее значение титров вируса Вакцинный штамм VC-03 МПВ накапливался в больших титрах на 0,5 1д, по сравнению со штаммов 8544.

Фетальная сыворотка в поддерживающей среде стимулировала процесс репликации штаммов вируса, что выражалось в сокращении на 24 часа

латентной фазы ЦПД, в течении вирусной инфекции в клетках и накоплении их в больших титрах на 1,0-1,5 Ig ТЦД5о/см3.

Штаммы характеризовались как ТСс,и:+ и TCV+ штаммы МПВ птиц. 2.2.3.2. Изучение способности вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ к репродукции в клетках Vero при различной температуре (RctTC- признак).

Клетки Vero культивировали в пробирках по 1,0 см3 и во флаконах PS по 10,0

см3 в стационарных условиях при температуре (37,5 ± 0,5) С. Способность

штаммов вируса к репликации при температурах 34, 37 и 40 С изучали в

процессе 5 пассажей при ежедневном контроле ЦПД вируса на клетки.

Вакцинные штгшмы 8544 и VC-03 мстапневмовируса птиц вызывали острую

форму вирусной инфекции в клетках Vero при температурах культивирования

34, 37 и 40°С. Таблица 4

Способность вакцинных штаммов МПВ к репликации при различных температурах и определение rctTC признака

Инфекционный титр вируса, lg ТДЦ50/СМ3 (M±m)*

Температура культивирования

Штамм вируса Rct34. 5 пассаж Индекс подавления репликации вируса 18ТДЦ,037 1ёТДЦ5034 Ха- рак- тери сти ка шта мма по rct3s» Rct37° Харак терис тика штам ма по rct37° Rct40- 5 пассаж Индекс подавления репликации вируса lgTOo 37°- IgTOUso 40°" Ха- рак- тери сти ка шта мма по rct40°

8544 6,5+0,2* 0,75±0,01 + 6,25±0,2 + 5,8+0,15 0,45+0,01 +

VC-03 6,5+0,45 0,25+0,05 + 6,75+0,5 + 6,5±0,5 0,25+0,05 +

Примечание: М±т, разница в титрах вируса при 37 и 34 С (37 и 40 С).

Полученные данные, представленные в таблице 4, показывают, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 метапневмовируса способны к репликации при неоптимальных температурах культивирования и характеризовались как ГС1ТС+ штаммы.

2.2.3.3. Изучение способности вакцинных штаммов к индукции интерферона и их чувствительности к интерферону (If, slf- признаки)

Способность вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ к индукции интерферона изучали в клетках Vero множественностью заражения 0,01; 0,1; и 1,0 ТЦЦчп на клетку и температуре культивирования при (37,5 ± 0,5)*С. В каждой срок исследования из флаконов PS с зараженной культурой брали пробы по 3,0 см3 культуральной жидкости, которую замещали равным объемом среды МЕМ. В полученных пробах титровали интерферон. Данные опытов свидетельствовали, что концентрация интерферона в культуральной жидкости находилась в прямой зависимости от индуцируемой дозы штаммов-индуцентов и времени отбора проб после инфицирования клеток Vero. Наибольшую активность интерферона отмечали через 96 часов культивирования.

Вакцинные штаммы МПВ существенно не отличались по способности к индукции интерферона в клетках Vero и по чувствительности к ингибирующему действию интерферона. Штаммы 8544 и VC-03 характеризовались как If+ и s If* штаммы.

2.2.4. Признаки вакцинных штаммов метапневмовируса, обусловленные свойствами поверхностной структуры вируса

2.2.4.1. Изучение терморезистентности (t56 - признак). Вируссодержащую культуральную жидкость помещали в водяную баню в пробирках по 1,0 см3. Учет времени начинался, когда температура в пробирках достигала температуры водяной бани. Материал выдерживали в течение 10, 20 и 30 минут при температуре 56 С . Данные опытов представлены в табл. 5.

Результаты, приведенные в таблице 5, показывают, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц инактивировались при температуре нагревания 56 С в течение 30 минут, однако штамм 8544 был наиболее чувствителен к повышенной температуре.

Сравнительная характеристика по терморезистентности штаммов8544 и VC-03

Штамм вируса Температура инактивации, град. Время обработки, мин Константа скорости инак. lgK„H

10 20 30

Титр вируса, lg ТЦДдо/см3

8544 VC-03 56 56 2.5 + 0.2 1.25± 0.15 0 0,024 0,037

6,0 ± 0,1 3.2 ± 0,25 6,0 ± 0,1 2.1 ± 0,1 6,0 +0,1 0

6,5 ± 0,3 6,5 ± 0,3 6,5 ± 0,3

Примечание: числитель- титр вируса после обработки; знаменатель- титр вируса до обработки.

2.2.4.2. Чувствительность МПВ птиц к действию формальдегида и ДЭИ.

В экспериментах по инактивации штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц использовали вируссодержащую культуральную жидкость с активностью (5,75±0,1) и (6,0±0,1) lg ТЦД^/смЗ. Полученные результаты свидетельствовали о том, что скорость инактивации вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц формальдегидом и ДЭИ находилась в прямой зависимости от концентрации препаратов и времени их воздействия. Штаммы вируса теряли свою биологическую активность при воздействии формальдегида и ДЭИ в конечной концентрации 0,1% в течение 24 часов при температуре 37 С. 2.2.4.3. Изучение антигенных свойств вакцинных штаммов метапневмовируса птиц

Антигенные свойства испытуемых штаммов МПВ птиц изучали на 30-суточных цыплятах путем получения штаммспецифических сывороток. Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в реакции нейтрализации в клетках Vero в ß - варианте против 1000 ТЦД50 вируса и ИФА.

Данные, приведенные в таблице 6, показали, что антигенная активность вакцинного штамма VC-03 значительно выше по сравнению со штаммом 8544, что подтверждают значения титров, полученные в а - и ß - вариантах реакции нейтрализации и ИФА (2,7 ± 0,16, 6,8 ± 0,43 и 7347 ± 225 соответственно).

Активность гипериммунных штаммспецифических сывороток, полученные на вакцинные штаммы МПВ

Активность сывороток в: М±т*

Штамм вируса Реакции нейтрализации ИФА, обратные значения Р<

а— варианте, ИН, lg Р - варианте, logz

8544 2,25 ± 0,25 * 5,5 + 0,32 6089 ± 213 0,05

VC-03 2,7 ± 0,16 6,8 ± 0,43 7347 ± 225 0,05

Примечание: М±т* - среднее значение при Р<0,05

Таким образом, вакцинный штамм VC-03, индуцировал синтез специфических антител в более высоких титрах, что свидетельствует о большей антигенности штамма.

2.2.4.4. Изучение антигенной специфичности вируса (Ag - признак) и степени нейтрализации специфической антисывороткой (Ап - признак)

В опытах использовали штаммспецифические сыворотки, полученные путем двукратной иммунизации 30-суточных СПФ цыплят испытуемыми штаммами метапневмовируса птиц. Активность сывороток определяли в реакции нейтрализации в Р - варианте в клетках Vero против 500 и 1000 ТЦЦ50 вируса. В других опытах реакцию ставили в а - варианте с 4NE сыворотками.

Таблица 7

Результаты реакции нейтрализации сыворотками к вакцинным штаммам

8544 и VC-03 МПВ, полученные от вакцинированных цыплят

Штамм вируса Сыворотка к штаммам:

8544 VC-03

ИН, lg ТЦД50 Показатель достоверно сти результатов К по Мс Bride ИН, lg ТЦЦ50 Показатель достоверно сти результатов К по Мс Bride

8544 1,83 >2 31,56 1,34 >2 23,11

VC-03 1,41 >2 24,3 1,96 >2 21,78

Примечание: ИН - индекс нейтрализации; К - константа нейтрализации.

Результаты изучения различий в скорости течения реакции нейтрализации штаммспецифической сывороткой гомологичного и гетерологичного штаммов МПВ птиц кинетическим методом, приведенные в таблице 7, показали, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 МПВ птиц нейтрализовались в большей степени за время 1=15 мин контакта при 37° С гомологичной антисывороткой по сравнению с гетерологичной. Так, индекс нейтрализации штамма 8544 штаммспецифической сывороткой равнялся 1,83 ^ , а гетерологичной сывороткой - 1,34 1д. Аналогичную картину отмечали в отношении штамма УС-03 МПВ птиц. Штаммы характеризовались как и Ag штаммы вируса соответственно. Значения констант скорости нейтрализации (К) свидетельствовали о достоверности полученных результатов (> 2).

Степень нейтрализации испытуемых штаммов штаммспецифической сыворотки (Ап-маркер) изучали в перекрестной реакции нейтрализации и ИФА. В опытах использовали иммунную сыворотку в постоянной дозе с активностью 41ЧЕ. Полученные данные показали, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 нейтрализовались в больших логарифмах в присутствии гомологичной штаммспецифической сыворотки, чем гетерологичной. Однако штамм 8544 оказался менее чувствительным к специфическим антителам штамма УС-03. Степень антигенного родства между штаммами составила от 88 и 90 % в ИФА и реакции нейтрализации соответственно по АгсЬеи! а. НогеГаИ.

Таким образом, изучаемые вакцинные штаммы 8544 и УС-03 отличались по степени нейтрализации, но в то же время они оказались близкородственными и характеризовались как Ап+ и Ал' соответственно.

2.2.4.5. Изучение иммуногенной активности вакцинных штаммов МПВ птиц

Опыты по изучению иммуногенной активности вакцинных штаммов 8544 и УС-03 МПВ проводили на 10 - суточных цыплятах бройлерах. Вакцинировали птицу однократно в дозе 3,0 }g ТЦД50 в 0,2 см3 инсталляцией на конъюнктиву и слизистую носа.

С целью оценки напряженности иммунитета через 21 сут у цыплят контрольной и подопытной групп брали кровь, а затем проводили их заражение

17

эпизоотическим штаммом МПВ в дозе 3,0 ^ ТЦД,0 интраназально. Результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8

Иммуногенная активность вакцинных штаммов МПВ птиц

Штамм Иммунизир Кратность Кол-во Контрольное заражение

вируса ующая доза, вакцинации цыплят эпизоотическим штаммом МПВ в дозе 3,0 1я ТЦД,П

1ВТОД50 Заболело/заражено %

8544 3,0 однократно 30 0/15 0

УС-03 3,0 однократно 30 0/15 0

Нормальная

культуральная 30 12/15 80

жидкость

(плацебо)

Данные, приведенные в таблице 8, показывают, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 в вакцинальной дозе 3,0 ^ ТЦД50 не вызывали поствакцинальной реакции у цыплят, и при контрольном заражении через 21 сут. эпизоотическим штаммом МПВ в дозе 3,0 ^ ТЦД50 не заболели. Контрольные цыплята заболели с характерными респираторными симптомами МПВИ в 80% случаев. Уровень специфических антител в сыворотке крови у вакцинированных цыплят определяли в ИФА. Результаты представлены в табл. 9.

Данные опытов, приведенные в таблице 9, показывают, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 индуцировали синтез специфических антител в сыворотке крови у вакцинированных цыплят в умеренных титрах с иммунологическим сдвигом в организме цыплят 86,7 и 90,0% соответственно.

Коэффициент иммунологической эффективности у штамма 8544 был 6,7, а у штамма УС-03 он равнялся 10,0, а коэффициент корреляции у вакцинированных цыплят штаммами 8544 и УС-03 равнялся г = 0,6 (табл. 9).

Таблица 9

Титры специфических антител в сыворотке крови у вакцинированных цыплят

Вакцинный штамм вируса Титр антител в ИФА Е г >

Время после вакцинации, сут

21 30

8544 777 ± 58 932 ± 80 6,7 0,6

УС-ОЗ 953 ± 72 1087 ± 65 10,0 0,6

Примечание: Е - коэффициент иммунологической эффективности; т - коэффициент корреляции.

Из этого следует, что обратная связь выражена умеренно, то есть вакцинированная птица устойчива к заражению полевым вирусом по сравнению с невакцинированной птицей.

Заключение

Проблема изучения биологических признаков метапневмовирусов приобретает не только большое теоретическое, но и определенное практическое значение. Так как в исследованиях по изучению аггенуированных вакцинных штаммов необходимо стремиться к получению таких вариантов, которые, помимо снижения или утраты вирулентности для восприимчивых птиц, отличались от фенотипа исходного вируса возможно большим количеством других генетических признаков, коррелирующих с патогенностью. Результаты изученных биологических свойств вакцинных штаммов МПВ птиц используются при производстве и контроле живых и инакгавированных вакцин против этой болезни

Выводы

1. Изученные биологические (генетические) признаки вакцинных штаммов 8544 и VC-03 метапневмовируса птиц являются стабильными и могут быть использованы для контроля при производстве и применении вакцин против метапневмовирусной инфекции птиц, изготовленных из этих штаммов.

2. Вакцинные штаммы метапневмовируса не различаются по патогенности для куриных эмбрионов (Pche), а для цыплят (Pch) патогенность зависит от метода их заражения. Штаммы 8544 и VC-03 характеризуются как Pche±, Pchsc", Pchiv", Pch/, Pchúf МПВ птиц.

З: Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 метапневмовируса птиц способны к репликации в культуре куриных фибробластов и клетках Vero с выраженным цитопатическим эффектом цитолитическош типа с образованием синтиций и характеризуется как TCchM', TCV+ штаммы. Цитопатогенная активность штаммов оказалась весьма стабильной и сохранялась в процессе длительных пассажей. Штамм VC-03 обладал высокой степенью репликации и накапливался в больших титрах по сравнению со штаммом 8544.

4. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 метапневмовируса птиц способны к репликации в клетках Vero при культивировании их при пониженной и повышенной температуре культивирования, индуцируя острую вирусную инфекцию в клетках, и характеризуются как rct+M° и rct+40° штаммы. Различия между штаммами вируса имели штаммовый характер.

5. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ обладают выраженной интерфероногенной активностью при культивировании их в клетках Vero ( IT) и чувствительны к действию экзогенного интерферона (slf*). Установлена прямая зависимость между активностью индуцированного интерферона и множественностью инфицирования продуцента и временем после инокуляции клеток.

6. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 метапневмовируса термолабильны (t56+). чувствительны к инактивирующему действию формальдегида (F*), димерэтиленимину (DEf).

7. Вакцинные штаммы 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц обладают общими антигенными свойствами. Степень их антигенного родства составляет 88 и 90% соответственно в реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе.

Изученные штаммы 8544 и УС-03 характеризуются как А§+, Ап+ и Ag", Ал" штаммы соответственно.

8. Вакцинные штаммы 8544 и УС-03 МПВ птиц индуцируют синтез специфических антител у вакцинированных цыплят в умеренных титрах, вызывая иммунологический сдвиг в организме соответственно 86,7 и 90% цыплят.

Коэффициент иммунологической эффективности и корреляции свидетельствуют о том, что устойчивость у вакцинированных цыплят к полевому заражению выражена умеренно.

4. Практические предложения

1. Паспортизированы производственные вакцинные штаммы 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц.

2. Разработаны и утверждены Россельхозакадемией Методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц».

3. Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе биологических и ветеринарных институтов и на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов.

5. Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки

РФ:

1. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Данко Л.Ю., Бочкарев B.C. Способность метапневмовируса птиц к репродукции в культурах клеток// Ветеринария и кормление. - 2011. - № 1 - С. 14.

2. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Данко Л.Ю., Бочкарев B.C. Антигенная специфичность и степень нейтрализации вакцинных штаммов метапневмовируса птиц// Ветеринарная практика. - СПб, 2011. - № 1(52). - С. 35-37.

3. Трефилов Б.Б., Бочкарев B.C., Лисенкова A.C. Репродукция метапневмовируса птиц при различной температуре// Ветеринарная практика. — СПб, 2012. - № 1(56). - С. 15 -17.

Статьи, опубликованные в сборниках материалов конференций:

4. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Бочкарев B.C. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к метапневмовирусной инфекции птиц// Материалы междунар. науч.-практ. конфер. - СПб, 2011.-С. 53-58.

5. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Бочкарев B.C. Изучение биологических свойств вакцинных штаммов матапневмовируса птиц// Материалы Международного агропромышленного конгресса: Инновации - основа модернизации АПК. - СПб, 2012. - С. 37-38.

Тиражирование и брошюровка выполнена в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14 тел. (812) 233 46 69 Объем 1,0 у.п.л. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Бочкарев, Владимир Сергеевич, Санкт-Петербург

Министерство сельского хозяйства РФ Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии)

04201356210 На правах рукописи

БОЧКАРЕВ ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Трефилов Б.Б.

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...................................................................................................................6

1. Обзор литературы

1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц..........................................................10

1.1.1. Распространение и ущерб, причиняемый болезнью................................10

1.1.2 Биологические свойства метапневмовируса птиц.....................................12

1.1.2.1. Морфологическая структура метапневмовируса птиц........................12

1.1.2.2. Физико-химические свойства метапневмовируса птиц......................17

1.1.2.3. Патогенность метапневмовируса птиц.....................................20

1.1..2.4. Способность метапневмовируса к репликации в культурах клеток22 1.1.2.5.Антигенная специфичность метапневмовируса птиц....................24

1.1.3. Эпизоотологические особенности болезни................................... 27

1.1.4. Симптомы болезни и патологоанатомические изменения..................30

1.1.5. Диагностика болезни...............................................................32

1.1.6. Профилактика метапневмовирусной инфекции птиц.......................38

1.1.7. Заключение...........................................................................40

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы................................................................42

2.1.1. Материалы исследований.........................................................42

2.1.2. Методы исследований.............................................................44

2.2. Результаты собственных исследований.........................................53

2.2.1. Патогенные свойства вакцинных штаммов метапневмовируса..........53

2.2.1.1. Изучение патогенности для куриных эмбрионов (РсЬе-признак)...53

2.2.1.2. Изучение патогенности для цыплят (РсЬ-признак).....................55

2.2.2. Биологические признаки метапневмовируса, связанные с особенностями внутриклеточной репликации...............................57

2.2.2.1.Изучение цитопатогенной активности вакцинных штаммов

метапневмовируса..............................................................58

2.2.2.2. Изучение способности вакцинных штаммов 8544 и VC-03 к репродукции в клетках Vero при различной температуре

(Яс1тс-признак).........................................................................................62

2.2.2.3. Изучение способности вакцинных штаммов к индукции

интерферона и их чувствительности к интерферону.....................65

2.2.3. Признаки вакцинных штаммов метапневмовируса, обусловленные

свойствами поверхностной структуры вируса...............................67

2.2.3.1. Изучение чувствительности метапневмовируса птиц к некоторым

физическим и химическим факторам......................................68

2.2.3.1.1. Изучение терморезистентности (t56- признак)........................68

2.2.3.1.2. Чувствительность метапневмовируса птиц к действию формальдегида ( F- признак)..............................................71

2.2.3.1.3. Чувствительность вируса к действию димерэтиленимина.........73

2.2.3.1.4. Изучение антигенных свойств вакцинных штаммов метапневмовируса птиц......................................................75

2.2.3.1.5. Изучение антигенной специфичности вируса (Ag-признак) и степени нейтрализации специфической антисывороткой (Ап-признак)....................................................................78

2.2.3.1.6. Изучение иммуногенной активности вакцинных штаммов метапневмовируса птиц......................................................82

3. Обсуждение результатов исследований............................................87

Выводы.......................................................................................95

Практические предложения.............................................................96

Список литературы........................................................................97

Приложение.............................................................................. 118

Список сокращений

ИП иммунопероксидазное окрашивание

ИФ иммунофлуоресценция

ИФА иммуноферментный анализ

КЭ куриные эмбрионы

МПВ метапневмовирус

МПВИ метапневмовирусная инфекция

ПЦР полимеразная цепная реакция

РН реакция нейтрализации

СПФ свободные от патогенной флоры

СОГ синдром опухшей головы

ТОК тканевая органная культура

■у

ТЦД50/СМ 50% тканевая цитопатогенная доза

ТЦД цитопатогенное действие

ФЭК фибробласты эмбрионов кур

ART avian rhinotracheitis (ринотрахеит птиц)

APV Avian pneumovirus (пневмовирус птиц)

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

(твердофазный иммуноферментный анализ)

lg логарифм по основанию 10

Mab моноклональные антитела

SHS swollen head syndrome (синдром опухшей

головы)

TRT turkey rhinotracheitis (ринотрахеит индеек)

Vero перевиваемая линия клеток почки зеленой

мартышки

Pche патогенность для куриных эмбрионов

Pch патогенность для цыплят

t терморезистентность

ТС тканевая культура

Ret репликация при различной температуре

Ag антигенная специфичность

An степень нейтрализации специфической

антисывороткой

IA иммуногенная активность

If интерфероногенная активность

slf чувствительность к интерферону

Введение

Актуальность темы. Интенсификация птицеводства способствует возникновению и распространению инфекционных болезней. Плотный график вакцинаций, большая концентрация птицепоголовья, персистенция возбудителей вирусных и бактериальных болезней и другие факторы, подавляющие иммунную систему птиц, завоз новых кроссов ведут к появлению новых болезней, изменению вирулентности возбудителей инфекционных болезней, а также к проявлению уже изученных болезней вирусной и бактериальной этиологии (Б.Ф. Бессарабов, 2001; Оо^И, 2004).

К числу малоизученных вирусных болезней, появившихся во второй половине 20 века в РФ, необходимо отнести метапневмовирусную инфекцию птиц (М.А. Волкова с соавт, 2005; Во^Ькоу е1 а1., 2002).

Для профилактики этой болезни в птицехозяйствах применяют аттенуированные вакцины МоЫНб ЯТУ 8544 и №тоуас УС03 метапневмовируса птиц.

Метапневмовирусы, как и другие биологические объекты, обладают свойствами, передаваемыми по наследству. Наряду со свойствами общими для всех вирусов, имеются признаки, которые могут быть выражены в разной степени у вариантов одного и того же вируса. Эти свойства, играющие основную роль в дифференциации штаммов (вирусов), носят название генетических признаков.

Так как генетические признаки являются отражением особенностей вирусного генома, изменение их может служить показателем, эффективности различных экспериментальных воздействий на генетический материал вируса, включая химический и физический мутагенез.

Установлено, что вирулентные и аттенуированные штаммы вируса могут различаться по ряду генетических признаков, тщательное их изучение приобрело особое значение для отбора природно-ослабленных и искусственно полученных вакцинных вариантов.

Усовершенствование имеющихся методов контроля и научно-практическая разработка новых методов контроля вакцинных штаммов метапневмовируса птиц в процессе изготовления и применения вакцин против этой болезни, как и других биопрепаратов, должно складываться из следующих основных направлений:

а) применение современных методов оценки производственных штаммов, характеризующих их иммунобиологические особенности - детальная проверка генетических признаков, их вариабельности в организме и в культурах клеток;

б) применение высокочувствительных и стабильных клеточных культур, не содержащих контаминирующих агентов для контролей производственных штаммов и вакцин;

в) использование иммунных типоспецифических сывороток (не гипериммунных и не гамма-глобулинов) для типирования производственных штаммов и эталонов, для контроля иммуногенной и антигенной активности производственных серий вакцин.

При этом изучение и разработка критериев и методов контроля аттенуированных штаммов метапневмовируса птиц являются актуальными при производстве вакцин.

Цели и задачи исследования. Целью исследований было изучить иммунобилогические свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц и их стабильность в процессе исследований.

В соответствии с поставленной целью были выдвинуты следующие задачи:

- изучить патогенные свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц;

- изучить признаки вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, связанные с особенностями их внутриклеточной репродукции и выявляемые in vitro;

- изучить признаки вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, обусловленные свойствами поверхностной структуры;

- составить паспорт на вакцинные штаммы метапневмовируса птиц.

Научная новизна. Впервые изучены генетические признаки вакцинных штаммов 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц, показано их различие и доказана необходимость использования их для контроля при производстве вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц.

Показана возможность культивирования и динамика накопления вакцинных штаммов в различных биологических системах. Установлено различие в антигенной специфичности штаммов вируса.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследований послужили основанием для составления паспорта на вакцинные штаммы 8544 и УС-03 метапневмовируса птиц.

Разработаны и утверждены Россельхозакадемией методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

результаты изучения патогенных свойств вакцинных штаммов метапневмовируса птиц;

генетические признаки вакцинных штаммов, связанные с их внутриклеточной репродукцией;

- генетические признаки вакцинных штаммов, обусловленные свойствами их поверхностной структуры.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии

(2010-2012), на Международном агропромышленном конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и зоотехнии» (Санкт-Петербург, 2012); Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства: материалы Межрегиональной научно-практической конференции (Самара, 2011).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 141 странице компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает 200 источников, из которых 167 зарубежных.

1. Обзор литературы 1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц 1.1.1. Распространение и ущерб, причиняемый болезнью

Метапневмовирусная инфекция (МГГОИ) птиц - респираторная болезнь, характеризующаяся воспалительными процессами верхних дыхательных путей (носовых ходов, трахеи), инфраорбитальных синусов, сопровождается затрудненным дыханием, хрипами, чиханием, выделениями из носа (Jones, 1996). Болезнь у разных видов птиц проявляется в виде двух респираторных синдромов: у индеек - ринотрахеит (turkey rhinotracheitis - TRT); у цыплят и кур - синдром опухшей (большой) головы (swollen head syndrome - SHS) (Cook, Cavanagh, 2002).

Ринотрахеит индеек впервые был отмечен в конце 1970-х гг. в Южной Африке (Buys & Du Preez, 1980) и впоследствии также и у кур (Buys et al., 1989 a, b). Несколько лет спустя о болезни с похожими клиническими признаками сообщили во Франции (Giraud et al., 1986; Picault et al., 1986; 1987 a, b), a затем в Великобритании, где был выделен возбудитель (McDougall & Cook, 1986; Wilding et al., 1986; Wyeth et al., 1986; 1987) и охарактеризован как пневмовирус (Cavanagh & Barrett, 1988).

Болезнь регистрируется во многих европейских странах с развитым птицеводством (Jirjis et al., 2002): в Италии, Испании, Израиле, Венгрии (Lister, Alexander, 1986); в Германии (Hafez, Lohren, 1990; Hafez et al., 1990; Naylor, Jones, 1993); в Нидерландах (Cook et al., 1993), в Японии (Tanaka et al., 1995, 1996), на Американском континенте (Jones, 1996; Alexander, 1997; Senne et al., 1997; Cook et al., 1999; 2000; Seal, 2000); в Азии (Lu et al., 1994a).

Первичная вирусная инфекция часто осложняется болезнями бактериальной природы, ведущими в результате к высокой заболеваемости и смертности. Смертность обычно не превышает 1-2%, а заболеваемость 10%. У индеек-несушек или производителей вирус может вызывать существенное падение яичной продуктивности (Naylor & Jones, 1993; Jones, 1996; Cook et al., 2000; Cook, Cavanagh, 2002).

Morley & Thompson (1984); Droual & Woolcock (1994) сообщили о ассоциированном течении SHS с инфекционным бронхитом кур и ньюкаслской болезнью.

В Израиле в 1978 г. клиническое заболевание, сходное с пневмовирусной инфекцией, ассоциированной с МПВ птиц, регистрировали как в переболевших, так и вакцинированных стадах. Обсуждаются вопросы возможности циркуляции различных подтипов возбудителя (Bäyon-Auboyer et al. 1999; Banet-Noach et al., 2003, 2005)

В 1985 г. в Англии (Уэллсе) наблюдали острое течение болезни у индеек с поражением верхних дыхательных путей, причиной, которой оказался пневмовирус (Anon, 1985; Stuart et al., 1989; Nay lor, Jones, 1993). В это же время была зарегистрирована болезнь у бройлеров с синдромом опухшей головы. Во всех случаях был изолирован пневмотропный парамиксовирус (Pedersen et al., 2000).

В 1990-1992 гг. болезнь была обнаружена в родительских стадах и у товарных кур-несушек в ряде стран Азиатско-Тихоокеанского региона (Bell, Alexander, 1990; Hafer et al., 2000). В США в 1996 г. сообщалось о заболевании TRT у индеек в штате Миннесота (Jirjis et al., 2000), а в 1997 г. -в штате Колорадо (Collins, Gough, 1988). Колорадский изолят МПВ антигенно (Senne et al., 1998) и генетически (Seal, 1998, 2000; Seal et al., 2000) отличается от европейских изолятов, которые вызывают SHS у кур и TRT у индеек. Заболеваемость у индеек в коммерческих стадах ежегодно колеблется от 36,3 до 54,8%, а потери составляют около 15 млн. долларов в год (Goyal et al., 1999; Shin et al., 2000; Gulati et al., 2001 a, b). В 2004 году серьезные вспышки болезни были зарегистрированы в штатах Висконсин, Айова, Северная Дакота и Огайо (Bennett et al., 2004).

В России МПВИ птиц регистрировали на протяжении последних десятилетий в различных регионах, чаще всего болезнь встречается в бройлерных хозяйствах, преимущественно у кур родительских стад. Отмечается тенденция к увеличению случаев обнаружения антител к

метапневмовирусу у птиц яичных пород (А.Б. Сарбасов с соавт., 2003; В.Н. Ирза с соавт., 2003; В.Н. Ирза с соавт., 2005; A.C. Пронин с соавт.,2006; И.А.Борисова, С.К. Старов, 2006; Б.Б. Трефилов с соавт., 2007).

Из сказанного следует, что МПВИ птиц была и остается актуальной в большинстве стран мира, в том числе и в Российской Федерации.

1.1. 2. Биологические свойства метапневмовируса 1.1. 2.1. Морфологическая структура метапневмовируса птиц

Морфологическая структура вирусов, метапневмовируса в частности, является одной из наиболее стабильных генетических признаков и в связи с этим служит одним из основополагающих критериев в современной их классификации.

Пневмовирусы птиц являются РНК-содержащими. С несегментированным одноцепочечным негативным геномом, относящимися к семейству Paramyxoviridae подсемейству Pneumovirinae роду Metapneumovirus (Pringle, 1998; Lamb et al., 2000). Геном РНК состоит из восьми генов с их продуктами организованными в следующем порядке: З'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5с общей длиной от 13134 (AMPV подтип С) до 13378 (HMPV) нуклеотидов (Ishiguro et al., 2004; Lwamba et al., 2005).

Вирус имеет комплексную структуру и покрыт липопротеидной оболочкой, образующейся при выходе вириона. Главным образом образует сферические частицы, симметричные по спиральному типу, которые имеют размеры 80-200 нм. Также могут встречаться плеоморфные вирионы в диаметре 150-200 нм и длиной 1000-10000 нм. Спиральный нуклеотид имеет длину 14 нм (рис.1).

Оболочка напоминает бахрому с поверхностными выступами длиной 1315 нм, представляющие собой шипы шириной 2-3 нм у основания, максимальная 3-5 нм, расстояние между шипами 2-3 нм; включающие гемагглютинин и нейраминидазу (HN) или гемагглютинин (Н), или поверхностный гликопротеин (G) и слияния (F-гликопротеин), равномерно ее

Рис.1. Пневмовирус птиц (R.C. Jones, 1996)

покрывающие. Отсутствует гемагглютинирующая активность по отношению к эритроцитам цыплят, уток, свиней, крупного рогатого скота и морских CBHHOK(Giraud et al., 1986; Baxter-Jones et al., 1987; Collins a.Gough, 1988; Buys et al., 1989; O'Loan et al., 1992).

Молекулярная масса генома составляет 0,5% от веса вириона и варьирует у рода Pneumovirus в пределах 17-20 кЬ. Геном обычно мономерный или иногда мультиплоидный, несегментирован и содержит единичную линейную молекулу одноцепочечной РНК, отрицательной полярности, внутренняя последовательность GAA следует за трансляцией стартового сигнала в начале следующего гена. Вирионы могут также содержать положительную полярную одноцепочечную копию генома. Полная последовательность РНК генома составляет 15200-15900 нуклеотидов.

Пневмовирусы птиц не содержат неструктурных NS генов, что укорачивает его геном на 13,3 кЬ, а его восемь генов идут в порядке З'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5' - характерные признаки метапневмовируса птиц и человека (Ling, East