Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунобиологические свойства метапневмовируса птиц штамм "MPV - 07ВТ"

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства метапневмовируса птиц штамм "MPV - 07ВТ""

На правах рукописи

РОМЕНСКАЯ Диана Витальевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ ШТАММ «МРУ - 07ВТ»

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

3 О МАЯ 2013

005060576

Владимир - 2013

005060576

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Старое Сергей Константинович

Официальные оппоненты:

Ирза Виктор Николаевич

доктор ветеринарных наук, ФГБУ «ВНИИЗЖ», заведующий лабораторией эпизоотологии и мониторинга.

Смоленский Владимир Иванович

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ВГНКИ», заместитель директора.

Ведущая организация - федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Защита состоится «18» июня 2013 г. в «Ю00» часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г.Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» ( ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Автореферат разослан «14» мая 2013 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских

диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ»^^^^^^

кандидат биологических наук ¿ЛЖбанова Татьяна Валентиновна

1 Общая характеристика работы

1.1 Актуальность темы исследования. Метапневмовирусная инфекция птиц (МПВИ) является одной из актуальных проблем современного птицеводства. Экономический ущерб, причиняемый заболеванием, складывается из падежа птицы, снижения показателей яйценоскости, ухудшения конверсии корма и выбраковки птицы [4, 5, 8, 15]. Возбудитель МПВИ оказывает иммунодепрессивное действие, снижая общую резистентность организма, и тем самым повышая ее чувствительность к другим болезням [2, 7].

Проведенные исследования показали, что ущерб от МПВИ связан не только с эпизоотологией возбудителя и нарушениями ветеринарно-санитарного режима, но и с несовершенством современных методов диагностики и профилактики болезни [6, 7, 13].

МПВИ была впервые зарегистрирована в Южной Африке в конце 1970-х гг. и за короткий период времени охватила ряд стран с развитой птицеводческой индустрией. Серологические и вирусологические исследования свидетельствуют о повсеместном распространении МПВИ на территории России: наличие данного заболевания выявляли примерно в 20% исследованных птицеводческих хозяйств РФ [1,3].

На основании различий в аминокислотной последовательности генома вируса существующие штаммы метапневмовируса птиц (МПВП) классифицированы на 4 подтипа: А, В, С, О. Многообразие подтипов возбудителя создает значительные сложности в диагностике и профилактике болезни [9, 11, 14]. Молекулярный генетический анализ показал, что на территории РФ в 92-95% выявляют полевые изоляты МПВП, принадлежащие к подтипу В, и только в 5-8% случаев - к подтипу А [3]. Имеется крайне мало информации о биологических свойствах возбудителя МПВИ различных подтипов, поэтому проведение работ по выделению и изучению основных иммунобиологических свойств полевых изолятов и, в частности, подтипа В, превалирующих на территории РФ, является актуальной задачей.

Средства специфической профилактики широко применяют для борьбы с данной инфекцией. Программа вакцинации против МПВИ требует наличия живых и инактивированных вакцин [10, 12]. В РФ используют живые вакцины только импортного производства и инактивированные препараты (импортного и отечественного изготовления). В связи с вышеизложенным, актуальность научно-исследовательской работы, направленной на поиск иммуногенных вакцинных штаммов дЛя разработки отечественной живой вакцины, несомненна.

Таким образом, изучение иммунобиологических свойств штамма МПВП с целью определения возможности его использования в качестве вакцинного, является актуальной задачей.

1.2 Степень разработанности проблемы. Опубликовано значительное количество работ об успешном применении клеточных культур при изучении биологических свойств МПВП, при изготовлении диагностикумов и вакцин. В то же время, совершенствование вакцин продолжается путем подбора штаммов вируса - кандидатов в вакцинные при изучении полевых изолятов, полученных от птиц в случаях массовой заболеваемости.

1.3 Цель и задачи исследования. Главной целью исследований являлось изучение иммунобиологических свойств МПВП штамм «MPV — 07ВТ». Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить молекулярно-генетические свойства изолята МПВП;

- адаптировать штамм «MPV - 07ВТ» к системе культивирования;

- подобрать параметры культивирования штамма «MPV - 07ВТ» в

перевиваемой культуре клеток Vero;

- изучить антигенные свойства штамма «MPV - 07ВТ»;

-сравнить штамм «MPV - 07ВТ» с другими штаммами МПВП,

используемыми для изготовления вакцин против МПВИ;

- провести процедуру депонирования и разработать нормативную

документацию на штамм «MPV - 07ВТ».

1.4 Научная новизна результатов исследований. Впервые в РФ предложен новый штамм «MPV - 07ВТ» МПВП, адаптированный к первично-трипсинизированной и перевиваемым культурам клеток: ФЭК, Vero, Marc-145, МА-104. Изучены иммунобиологические свойства штамма «MPV - 07ВТ» и отработаны параметры его культивирования в первичной культуре клеток ФЭК, в перевиваемой культуре клеток Vero.

В ходе изучения иммунобиологических свойств штамма «MPV — 07ВТ» была установлена возможность использования его в качестве кандидата в вакцинные штаммы против МПВИ.

1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования. По результатам проведенных исследований предложен производственный штамм «MPV - 07ВТ». Проведено депонирование (справка о депонировании № 4 от 30.03.12), разработан и утвержден «Стандарт организации на штамм «MPV - 07ВТ» МПВП (СТО 00495527-0173-2012)».

В рамках выполнения научно-исследовательских работ по теме диссертации разработаны, комиссионно проверены, одобрены и утверждены ученым советом ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методики:

— «Методические рекомендации по культивированию и титрованию метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Marc-145»;

— «Методические указания по титрованию метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток МА-104».

1.6 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- биологические свойства штамма «MPV — 07ВТ»;

- подбор оптимальных условий культивирования штамма «MPV - 07ВТ»;

- антигенные свойства штамма «MPV — 07ВТ»;

- сравнение штамма «MPV - 07ВТ» с другими штаммами МПВП, используемыми для изготовления вакцин против МПВИ.

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В

диссертационной работе приведены результаты исследований по изучению

иммунобиологических свойств МПВП штамм «МРУ - 07ВТ». Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 06.02.02-1,3,4,5,9, 14.

1.8 Степень достоверности и апробация результатов исследования. Результаты проведенных исследований получены с использованием большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, подтверждающими их достоверность. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (г.Санкт-Петербург, 2011г.), Международных научно-практических конференциях молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (г.Владимир, 2010г. и 2012г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период 2009-2012 гг.

1.9 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных по списку ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.10 Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов, методов, собственных исследований, обсуждений, выводов и практических предложений, содержит 14 таблиц и 22 рисунков. Список использованной литературы включает 203 наименования, из них 25 отечественных и 178 зарубежных. В приложении представлены копии титульных листов документов, отражающих итоговые результаты научной работы и подтверждающих их достоверность.

1.11 Место выполнения работы. Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2008-2012 гг. в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

1.12 Личный вклад автора. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.в.н. Л.В. Малаховой, Л.М. Обуховой и к.б.н. Б.Л. Маниным, З.Б. Никоновой, за что автор выражает им сердечную благодарность.

2 Собственные исследования 2.1 Материалы

2.1.1 Вирус. В работе использовали: изолят МПВ/В/07, выделенный от цыплят-бройлеров птицефабрики Тульской области; штамм «MPV - 07ВТ» подтипа В МПВП, полученный в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (депонирован 30 марта 2012 г.).

2.1.2 Вакцины. Экспериментальная вакцина против МПВИ из штамма «MPV - 07ВТ; коммерческая вакцина из штамма «PV03-B №127 ДЕП» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ»; . коммерческая живая вакцина против метапневмовируса птиц Nobilis 8544 производства фирмы «Intervet» (Голландия).

2.1.3 Культуры клеток. Адаптацию изолята МПВП проводили с использованием трахеальной органной культуры (ТОК). МПВП штамм «MPV — 07ВТ» культивировали в первично-трипсинизированной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур - ФЭК, а также в перевиваемых линиях клеток: почки африканской зеленой мартышки - Vero, гибриде клеток почки африканской зеленой мартышки - BGM, линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы эпителия печени петуха - LMH и Магс-145 - культуре клеток фетальной почки макаки резус, клон клеток МА-104. Перевиваемые культуры клеток в виде готового монослоя получали из отдела культивирования клеток (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

2.1.4 Животные. В лабораторных экспериментах использовали коммерческих цыплят мясных и яичных пород кур различных возрастов.

2.2 Методы

2.2.1 Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems»).

2.2.2 Анализ нуклеотндных последовательностей проводили в программе Bio Edit, версия 7.0.5.3. Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма Neighbor-Joining пакета программ MEGA, версия 4.0.

2.2.3 Выделение метапневмовируса птиц в трахеальной органной культуре. ТОК готовили из трахей эмбрионов кур категории SPF на 19-21 сутки инкубации. Эксплантаты трахеи культивировали в 24-луночных культуральных планшетах в течение 24 ч. Вируссодержащий материал вносили в объеме 50-100 мкл на один эксплантант трахеи и инкубировали в течение 1,5 ч. Затем инокулят удаляли и вносили 1,0 см3 среды ПСС. Через 3-5 суток после инфицирования отбирали эксплантанты трахеи вместе с культуральной жидкостью. Для выделения МПВП проводили 5 последовательных пассажей.

2.2.4 Культивирование метапневмовируса птиц включало в себя инфицирование перевиваемых культур клеток в роллерных сосудах объемом 3000 см3, время культивирования составляло 2—5 суток, с последующим сбором вируссодержащего материала.

2.2.5 Определение инфекционной активности метапневмовируса птиц проводили титрованием в двухсуточной клеточной культуре клеток Vero, Marc-145, МА-104 в течение 10 суток. Титром вируса считали наивысшее его разведение, вызывающее четкое цитопатическое действие (ЦПД) в 50% гомологичной культуре клеток. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина.

2.2.6 Диагностические методы исследований. Для оценки гуморального иммунитета использовали набор для определения антител к МПВП иммуноферментным методом (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), а также блокирующий вариант ИФА — набор фирмы «Svanova» (Швеция) в соответствии с инструкциями по применению наборов. Результаты ИФА считали

положительными при выявлении антител в титрах > 1:800 (ВНИИЗЖ), процент блокирующих антител > 40 %.

2.2.7 Определение стерильности. Определение стерильности проводили по ГОСТ 28085.

2.2.8 Статистическая обработка результатов исследовании.

Использовали общепринятые способы статистической обработки экспериментально полученных выборок варьирующих переменных. Определяли дисперсию, стандартное отклонение и доверительный интервал средних значений.

2.3 Результаты исследований 2.3.1 Биологические свойства штамма «МРУ —07ВТ» 2.3.1.1 Молекулярио-генетические свойства изолята МПВП.

Исследования основывались на определении первичной структуры фрагментов генов О (361 нуклеотид) и N (719 нуклеотидов) испытуемого штамма «МРУ - 07ВТ» с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами МПВП подтипа В из базы данных ОепВапк, а также вакцинного штамма РУ-03В (табл. 1 и 2). Методом ОТ-ПЦР были амплифицированы участки генома штамма «МРУ - 07ВТ». Полученный фрагмент нуклеиновой кислоты очищали от остатков праймеров и проводили реакцию секвенирования в автоматическом режиме.

Таблица 1 — Использованные для филогенетического анализа

последовательности гена в МПВП подтипа В

Название штамма/изолята Страна выделения Номер в ОепВапк

УСОЗ/60616 (вакцина АУ1Па ЯТ1) Франция АВ548428

2119 Италия 1.34031

Ниг^агу/657/4 Венгрия Ь34033

8728 Испания 1.34034

1зг/1708/02 Израиль АУ728268

аМРУ/В/ВгагП-05/и8Р-01 Бразилия 0(^786396

аМРУ/В/Вга2П-05/ШР-02 Бразилия ОС)786397

аМРУ/В/ВгагИ-ОЗ/ШР-ОЗ Бразилия Р(2786398

аМРУ/В/Вга2П-05/и5Р-04 Бразилия 00786399

аМРУ/В/ВгагП-07/и5Р-05 Бразилия ЕШ40746

аМРУ/В/Вгаи1-07/ШР-06 Бразилия Еи 140747

аМРУ/В/ВгагП-06/ШР-07 Бразилия ЕШ40748

аМРУ/В/ВгагЛ-07/и5Р-08 Бразилия Е1Л40749

аМРУ/сЫскеп/В/ВгагП/23-07Р/2007 Бразилия Р.1828951

аМРУ/сЫскеп/В/ВгагП/23-07Т/2007 Бразилия Б.1828950

аМРУ/с1пскеп/В/Вгаги/25А-07/2007 Бразилия FJ 828953

аМРУ/сЫскеп/В/ВгагП/27А-07/2007 Бразилия Р.1828952

аМРУ/сЫскеп/№?епа/М39/2006 Нигерия АМ490058

аМРУ/сЫскеп/№йепа/ЫШ9/2006 Нигерия АМ490057

РУ-ОЗВ Россия нет

Таблица 2 — Использованные для филогенетического анализа

последовательности гена N МПВП подтипа В

Название штамма/изолята Страна выделения Номер в СепВапк

2119 Италия и39296

УСОЗ/60616 Франция АВ548428

Нигщагу/657/4 Венгрия АР325442

98103 Франция АМ293283

РУ-ОЗВ Россия Нет

Дендрограммы, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов О и N МПВП подтипа В, представлены на рис. 1 и 2.

-аМР^сМскеп/В/Вгаи1/25А-07/2007

аМР\//сЬ|Скеп В Вгаа1 27А-07 2007

- аМР\//сЫскеп/В/Вгаа1/23-07Т/2007

--аМР\//сЫскеп/В/Вга2Л/23-07Р/2007

-аМР\//В/Вга2П-06/иЗР-07

|-аМР\//В/Вга2П-07/иЗР-08

-[__. аМР\//В/Вгаи1-07/иЗР-05

--I aMPV/B/Bгaz¡l-07/USP-06

, аМР\//В/ВгагП-05/иЗР-02

- аМР\//В/ВгагП-05/иЗР-ОЗ

I аМРЧ//В/ВгагМ-05/иЗР-04

I- 21 19

Р vc03/60616 —1_1 Нипдагу/657/4

^-872в

МРУ - 07ВТ

-1бг/1 708/02

.-аМР^В/сМскеп/Мгдепа/М139/2006

I аМР\//сЫскепЛ\Мдепа/М1Р89/2006 - аМРЧ//В/Вгаа1-О5/иЗР-01

-PV-OЗB

Рисунок 1 — Филогенетические связи штаммов и изолятов МПВП подтипа В, установленные на основе анализа фрагмента гена С

-98103

-РУ-ОЗВ

--Нипдагу/657/4

УСОЗ/60616 -2119

-МР\Л07ВТ

I-1

(1001

Рисунок 2 - Филогенетические связи штаммов и изолятов МПВП подтипа В, установленные на основе анализа фрагмента гена N

Уровень отличий нуклеотидных последовательностей штамма

«МРУ - 07ВТ» от вакцинного штамма РУ-03В и опубликованных в базе данных ОепВапк последовательностей МПВП подтипа В составил 0,4-7,3% и 1,2-2,0% для фрагментов генов в и 14, соответственно. В результате анализа фрагмента гена в установлено, что штамм «МРУ - 07ВТ» генетически более близок к штаммам и изолятам вируса из стран Европы, а также Нигерии (уровень отличий 0,4-1,3%). При этом штамм «МРУ - 07ВТ» имеет значительные отличия от вакцинного штамма РУ-03В (7,3%) и изолятов вируса из Бразилии (3,5-4,8%).

Таким образом, в результате генетического анализа, штамм «МРУ - 07ВТ» идентифицирован как МПВП подтипа В. При этом, установлено отличие первичной структуры генов исследуемого штамма от опубликованных ранее последовательностей вируса.

2.3.1.2 Адаптация МПВП к первично-трипсинизированной культуре клеток ФЭК. Для первоначального выделения и первичной адаптации вируса мы использовали ТОК в течение 5 пассажей. Но наиболее важным и зачастую самым трудоемким является адаптация вируса к первично-трипсинизированным или перевиваемым культурам клеток. Адаптацию изолята МПВП к первично-трипсинизированной культуре клеток ФЭК проводили путем последовательных пассажей, изучая инфекционную активность вируса на каждом пассажном уровне.

Результаты, представленные в табл.3, демонстрируют, что изолят МПВП подтипа В адаптировался к первично-трипсинизированной культуре ФЭК уже после 3 пассажей.

ЦПД характеризовалось формированием округлых полиокариоцитов, которые в дальнейшем увеличивались в размере и, сливаясь, образовывали конгломераты различного размера и формы, инфекционная активность вируса после 4 пассажа превышала 7,38 ± 0,14 1§ ТЦД50/см3.

Таблица 3 - Динамика адаптации изолята МПВП к первично-трипсинизированной культуре ФЭК (п=3)

№ пассажа ЦПД Время культивировання.ч Титр вируса, lg ТЦД50/СМ3 (T±m)'

1 + 120 3,17±0,14

2 ++ 120 3,25±0,43

3 +++ 96 5,42±0,38

4 ++++ 96 7,38±0,14

5 ++++ 96 7,42±0,14

6 I I I 1 72 7,57±0,24

7 1 1 1 1 48 7,92±0,08

Примечание + -поражение монослоя на 1/4; ++ - поражение монослоя на 2/4;

+++ - поражение монослоя на 3/4; ++++ - полное поражение монослоя. 1 - Даны средние величины титров и их стандартные ошибки (1д ТЦД^см1)

2.3.1.3 Подбор перевиваемой культуры клеток для репродукции

МПВП. Проведенные опыты по адаптации полевого изолята МПВП к первично-трипсинизированной культуре ФЭК демонстрируют, что данную линию клеток можно использовать в качестве системы культивирования для репродукции МПВП. Однако большая трудоемкость технологического процесса затрудняет использование линии клеток ФЭК для промышленного способа культивирования МПВП. Альтернативой этому может служить использование перевиваемых культур клеток. Чувствительность перевиваемых культур клеток Vero, BGM, LMH изучали, используя способ последовательных пассажей, определяя инфекционную активность вируса на каждом пассажном уровне. Результаты исследований представлены в табл. 4.

Полученные данные свидетельствуют, что наиболее чувствительными к заражению МПВП оказались клетки Vero. Результаты титрования МПВП штамма «MPV — 07ВТ» в перевиваемой культуре клеток Vero показывают, что в процессе адаптации инфекционная активность вируса постепенно увеличивалась и к 5 пассажному уровню достигла 7,42 ± 0,14 lg ТЦД50/см3. В

культурах клеток BGM, LMH количество клеток, подвергшихся ЦПД вируса в последующие сроки культивирования, не увеличивалось. При определении способности вируса накапливаться в вышеперечисленных культурах инфекционная активность была невысокой и находилась в пределах 4,17-5,50 lg ТЦД50/см3. Поэтому в качестве системы культивирования для МПВП была выбрана перевиваемая культура Vero.

Таблица 4 — Результаты культивирования изолята МПВП подтипа В

в различных перевиваемых культурах клеток (п=3)

Культура клеток Инфекционная активность МПВП соответственно пассажу, 1й ТЦД50/см3, (Т±ш)

1 2 3 4 5

Vero 3,17±0,29 3,29±0,33 3,58±0,14 7,25±0,25 7,42±0,14

BGM 3,13±0,18 3,50±0,28 3,25±0,25 4,50±0,25 5,50±0,14

LMII 3,00±0,50 3,31 ±0,26 3,33±0,14 3,67±0,14 4,17±0,29

2.3.2 Подбор оптимальных параметров культивирования. Для

подбора оптимальных параметров культивирования МПВП штамма «MPV - 07ВТ» были изучены стадии взаимодействия вируса с клетками Vero в зависимости от времени культивирования, множественности заражения, а также разного уровня рН поддерживающей среды. В результате изучения репродукции МПВП штамма «MPV — 07ВТ» в клетках Vero установлено, что деструктивные изменения проявляются в виде слияния клеток и образования симпластов (рис.3).

Деструктивные изменения усиливались со временем культивирования и были максимальными через 48 ч культивирования. Инфекционная активность вируса МПВП также повышалась и достигала максимума к 48 ч, титр вируса составлял 7,25 lg ТЦЕЬо/см3.

Далее устанавливали влияние множественности заражения на репродукцию МПВП в культуре клеток Vero. Проводили 4 пассажа, используя дозу заражения 1,0; 0,1 и 0,01 ТЦД50/кл. Культивирование вируса прекращали при полном лизисе клеток. Инфекционную активность вируса определяли методом титрования в культуре клеток Vero. По результатам проведенных

опытов наибольшее накопление МПВП отмечалось на всех этапах пассирования при множественности заражения вируса 0,1 ТЦЦ50/'кл.

щя

сЩЖ

к • •/■• .х-'«

ШтШВШ Ш

Примечания i - Интактная культура клеток (фазовый контраст, v 40);

2- Формирование симпластов (фазовый контраст, 48 ч);

3- Формирование симпластов (люминисцентная микроскопия, 48 ч).

Рисунок 3 — Изменения в культуре клеток Vero, обусловленные действием вируса

При культивировании вируса в перевиваемых линиях клеток важнейшим параметром является величина рН поддерживающей среды. Наиболее интенсивно МПВП размножался в культуре клеток Vero при величине рН 7,4 (табл. 5). Изменение показателя в более щелочную (до 8,0) или кислую (до 6,0) сторону вело к снижению уровня накопления вируса.

Таблица 5 - Влияние рН поддерживающей среды на репродукцию

МПВП в культуре клеток Vero

рН Титр вируса, Количество опытов

ТЦД50/СМ3

6,5 6,67±0,17 4

7,0 7,50±0,14 4

7,4 8,0±0,08 3

7,6 7,13±0,22 3

8,0 5,50±0,14 4

Для изучения способности штамма «MPV - 07ВТ» к масштабной репродукции в качестве кандидата в производственные штаммы, использовали систему роллерного культивирования в сосудах объемом 3000 см 3.

Первоначально была определена оптимальная посевная доза клеток Vero для получения вируссодержащего материала МПВП. В опытах использовали

концентрацию клеток от 80 до 270 тыс/см3. Результаты проведенных опытов суммированы в табл. 6.

Таблица 6 — Влияние концентрации клеток Vero на инфекционный титр МПВП (п=3)

Посевная концентрация клеток, тыс/см3 Возраст культуры, ч Время культивирования, ч Титр вируса, lg ТЦД50/СМ , (T±m)

80-100 72 72 5,50±0,14

150-180 72 48 7,93±0,08

240-270 72 48 6,67±0,17

Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что при репродукции в культуре клеток Vero вирус максимально накапливается при плотности клеток в монослое 150-180 тыс/см3. Увеличение (до 240-270 тыс/см3) или уменьшение (до 80-100 тыс/см3) концентрации клеток приводило к ослаблению репродукции МПВП.

В следующей серии опытов изучали влияние различного объема поддерживающей среды — 100, 200 и 300 см3. Сбор вируссодержащего сырья проводили после полного лизиса клеток и четко выраженного ЦПД вируса. Величину накопления вируса в зависимости от срока культивирования и объема поддерживающей среды определяли путем титрования в перевиваемой культуре клеток Vero. Результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7 — Инфекционный титр МПВП, в зависимости от срока культивирования и объема поддерживающей среды (п=3)

Объем среды, cmj Время культивирования, ч Развитие ЦПД Титр вируса, lgTIWVcM3

100 24 + 5,62±0,12

48 ++ 6,67±0,17

72 ++++ 7,08±0,08

200 24 ++ 5,62±0,12

48 ++ 6,17±0,08

72 ++++ 7,42±0,08

96 ++++ 6,62±0,12

300 24 ++ 7,42±0,17

48 ++++ 8,17±0,08

Примечание + -поражение монослоя на 1/4; ++ - поражение монослоя на 2/4;

+++ - поражение монослоя на 3/4; ++++ - полное поражение монослоя.

Из данных табл. 7 видно, что при культивировании МПВП в перевиваемой культуре клеток Vero существенное влияние на репродукцию

вируса оказывает как объем поддерживающей среды, так и время культивирования. Наибольший выход культурального вируссодержащего материала приходится на 48-72 ч культивирования в сосудах с объемом поддерживающей среды ПСС 300 см3.

2.3.3 Подбор культуры клеток для тнтрования МПВП. Для поиска альтернативных клеточных систем для культивирования и определения инфекционной активности МПВП в качестве кандидатов были выбраны перевиваемые культуры клеток почек обезьян Маге-145 и МА-104. Выбранные системы отличаются от других культур четкостью морфологии, однородностью эпителиоподобных клеток, отсутствием гранулярности, а также способностью сохранять целостность монослоя без значительных дегенеративных изменений до 10 суток. В табл. 8 представлены основные параметры культивирования МПВП в данных культурах клеток, позволяющие получать сопоставимые с основной тест-системой (культура клеток Vero) показатели титров МПВП.

Таблица 8 — Параметры культивирования МПВП в культурах клеток МА-104, Магс-145 и Vero

Параметры титрования Культура клеток

МА-104 Магс-145 Vero

Смена среды не проводили каждые 96 ч каждые 96 ч

Окончательный учет 5 сут 7 сут 7 сут

Титр инфекционной активности, Ir ТЦД5о/с.м3 7,17±0,14 7,25±0,25 7,31 ±0,14

Результаты, представленные в табл.8, демонстрируют, что величины инфекционной активности штамма «MPV — 07ВТ» при титровании в культурах клеток МА-104, Магс-145 и Vero формально различались, но статистического подтверждения не имели и составили: 7,17±0,14, 7,25±0,25 и 7,31±0,14 lg ТЦД50/см3, соответственно. Таким образом, культуры клеток Магс-145 и МА-104 являются альтернативой культуре клеток Vero при титровании МПВП.

2.3.4 Изучение антигенных свойств штамма «МРУ - 07ВТ». Для

изучения антигенных свойств штамма «МРУ - 07ВТ» был изготовлен экспериментальный образец вакцины.

2.3.4.1 Антигенная активность штамма «МРУ - 07ВТ» при введении цыплятам в разных дозах. Для определения оптимальной иммунизирующей дозы вакцины, обеспечивающей выработку напряженного иммунитета, цыплятам десятисуточного возраста вводили вакцину внутримышечно в дозе от 3,5 до 4,5 ^ ТЦД50/0,5см'. Уровень титра антител определяли методом ИФА через 7, 14, 21, 28 суток. Было установлено, что применение вакцины в дозах 2,5 — 4,5 ТЦД5О/0,5см3 вызывает формирование иммунного ответа у вакцинированной птицы к 21 суткам. Однако, при введении доз 2,5 и 3,0 ^ ТЦД50/0,5см3 уровень антител в сыворотках крови птиц находился ниже положительного значения, составляя 1:550, 1:595, соответственно (рис.4).

Сутки после вакцинации

-♦-2,5 3,0 -♦—3,5 -♦-4,0 —♦—4,5

Рисунок 4 — Динамика титров антител к МПВП у цыплят при введении разных доз вакцины на основе штамма «МРУ —07ВТ»

Таким образом, оптимальный иммунный ответ на введение образца экспериментальной вакцины на основе штамма «МРУ - 07ВТ» получили при вакцинации цыплят в дозе 3,5 ^ ТиД5о/0,5см3. Применение более высоких доз вакцины (4,0 и 4,5 ^ ТЦД5о/0,5см3) нецелесообразно, а более низкие дозы индуцировали выработку антител ниже положительного значения.

2.3.4.2 Антигенная активность штамма при введении разными методами. Для иммунизации использовали образец экспериментальной вакцины из штамма «МРУ — 07ВТ», который первой группе цыплят вводили интраназально, второй - перорально, третью группу иммунизировали внутримышечно, а четвертая группа цыплят оставалась интактной (контроль). В каждой группе было по 15 голов. Титры гуморальных антител в сыворотках крови птиц определяли через 7, 14, 21 и 28 суток после вакцинации.

Сутки после вакцинации Интраназально —♦—Перорально —♦—Внутримышечно • Контроль

Рисунок 5 - Динамика титров антител к МПВП у цыплят после вакцинации разными методами иммунизации

Как свидетельствуют данные, приведенные на рис. 5, интенсивность антителообразования при разных способах введения штамма «МРУ - 07ВТ» на ранних стадиях не отличалась. Так, к 7 суткам значения титров антител в реакции ИФА во всех опытных группах находились практически на одном уровне и составили 1:150, 1:145, 1:180.

В дальнейшем наблюдали более интенсивное антителообразование во всех опытных группах. Титры антител в группах цыплят, иммунизированных интраназально, перорально и внутримышечно, к 21 суткам превысили положительный уровень и составили 1:1400, 1:930, 1:2300, соответственно.

Из полученных данных видно, что все вышеперечисленные способы введения образца экспериментальной вакцины из штамма «MPV - 07ВТ» способствуют выработке антител, обеспечивающих выраженный иммунный ответ против МПВИ у цыплят.

2.3.4.3 Влияние кратности введения вакцины из штамма «MPV — 07ВТ» на напряженность и продолжительность иммунитета. Экспериментальную вакцину в дозе 3,5 ^ТЦД50/0,5см' вводили цыплятам десятисуточного возраста двух опытных групп внутримышечно, третью группу оставляли интактной (контроль). Сыворотку крови цыплят исследовали в реакции ИФА на 15, 30, 60, 90, 120, 150 и 180 сутки. Цыплят второй опытной группы через 60 суток иммунизировали повторно. Сыворотку крови от цыплят данной группы исследовали трехкратно с интервалом в 30 суток.

_Сутки после вакцинации_

■ Однократная вакцинации 1 Ревакцинация

Невакцинированнме

Рисунок 6 - Динамика антителообразования у цыплят после введения штамма «МРУ — 07ВТ»

Данные, представленные на рис. 6, свидетельствуют, что однократная иммунизация цыплят экспериментальной живой вакциной против МПВИ обеспечивает накопление и сохранение антител к МПВП у цыплят в течение 2 месяцев, после чего их уровень снижается до значений менее

диагностических. Повторная иммунизация вызывает экзальтацию иммунного ответа продолжительностью до 120 суток.

2.3.4.4 Депонирование штамма «MPV — 07ВТ». Процедура депонирования предусматривала определение следующих основных показателей: стерильность, контаминацию посторонними вирусами и микоплазмами, генетическую принадлежность и филогенетическое родство с имеющимися штаммами и изолятами МПВП, безвредность, стабильность при репродукции, антигенную активность штамма «MPV — 07ВТ».

Установлено, что штамм «MPV - 07ВТ» свободен от анаэробных, аэробных, мезофильных бактерий, грибов, не контаминирован чужеродными вирусами и М. gallicepticum и М. Synoviae.

С использованием методов молекулярно-биологического анализа штамм «MPV — 07ВТ» был идентифицирован как МПВП птиц подтипа В, при этом установлено отличие первичной структуры генов исследуемого штамма от опубликованных ранее последовательностей МПВП.

Штамм является стабильным при проведении репродукции в течение 35 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток Vero, т.е. штамм «MPV — 07ВТ» не снижает инфекционную активность.

Штамм «MPV — 07ВТ» безвреден для птицы и обладает определенной антигенной активностью.

На основании проведенных опытов было установлено, что штамм «MPV — 07ВТ» МПВП соответствует паспортным данным и требованиям, предъявляемым к производственным штаммам МПВП для изготовления вакцин и диагностических препаратов.

2.3.4.5 Сравнительная характеристика антигенной активности вакцин против 1У1ПВИ. Были проведены сравнительные испытания антигенной активности живой экспериментальной вакцины из штамма «MPV - 07ВТ», живой коммерческой вакцины из штамма «PV03-B №127ДЕП» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» и коммерческой вакцины фирмы Nobilis RTV 8544 из штамма «BUT 1 # 8544».

Все образцы вакцин вводили десятисуточным цыплятам парентерально в объеме 0,5 см3. Инфекционная активность вируса в испытуемых образцах была одинаковой и составила 3,5 ^ ТЦД50.

2000

1800

< 1600 в

а 1400 ° 1200 | 1000 | 800 а. 600 Н 400 200 0

—•— «МРУ-07ВТ» «РУ03В-№127ДЕП» —»—«ВИТ 1 #8544»

Рисунок 7-Динамика формирования иммунного ответа на введение вакцин отечественного и зарубежного производства

Как видно из данных рис. 7, все образцы вирусвакцин против МПВИ способствовали выработке гуморального ответа. Обе отечественные вакцины не уступали импортному аналогу по антигенной активности.

Таким образом, штамм «МРУ - 07ВТ» по совокупности изученных признаков может быть охарактеризован как кандидат в вакцинные штаммы МПВП.

3 Выводы

1. Впервые в РФ предложен и изучен новый штамм «МРУ - 07ВТ», который в результате молекулярно-генетического анализа был идентифицирован как МПВП подтипа В, а также установлено отличие первичной структуры генов исследуемого штамма от опубликованных ранее последовательностей МПВП.

Сутки после заражения

2. Штамм «MPV — 07ВТ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток Vero, а также установлена возможность использования культур Магс-145 и МА-104 в качестве альтернативных систем для культивирования и определения инфекционной активности МПВП.

3. Отработаны оптимальные параметры культивирования метапневмовируса штамм «MPV - 07ВТ» в перевиваемой культуре клеток Vero, обеспечивающие получение больших объемов вируссодержащего материала с инфекционной активностью не менее 7,5 lg ТЦД50/см3 с учетом концентрации клеток Vero - 150-180 тыс/см3, множественности заражения - 0,1 ТДД50/кл; рН среды — 7,4; времени культивирования — 48ч.

4. При изучении антигенных свойств образца вакцины на основе штамма «MPV - 07ВТ» установлено, что при однократной и двукратной иммунизации цыплят в дозе 3,5 lg ТЦЦ50/0,5см3 у птиц формируется выраженный гуморальный ответ продолжительностью не менее двух и четырех месяцев, соответственно.

5. При анализе антигенной активности экспериментальной вакцины против МПВИ на основе штамма «MPV - 07ВТ» в сравнении с существующими коммерческими вакцинами против МПВИ установлено, что экспериментальная вакцина не уступает коммерческим аналогам.

6. Штамм «MPV — 07ВТ» депонирован и заложен на хранение в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ ВНИИЗЖ. На штамм «MPV — 07ВТ» разработан и утвержден стандарт организации (СТО 00495527-0173-2012)», закрепляющий его использование для изготовления диагностических наборов и в качестве кандидата в вакцинные штаммы.

4 Практические предложения

1. Для практического использования предлагается производственный штамм «MPV — 07ВТ» МПВП, который после изучения иммунобиологических свойств был депонирован в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (справка о депонировании

ФГБУ «ВНИИЗЖ» №4 от 30 марта 2012). При детальном изучении иммуногенных свойств данного штамма установлена возможность его использования для крупномасштабного культивирования и изготовления вакцин против МПВИ.

2. Предложены, комиссионно проверены, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические рекомендации:

«Методические рекомендации по культивированию и титрованию метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Магс-145»;

«Методические рекомендации по титрованию метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Ма-104».

Методические указания могут быть использованы в научно-исследовательских учреждениях и на биопредприятиях, производящих диагностикумы и вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц.

5 Список литературы

1. Бессарабов Б.Ф., Лазуткина Е.А., Яковлев А.Г. Пневмовирусы птиц // III Международный ветеринарный конгр. по птицеводству. - М,- 2007.- С.78-84.

2. Виноходов В.О. Этюды диагностики и меры борьбы с парамиксовирусными инфекциями птиц // Ветеринария в птицеводстве.-2006.-№1(6). - С. 13-30.

3. Выявление метапневмовирусов птиц в Российской Федерации с помощью молекулярно-биологических методов / З.Б. Хлебовец [и др.] // 5-й Междунар. ветеринарн. конгр. по птицеводству. - М. - 2009. - С. 114-118.

4. Пневмовирусная инфекция птиц /И.А.Борисова [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных,- 2006. - Т.4.- С. 281 - 296.

5. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Н.В. Фомина. - М.: Колос, 1979. - С. 233-240, 409-415.

6. Avian pneumovirus and its survival in poultry litter / B. N. Velayudhan [et al.] // Avian Disease - 2003. - Vol. 47. - P. 764-768.

7. Avian pneumovirus infections of laying hens: experimental studies / J.K.A. Cook [et al.] // Avian Pathology. - 2000. - Vol.29.- P.545 - 556.

8. Avian pneumovirus update / D.A. Senne [et al.] // Proceeding Annu Meet Am Vet Med Assoc. -1997. - Vol. 134. - P. 190.

9. Cook, J.K.A. Attenuation of turkey rhinotracheitis virus by alternative passage in embryonated chicken eggs and tracheal organ cultures / J.K.A. Cook, M.M. Ellis // Avian Pathol. - 1990.-Vol. 19.-P. 181-185

10. Cook J.K.A. A live attenuated turkey rhinotracheitis virus vaccinel. Stability of the attenuated strain // Avian Pathology.-1989. - Vol.18.- P.511-512.

11. Eterradossi N. Discrepancies in turkey rhinotracheitis ELISA results using different antigens // Veterinary Record.- 1992. - Vol.31. - P.563-564.

12. Heckert R.A., Myers D. J. Absence of antibodies to avian pneumovirus in Canadian poultry // Veterinary Record. -1993. - Vol. 132,№7. - P. 172.

13. Khehra R.S., Jones R.C., Bradbury J.M. Dual infection of turkey poults with avian pneumovirus and Mycoplasma synoviae // Avian Pathology. -1999. - Vol. 28.-P. 401 -404.

14. Permissibility of different cell types for the growth of avian Metapneumovirus / A. Tiwary [et al.] // J. of Virological Methods. - 2006. -Vol.138.- P.80-84.

15. Senne D.A., Edson R.K., Comb B.M. Avian pneumovirus update // Proceedings of American Veterinary Medical Associations. 134th Annual Congress, Reno, 2000. - P.190.

6 Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Изучение инфекционной активности вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц / Н.И. Герасимова, JI.B. Малахова, Д.В. Роменская [и др] // Труды федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2011 - Т. 9. - С. 202 - 209.

2. Малахова JI.B., Роменская Д.В. Концентрирование метапневмовируса птиц различными способами // Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе: сб. статей 64-й междунар. науч.-практ. конф.: в 3 Т., Т. 2.: Архитектура и строительство. Ветеринарная медицина и зоотехния / под ред. И.А. Яцюка, Н.Ю. Парамоновой. - Кострома: КГСХА, 2013 -С. 179- 182.

3. Роменская Д.В., Манин Т.Б. Адаптация нового нзолята метапневмовируса птиц подтипа В к перевиваемой культуре клеток Vero // Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6. - С. 45 - 46.

4. Роменская Д.В., Манин Т.Б. Изучение чувствительности различных культур клеток к полевому пзоляту метапневмовируса птиц подтипа В // Ветеринария и кормление. - 2009. - № 6. — С. 42 - 44.

5. Роменская Д.В., Манин Т.Б., Манин Б.Л. Изучение цитоморфологических трансформаций клеточного монослоя Vero - V в зависимости от времени репродукции метапневмовируса птиц // Клеточные культуры. Информационный бюллетень. Вып. 28. / под ред. М.С. Богдановой. -СПб, 2012.-С. 50 - 55.

6. Роменская Д.В., Манин Т.Б., Манин Б.Л. Цитоморфологические трансформации клеточного монослоя Vero — V при репродукции метапневмовируса птиц подтипа В // Цитология — 2011 — Т. 53. - №9: Тезисы докладов и сообщений, представленных на школу конференцию для молодых ученых «клеточные технологии для регенеративной медицины» (Санкт-Петербург, 17-21 октября 2011г.) — С. 746 - 747.

Подписано в печать 08 мая 2013 г. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Роменская, Диана Витальевна, Владимир

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

На правах рукописи

04201357666

РОМЕНСКАЯ Диана Витальевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ ШТАММ «МРУ - 07ВТ»

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель — СТАРОВ Сергей Константинович,

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Владимир -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика метапневмовирусной инфекции птиц........................1 о

1.1.1 История изучения................................................................................................................................................11

1.1.2 Возбудитель..................................................................................................................................................................13

1.1.3 Эпизоотологические данные..........................................................................................................14

1.1.4 Клинические признаки................................................................................................................................17

1.1.5 Патогенез и патологоанатомические данные......................................................21

1.1.6 Иммунитет........................................................................................................................................................................24

1.2 Методы и средства диагностики метапневмовирусной инфекции

птиц........................................................................................................................................................................................................................25

1.2.1 Системы культивирования для диагностики........................................................26

1.2.2 Диагностика................................................................................................................................................................28

1.3 Меры профилактики и борьбы................................................................................................................................30

1.4 Критерии подбора штаммов для производства вакцин против МПВИ................................................................................................................................................................................................................35

1.5 Заключение по обзору литературы..................................................................................................................39

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы..........................................................................................................................................................41

2.1.1 Вирус..............................................................................................................................................................................................41

2.1.2 Вакцины....................................................................................................................................................................................41

2.1.3 Животные........................................................................................

2.1.4 Культуры клеток........................................................................................................................................................42

2.1.5 Питательные среды и вспомогательные материалы......................................42

2.1.6 Оборудование..................................................................................................................................................................43

2.1.7 Методы исследований......................................................................................................................................43

2.1.7.1Секвенирование................................................................................................................................43

2.1.7.2 Анализ нуклеотидных последовательностей................................43

2.1.7.3 Выделение метапневмовируса птиц в трахеальной органной культуре..............................................................................................................................................43

2.1.7.4 Культивирование метапневмовируса птиц......................................44

2.1.7.5 Определение инфекционной активности вируса....................45

2.1.7.6 Иммуноферментный анализ......................................................................................46

2.1.7.7 Определение стерильности..........................................................................................46

2.1.7.8 Лиофильное высушивание............................................................................................47

2.1.7.9 Статистическая обработка результатов исследований 47

2.2 Результаты собственных исследований............................................................................................48

2.2.1 Исследования по адаптации полевого изолята МПВП............................48

2.2.1.1 Молекулярно-генетические свойства изолята МПВП. 48

2.2.1.2 Изучение биологических свойств изолята МПВП в первично-трипсинизированной культуре клеток ФЭК........................51

2.2.1.3 Репродукция изолята МПВП в перевиваемых линиях клеток........................................................................................................................................................................................53

2.2.2 Подбор оптимальных параметров культивирования штамма «MPV - 07ВТ» в перевиваемой культуре клеток Vero................................................57

2.2.2.1 Влияние времени культивирования на уровень накопления вируса..............................................................................................................................................57

2.2.2.2 Влияние множественности заражения и числа пассажей на уровень накопления МПВП....................................................................62

2.2.2.3 Влияние величины рН поддерживающей среды на репродукцию вируса........................................................................................................................................64

2.2.2.4 Культивирование штамма вируса «MPV - 07ВТ» в роллерных сосудах..............................................................................................................................................64

2.2.3 Изучение антигенных свойств штамма «MPV - 07ВТ»......................72

2.2.3.1 Антигенная активность штамма «MPV - 07ВТ» при введении цыплятам в разной дозе........................................................................72

2.2.3.2 Антигенная активность штамма при введении разными методами..............................................................................................................................................75

2.2.3.3 Изучение продолжительности иммунитета у цыплят после введения штамма «MPV - 07ВТ»........................................................................77

2.2.3.4 Антигенная активность штамма «MPV - 07ВТ» при введении разновозрастной птице..............................................................................................79

2.2.3.5 Изучение антигенной активности штамма «MPV - 07ВТ» при разной кратности введения..............................................81

2.2.4 Основные параметры штамма «MPV - 07ВТ» и процедура

его депонирования..................................................................................................................................................................82

2.2.5 Сравнительная оценка антигенных свойств штаммов МПВП. 90

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................93

4 ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................................................................101

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ......................................................................................................102

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..............103

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................105

8 ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................................................................124

Справка о депонировании........................................................................................................................................................125

Стандарт организации на штамм «МРV - 07ВТ» МПВП..................................................131

Методические рекомендации по культивированию и титрованию

метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Marc-145..........133

Методические указания по титрованию метапневмовируса птиц в

перевиваемой культуре клеток МА-104........................................................................................................136

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования.

Метапневмовирусная инфекция птиц (МПВИ) является одной из актуальных проблем современного птицеводства. Экономический ущерб, причиняемый заболеванием, складывается из падежа птицы, снижения показателей яйценоскости, ухудшения конверсии корма и выбраковки птицы [20, 24, 39, 173]. Возбудитель МПВИ оказывает иммунодепрессивное действие, снижая общую резистентность птицы, и тем самым повышая ее чувствительность к другим болезням [7, 37].

Проведенные исследования показали, что ущерб от МПВИ связан не только с эпизоотологией возбудителя и нарушениями ветеринарно-санитарного режима, но и с несовершенством современных методов диагностики и профилактики болезни [35, 37, 119].

МПВИ была впервые зарегистрирована в Южной Африке в конце 1970-х гг. и за короткий период времени охватила ряд стран с развитой птицеводческой индустрией. Серологические и вирусологические исследования свидетельствуют о повсеместном распространении метапневмовирусной инфекции на территории России: наличие данного заболевания выявляли примерно в 20% исследованных птицеводческих хозяйств РФ [1,9].

На основании различий в аминокислотной последовательности генома вируса существующие штаммы метапневмовируса птиц (МГТВП) классифицированы на 4 подтипа: А, В, С, О. Многообразие подтипов возбудителя создает значительные сложности в диагностике и профилактике болезни [57, 80, 154]. Молекулярный генетический анализ показал, что на территории РФ в 92-95% выявляют полевые изоляты МПВП, принадлежащие к подтипу В, и только в 5-8% случаев - к подтипу А [9]. Имеется крайне мало информации о биологических свойствах возбудителя МПВИ различных подтипов, поэтому проведение работ по выделению и изучению основных иммунобиологических свойств полевых изолятов и, в частности, подтипа В, превалирующих на территории РФ, является актуальной задачей.

Средства специфической профилактики широко применяют для борьбы с данной инфекцией. Программа вакцинации против МПВИ требует наличия живых и инактивированных вакцин [60, 92]. В РФ используют живые вакцины только импортного производства и инактивированные препараты (импортного и отечественного изготовления). В связи с вышеизложенным, актуальность научно-исследовательской работы, направленной на поиск иммуногенных вакцинных штаммов для разработки отечественной живой вакцины, несомненна.

Таким образом, изучение иммунобиологических свойств штамма МПВП с целью определения возможности его использования в качестве вакцинного, является актуальной задачей.

Степень разработанности проблемы

Опубликовано значительное количество работ об успешном применении клеточных культур при изучении биологических свойств МПВП, при изготовлении диагностикумов и вакцин. В то же время, совершенствование вакцин продолжается путем подбора штаммов вируса - кандидатов в вакцинные при изучении полевых изолятов, полученных от птиц в случаях массовой заболеваемости.

Цель и задачи исследования

Главной целью исследований являлось изучение иммунобиологических свойств МПВП штамм «MPV - 07ВТ». Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить молекулярно-генетические свойства изолята МПВП;

- адаптировать штамм «MPV - 07ВТ» к системе культивирования;

- подобрать параметры культивирования штамма «MPV - 07ВТ» в

перевиваемой культуре клеток Vero;

- изучить антигенные свойства штамма «MPV - 07ВТ»;

- сравнить штамм «MPV — 07ВТ» с другими штаммами МПВП,

используемыми для изготовления вакцин против МПВИ;

- провести процедуру депонирования и разработать нормативную

документацию на штамм «MPV - 07ВТ».

Научная новизна результатов исследований

Впервые в РФ предложен новый штамм «MPV - 07ВТ» МПВП, адаптированный к первично-трипсинизированной и перевиваемым культурам клеток: ФЭК, Vero, Marc-145, МА-104. Изучены иммунобиологические свойства штамма «MPV - 07ВТ» и отработаны параметры его культивирования в первичной культуре клеток ФЭК, в перевиваемой культуре клеток Vero.

В ходе изучения иммунобиологических свойств штамма «MPV - 07ВТ» была установлена возможность использования его в качестве кандидата в вакцинные штаммы против МПВИ.

Теоретическая и практическая значимость исследования

По результатам проведенных исследований предложен производственный штамм «MPV - 07ВТ». Проведено депонирование (справка о депонировании № 4 от 30.03.12), разработан и утвержден «Стандарт организации на штамм «MPV - 07ВТ» МПВП (СТО 00495527-0173-2012)».

В рамках выполнения научно-исследовательских работ по теме диссертации разработаны, комиссионно проверены, одобрены и утверждены ученым советом ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методики:

— «Методические рекомендации по культивированию и титрованию метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Marc-145»;

- «Методические указания по титрованию метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток МА-104».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- биологические свойства штамма «MPV - 07ВТ»;

- подбор оптимальных условий культивирования штамма «MPV - 07ВТ»;

- антигенные свойства штамма «MPV - 07ВТ»;

- сравнение штамма «MPV - 07ВТ» с другими штаммами МПВП,

используемыми для изготовления вакцин против МПВИ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В диссертационной работе приведены результаты исследований по изучению иммунобиологических свойств МПВП штамм «MPV - 07ВТ». Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 06.02.02 - 1, 3, 4, 5, 9, 14.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Результаты проведенных исследований получены с использованием большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, подтверждающими их достоверность. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (г.Санкт-Петербург, 2011г.), Международных научно-практических конференциях молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (г.Владимир, 2010г. и 2012г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период 2009-2012 гг.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных по списку ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов, методов, собственных исследований, обсуждений, выводов и практических предложений, содержит 14 таблиц и 22 рисунков. Список использованной литературы включает 203 наименования, из них 25 отечественных и 178 зарубежных. В приложении представлены копии титульных листов документов, отражающих итоговые результаты научной работы и подтверждающих их достоверность.

Место выполнения работы

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2008-2012 гг. в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

Личный вклад автора

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.в.н. Л.В. Малаховой, Л.М. Обуховой и к.б.н. Б.Л. Маниным, З.Б. Никоновой, за что автор выражает им сердечную благодарность.

,t>

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общая характеристика метапневмовируснон инфекции птиц

МПВИ ранее именовалась ринотрахеитом индеек (Turkey Rhinotracheitis -TRT), в настоящее время чаще называется метапневмовирусной инфекцией птиц, вызываемой метапневмовирусом птиц (МПВП, AMPV - Avian Metapneumovirus).

МПВИ проявляется в виде двух респираторных синдромов: у индеек -ринотрахеит; у кур и цыплят - синдром опухшей или большой головы (swollen head syndrome - SHS) [ПО]. Болезнь сопровождается серозно-гнойными , ' воспалениями носовых ходов и синусов, хроническими энтеритами,

перитонитами, воспалениями яичников, затрудненным дыханием, кашлем и чиханием [24, 142, 145, 146, 165]. Вирусная инфекция часто осложняется вторичной бактериальной микрофлорой, что приводит к высокой заболеваемости. Смертность среди молодняка составляет 3-7%, достигая в осложненных случаях 65% [1, 3, 4, 5, 6, 114, 115]. У индеек кур-несушек МПВИ способна вызывать существенное снижение яйценоскости, достигающей 40% [37, 134, 178].

Инфекция, вызванная МПВП, увеличивает чувствительность к побочным заболеваниям [2, 94]. Предрасполагающими факторами, как и для других респираторных инфекций, являются плохой микроклимат, слабая вентиляция, сырость и т. д. В птичниках с удовлетворительным микроклиматом МПВИ птиц может проявляться в форме слабых конъюнктивитов или протекать бессимптомно [1,7, 149].

Для профилактики болезни разрабатывают программу, которая включает в себя сначала иммунизацию птиц живыми, а затем инактивированными вакцинами. На сегодняшний день, несмотря на большой ассортимент живых и инактивированных вакцин против МПВИ птиц, недостаточно изучены многие вопросы, связанные с применением вакцин против МПВИ птиц. Проведением мероприятий и улучшением микроклимата (зоогигиенические условия, воздухообмен и т.д.) удается снизить потери, особое внимание при этом обращают на повышение резистентности организма [89, 92]. Экономический

*

ущерб от данной болезни связан не только с падежом и выбраковкой цыплят-бройлеров, но и недополучением инкубационного яйца.

Актуальность проблемы заключается в том, что не полностью изучены некоторые аспекты эпизоотологических особенностей МПВИ, диагностики и эффективности специфической профилактики (4).

1.1.1 История изучения и спектр распространения

Первый случай МПВИ птиц в промышленных индейководческих хозяйствах был описан в Южной Африке исследователями Байусом и Дю При в конце 1970-х гг., где инфекция произвела опустошительный эффект. Зарегистрированную болезнь н�