Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц"

На правах рукописи

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 2 МАЙ 2011

Санкт-Петербург-2011

4846228

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения Всероссийский научно - исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор ветеринарных наук Трефилов Борис Борисович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор ветеринарных наук, профессор Придыбайло Николай Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор Ярыгина Елена Игоревна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится «11» мая 2011 года в И часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5. I I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «11» апреля 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Белова Лариса Михайловна

Введение

Актуальность таны. Металневмовирусная инфекция широко распространена в стадах коммерческой птицы (куры-несушки, бройлеры и индейки) в птицеводческих хозяйствах разных стран мира (S.B. Buys & J.H. Du Preez, 1980; S.B. Buys et al., 1989; J.S. Mc Dongall & Cook, 1986; G.P. Wilding et al., 1986; A.N. Alkhalaf, 2002; R.C. Jones, 2004).

Первичная вирусная инфекция часто осложняется болезнями бактериальной и вирусной природы, ведущими в результате к высокой заболеваемости и смертности (И.А.Борисова, А.В.Борисов, 2009; J.K.A. Cook, 2000).

Случаи возникновения метапневмовирусной инфекции птиц отмечены в птицехозяйствах Российской Федерации (В.Н.Ирза с соавт., 2003,2005; З.Б.Хлебовец с соавт., 2005; Д.В.Дмитрисв, 2007; Б.Б.Трефилов с соавт., 2010). У невакцинированных кур-несушек и бройлеров регистрировали специфические антитела к метапневмовирусу.

Исходя из обширных различий в антигенной структуре и аминокислотной последовательности гена, существующие штаммы метапневмовируса классифицированы на четыре подтипа A,B,C,D (И.А.Борисова, 2008; J.K.A. Cook, D. Cavanagh, 2002; M.I. Sabara, J.E. Laren со, 2002).

Проблема антигенной структуры метапневмовируса помимо большого теоретического значения представляет в настоящее время существенный практический интерес в период массовой вакцинации против этой болезни, а также при изучении репликации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса в организме и культурах клеток и их распространения среди птицы.

Чувствительность клеточных культур к метапневмовирусу птиц установлена многими исследованиями (И.А. Борисова, 2008; А.С.Пронин с соавт., 2006; В. Panigrahy et al., 2000; F.E. Jirjis et al., 2000, J.K.A. Cook et al., 2001). Однако какая бы система не была использована для обнаружения вируса, его идентификация может быть подтверждена при помощи различных серологических методов исследований.

Изучение антигенной специфичности и степени нейтрализации штаммспецифической антисывороткой метапневмовируса птиц в литературе не сообщалось.

Вместе с тем, по результатам исследований сотрудниками ГНУ ВНИИЗЖ (А.С.Пронин с соавт., 2006) установлена циркуляция метапневмовируса птиц на территории РФ подтипов А и В.

В связи с вышеизложенным изучение репродукции метапневмовируса (МПВ) птиц в гомологичных и гетерологичных культурах клеток и определение антигенных штаммовых различий вируса являются актуальными.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение культуральных

и антигенных свойств мстапневмовируса птиц.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

- выделить метапневмовирус птиц и провести его идентификацию;

- изучить культуральные свойства метапневмовируса птиц;

- изучить антигенные свойства метапневмовируса птиц;

- разработать методические положения по диагностике метапневмовирусной инфекции птиц.

Научная новизна. Установлена возможность использования культуры клеток куриных эмбрионов и клеток Vero для выделения из патологического материала метапневмовируса птиц. Показана возможность культивирования МПВ птиц в различных клеточных культурах и установлена их отличие в чувствительности к вакцинным и эпизоотическим штаммам возбудителя болезни. Выявлена высокая репликационная способность вакцинных штаммов МПВ птиц в клетках Vero.

Впервые изучены антигенная специфичность и степень нейтрализации гомологической и гетерологической штаммспецифической сывороткой вакцинных штаммов МПВ птиц в реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе и установлено их отличие по Ag и Ап признакам. Определена степень антигенного родства вакцинных и эпизоотических штаммов МПВ птиц.

Практическая значимость работы. Установлена перспективность использования клеток Vero для наработки вирусного материала при изготовлении средств диагностики и специфической профилактики метапневмовирусной инфекции птиц.

Разработаны и утверждены Россельхозакадемией Методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц». Основные положения . выносимые на защиту:

- результаты по выделению изолятов вируса и их идентификации;

- культивирование метапневмовируса птиц в первично-трипсинизированных культурах клеток;

- культивирование метапневмовируса птиц в клетках Vero;

- результаты изучения антигенности вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, их антигенной специфичности и степени нейтрализации со штаммспецифическими сыворотками.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИГ1 Россельхозакадемии (2007-2010гт.), на Международном

агропромышленном конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и зоотехнии» (Санкт-Петербург, 2009г.); Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства: материалы Межрегиональной научно-практической конференции (Самара, 2010).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н. В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре научные статьи. Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 170 источников, из которых 153 зарубежных.

2.Собственные исследования 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2007-2010 гг. в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения Всероссийский научно - исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии) в соответствии с научно-технической программой НИР 08.07.05.

При выполнении работы использовали следующие материалы: Вирус: вакцинный штамм В544 подтипа А метапневмовируса птиц (G.P. Wilding, 1986), Nobilis (Голландия); вакцинный штамм VC-03 подтипа В метапневмовируса птиц (Y.P. Picault, 1987), Nemovac Rhone Merieux (Франция); E-07 эпизоотический штамм метапневмовируса птиц, выделенный в ГНУ ВНИВИП; Н-08 эпизоотический штамм метапневмовируса птиц, выделенный в ГНУ ВНИВИП. Вирусные штаммы поддерживали в перевиваемой линии клеток Vero и хранили при температуре минус 20°С.

Диагностикумы: набор для обнаружения антител к возбудителю метапневмовирусной инфекции птиц BioCek, производства фирмы "Avian Rhinotracheitis Antibody Test Kit" (Holland); набор для обнаружения антител к вирусу метапневмовирусной инфекции птиц в

сыворотках крови кур методом иммуноферментного анализа, производства ГНУ

внивип.

Куриные эмбрионы и цыплята: яйца СПФ кур, фирмы "Lohmann Tierzucht" (Германия), 300 шт.; эмбрионы СПФ кур, фирмы "Lohmann Tierzucht", 100 шт.; цыплята, инкубированные из яиц СПФ кур фирмы "Lohmann Tierzucht" в ГНУ ВНИВИП, 50 голов.

Культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры фибробластов СПФ эмбрионов кур (ФЭК), эмбрионов уток (ФЭУ), эмбрионов гусей (ФЭГ); перевиваемая культура клеток почки зеленой африканской мартышки, клетки Vero (НИИ гриппа АМН, Санкт-Петербург); трахеальная органная культура (ТОК) куриных эмбрионов. Первично-трипсинизированные культуры клеток готовили из кожно-мышечной ткани 10-12 -суточных СПФ куриных, 14-15-суточных утиных и гусиных эмбрионов по методике Dulbecco R.&Vogt М. (1954) в модификации Younger J.S. (1954).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: питательная среда Игла MEM и ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда №199, жидкая, с L-глутамином; питательная среда ДМЕМ/Т12 с Hepes, жидкая; сыворотка крови крупного рогатого скота, неконсервированная для культур клеток; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор, 0,25% фирмы «US BIO»; версена раствор, 0,02%; Хенкса раствор фирмы "Hyclone". Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы "Hyclone", производства ООО «Биолот».

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатическому действию (ЦПД)

проводили в чувствительной клеточной культуре (ФЭК, клетки Vero) методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench Н. (Н.И. Троценко с соавт., 2000) и выражали в lg ТЦД50 в 1,0 см3 (тканевая цитопатогенная доза).

Результаты титрования вируса подвергли статистической обработке методами, изложенными в соответствующих руководствах (Терентьев П.В., Ростова Н.С., 1977).

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии (Н.И. Троценко с соавт., 2000).

Титр вируса и конечную точку нейтрализации вычисляли по Reed L.J. & Muench Н. на основании ЦПД в культуре клеток через 5-6 суток инкубации после инокуляции культуры. Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

За титр антител принимали то наибольшее разведение сыворотки, которое было способно ингибировать активность вируса, внесенного в указанной дозе, в 50% зараженной культуры.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). При определении титра (активности) штаммспецифичсских сывороток и изучении антигенных свойств испытуемых штаммов вируса, а также принадлежности выделенных изолятов вируса, наряду с реакцией нейтрализации, использовали непрямой метод ИФА, разработанный в ГНУ ВНИВИП на подтип А и В метапневмовируса птиц. ИФА ставили согласно инструкции по применению набора и методическим указаниям «Лабораторная диагностика метапневмовирусной инфекции птиц методом иммуноферментного анализа», утвержденньм Росссльхозакадемией 2009г.

Получение штаммспецифической сыворотки. Гипериммунные сыворотки к изучаемым штаммам метапневмовируса получали на 20-суточных СПФ цыплятах в камеральных условиях (настольных боксах). Вируссодержащий материал (культурная жидкость) в дозе Ю5 ТЦД50 в см" вводили подкожно в область нижней третьи шеи двукратно с интервалом 10 сут. После 20-суточного перерыва вирусный антиген, адсорбированный на 0,3% гидроокиси алюминия, инокулировали в объеме 1 см3 подкожно. На 28-30 сут. у цыплят из сердца брали кровь для получения сыворотки, их освобождали от термолабильных неспецифичсских ингибиторов и хранили во флаконах по 10 см3 при температуре минус

Антигенную специфичность (Ag-признак) и степень нейтрализации штаммеиецифичной антисыворотки (An-признак) вируса изучали по методу McBride W.D. (1959) в модификации Gard S. (1960). Антигенный характер каждого штамма вируса является специфичным и высокостабильным свойством и не зависит от той чувствительности системы, в которой репродуцируется вирус. Для характеристики Ag-признака по методу McBride применили величину К, которая вычисляется по формуле:

/) - рабочее разведение сыворотки; У0 - исходная активность вируса; VI - активность вируса ко времени;

При сравнении А§-признака штаммов использовали так называемую нормальную величину К (КК). При этом абсолютную величину стандартного штамма, нейтрализованного гомологичной сывороткой, принимали за 100%, а величину Ж других изучаемых штаммов выражали в процентах по отношению к величине К стандартного

15-20°С.

штамма. Степень антигенного родства определяли по формуле АгсЬеШ }., ПоглГаП Р.Ь. (3. Лярски, 1980).

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Выделение метапневмовируса птиц и его идентификация. Для выделения вируса готовили суспензию из выделений носоглотки, слизистой трахеи, синусов головы (тампонов) в растворе Хенкса или физиологическом растворе, содержащем антибиотики в 1 см3: бензилпенициллина 1000 ЕД, 10 мг стрептомицина сульфата, 25 мкг амфотерицина В и выдерживали при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Контроль на стерильность суспензии проводили высевами на МПБ, МПА, среду Китт-Тароцци и агар Сабуро, наблюдение в течение 10 суток. Надосадочную жидкость использовали для инокуляции чувствительной биологической модели.

2.2.1.1. Выделение метапневмовируса птиц на развивающихся куриных эмбрионах.

Для выделения МПВ птиц использовали развивающиеся СПФ куриные эмбрионы 6-7-суточного возраста. Перед заражением эмбрионы овоскопировали и отбирали подвижные с хорошо развитой сосудистой системой. Инфицирование проводили в желточный мешок суспензией патологического материала в объеме 0,1-0,2 см3. Для каждого материала использовали не менее 10 эмбрионов, контролем служили незараженные эмбрионы. Эмбрионы инкубировали в течение 6-7 суток при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности 55-60% при ежедневном овоскопировании. Погибших в течение 48 часов выбраковывали, а павших в последующие сутки наблюдения и оставшихся живыми после 6-7 суток инкубации охлаждали при 4-6°С- и вскрывали. От каждого эмбриона стерильно отбирали экстраэмбриональную жидкость и оболочки желточного мешка. Контроль на стерильность проводили высевами на МПА, МПБ и агар Сабуро. Возможное присутствие вируса устанавливали по наличию следующих изменений в эмбрионе: гибель и гиперемия наружного покрова зародыша в различной степени, замедление развития зародыша, инъекция сосудов и гиперемия желточного мешка. Проводили 2-3 пассажа на куриных эмбрионах. При этом накопление и титры вируса были низкими, поэтому дальнейшую адаптацию вируса проводили на культурах клеток.

2.2.1.2. Выделение вируса на клеточных культурах. Для первичного выделения и последующей адаптации изолята MIIB птиц использовали первично-трипсинизированную культуру клеток, полученную из 10-12-суточных СПФ куриных эмбрионов и перевиваемые клетки Vero.

Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани куриных эмбрионов путем диспергирования в 0,25% растворе трипсина. Культуру выращивали в стационарных условиях в течение 2-3 суток до формирования ровного плотного монослоя в питательной ростовой среде Игла MEM и среде № 199 в соотношении 2:1 с содержанием до 10% сыворотки крови КРС и антибиотиков.

Перед заражением пробирочные культуры клеток освобождали от ростовой срсды, отмывали поддерживающей средой без сыворотки крови, вносили суспензию из патологического материала (или хориоаллантоисную жидкость зараженных куриных эмбрионов) в объеме 0,2 см3 и оставляли культуру при (37,5±0,5)°С в течение 60 минут для адсорбции вируса. Затем в пробирки с инфицированной культурой вносили 1,0 см3 поддерживающей среды. Зараженные культуры инкубировали в течение 7-9 суток при температуре (37,5±0,5)°С до появления выраженного цитопатогенного действия вируса. Изолят вируса вызывал острую форму вирусной инфекции с характерным цитопатогенным действием: округление клеток и появление в них зернистости на отдельных участках монослоя клеток на 2-3 сутки после инфицирования культуры; дезинтеграция клеток значительной части монослоя и появление разрывов в нем; полная дегенерация монослоя и образование синцитиальных комплексов.

В результате 4-5 последовательных пассажей из патологического материала (носовые выделения, соскобы слизистой оболочки носоглотки, синусов головы и трахеи) на клетках Vero или на развивающихся куриных эмбрионах, с последующей адаптацией на клетках Vero, выделены два изолята вируса Е-07 и Н-08, вызывающие цитопатический эффект в культурах клеток.

2.2.1.З.. Идентификацию изолятов вируса Е-07 и Н-08 проводили в прямой реакции нейтрализации со специфической сывороткой к эталонному вакцинному штамму 8544, а также методом ИФА путем выявления антител в сыворотках крови иммунизированных цыплят этими изолятами (табл. 1).

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что индексы нейтрализации изолятов вируса со штаммспецифичсскими сыворотками к вакцинным штаммам 8544 и VC-03 метапневмовируса птиц положительные, что свидетельствует о принадлежности изолятов к МПВ птиц. По величинам титров антител в ИФА и индексов нейтрализации можно судить, что выделенные изоляты вируса относятся к подтипу А.

Результаты реакции нейтрализации и иммуноферментного анализа

Изоляты вируса Индекс нейтрализации к вакцинным штаммам, 1^ТЦД;о, Мип* Титры антител в ИФА к, вакцинным штаммам, М±т** \

8544 УС-03 8544 УС-03

Е-07 2,1 ±0,11* 1,75 ±0,3 703 ±15** 501 ± 12

Н-08 2,5 ± 0,2 1,9 ±0,21 652 ± 12 590 ± 14

Для подтверждения полученных результатов по идентификации изолятов вируса были проведены серологические исследования на наличие специфических антител к МПВ в сыворотке крови разновозрастной птицы птицехозяйств № 1 и № 2 методом ИФА (табл. 2).

Таблица 2

Титры специфических антител к МПВ в сыворотке крови птиц разного возраста (п = 23)

Птице-хозяйство Изоляты вируса Титры антител в ИФА, М±т*

Возраст птицы, сут.

1 150 250 360 446

№ 1 Е-07 2643±413* н.и. 9918±1010 9913±830 н.и.

№2 Н-08 н.и. 5699 ±822 6959 ± 642 9365 ±948 11259 ±948

Примечание: н.и. - не исследовали; * - титры в обратных величинах.

При серологическом исследовании выявлены нарастающие титры антител к метапневмовирусу в зависимости от возраста птицы, что свидетельствует о персистенцин возбудителя в организме птицы.

2.2.2. Изучение культуральных свойств метапневмовируса птиц

2.2.2.1. Культивирование вируса в иервичпо-трнисиннзированных клеточных культурах. Опыты по изучению способности метапневмовируса птиц к репродукции в клеточных культурах проводили в первично-трипсинизированных культурах фибробластов 10-11 - суточных куриных, 14-15 - суточных утиных и гусиных эмбрионов. В качестве питательной ростовой среды применяли среду Игла MEM и среду № 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков ( бензилпенициллина 100 ЕД/см3 и сульфата стрептомицина 100 мкг/см3). Взвесь клеток вносили в ростовую среду из расчета 700-750 тыс. кл/см3. Культивирование проводили в пробирках по 1,0 см3 под углом 5° и / или во флаконах PS «Orange Scientibic» в стационарных условиях при температуре (37,5 ± 0,5)° С. Обычно через 24-48 ч инкубирования сформировался сплошной ровный монослой клеток. Специфичность цитопатического эффекта подтверждали реакцией нейтрализации с гомологичными штаммспецифическими сыворотками. При микроскопическом изучении культур клеток, инокулированных вакцинными и эпизоотическими штаммами МПВ, отмечали характерные цитопатические изменения, которые выражались в дегенерации клеток через различные сроки после инфицирования. Так, репликация вакцинных штаммов 8544 и VC-03 в культуре клеток куриных эмбрионов сопровождалась цитопатическим эффектом с первого пассажа и этот феномен обнаруживался через 48-72 часа после инокуляции клеток. В культурах клеток утиных и гусиных эмбрионов вакцинные штаммы адаптировались со 2-3-го пассажа. Штаммы 8544 и VC-03 вируса вызывали развитие острой формы вирусной инфекции в первичных культурах различным латентным периодом в зависимости от вида культуры.

Характер ЦПД выражался в округлении клеток с зернистостью в цитоплазме на ограниченных участках монослоя через 48-72 часа. На 4-5 сутки инкубации зернистость наступала по всему монослою. Полную дегенерацию и гибель клеток куриных эмбрионов отмечали на 6-7 сутки и 8-9 сутки клеток утиных и гусиных эмбрионов после инфицирования с образованием разной величины синцитиальных формаций. Эпизоотические штаммы Е-07 и Н-08 МПВ адаптировались к условиям культивирования в культуре фибробластов куриных эмбрионов с 3-5 пассажа, вызывая цитопатический эффект в виде округления клеток с зернистостью в цитоплазме и формирования небольших синцитий (табл. 3).

Инфекционные титры штаммов МПВ пятого пассажа в первично-триисинюированных клеточных культурах (Р < 0,05)

Таблица 3

Наименование культур клеток Титры вируса, ^ ТЦД50/СМ3, М±т *

Штаммы вируса:

8544 УС-03 Е-07 Н-08

ФЭК 5,25 ± 0,2* 5,75 ±0,1 2,75 ±0,2 2,25 ± ОД

ФЭУ 2,75 ±0,1 2,75 ± 0,25 н.и. н.и.

ФЭГ 2,5 ± 0,2 2,66 ±0,1 н.и. н.и.

Примечание: н.и. - не исследовали.

Данные, приведенные в таблице 3, показывали, что в первично-трипсинизированной культуре фибробластов куриных эмбрионов вакцинные штаммы 8544 и УС-03 накапливались в высоких титрах, а способность к репликации эпизоотических штаммов Е-07 и Н-08 в ней была в два раза ниже, что свидетельствует о слабой адаптации штаммов. В культурах фибробластов утиных и гусиных эмбрионах вакцинные штаммы репродуцировали в низких титрах.

В процессе изучения культуральных свойств МПВ птиц вакцинные штаммы 8544 и УС-03 прошли десять пассажей. Результаты представлены в табл.4.

Данные, приведенные в таблице 4, показали, что в культуре ФЭК вакцинные штаммы 8544 и УС-03 накапливались в высоких титрах (5,33± 0,15 и 5,66 ± 0,2 ^ ТЦД5о/см3 соответственно) и в низких титрах в культурах ФЭУ и ФЭГ (3,4 ± 0,2 и 3,6 ± 0,2 ^ ТЦЦ50/см3).

В результате проведенных исследований установлено, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 МПВ птиц имели большую степень репликации в культуре клеток куриных эмбрионов.

Инфекционные титры вакцинных штаммов МПВ птиц в первично-трипсинизированных

культурах клеток (п = 5)

Наименование Штамм вируса Титр вируса, lgTlUko/cM3, Мш*

культур Число пассажей

клеток 1 3 5 10

ФЭК 8544 VC-03 5,2 ±0,1 5,75 ±0,2 5,33 ±0,15* 5,66 ± 0,2 5,25 ±0,2 5,75 ±0,1 5,15 ±0,3 5,5 ±0,2

ФЭУ 8544 VC-03 1,75 ±0,2 2,5 ± 0,1 2,5 ±0,15 3,2 ±0,2 2,75 ± 0,3 3,1 ±0,3 3.5 ± 0,2 3.6 ± 0,2

ФЭГ 8544 VC-03 1,66 ±0,2 2,75 ±0,1 2,1 ±0,25 2,75 ±0,1 3,0 ± 0,2 3,7 ±0,1 3.4 ± 0,2 3.5 ±0,3

2.2.2.2. Культивирование вируса в перевиваемых клетках Vero. Клетки Vero поддерживали путем пересева с интервалом 5-6 сут безцентрифужным методом. Для снятия монослоя клеток со стекла использовали растворы трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:9. Монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса, затем в матрас вносили смесь растворов трипсина и версена, подогретую до 37° С и инкубировали в термостате в течение 5-10 мин до начала отделения клеток от стекла. Раствор версена с трипсином сливали, а клетки ресуспензировали в определенном объеме питательной среды. Клетки подсчитывали в камере Горяева, затем разводили питательной ростовой средой (ДМЕМ/ F12 с Hepes + 5-10% фетальной сыворотки и антибиотики) до необходимой концентрации ( 1,5- 105 - 2,5 • 105 клеток/ см3 ). Клетки культивировали в стационарных условиях при температуре ( 37,5 ± 0,5)° С в пробирках по 1,0 см3 и одноразовых матрасах. В течение 48 ч формировался плотный клеточный монослой, пригодный для инокуляции вирусом. Из сосудов сливали ростовую среду, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и вносили испытуемый вирус с множественностью заражения 0,1-1,0 lg ТЦД50 на клетку. Инфицированную культуру помещали в термостат для контакта вируса с клетками и выдерживали в течение 30-60 мин при температуре (37,5 ± 0,5)° С. Затем вносили поддерживающую среду.

Результаты исследований по определению влияния посевной концентрации клеток Vero, их возраста и времени съема вируса на накопление вакцинных штаммов МПВ представлены в табл. 5.

Таблица 5

Влияние посевной концентрации клеток Vero, их возраста и времени съема вируса на его величину инфекционного титра в клетках Vero (п=3)

Время съема вируса,ч Возраст клеток Vero, ч Множественность заражения, ТЩЫкл Концентрация клеток, тыс/см3 Титр инфекционности вируса, lg ТЦД50/СМ3, М±т*

8544 VC-03

24 48-72 0,5 200 3,5 ± 0,1* 3,75±0,2

48 48-72 0,5 200 6,1 ±0,3 6,5 ± 0,2

72 48-72 0,5 200 6,25± ОД 6,75 ± 0,1

96 48-72 0,5 200 6,0 ± 0,3 6,5 ± 0,4

Данные, приведенные в таблице 5 , показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 имели максимальное накопление 6,25± 0,1 и 6,75 ±0,1 lg 'ГЦД50/СМ3 соответственно в клетках Vero с посевной концентрацией 200 тыс.кл/см3 при оптимальном времени их инокуляции через 48-72 ч и времени съема 72 ч.

Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 вызывали острую форму вирусной инфекции в клетках Vero. Цитопатогенное действие сопровождалось округлением клеток с зернистостью в цитоплазме на ограниченных участках монослоя через 48 ч после инокуляции. На 3-5 сут. инкубации зернистость в клетках наступала по всему монослою. Полную дегенерацию отмечали на 5-7 сут. с образованием больших синцитиальных формаций. Эпизоотические штаммы Е-07 и Н-08 МПВ птиц адаптировались к условиям культивирования в клетках Vero после 2-3 слепых пассажей, вызывая ЦПД в виде округления клеток, появления в них зернистости и формирования небольших синцитий.

2.2.2.3. Культивирование вируса в трахеальной органной культуре. В опытах для получения трахеальной органной культуры использовали СПФ эмбрионы кур, отбор которых проводили за одни сутки до вывода. Подготовку эмбрионов, извлечение зародыша и освобождение трахеи осуществляли по общепринятым методикам. Поперечные срезы колец трахеи незамедлительно переносили во флаконы со средой Игла ДМЕМ, включающей Hepes, 0,2% глюкозу и антибиотики бензилпенициллина натриевой соли 1000 ЕД/см3, сульфата стрептомицина 10 мг/см3. Через 24 часа инкубации при температуре (37,5 ± 0,5) °С ТОК исследовали под микроскопом на наличие активности ресничек эпителия. Кольца с активностью ресничек на 80-90% инокулировали испытуемыми вакцинными штаммами 8544 и VC-03 МНВ птиц в 1,0 см3 вируссодержащего материала, предварительно удалив из флаконов питательную среду. Флаконы с ТОК оставляли при температуре 37,5 °С на 1 час, снова отмывали и добавляли свежую среду. Культуры контрольные и инфицированные культивировали в течение 5-6 сут при ежедневном исследовании на снижение или отсутствие активности ресничек (цилиостаз). Установлено, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 вызывали незначительное снижение активности ресничек на 3-5% и 7% соответственно. Степень репродукции штаммов МГ1В в клетках эпителия трахеи изучали методом титрования в клетках Vero (табл.6). Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой степени репликации вакцинных штаммов в ТОК и накоплении их в высоких титрах.

Таблица 6

Титры инфекционности вакцинных штаммов МПВ в трахеальной органной культуре (п = 3)

Титр инфекционности вируса, lg ТЦД50/СМ3, М+т*

Штаммы вируса Число пассажей

1 2 3

8544 5,1 ±0,2* 5,3 ±0,33 5,33 ±0,15

VC-03 5,4 ±0,3 5,5 ± 0,25 5,55 ±0,15

В процессе изучения культуральных свойств метапневмовируса птиц была определена чувствительность различных клеточных культур к испытуемым штаммам МПВ относительно клеток Vero (табл.7). Результаты показали, что клетки Vero наиболее

чувствительны к изучаемым штаммам вируса, а в культуре фибробластов утиных эмбрионов вирус слабо адаптировался.

Таблица 7

Индекс чувствительности клеток Vero, первичных и органной культур вакцинных и эпизоотических штаммов МПВ птиц

Наименование культур клеток Индекс чувствительности, И

Штаммы вируса:

Вакцинные Эпизоотические

8544 VC-03 Е-07 Н-08

Клетки Vero 1,0 1,0 1,0 1,0

ФЭК 0,840 0,854 0,760 0,762

ФЭУ 0,076 0,102 н.и. н.и.

ФЭГ 0,551 0,542 н.и. н.и.

ток 0,625 0,782 0,721 0,706

Таким образом, полученные данные но изучению культуральных свойств МПВ птиц показали, что способность штаммов МПВ к репликации в клеточных культурах была различной.

2.2.3. Изучение антигенных свойств метапневмовируса птиц. Антигенные свойства испытуемых штаммов МПВ птиц изучали на 30-суточных цыплятах путем получения штаммспецифических сывороток. Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в реакции нейтрализации в клетках Vero в ß - варианте против 1000 ТЦД50 вируса и ИФА. В других опытах реакцию ставили в а - варианте с 4NE сыворотками. Данные, приведенные в таблице 8, показали, что антигенная активность вакцинного штамма VC-03 значительно выше по сравнению со штаммом 8544, что подтверждали значения титров, полученные в а - и ß - вариантах реакции нейтрализации и ИФА (2,7 ± 0,16, 6,8 ± 0,43 и 7347 ± 225 соответственно). Активности штаммспецифических сывороток к эпизоотическим штаммам Е-07 и Н-08 как в реакции нейтрализации, так и в ИФА были низкими.

Антигенная активность штаммов МПВ птиц (п = 5)

Штамм вируса Активность сывороток в:

Реакции нейтрализации ИФА, обратные значения, Мш ** Р<

а - варианте, ИН, lg ТЦД50, М±т * ß - варианте, log2

8544 2,25 ± 0,25* 5,5 ± 0,32 6089 ±213** 0,05

VC-03 2,7 ±0,16 6,8 ± 0,43 7347 ± 225 0,05

Е-07 1,77 ±0,15 н.и. 703 ±15 0,05

Н-08 1,85 ±0,2 н.и. 652 ±12 0,05

Поскольку в настоящее время в РФ контроль над заболеванием основан, главным образом, на вакцинации, нами был поставлен опыт по определению антигенности вакцинных штаммов 8544 и УС-03 на цыплятах 10 - суточного возраста, вакцинированных согласно инструкции по применению живых вакцин, изготовленных из этих штаммов (табл.9).

Таблица 9

Среднегеометрические титры антител в сыворотке крови у вакцинированных цыплят на 21

сут после вакцинации

Сыворотки к вакцинным штаммам Титры антител в ИФА* к наборам из:

антигена 8544 Процент выявления антигена УС-03 Процент ( выявления

8544 840 50 777 60

УС-03 834 50 953 87,5

примечание: * - титры антител в обратных величинах.

Данные, приведенные в таблице 9, показали, что вакцинные штаммы индуцировали выработку гуморальных антител в сыворотке крови у привитых цыплят в низких титрах,

хотя на штамм VC-03 уровень специфических антител был значительно выше. Необходимо отметить, что при использовании набора для выявления антител к МПВ с антигеном 8544 процент положительно реагирующей птицы составил 50, а титры антител были равными как с гомологичными, так и с гетерологичными антителами. А при использовании набора ИФА с антигеном VC-03 положительно реагирующая птица составила с гомологичными антителами 87,5%, а с гетерологичными антителами была 60%.

Таким образом, вакцинный штамм VC-03, как при вакцинации, так и при гипериммунизации, вызывал синтез специфических антител в более высоких титрах, что свидетельствует о большей антигенности штамма. 2.2.4. Изучение антигенной специфичности вируса ( Ag - признак )

При изучении этиологии случаев заболевания МПВИ птиц в период массовой вакцинации против нее, а также вопросов репликации вакцинных штаммов в организме и их распространения среди птиц, при исследовании генетической устойчивости вакцинных штаммов должны быть получены доказательства происхождения выделенных штаммов от вакцинных или эпизоотических.

Для решения этих вопросов следует: изучить патогенность для цыплят, культуральные свойства и провести идентификацию штаммов при помощи их нейтрализации штаммспецифическими сыворотками. Gard (1960) предложил модификацию теста определения Ag - признака, суть которого заключается в том, что сыворотка иммунизированного животного в состоянии нейтрализовать большее количество гомологичного вируса, чем гомотипичного.

В опытах использовали штаммспецифические сыворотки, полученные путем двукратной иммунизации 30-суточных СПФ цыплят испытуемыми штаммами метапневмовируса птиц. Активность сывороток определяли в реакции нейтрализации в р - варианте в культуре клеток Vero против 500 и 1000 ТЦД50 вируса, а в а - варианте реакцию ставили с 4NE сыворотками. Результаты изучения различий в скорости течения реакции нейтрализации штаммспецифической сывороткой гомологичного и гетерологичного штаммов МПВ птиц кинетическим методом приведены в табл.10. Полученные данные показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц нейтрализовались в большей степени за время t = 15 мин контакта при 37° С гомологичной антисывороткой по сравнению с гетерологичной. Так, индекс нейтрализации штамма 8544 штаммспецифической сывороткой равнялся 1,31 - 1,34 lg , а гетерологичной сывороткой - 0,89 - 1,09 lg. Аналогичную картину отмечали в отношении штамма VC-03 МПВ птиц. Значения констант скорости нейтрализации (К) свидетельствовали о достоверности полученных результатов ( > 2).

Таблица 10

Результаты реакции нейтрализации сыворотками к вакцинным штаммам 8544 и

УС-03 МПВптиц

Штамм вируса Сыворотка к штаммам:

8544 УС-03

ИН, ТЦД50 Показатель достоверности результатов К по Мс Впс1е ИН, 1ё ТЦД5о Показатель достоверности результатов К по Мс внае

8544 1,34 >2 29,26 1,09 >2 6,72

8544 1,31 >2 13,44 0,89 >2 9,31

УС-03 0,96 >2 3,62 1,83 >2 13,6

УС-03 1,1 >2 8,99 1,57 >2 21,78

Примечание: ИН - индекс нейтрализации;

К - константа нейтрализации.

2.2.5. Изучение степени нейтрализации (Ап - признак).

Демонстрация подтиповых различий метапневмовируса птиц является наиболее важным недавно сделанным открытием в исследовании возбудителя МПВИ птиц. Поскольку вариации обнаружили в О-протеине, который тесно связан с начальными стадиями болезни, имеется очевидная причастность этого белка к предлагаемой защите при помощи вакцин и серологической диагностики с использованием отдельных подтипов вируса в качестве референтных антигенов в ИФА или в реакциях нейтрализации. Степень нейтрализации испытуемых штаммов штаммспецифической сыворотки (Ап-маркер) изучали в перекрестной реакции нейтрализации и ИФА. В опытах использовали иммунную сыворотку в постоянной дозе с активностью 4Ж (табл.11). Результаты показали, что вакцинные штаммы 8544 и УС-03 нейтрализовались в больших логарифмах в присутствии гомологичной штаммспецифической сыворотки, чем гетерологичной. Однако штамм 8544 оказался менее чувствительным к специфическим антителам штамма УС-03. Степень антигенного родства между штаммами составила от 88 и 90 % в ИФА и реакции нейтрализации соответственно по АгсЬеШ а. НогеГаН.

Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемые вакцинные штаммы 8544 и УС-03 отличаются по степени нейтрализации, но в то же время они оказались близкородственными.

Таблица 11

Результаты перекрестных реакций нейтрализации и ИФА вакцинных штаммов специфическими антисыворотками (п=5)

Штамм вируса Сыворотки к штаммам Р<

8544 VC-03

ИН, lgTIW50 ИФА ИН, Ig ИФА

8544 2,25±0,25 6089±213* 1,82±0,3 4655±341* 0,05

VC-03 1,77±0,2 4868±285 2,7±0,16 7347±225 0,05

Примечание: ИН - индекс нейтрализации;

- титры антител в обратных величинах.

В результате проведенных исследований выделены от цыплят два изолята вируса и идентифицированы как метапневмовирус птиц со штаммспецифическими сыворотками 8544 и VC-03, принадлежащими к подтипам А и В соответственно. Испытуемые штаммы 8544, VC-03, Е-07 и Н-08 МПВ птиц отличались по культуральным и антигенным свойствам, антигенной специфичности и степени нейтрализации штаммспецифическими сыворотками.

З.Выводы

1. Изоляты вируса, выделенные от цыплят, идентифицированы как метапневмовирус птиц в реакции нейтрализации и ИФА с использованием штаммспецифических сывороток к эталонным вакцинным штаммам 8544 и VC-03, принадлежащих к подтипам А и В метапневмовируса птиц.

2. Перевиваемая линия клеток Vero и культура куриных фибробластов успешно использованы для первичного выделения изолятов метапневмовируса птиц из патологического материала и постановки реакции нейтрализации.

3. Метапневмовирус птиц способен к репликации в различных клеточных культурах эмбрионов птиц и клетках Vero с выраженным цитопатическим эффектом цитолитического типа с образованием синцитий.

4. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц обладают высокой степенью репликации в клетках Vero и культуре клеток куриных эмбрионов, вызывая острую вирусную инфекцию, обуславливая деструкцию и гибель клеток. В культурах фибробластов гусиных

и утиных эмбрионов штаммы вируса индуцируют слабое цитопатогенное действие в клетках и накапливаются в низких титрах.

5. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц в прививочной дозе индуцируют формирование гуморальных антител в сыворотке крови птиц в низких титрах, в то же время штамм VC-03 отличается большей антигенной активностью.

6. Установлены различия в антигенной специфичности и степени нейтрализации (в скорости течения реакции) вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц. Снижение титра обоих штаммов в процессе нейтрализации для гомологичного по Ag признаку штамма выше, чем для гетерологичного.

7. Вариабельность штаммов МПВ птиц по антигенным свойствам, возможно, обусловлена географической разобщенностью зон их циркуляции.

4. Практические предложения

1. Разработаны и утверждены Россельхозакадемией Методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц».

2. Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе со студентами биологических и ветеринарных институтов и на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, работающих в области промышленного птицеводства.

5.Спнсок научных работ, опубликованных по материалам диссертации. Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Чувствительность клеточных культур к метапневмовирусу птиц / Б.Б.Трефилов, Л.Ю. Данко// Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2010.-№1,- С.44-46.

2. Способность метапневмовируса птиц к репродукции в культурах клеток/ Б.Б.Трефилов, Н.В.Никитина, Л.Ю.Данко, В.С.Бочкарев// Ж. Ветеринария и кормление. -2011. - № 1.-С. 14.

3. Антигенная специфичность и степень нейтрализации вакцинных штаммов метапневмовируса птиц / Трефилов Б.Б., Данко Л.Ю., Бочкарев B.C., Никитина Н.В.// Ж.. Ветеринарная практика. - 2011. - № 1. - С.35-37

Статья, опубликованная в материалах конгресса:

4. Ассоциированное течение респираторных вирусных болезней птиц/ Б.Б.Трефилов, Н.В.Никитина, Л.Ю.Данко, Ф.М.Пунтус// Материалы междунар. агропромыш. конгр. -СПб, 2009.-С. 41-42.

Подписало в печать 5 апреля 2011 г. Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ №64 Типография «Сан-Принт» 191119 Санкт-Петербург, ул. Черняховского, 24

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Данко, Леонид Юрьевич

Введение.

1.Обзор литературы.

1.1 .Метапневмовирусная инфекция птиц.

1.1.1.Хронологическая справка, распространение и ущерб, причиняемый этой болезнью.

1.1.2.Характеристика и морфология метапневмовируса птиц.

1.1.3.Культуральные свойства метапневмовируса птиц.

1.1.4.Антигенная вариабельность метапневмовируса птиц.

1.1.5а.Эпизоотологические данные болезни.

1.1.6.Клинические признаки и патологоанатомические изменения.

1.1.7.Диагностика болезни.

1.1.8.Профилактика и меры борьбы с болезнью.

1.1.9.3аключение.

2.Собственные исследования.

2.1.Материалы и методы.

2.1.1 .Материалы исследований.

2.1.2.Методы исследований.

2.2.Результаты собственных исследований.

2.2.1.Выделение метапневмовируса птиц и его идентификация.

2.2.2.Изучение культуральных свойств метапневмовируса птиц.

2.2.3.Изучение антигенных свойств метапневмовируса птиц.

2.2.4.Изучение антигенной специфичности вируса ( Ag - признак ).

2.2.5.Изучение степени нейтрализации (Ап —признак).

3.Обсуждение результатов исследований.

4.Выводы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц"

Актуальность темы. Метапневмовирусная инфекция широко распространена в стадах коммерческой птицы (куры-несушки, бройлеры и индейки) в птицеводческих хозяйствах разных стран мира (Buys & Du Preez, 1980; Buys et al., 1989; Me Dongall & Cook, 1986; Wilding et al., 1986; Alkhalaf, 2002; Jones, 2004).

Первичная вирусная инфекция часто осложняется болезнями бактериальной и вирусной природы, ведущими в результате к высокой заболеваемости и смертности (И.А.Борисова, А.В.Борисов, 2009; Cook, 2000).

Случаи возникновения метапневмовирусной инфекции птиц отмечены в птицехозяйствах Российской Федерации (В.Н.Ирза с соавт., 2003,2005; З.Б.Хлебовец с соавт., 2005; Д.В.Дмитриев, 2007; Б.Б.Трефилов с соавт., 2010). У невакцинированных кур-несушек и бройлеров регистрировали специфические антитела к метапневмовирусу.

Исходя из обширных различий в антигенной структуре и аминокислотной последовательности гена, существующие штаммы метапневмовируса классифицированы на четыре подтипа A,B,C,D (И.А.Борисова, 2008; Cook, Cavanagh, 2002; Sabara, Varence, 2002).

Проблема антигенной структуры метапневмовируса помимо большого теоретического значения представляет в настоящее время существенный практический интерес в период массовой вакцинации против этой болезни, а также при изучении репликации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса в организме и культурах клеток и их распространения среди птицы.

Чувствительность клеточных культур к метапневмовирусу птиц установлена многими исследованиями (И.А. Борисова, 2008; А.С.Пронин с соавт., 2006; Panigrahy et al., 2000; Jirjis et al., 2000, Cook et al., 2001). Однако какая бы система не была использована для. обнаружения вируса, его идентификация может быть подтверждена при помощи различных серологических методов исследований.

Изучение антигенной специфичности и степени нейтрализации штаммспецифической антисывороткой метапневмовируса птиц в литературе не сообщалось.

Вместе с тем, по результатам исследований сотрудниками- ГНУ ВНИИЗЖ (А.С.Пронин с соавт., 2006) установлена циркуляция' метапневмовируса птиц на территории РФ подтипов« А и В.

В связи с вышеизложенным изучение репродукции метапневмовируса (МПВ) птиц в гомологичных и гетерологичных культурах клеток и определение антигенных штаммовых различий вируса являются актуальными.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение культуральных и антигенных свойств метапневмовируса птиц.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

- выделить метапневмовирус птиц и провести его i идентификацию;

- изучить культуральные свойства метапневмовируса птиц;

- изучить антигенные свойства метапневмовируса птиц;

- разработать методические положения по диагностике метапневмовирусной инфекции птиц.

Научная новизна. Установлена возможность использования культуры клеток куриных эмбрионов и клеток Vero для выделения из патологического материала метапневмовируса птиц. Показана возможность культивирования МПВ птиц в различных клеточных культурах и установлена их отличие в чувствительности к вакцинным и эпизоотическим штаммам возбудителя болезни.

Выявлена- высокая репликационная? способность вакцинных; штаммов МПВ птиц в.клетках Vero.

Впервые изучены; антигенная? специфичность и степень, нейтрализации ; гомологической и гетерологической штаммспецифической сывороткой вакцинных: штаммов МПВ- птиц в реакции: нейтрализации; и иммуноферментном анализе и установлено их отличие по Ag и Ап признакам. Определена степень антигенного? родства вакцинных и эпизоотических штаммов МПВ птиц. .

Практическаязначимостьработы. . Установлена перспективность использования клеток Vero . для наработки вирусного материала при изготовлении средств диагностики, и, специфической профилактики метапневмовируснои инфекции птиц®.

Разработаны и утверждены Россельхозакадемией Методические положения^'«Диагностика;метапневмовируснои инфекции птиц».

Основные положения . выносимые uá защиту:

- результаты по выделению изолятов вируса и: их идентификации;

- культивирование метапневмовируса птиц в , первично-трипсинизированных.культурах клеток;

- культивирование метапневмовируса птиц в клетках Vero;

- результаты изучения антигенности вакцинных, штаммов метапневмовируса птиц, их антигенной специфичности и степени, нейтрализации со штаммспецифическими сыворотками.

Апробаиия работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены- и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии5 и ОБП и Ученого совета ГНУ ВI IИ В И11 Россельхозакадемии (2007-2010гг.), на Международном агропромышленном конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и зоотехнии» (Санкт-Петербург, 2009г.); Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства: материалы Межрегиональной научно-практической конференции (Самара, 2010).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н. В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано четыре научные статьи.

Структура и объем диссертаиионной работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 170 источника, из которых 153 зарубежных.

1. Обзор литературы 1.1.Метапневмовирусиая инфекция птиц

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Данко, Леонид Юрьевич

4. Выводы к Изоляты вируса, выделенные от цыплят идентифицированы как метапневмовирус. птиц в реакции нейтрализации и ИФА с использованием штаммспецифических сывороток к эталонным вакцинным штаммам 8544 и VC-03, принадлежащих к подтипам А и В метапневмовируса птиц.

2. Перевиваемая линия клеток. Vero и культура куриных фибробластов успешно использованы для первичного выделения изолятов метапневмовируса • птиц из патологического материала и постановки реакции нейтрализации.

3. Метапневмовирус птиц способен к репликации в- различных клеточных культурах эмбрионов птиц и клетках Vero- с выраженным цитопатическим эффектом цитолитического типа с образованием синцитий. ■

4. Вакцинные штаммы 8544 и VG-03 МПВ птиц обладают высокой степенью репликации в клетках Vero и культуре клеток куриных эмбрионов, вызывая острую вирусную инфекцию, обуславливая деструкцию и гибель клеток. В культурах фибробластов гусиных и утиных эмбрионов штаммы вируса индуцируют слабое цитопатогенное действие в клетках и накапливаются в низких титрах.

5. Вакцинные штаммы 8544 и УС-03 МПВ птиц в прививочной дозе индуцируют формирование гуморальных антител в сыворотке крови птиц в низких титрах.

6. Установлены различия в антигенной специфичности и степени нейтрализации (в скорости течения реакции) вакцинных штаммов 8544 и УС-03 МПВ птиц. Снижение титра обоих штаммов в процессе нейтрализации для гомологичного по А§ признаку штамма выше, чем для гетерологичного.

7. Вариабельность штаммов МПВ птиц по антигенным свойствам, возможно, обусловлена географической разобщенностью зон их циркуляции.

Заключение

В результате проведенных исследований выделены от цыплят: два; изолята. вируса: и идентифицированы как метапневмовирус птиц« со штаммспецифическими сыворотками 8544 и VC-03, принадлежащими к подтипам А и В: соответственно. Испытуемые штаммы 8544, VC-03, Е-07 и IT-08 МПВ птиц отличались по культуральным и антигенным свойствам, антигенной! специфичности и степени нейтрализации штаммспецифическими сыворотками.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Данко, Леонид Юрьевич, Санкт-Петербург

1. Борисова И.А. Метапневмовирусная инфекция птиц / И.А.Борисова, A.B. Борисов // РацВетИнформ. 2009. - №12. -С.9 - 11.

2. Борисова, И.А. Антигенная активность экспериментальной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и пневмовирусной инфекции птиц /И.А. Борисова // Вет. патология. 2006. - №4 (19)«. - С.144-146.

3. Борисова, И.А. Пневмовирусная инфекция птиц /И.А Борисова, С.К. Старое // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2006. - Т.4. - С.281-296.

4. Виноходов, В.О. Синдром «опухшая голова» или введение в отоларингологию птиц / В.О. Виноходов // Ветеринария в птицеводстве.- 2003. №1 (7) - С.14-27.

5. Ирза, В.Н. Проблемы респираторных заболеваний в современном птицеводстве / В.Н. Ирза, A.B. Борисов, В.В Дрыгин и др. //, 1-й Междунар. ветер, конгресс по птицеводству. М., 2005. - С.14-22.

6. Ирза, В.Н. Серологический мониторинг по птичьему пневмовирусу (Avian Pneumovirus APV) в России / В.Н. Ирза, Т.В. Оковытая, В.В. Борисов и др. // Конференция по птицеводству.-Зеленоград, 2003. - С.222-223.

7. Капустин В.Н. Диагностика и профилактика пневмовируса у кур-несушек / В.Н. Капустин, В.Г. Лысый // Ветеринария и кормление 2005. - №5. - С.31

8. Каспарьянц С. Пневмовирусы- птицы / С.Каспарьянц, А. Столляр, Preston Vet Kft // РацВетИнформ. 2009. - №11. -С.8-10.

9. П.Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина // М.: Агропромиздат, 1991.-С.376.

10. Терентьев П.В. Практикум по биометрии: Учебное пособие /П.В.Терентьев, Н.С.Ростова// Л.: изд. Ленинградского ун-та, 1977. С.37-91.

11. Трефилов Б.Б. Ассоциированное течение респираторных вирусных болезней птиц / Б.Б. Трефилов, Н.В.Никитина, Ф.М. Пунтус и др. // Матер.междунар. конгр.- СПб. 2009. - С.41-42

12. Трефилов Б.Б. Пневмовирусная инфекция птиц (эпизоотология, диагностика) / Б.Б. Трефилов, Н.В. Никитина, Н.В. Денисов и др. // Актуал. пробл. вет. мед. (научно-практ. конгр. 24-25 августа 2007). СПб. - 2007.- С.210-211.

13. Троценко Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская // М.: «Колос»,2000. С.272.

14. Чистяков И.А. Статистические методы в вирусологических исследованиях/ И.А.Чистяков// В кн. «Руководство по вет.вирусол.» под ред. проф. В.Н.Сюрина. М., 1966. — С.390-408.

15. Ahmadian, G. Detection and characterization of Processing encoded by the second ORF of the M2 gene of pneumoviruses / G. Ahmadian, P. Chambers, A.J. Easton // J. Gen. Virol. 1999. -V .80. - P.2011-2016.

16. A1-Ankari, A.R. Avian pneumovirus infection in broiler chicks inoculated with Escherichia coli at different time intervals I A.R. Al-Ankari, J.M. Bradbury, C.R. Naylor et al. // Avian Pathol. -2001. V.30. - P.257-267.

17. Alexander, D.J. Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections//D.J. Alexander, / Diseases of Poultry.-10th ed. Ames, Iowa, 1997. P.541-569.

18. Alkhalaf, A.N. Pathogenicity, transmissibility, and tissue distribution of avian pneumovirus in turkey poults / A.N. Alkhalaf, L.A.Ward, R.N. Dearth et al. // Avian Dis. 2002. -V.46. - P.650-659.

19. Anon. Turkey rhinotracheitis of unknown aetiology in England and Wales: a preliminary report from the British Veterinary Poultry Association / Anon. // Vet. Rec. 1985. - V.117. - P.653-654.

20. Arns, C.W. Swollen head syndrome in poultry flocks in Brazil / C.W. Arns, H.M. Hafez // Proc. 41st Western Poultry Dis. Conf. -Sacramento, California, 1992. P.81-83.

21. Archetti J. Persistent antigenic variation of influenza. A viruses after incomplete neutralization in ovo with heterologous immune serum/ J. Archetti, F.L.Horsfall// J.exp. med.: 1950. -V.92. - P .441.

22. Banet-Noach, C. Characterization of Israeli avian metapneumovirus strains in turkeys and chickens / C. Banet

23. Noach, L. Simanov, S. Perk // Avian PatKol. 2005. - V.34. -P.220-226

24. Banet-Noach, C. Direct (non-vector) transmission of West Nile virus in geese / C. Banet-Noach, L. Simanov, M. Malkinson // Avian Pathol. 2003. - V.32. - P.489-494.

25. Baxter-Jones C. Close relationship between TRT virus isolates / C. Baxter-Jones, J.K.A. Cook, J.A. Frazier et al. // Vet. Rec. -1987. V.120. - P.562.

26. Baxter-Jones, C. A comparison of three methods for detecting antibodies to turkey rhinotracheitis virus. / C. Baxter-Jones, M. Grant, R.C. Jones et al. // Avian Pathol. 1989. - V.18. - P.91-98.

27. Baxter-Jones, C. A comparison of three methods for detecting antibodies to turkey rhinotracheitis virus. / C. Baxter-Jones, M. Grant, R.C. Jones // Avian Pathol. 1989. - V.18. - P.91-98.

28. Baxter-Jones, C. Immunofluorescence as a potential diagnostic method for turkey rhinotracheitis. / C. Baxter-Jones, G.P. Wilding & M. Grant // Vet. Rec. 1986. - V.119. - P.600-601.

29. Bell, I.G. Failure to detect antibody to turkey rhinotracheitis virus in Australia poultry Hocks / I.G. Bell, D.J. Alexander // Austral. Vet. J. 1990. - V.67. - P.232-233.

30. Bennett R.S. A wild goose metapneumovirus containing a large attachment of glycoprotein is avirulent but immunoprotective in domestic turkeys /R.S. Bennett, R. La Rue, D. Shaw et al. // J. Virol. 2005. - V.79. - P. 14834-14842.

31. Bennett R.S. Evidence of avian pneumovirus spread among wild birds and domestic turkeys in central North America / R.S. Bennett, M.K. Njenga, J. Nezworski et al. // Avian Dis 2004 -V 48 - P.902-908.

32. Bennett, R.S. Detection of avian pneumovirus in wild Canada geese (Branta canadensis) and blue-winged teal (Anas discros) / R.S. Bennett, B. McComb, H.J. Shin et al. // Avian Dis. 2002. -V.46.-P.1025-1029.

33. Buys, S.B. A preliminary report on the isolations of a virus causing sinusitis in turkeys in Souch Africa and attemps to attenuate the virus / S.B. Buys, J.H. Du Preez // Turkeys. 1980. -V.28. -P.36.

34. Buys, S.B. The isolation and attenuation of a virus causing rhinotracheitis in turkeys in South Africa, Onderstepoort / S.B. Buys, J.H. Du Preez, J.H. Els // J. Vet. Res. 1989a. - V.56. -P.87-98

35. Cadman H.F. A serosurvey using enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies against poultry pathogens in Ostriches (Struthio camelus) from Zimbabwe / H.F. Cadman, P.J. Kelly, R. Zhou et al. //Avian Dis.-1994. V.38. - P.621- 625.

36. Cavanagh, D. Innovation and discovery: the application of nucleic acid-based technology to avian virus detection and characterization / D. Cavanagh // Avian Pathol. 1999. - V.30. -P.581-598.

37. Cavanagh, D. Pneumovirus-like characteristics of.the mRNA and proteins of turkey rhinotracheitis virus / D. Cavanagh, T. Barrett // Virus Res.-1988 V.ll. - P.241-256.

38. Chettle, N.J. The use of an ELISA test to detect antibodies to turkey rhinotracheitis / №J« Chettle, P.J. Wyeth //.' Brit. Vet. Ji -1988. V.144.- P.282-287.

39. Collins, M.S. Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using1 polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies / M.S. Collins, W.J. Cox, N.J. Gettle // Avian Pathol. -1993. V.22. - P.469-479.

40. Gollins, M.S. Characterisation of a virus associated with turkey rhinotracheitis / M.S. Collins, R.E. Gough // J. Gen. Virol. -1988. V.69. - P.909-916.

41. Collins, M.S. Respiratory syncytial virus/ M.S. Collins, K. Mcintosh, R.M. Chanock // Fields Virology. 3rd ed. Philadelphia; 1996.- P. 1313-1351.

42. Cook J. K. A. Infectious bronchitis virus vaccine interferes with the replication of avian pneumovirus vaccine in domestic fowl/ J.K.A. Cook, M.B. Huggins, S.J. Orbell et al:. II Avian Pathol. -2001. V.30. - P. 233-242.

43. Cook J.K.A. A live attenuated turkey rhinotracheitis vaccine.

44. Stability of the attenuated strain 7 J.K.A. Cook, M.M. Ellis,

45. C.A. Dolby et al. // Avian Pathol. 1989a. - V. 18. -. P.51 1-522.

46. Cook J.K.A. A live attenuated turkey rhinotracheitis virus vaccine. 2. The use of the attenuated strain as an experimental vaccine / J.K.A. Cook, H.C. Holmes, P.M. Finney et, al. // Avian Pathol. 1989b. - V.18. - P.523-534. '

47. Cook J.K.A. Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies / J.K.A. Cook,

48. B.V. Jones, M.M. Ellis et al. // Avian Pathol.- 1993b. V.22. -P. 257 -273.

49. Cook J.K.A. Avian pneumovirus infection of laying hens: experimental studies / J.K.A. Cook, J. Chester, F. Orthe et al. // Avian Pathol. 2000. - V.29. - P.545-556.

50. Cook, J.K.A. Attenuation of turkey rhinotracheitis virus by alternative passage in embryonated chicken eggs and tracheal organ cultures / J.K.A. Cook, M.M. Ellis // Avian Pathol. 1990.- V.19. P.181-185.

51. Cook, J.K.A. Avian rhinotracheitis. / J.K.A. Cook // Revue Scientifique et Technique, Office International des Epizooties. -2000. L. 19. - P.602-613.

52. Cook, J.K.A. Detection and differentiation of avian pneumoviruses (metapneumoviruses)/ J. K. A. Cook, D. Cavanagh // Avian Pathol. 2002 - V.31 - P. 117-132.

53. Cook, J.K.A. In vitro and in vivo studies in chickens and turkeys on strains of turkey rhinotracheitis virus isolated from the two species / J.K.A. Cook, S. Kinloch, M.M. Ellis // Avian Pathol. -1993a. V.22. - P.157-170.

54. Cook, J.K.A. Preliminary antigenic characterisation of an avian pneumovirus isolated from commercial turkeys in Colorado. USA / J.K.A. Cook, M.B. Huggins, S.J. Orbell et al. // Avian Pathol. 1999. - V.28. - P.607-617.

55. Cook, J.K.A. Preliminary antigenic characterization of an avian pneumovirus isolated from commercial turkeys in Colorado, USA.

56. J.K.A. Cook, M.B. Huggins, S J. Orbell et al. // Avian Pathol. 1999. - V.28. - P.607-617

57. Cook, J.K.A. Protection provided by a commercially avialable vaccine against different strains of turkey rhinotracheitis virus / J.K.A. Cook, M.B. Huggins, M.A. Woods et al. // Vet. Rec. -1995. V.136. - P.392-395.

58. Cook, J.K.A. The pathogenesis of turkey rhinotracheitis in turkey poults inoculatet with the virus alone or together with two strains of bacteria / J.K.A. Cook, M.M. Ellis, V.B. Huggins // Avian Pathol. 1991. - V. 119. - P.181-185.

59. Dani M. A. Molecular chracterization of Brazilian avian pneumovirus isolates: comparison between immunochemiluminescent Southern blot and nested PCR/ M. A. Dani, E. L. Durigon, C. W. Arns// J. Virol. Methods. 1999. - V. 79. - P. 237-241.

60. Dar, A.M. Sequence analysis of the nucleocapsid and phosphoprotein genes of avian pneumovirus circulating in the US / A.M. Dar, S. Munir, S.M. Goyal et al. // Virus Res. -2001. V.79. - P.15-25.

61. D'Arce, R.C.F. Subtyping of new Brazilian avian metapneumovirus isolates form chickens and turkeys by reverse transcriptase nested - polymerase chain reaction / R.C.F. D'Arce, L.T. Coswig, R.S. Almeida et al.// Avian Pathol. -2005. - V.34.- P.133-136.

62. Davis, Q. Yu PJ. Sequence and in vitro expression of the M2 gene of turkey rhinotracheitis pneumovirus / Q. Yu PJ. Davis, T.D.K. Brown, D. Cavanagh // J. Gen. Virol. 1992. - V.73. -P.1355-1363.

63. Droual, R. Swollen head syndrome associated with E. coli and infectious bronchitis virus in the Central Valley of California. /

64. R. Droual & P.R. Woolcock // Avian Pathol. 1994. - V.23 -P.733-742.

65. Eterradossi, N. Discrepanciens in turkey rhinotracheitis ELISA results using different antigens / N. Eterradossi, D. Toquin, M. Guittet et al. // Vet. Rec. 1992. - V.131. - P.563-564.

66. Eterradossi, N. Evaluation of different turkey rhinotracheitis viruses used as antigens for serological testing following live vaccination and challenge / N. Eterradossi, D. Toquin, G. Bennejean // Vet. Med. 1995. - V.42. - P.175-186.

67. F.E. Jirjis, F.E. Pathogenesis of avian pneumovirus infection in turkeys / F.E. Jirjis, S.L. Noll, D.A. Halvorson et al. // Vet. Pathol. 2002. - V.39. - P.300-310.

68. Gerrard, C. Avian rhinotracheitis diagnostic kit. / C. Gerrard, A. Whitworth, N.J. Chettle et al. // Vet. Rec. 1990. - V.126. -P.342.

69. Giraud, P. La rhinotracheite infectieuse de la dinde. Description et role d'un nouvel agent viral. / P. Giraud, M. Guittet, D. Toquin et al. // Receuil de Medecine Veterinaire. 1988. - L.164. -P.39-44.

70. Giraud, P. Turkey rhinotracheitis in France: preliminary investigations on a ciliostatic virus / P. Giraud, G. Bennejean, M. Guittet et al.//Vet. Rec. 1986. - V.119. - P.607-608.

71. Gough R.E. Experimental infection of turkeys, chickens, ducks, geese, guinea fowl, pheasants, and pigeons with turkeyrhinotracheitis virus / R.E. Gough, M.S. Collins, W.J. Cox , N J Chette // Vet. Rec. 1988. - V. 123 - P.58-59.

72. Gough, R.E. Antigenic relationships of three turkey rhinotracheitis viruses / R.E Gough, M.S. Collins // Avian Pathol.- 1989. V. 18. - P.227-238.

73. Gough, R.E. Isolation of an avian pneumovirus from broiler chickens / R.E. Gough // Vet. Rec. 1994. - V.134. - P.353-354.

74. Goyal, S.M. Isolation of avian pneumovirus in US turkey flocks / S.M. Goyal, S. Chiang, A. Dar et al. // J. Vet. Diagn. Invest. -2000. V. 12. - P.116-118.

75. Goyal, S.M. Seroprevalence of avian pneumovirus in Minessota turkeys / S.M. Goyal, D. Lauer, K. Friendshuh, D.A. Halvorson // Avian Dis. 1999. - V.47. - P.244-250.

76. Graham, D.A. Isolation of ortho- and paramyxovirus from wild birds in Northern Ireland during the 1997 Newcastle epizootic / D.A. Graham, A. German, D. Abernethy et al. // Vet. Rec. -1999. V.145. - P.20-21.

77. Grant, M. An enzyme-linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of turkey rhinotracheitis infection / M. Grant, C. Baxter-Jones, G.P. Wilding // Vet. Rec. 1987. - V.120 - P.279-280.

78. Gulati, B.R. Protective efficacy of high-passaged avian pneumovirus (APV/MN/turkey/l-a/97) in in.keys / B.R. Gulati, D.P. Patnayak, A.M. Sheikh et al. // Avian Dis. 2001. - V.45. -P.593-597

79. Hafez, H.M. Comparative investigation of different turkey rhinotracheitis (TRT) virus isolate from different countries / H.M. Hafez // Dtsch. Tierarztl Wochenschr. 1992. - Bd.99'. - S.486-488'.

80. Hafez, H.M. Presence of avian pneumovirus type A in continental Europe during the 1980s / H.M. Hafez, M. Hess, C. Prusas et al. // J. Vet. Med. B. 2000. - V.47 - P.29-33.

81. Hafez, H.M. Rhinotracheitis der punten: Ubersicht und Erfahrungen in der Bundesrepublik Deutschland. / H.M. Hafez // Wiener Tierärztliche Monatsschrift. 1991. - Bd.78. - S.195-200.

82. Hafez, H.M. Swollen head syndrome: clinical observations and serological examinations in West Germany / H.M. Hafez, U. Lohren // Dtsch. tierarztl. Wochenschr. 1990. - Bd.97. - S.322-324.

83. Hafez, H.M. Isolation of turkey rhinotracheitis virus from turkeys/ H.M. Hafez, F.Weiland// Tierartztl. Umschau. 1990. -Bd',45. - S.103-111.

84. Hafez, H.M. The role of pneumovirus in swollen head syndrome of chickens. Review / H.M. Hafez//Arch. Geflugelkunde. 1993. -Bd.57. - S.181-185.

85. Houadfi E. Swollen head syndrome in broiler chicken in Morocco / E. Houadfi, M. Hamam, J. Vanmarche, J.K.A. Cook // Proc. 40th Western Poultry Dis. Conf. Acapulco, Mexico 1991. - P. 126127.

86. Jirjis F.E. Avian pneumovirus infection in Minnesota turkeys: experimental reproduction of the disease / F.E. Jirjis, S.L. Noll, D.A. Halvorson et al. // Avian Dis. 2000. - V.44. - P.222-226.

87. Jones R.C. Experimental infection of laying of turkeys with rhinotracheitis virus: distribution of virus in the tissues and serological respons / R.C. Jones, R.A. Williams, C. Baxter-Jones et al. // Avian Pathol. 1988 - V.17. - P.841-850.

88. Jones R.C. Experimental infection of laying turkeys with rhinotracheitis virus: distribution of virus in the tissues and serological response. / R.C Jones, R.A. Williams, C. Baxter-Jones et al. // Avian Pathol. 1988. - V.17. - P.841-850.

89. Jones, R.C. Avian pneumovirus infections: questions still unanswered / R.C. Jones // Avian Pathol. 1996. - V.23. - P.639-648.

90. Jones, R.C. Demonstration of a candidate virus for turkey rhinotracheitis in experimentally inoculated turkeys / R.C. Jones; C. Baxter Jones, G.P. Wilding et al. // Vet.Rec. - 1986. - V. 119: - P.599-600.

91. Jones, R.C. Effect of cyclophosphamide immunosuppression on the immunity of turkeys to viral rhinotracheitis. / R.C. Jones, C.J. Naylor, A.I. Al-Afaleq et al. // Research in Veterinary Science. 1992. - V.53 - P.38-41.

92. Jones, R.C. Experimental infection of chickens with a ciliostatic agent isolated from turkeys with rhinotracheitis. / R.C. Jones, C.

93. Baxter-Jones, C.E. Savage et al. // Vet. Rec. 1987. - V.120. -P.301-302.

94. Jones, R.C. Respiratory viral diseases lessons to be learned? / R.C. Jones // Int. Poultry Prod. - 2004. - V.12. - P.11-15.

95. Juhasz, K. Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups / K. Juhasz, A.J. Easton // J. Gen. Virol. 1994. -V.75. - P.2873-2880.

96. Kapczynski, D.R. Immunization of turkeys with a DNA vaccine expressing either the F or N gene of avian metapneumovirus / D.R. Kapczynski, H.S. Sellers // Avian Dis. 2003. - V.47. -P.1376-1383.

97. Ling, R. Turkey rhinotracheitis virus: in vivo and in vitro polypeptide synthesis / R. Ling, C.R. Pringle // J. Gen. Virol. -1988 V.69. - P.917-923.

98. Lister, S.A. Turkey rhinotracheitis: a review / S.A. Lister, D.J. Alexander // Vet. Bull. 1986. - V.56. - P.637-663.

99. Lu, Y.S. Swollen head syndrome in Taiwan-isolation of an avian pneumovirus and serological survey. / Y.S. Lu, Y.S. Skien, H.J. Tsai et al. // Avian Pathol. 1994b. - V.23. - P.169-174.

100. Lu, Y.S. Swollen head syndrome in Taiwan-isolation of an avian pneumovirus and serological survey. / Y.S. Lu, Y.S. Skien, H.J. Tsai et al. // Exp. Rep. Tprian. 1994a.- No 30.- P.103-108.

101. Lwamba, H.C.M. Comparison of the full-length genome sequence of avian metapneumovirus subtype C with other paramyxoviruses / H.C.M. Lwamba, R. Alvarez, M.G. Wise et al. // Virus Res. 2005.V.107.-P.83-92.

102. Maharaj, S.B. Isolation of an avian pneumovirus-like agent from broiler breeder chikens in South Africa / S.B. Maharaj // Vet. Rec. 1994. - V.134. - P.525-526.

103. McBride W.D. Antigenetic analysis of polioviruses by kinetic studies of serum neutralization/ W.D. McBride// Virology.- 1959. V.7. - N.l. - P. 45-58.

104. McDougall, J.S. Turkey rhinotracheitis: preliminary investigations / J.S. McDougal, J.K.A. Cook // Vet. Rec. 1986. -V.118. - P.206-207.

105. Mekkes, D.R. Comparison of three commercial ELISA kits for the detection of turkey rhinotracheitis virus antibodies. / D.R. Mekkes & J.J. de Wit // Avian Pathol. 1999. - V.27. - P.301-305.

106. Morley, A.J. Swollen head syndrome in broiler chikens / A.J. Morley, D.K. Thompson // Avian Dis. 1984. - V.28. -P.238-243.

107. Nakamura K. Attempts to reproduce swollen head syndrome in specific pathogen free chickens by inoculating with Escherichia coli and/or turkey rhinotracheitis virus / K. Nakamura, M. Mase, N. Tanimura et al. // Avian Pathol. 1998- V.27. P.21-27.

108. Naylor, C.J. Exacerbation of Mycoplasma gallisepticum infection in turkeys by rhinotracheitis virus. / C.J. Naylor, A.R. Al-Ankari, A.I. Al-Afaleq et al. // Avian Pathol. 1992. - V.21.- P.295-305.

109. Naylor, C.J. Turkey rhinotracheitis: a review / C.J. Naylor, R.C. Jones // Vet.Bull. 1993. - V.63.-P.339-349.

110. Naylor, CJ. Demonstration of a virulent subpopulation in a prototype live attenuated turkey rhinotracheitis vaccine. / C.J. Naylor, & R.C. Jones // Vaccine. 1994. - V.12. - P.1225-1230.

111. Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgrupp/ M. H. Bayon-Auboyer, C. Arnauld, D. Toquin, N. Eterradossi// J. Gen. Virol. 2000. - V.81. - P. 2723-2733.

112. O1 Brien, J.D.P. Swollen head syndrome in broiler breeders I J.D.P. O' Brien // Vet. Rec.-1985. V.117. - P.619-620.

113. O'Loan, C.J. The detection of turkey rhinotracheitis virus antigen in formalin fixed, paraffin embedded tissue using astreptavidin-biotin-immunoperoxidase method. / C.J. O'Loan & G.M. Allan // Avian Pathol. 1990. - V.19. - P.401-407.

114. O'Loan, CJ. Immunogold labelling of turkey rhinotracheitis virus. / CJ. O'Loan, W.L. Curran & M.S. McNulty // J. of Vet. Med., series B. 1992. - V.39. - P.459-466.

115. Pages-Mante, A. Studies on swollen head syndrome in Spain /A. Pages Mante // New and Evolving Virus Diseases of Poultry: Proc. Seminar Europ. Comm. - Brussels. - 1994. - P.109.

116. Panigrahy, B. Experimental and serologic observations on avian pneumovirus (APV /turkey /Colorado/97) infection in turkeys / B. Panigrahy, D.A. Senne, J.C. Pedersen // Avian Dis -2000. V.44. - P.17-22.

117. Patnayak D.P. Cold adapted avian pneumovirus for use as live, attenuated vaccine in turkeys / D.P. Patnayak, B.R. Gulati, M.A. Sheikh et al. // Vaccine. 2003. - V.21. - P.1371-1374

118. Patnayak D.P. Experimental and field evaluation of a live vaccine against avian pneumovirus / D.P. Patnayak, M.A. Sheikh, B.R. Gulati et al. // Avian Pathol. 2002. - V.31. - P.377-382.

119. Patnayak, D.P. Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines / D.P. Patnayak, A. Tiwari, S.M. Goyal // Avian Pathol. 2005. - V.34. - P.123-126.

120. Pattison, M. Observations on swollen head syndrome in broiler and broiler breeder chickens / M. Pattison, N. Chettle // Vet. Rec. 1989. - V.125. - P.229-231.

121. Pedersen, J.C. The sensitivity and specificity of a reverse transcription polymerase chain reaction assay for the avian pneumovirus (Colorado strain) / J.C. Pedersen, D.L. Reynolds, A. All // Avian Dis. - 2000. - V.44. - P.681-685.

122. Peret T.C. Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America / T.C. Peret, G. Biovin, Y. Li et al. //J. Infect. Dis. 2002. - V.185. - P.1660-1663.

123. Picault J.P. Isolation of a TRT-like virus from chickens with swollen head syndrome / J.P. Picault, Giraud, P. Drouin et al. // Vet. Ree. "1987a. - V.121. - P.135.

124. Picault J.P. Syndrome infectieux de gonflement de la tete (S.I.G.T.): bilan actuel des recherches etiologiques. / J.P. Picault, P. Drouin, J. Lamande et cie. // L'Aviculteur. 1986. - L.467 -P.43.

125. Picault J.P. Une etiologie commune avec la rhinotracheite infectieuse de la dinde. / Picault J.P., Giraud P., Drouin P. et cie. // L'Aviculteur. L.481. - P.74.

126. Pringle, C. R. Virus taxonomy / C.R. Pringle // Arch. Virol.- 1999. V.144. - P.2065-2069.

127. Pringle, C.R. Pneumoviruses / C.R. Pringle // Virology A Practical Approach, Oxford, United Kingdom - 1985. - P.95-117.

128. Pringle, C.R. Virus taxonomy / C.R. Pringle // Arch. Virol.- 1998. V.143. - P.1449 - 1459.

129. Quingzong, Y. Protection against turkey rhinotracheitis pneumovirus (TRTV) induced by a fowlpox virus recombinant expressing the TRTV fusion protein glycoprotein. / Y. Quingzong, T. Barrett, T.D.K. Brown et al., // Vaccine. 1994 -V. 12. - P.569-573.

130. R.A. Lamb, Paramyxoviridae / R.A. Lamb, P.L. Collins, D. Kolacofsky et al. // Acad. Pres., N.Y. 2000. - P.835-849.

131. Randhawa, J.S. Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus / J.S. Randhawa, S.D. Wilson, K.P. Tolley // J. Gen. Virol. -1996. V.77. - P.3047-1051.

132. Rima, B. Comparison of amino acid sequences of the major structural proteins of the paramixo- and morbilliviruses / B. Rima // Genetics and* Pathogenicity of Negative Strand Viruses. Elsevier, Amsterdam. 1989. - P.254-263.

133. Sahara M. I. Evaluation of a Japanese quail fibrosarcoma cell line (QT 35) for use in the propagation and detection of metapneumovirus/ M. I. Sabara, J.E.Larence// J. Virol Method. -2002. - V. 102. - P. 73-81.

134. Seal, B.S. Avian pneumoviruses and emergence of a new type in the United State of America/ B.S.,Seal // Anim. Hlth. Ris. Reviews. 2000. - V.l. - P.67-72.

135. Seal, B.S. Fusion protein predicted amino acid sequence of the first U.S. avian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other U.S. isolates / B.S. Seal, H.S. Sellers, R.J. Meinersmann // Virus Res. 2000. -V.66. - P.139-147.

136. Seal, B.S. Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demonstrate that the first U.S.avian pneumovirus isolate is distinct from European strains / B.S. Seal // Virus.Res. 1998. - V.58. - P. 45-52.

137. Senne D.A. Avian pneumovirus in Turkeys: have you seen it? / D.A. Senne, J.C. Pedersen, R.K. Edson et al. // Proc. 47th Western Poultry Dis. Conf. -Sacramento, California, 1998. P.67-68.

138. Senne D.A. Avian pneumovirus update / D.A. Senne, R.K. Edson, J.C. Pederson et al. // Proc. 134th Ann. Conf-Schaumburg, Illinois: Am. Vet. Med. Assoc, 1997. P. 190.

139. Serological evidence of avian pneumovirus infection in reared and free-living pheasants. E. Catelli, M.A. De Marco, M. Delogu et al. // Vet. Rec. 2001. - V.149. - P. 56-58.

140. Shin, H.J. Isolation; of avian; pneumoviruses from; mallard ducks that is genetically* similar to; viruses; uses isolated from neighboring commercial turkeys / H.J. Shin, K.V. Nagaraja, B. McComb et aL. // Virus Res. 2002a. - V.83; - P:207-2I2.

141. Shin, H.J. Molecular epidemiology of subgroup C avian pneumoviruses isolated in the United Slates andc comparison with subgroup A and B viruses / H.J. Shin, K.T. Cameron, J.A. Jacobs et al. // J. Clin. Microbiol, 2002b. - V.40- P.1687-1 693.

142. Shin, H.J^. Neonatal avian pneumovirus infection in' commercial turkeys / I4.J. Shin, K.V. Nagaraja, M.C. Kumar et al. // Avian Dis. 2002c. - V.46. - P.239-244.

143. Shin, II.J. Specific detection of avian pneumovirus (APV) US isolates by RT-PCR / H. J. Shin, G. Rajashekara, FiF. Jirjis et al. // Arch. Virol. 2000. - V. 145. - P: 1-23.9-1246.

144. Stuart, J.C. Turkey rhinotracheitis (TRT) in Great Britain. . In: Récent advances in turkey science / J;C Stuart // C. Nixey, T.

145. Toquin D. Infectious rhinotracheitis in turkeys: antigenic differences revealed by ELISA / D. Toquin, N. Eterradossi, M. Guittet et al. // New and Evolving Virus Diseases of Poultry: Proc. seminar/ Europ. Comm. Brussels. - 1994. - P. 111-121.

146. Toquin, D. Use of a related ELISA antigen for efficient .TRT serological testing following live vaccination. / D. Toquin, N. Eterradossi & M. Guittet // Vet. Ree. 1996. - V.139. - P.71-72.

147. Toquin,D. Isolation of a pneumovirus from a Muscovy duck / D. Toquin, M.H. Bäyon-Auboyer, N. Eteradossi et al. // Vet. Ree. 1999. - V.145. - P.680.

148. Weisman, Y. Turkey rhinotracheitis (TRT) in Turkey flocks in Israel-virus isolation and serological response / Y. Weisman, C. Strengel, R. Blumenkranz et al. // Proc. 37th Western Poultry Dis. Conf. Davis, California, 1988. P.67-69.

149. Van den Hoogen B.G. A newly discowered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease/ B.G.Van den Hoogen, J. C. de Jong, J. Kuiken et al.// Nature Medicine. 2001. - V.7. - P. 719-724.

150. Van de Zande S. Duration of cross-protection between subtypes A and B avian pneumovirus in turkeys / S. Van de Zande, C. Nauwynck, C. Naylor et'al. // Vet. Ree.- 2000.- V. 147. P. 132-134.

151. Welchman, D. de B. Infectious agents associated with respiratory disease in pheasants / D. de B. Welchman, J.M. Bradbury, D. Cavanagh et al. // Vet. Ree. 2002. - V.150. -P.658-664.

152. Wilding, G.P. Ciliostatic agent found in rhinotracheitis / G.P. Wilding, C. Baxter-Jones,M. Grant // Vet. Ree. 1986. -V.118. - P.735.

153. Williams, R.A. Development of a live attenuated vaccine against turkey rhinotracheitis/ R.A. Williams, C.E. Savage, R.C. Jones // Avian Pathol. 1991. - V.20. - P.45-55.

154. Wyeth P.J. Antibodies to TRT in chickens with swollen head syndrome / P.J. Wyeth, N.J. Chettle, R.E. Gough et al. //Avian Dis. 1987. - V.31. - P.286-287.

155. Wyeth, P.J. Preliminary observation on a virus associated with turkey rhinotracheitis / P.J. Wyeth, R.E. Gough, N.J. Chettle et al. // Vet.Ree. 1986. - V.119 - P.139.

156. Yu Q. Sequence and in vitro expression of the M2 gene of turkey rhinotracheitis pneumovirus/ Q. Yu, P.J. Davis, T.D. Brawn & D. Cavanagh// J.of Gen. Virol. -1992. V.73. - P. 1355-1363.