Экспресс-метод диагностики метапневмовирусной инфекции птиц на основе иммуноферментного анализа

Лисенкова, Анастасия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Экспресс-метод диагностики метапневмовирусной инфекции птиц на основе иммуноферментного анализа
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Экспресс-метод диагностики метапневмовирусной инфекции птиц на основе иммуноферментного анализа"

На правах рукописи

ЛИСЕНКОВА АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург, 2013

005546216

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения «Всероссийский научно исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академи] сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Трефилов Борис Борисович, доктор

ветеринарных наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Калишин Николай Михайлович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», профессор кафедры организации ветеринарного дела

Шкуратова Ирина Алексеевна,

доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт», директор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГНУ «Сибирский научно-исследовательски!

институт птицеводства» Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «15 » ноября 2013 года в 13.00 часов н заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санк Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адрес 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5, тел./факс (812) 388-10-55.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Санк Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «"ТУ' » 2013 г., размещен на сайте ВА

Минобрнауки РФ и №рр: // spbgavm.ru. /

Ученый секретарь диссертационного совета

Белова Лариса Михайловна

1. Общая характеристика работы Актуальность темы исследования. Болезнь, вызываемая метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у индеек, так и у кур всех возрастов [1,3,9]. Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезный экономический ущерб из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и приводит к гибели, снижению мясной и яичной продуктивности взрослой птицы [6,7]. Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания.

Многообразие подтипов А, В, С, О возбудителя и вирулентных свойств метапневмовируса, также затрудняет правильную своевременную постановку диагноза и не позволяет дать оценку этиологической роли вируса в патогенезе и течении болезни [6].

Основными трудностями при выделении возбудителя является достаточно короткий период персистенции и ограниченный тропизм вируса в организме птицы [5,8].

Поскольку клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения при МПВИ птиц непатогномоничны, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам.

Степень разработанности темы. Большинство методов, позволяющих выявить вирус в организме птицы, основано на иммуноферментном анализе [2,10].

Среди большого числа модификаций ИФА наибольшее распространение получил «сэндвич» вариант ИФА и ОТ-ПЦР для экспресс диагностики МПВИ [2]. Учитывая широкое распространение в Российской Федерации метапневмовируса птиц подтипов А и В и масштабное производство биологических препаратов из данных подтипов, необходимо разработать чувствительный и специфический метод индикации антигена метапневмовируса в

патологическом материале и исходном сырье при изготовлении и контроле вакцин и диагностикума.

Цель и задачи. Целью настоящей работы явилась разработка тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах на основе «сэндвич» варианта ИФА.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- получить иммуноспецифические компоненты тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах;

- определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

- с помощью разработанного «сэндвич» варианта ИФА провести исследования содержания антигена метапневмовируса птиц в патологическом материале и в вируссодержащем сырье для изготовления вакцины;

- разработать методические положения по определению содержания антигена МПВ птиц в биологических материалах с помощью тест-системы на основе «сэндвич» варианта ИФА.

Научная новизна. Впервые в качестве экспресс диагностики МПВИ птиц разработан «сэндвич» вариант ИФА с использованием отечественных препаратов и реактивов. Выделены антиметапневмовирусные IgG (H+L) из гипериммунной сыворотки крови цыплят, получен конъюгат [анти-МПВ IgG(H+L), меченые пероксидазой хрена]. Определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции. Дана сравнительная оценка «сэндвич» варианта ИФА с методом титрации в клетках Vero. Изучены сроки выявления антигена метапневмовируса в клетках Vero, а также в органах и тканях у экспериментально зараженных цыплят. Показано, что данные ИФА имели

высокий коэффициент корреляции (г= 1,0) с результатами титрации вируса в клетках Vero.

С помощью тест-системы проведено исследование патологического материала из 2 птицеводческих хозяйств и выявлен антиген метапневмовируса птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанного «сэндвич» варианта ИФА при выявлении антигена метапневмовируса в биологическом сырье, предназначенном для изготовления вакцины. Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработан высокоэффективный экспресс-метод выявления и количественного определения антигена МПВ птиц в патологическом материале и сырье, предназначенном для производства вакцины на основе «сэндвич» варианта ИФА.

Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Методические положения по выявлению антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах «сэндвич» вариантом иммуноферментного анализа» от 10. 06. 2013 г.

Методология и методы исследования

Вирус: производственный вакцинный штамм VC-03 подтипа В метапневмовируса птиц, Nemovak Rhone Merilux (Франция).

Вирус поддерживали в клетках Vero и хранили при температуре минус 20°С

Инкубационные яйца, эмбрионы и цыплята: яйца СПФ кур, фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 200 штук; СПФ цыплята, инкубированные в ГНУ ВНИВИП, 50 голов.

Культуры клеток: перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки, клетки Vero ( институт гриппа АМН, Санкт-Петербург). Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: питательная среда Игла МЕМ или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор,

0,25% фирмы «US ВЮ»; версена раствор, 0,02%; Хенкса раствор. Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone»; альбумин бычий сывороточный, чистота > 95; 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер; 0,01М фосфатно-солевой буфер; 0,05 М фосфатно-цитратный буфер; натрия хлорид (NaCI), х.ч.; перекись водорода, ОАО «Татхимфармпрепараты»;

ортофенилендиамин (ОФД), фирмы Sigma; твин 20 (Р7949), фирмы Sigma. Титрование вируса по цитопатогенному действию (ЦГЩ) проводили на клетках Vero методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями. Величину титра вычисляли по методу Reed LJ. & Muench Н. и выражали в lg ТЦД5о в 1.0 см3 [4].

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии [4].

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП). Выделение иммуноглобулинов G (IgG). Исходным сырьем для получения специфических IgG служила иммунная сыворотка крови цыплят. Осаждение сывороточных иммуноглобулинов проводили 30% раствором сернокислого аммония, с последующей очисткой на колонке с Sephadex G-200. Иммуноферментные конъюгаты получали модифицированным методом периодатного окисления [11]. Очистку конъюгатов проводили методом гельфильтрационной хроматографии на колонке с Sephadex G-200, уравновешенной 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2 (+ 0,02 М NaCI). Использовали фракции со значениями RZ = 0,4—0,6. Активность конъюгата проверяли в прямом «сэндвич» варианте ИФА со специфическим иммуноглобулином.

«Сэндвич» вариант иммуноферментного анализа. Для сенсибилизации поверхности лунок планшет для ИФА использовали очищенные антиметапневмовирусные иммуноглобулины G в оптимальной концентрации, разведенные в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,7.

Иммобилизацию специфических IgG на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 16-18 часов при температуре 4-8°С. Несвязавшиеся с поверхностью полистирола специфические IgG отмывали трехкратно в объеме 0,2 см3 0,01М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,07,4. Все реакции на планшетах проводили в объеме 0,1 см3. Антигенсодержащий материал и конъюгат инкубировали в ФСБ рН 7,2+ 0,15 M NaCl +0,1% твин-20 + 0,2% бычий сывороточный альбумин в течение 2 часов при 37°С. Для отмывки планшет применяли буфер ФБРТ в объеме 0,2 см3. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин + 0,01% Н202 в 0,05 M фосфатно-цитратном буфере рН 4,9-5,0. Реакцию останавливали 0,05 см3 10% раствора H2S04 через 1520 мин после внесения субстрата и оптическую плотность измеряли на иммуноферментном анализаторе «Униплан» при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка данных. Все полученные результаты обработаны статистически. Использовали общепринятые методы вариационной статистики, применяя компьютерную программу Microsoft Excel. Положения, выносимые на защиту:

- тест-система, разработанная на основе «сэндвич» варианта ИФА для выявления и количественного определения антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах, включающая обоснования оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов и способ выражения концентрации антигена;

- результаты сравнительной оценки выявления антигена метапневмовируса птиц в клетках Vero в «сэндвич» варианте ИФА и методом титрации;

- результаты выявления антигена метапневмовируса в клетках Vero и в органах и тканях у экспериментально зараженных цыплят;

- данные эпизоотологического обследования птицехозяйств РФ.

Степень достоверности и апробация результатов.

Научные положения, выводы и практические рекомендации, сформулированные в диссертационной работе научно-обоснованы, достоверны и вытекают из результатов собственных исследований. Исследования проведены на большом фактическом материале с использованием современных вирусологических, биохимических и серологических методов исследований.

По результатам научных исследований опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, и 5 статей опубликованы в сборниках материалов конференций и конгрессов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (20112013гг.), на международных агропромышленных конгрессах (Санкт-Петербург, 2011,2013г.); XVII международной конференции ВНАП (Сергиев Посад, 2012 г.); XVIII Congress World Veterinary Poultry Associatio French branch (GF-AMVA) 19-23 august 2013, Nantes France.

Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, основная часть, заключение, список сокращений, список литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 5 таблицами, 11 рисунками и 6 формулами. Список литературы включает 238 источников, из которых 181 зарубежных.

2. Основное содержание работы 2.1. Получение специфических компонентов для ИФА

2.1.1. Получение контрольного антигена метапневмовируса птиц.

Метапневмовирус культивировали в клетках Vero в стационарных условиях при температуре ( 37,5 ± 0,5)° С в пробирках по 1,0 см3 или во флаконах PS "Orange Scientibic". Вакцинный штамм VC-03 метапневмовируса птиц имел максимальное накопление 6,75 ±0,1 lg ТЦЦ50/см3 в клетках Vero с посевной концентрацией 200 тыс.кл/см3 при дозе вируса 1,0 ТЦД5о/кл. и времени съема через 72 часа.

Инактивацию вируса проводили аминоэтилэтиленимном в конечной концентрации 0,1% при температуре 37 0 С в течение 24 часов.

Для получения концентрированного вируссодержащего материала был использован метод дифференциального центрифугирования. Вирус из предварительно осветленной кулыуральной жидкости осаждали при 75000 g в течение 1,5 часов. Осадок ресуспендировали в 5,0 см3 фосфатно-солевого буфера и очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и рН элюирующеш буфера и количества наносимого вирусного материала. Результаты исследований показали, что очистка концентрированного В СМ, используя МПС с диаметром пор 1000А, 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и осадка. Степень очистки вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Вирус разливали по 1,0 см3 во флаконы и хранили при температуре -20° С.

В дальнейшей работе его использовали в качестве контрольного антигена при разработке иммуноферментной тест-системы для обнаружения метапневмовируса птиц в биологических материалах.

2.1.2. Получение специфической сыворотки к МПВ птиц. Специфическую гипериммунную сыворотку крови к метапневмовирусу получали на клинически здоровых цыплятах 20-суточного возраста, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Оптимальным методом получения гипериммунной сыворотки крови кур явилось трехкратное введение птице очищенного метапневмовирусу по схеме: двукратное подкожное введение антигена в объеме 0,5 см3 с интервалом в 7 сут. Третья внутрибрюшинная иммунизация через 7 сут. в объеме 1,0 см3. Через 14 сут. после последней иммунизации цыплят тотально обескровливали. Специфическая сыворотка крови в РН имела титр 8,0 1о§2, а в ИФА - 1:5500. 2.1.3. Выделение специфических иммуноглобулинов. Выделение 1§0 из иммунной сыворотки крови проводили сульфатно-риваноловым методом. Фракцию, содержащую 1§С(Н+Ь), очищали с помощью гельхроматографии на

БерИаскх в-200 и идентифицировали иммуноэлектрофорезом. Содержание белка в полученном материале составило 10,5 мг/ см3 по Лоури. Выделенные 1§0(Н+Ь) в дальнейшем использовали для получения иммунопероксидазного конъюгата и сорбции на планшеты для ИФА.

2.1.4. Получение иммунопероксидазного конъюгата кур. Конъюгат получали модифицированным методом периодатного окисления (Иакапе, 1981). Очистку конъюгатов от несвязавшейся пероксидазы проводили на колонке с сефадексом О-200. Отбирали пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6, так как именно при этом коэффициенте достигается оптимальное соотношение фермента с ^С(Н+Ь) в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы.

Активность конъюгата проверяли в «сэндвич» варианте ИФА со специфическим иммуноглобулином О, который сорбировали в лунки полистиролового планшета в течение 2 часов при 37°С или 16-18 часов при 4-8°С в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5-9,7 с концентрацией 5,0 мкг/см3 и трижды отмывали 0,01М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20, рН 7,2±0,2 (ФБРТ), добавляя в каждую лунку не менее 0,2 см3. Затем вносили контрольный антиген МПВ в десятикратных разведениях, начиная с разведения 1:10 до 1:108, который инкубировали 60 минут при 37°С. Конъюгат вносили в разведениях близких к предварительно оттитрованным. За рабочее разведение конъюгата принимали концентрацию, при которой выявляли контрольный антиген МПВ в наибольшем разведении при минимальном фоне неспецифического окрашивания в лунках, не содержащих определенный антиген или содержащих гетерологичный антиген. В наших опытах рабочее разведение полученных конъюгатов варьировало от 1:1500 до 1:3000.

2.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц 2.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия

компонентов

2.2.1.1. Определение сенсибилизирующих доз метапневмовирусных антител.

Оптимизацию тест-системы на основе «сэндвич» варианта ИФА для обнаружения антигена метапневмовируса птиц в биологическом материале вели по иммуноспецифическим и неспецифическим компонентам. В ходе отработки условий получения активного твердофазного иммуносорбента оценивали влияние концентрации иммуноглобулинов О , температуры и значения рН реакционной среды и продолжительности сорбции. Выбор оптимальной концентрации специфических антител проводили в диапазоне от 0,5 мкг/см3 до 10 мкг/см3 при продолжительности сорбции в течение 16-18 часов при 4°С в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,7. Сенсибилизирующая активность антител была различной, и зависимое от концентрации антиметапневмовирусных антител связывание антигена происходило в пределах ^О от 1,0 до 5,0 мкг/см3 . При этом изолинии выходили на «плато», что свидетельствует о насыщении поверхности лунок белком. Дальнейшее увеличение концентрации антител (более 8,0 мкг/см3 на лунку) не приводило к возрастанию емкости твердофазного иммунособрента. При концентрации белка менее 0,5 мкг/см3 имело место значительное снижение величины экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. Кроме того, на последующих этапах ИФА это могло привести к повышению фонового сигнала вследствие неспецифической сорбции молекул конъюгата на свободных поверхностях полистирола.

2.2.1.2. Определение рН сорбирующего буфера. Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН сорбирующей буферной системы. По данным литературы известно, что для фиксации различных антител в основном используется карбонат-бикарбонатный буфер (рН 9,6). При выборе оптимального значения рН сорбирующей буферной системы исследовали: натрий-ацетатный буфер рН 4,2; фосфатный буфер рН 7,2-7,4; карбонат-бикарбонатный буфер рН 9,5-9,7 и 11,0. Было установлено, что интенсивность реакции в указанном диапазоне варьировала, достигая максимума при рН 9,5-9,7, при котором величина экстинкции превышала экстинкцию при нейтральных рН. Полученные данные свидетельствовали о том, что при рН 9,5-9,7 адсорбция

антител на поверхности полистирола была выше, чем при рН 7,2-7,4. При сдвигах рН в щелочную (11,0), так и в кислую (4,2) стороны, величины экстинкции снижались, по-видимому, за счет частичной денатурации белка и уменьшения специфической активности.

2.2.1.3. Определение времени и температуры сорбции антиметапневмовирусных антител. Влияние продолжительности инкубации и температуры на фиксацию специфических антител изучали с использованием оптимальной концентрации иммуноглобулинов в в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,7. Сенсибилизацию полистироловых планшет иммуноглобулинами в проводили при 4°, 20°, 37° и 56°С в течение 2 и 18 часов.

Изучение кинетики сорбции показало, что при температурах 4° и 20°С полное насыщение поверхности твердой фазы антиметапневмовирусными антителами происходило через 16-18 часов, тогда как при температуре 37°С время сорбции сокращалось до 2 часов. По-видимому, с увеличением температуры происходило увеличение коэффициента диффузии белка и время достижения равновесия уменьшалось. Следует отметить, что при температуре 56°С полное насыщение поверхности полистирола антителами также наступало через 2 часа, но при этом наблюдалось резкое снижение специфичности. Специфичность диагностической тест-системы определяли по отсутствию реакции с антигенотрицательной культуральной жидкостью. Исходя из полученных данных нами был сделан вывод о том, что наиболее оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет иммуноглобулинами в является инкубация при 4°С в условиях бытового холодильника в течение 16-18 часов.

2.2.1.4. Определение времени и температуры инкубации антигенсодержащего материала с адсорбированными антиметапневмовирусными антителами. Существенную роль на данном этапе ИФА играет установление константы равновесия между иммобилизированными на поверхности полистирола антителами и антигеном и на последующем этапе между образовавшимся иммунным комплексом (антитело-антиген) иммунопероксидазным конъюгатом. Определение оптимального режима

инкубации антигенсодержащего материала с адсорбированными на планшетах иммуноглобулинами G проводили при температурах 20° и 37°С в течение 60, 90 и 120 минут. В таком же режиме проводили и инкубацию конъюгата. Равновесие в системе наступало практически через 90 минут при температуре 20°С, при температуре 37°С аналогичная картина уже наблюдалась через 60 минут, величины экстинкции были на одном уровне. Увеличение экспозиции до 90 минут сопровождалось возрастанием величин экстинкции на 15-20%, а при экспозиции 120 мин величины экстинкции еще больше возрастали, но при этом отмечался рост «фонового» окрашивания. Предусматривая стабильность и воспроизводимость результатов ИФА, при постановке иммуноферментной реакции вируссодержащий материал инкубировали в термостате при 37°С в течение 90 минут, а иммунопероксидазный конъюгат в тех же условиях в течение 60 мин.

2.2.1.5. Определение специфичности иммуноферментного анализа. В

твердофазных иммуноферментных анализах специфичность определяется минимальным «фоновым» сигналом, обусловленным неспецифическими взаимодействиями примесных (на этапе инкубации исследуемых образцов) или избыточных компонентов (на этапе инкубации конъюгата). Для устранения неспецифических взаимодействий, используются промывочные буферные системы, включающие неионный детергент (твин-20) и иммунологически инертные белки (бычий сывороточный альбумин, казеин или желатины). Твин-20, как поверхностно активный реагент, препятствует неспецифической сорбции. Инертные белки, обладая большей по сравнению с иммуноглобулинами сорбционной способностью, блокируют свободные поверхности твердой фазы. В то же время предлагают этого избежать, и наряду с детергентом в промывочный раствор ввести хаотропные ионы типа С1 в высоких концентрациях. При выборе оптимального промывочного буфера, использовали: ФСБ рН 7,2 с 0Д5М NaCl и 0,05% твин-20; ФСБ рН 7,2 с 0,15М NaCl, 0,05% твин-20 и 50% сыворотки КРС; ФСБ рН 7,2 с 0,5М NaCl и 0,1% твин-20; ФСБ рН 7,2 с 0,15М NaCl и 50% сыворотки КРС; ФСБ рН 7,2 с 0Д5М NaCl , 0,1% твин-20 и 0,2% БСА. На

основании результатов сравнительной оценки в настоящей диагностической тест системе был использован фосфатно-солевой буфер, рН 7,2, содержащий 0,5 NaCl с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20, обеспечивающи специфичность иммуноферментного анализа.

Специфичность диагностической тест-системы определяли по отсутстви реакции с антигенотрицательной культуральной жидкостью и с гетерологичным антигенами - антигеном ИЛТ и ИБК.

2.2.2. Оценка чувствительности иммуноферментной тест-системы.

Для установления пороговой чувствительности ИФА определяли зависимост величины оптической плотности ОП492 в реакции ИФА от разведен: контрольного очищенного концентрированного вакцинного штамма VC-03 МП птиц, с концентрацией белка 60 мкг в 1,0 см3 по Лоури, при оптимально концентрации сорбированных метапневмовирусных антител. Сенсибилизаци поверхности лунок планшет иммуноглобулинами G проводили в 0,05 карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,7, в течение 18 часов при температур 4°С. Десятикратные разведения метапневмовирусного антигена начинали разведения 10"1 до 10"7. Результаты исследований показали, что достоверн регистрируемое различие в показаниях ОП492 наблюдалось при разведени антигена МПВ в 10"6. При исследовании антигенотрицагельных образцо суспензии клеток Vero (контрольная группа) имели место низкие значен] экстинкций в пределах 0,15—0,20 ед. ОП492. Для оценки воспроизводимост результатов ИФА проводили двукратную (через 4 часа) постановку реакции течение дня. Полученные данные показали воспроизводимые результаты. Таки образом, выбор условий определения метапневмовирусного антигена использованного в качестве контрольного ряда, выявил преимущество ег титрования в 10-кратных разведениях, начиная с разведения 1:10. Тако контрольный ряд серийных разведений служил эталоном для количественнь определений антигена метапневмовируса в вируссодержащем материале пр инструментальном учете результатов реакции.

2.2.3. Практическое использование разработанного «сэндвич» варианта ИФА 2.23.1. Сравнительные исследования по выявлению антигена метапневмовируса птиц в клетках Vero «сэндвич» вариантом ИФА и методом титрации. Для проведения исследований использовали вакцинный штамм VC-03 МПВ, культивируемый в клетках Vero. Концентрацию вирусного антигена определяли в ИФА в сравнении методом титрации. Исследовали вируссодержащую культуральную жидкость, используемую в качестве сырья для изготовления вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц. Определяли среднюю величину титра антигена в пробах сырья, полученных до и после сушки. Готовили 10 - кратные разведения каждой пробы вируссодержащего материала, начиная с разведения 10"1 до 10"7. Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что результаты выявления вирусного антигена МПВ птиц «сэндвич» вариантом ИФА коррелируют с данными определения биологической активности методом титрации.

Таблица 1

Выявление антигена метапневмовируса птиц «сэндвич» вариантом ИФА и

методом титрации в клетках Vero

Метод исследования Разведения вируссодержащего материала Результат

10"' ю-2 Ю-3 10"4 Ю-5 10"6 ю-7

6,5 lg

Титрация + + + + + + - ТЦД50 в см3

вируса

6,0 lg

ИФА + + + + + + ТЦД50 В см3

Таким образом, при сравнительном изучении содержания антигена МПВ птиц, полученного методом титрации и ИФА, установлено, что определение содержания антигена в вируссодержащем сырье для изготовления вакцины в ИФА

было оправданным. Данные имели высокий коэффициент корреляции (г= -1,0) результатами титрации в клетках Vero. Разработанный «сэндвич» вариант ИФ позволяет выявить антиген металневмовируса, и определить его концентрацию н различных стадиях производства вакцины.

2.23.2. Обнаружение антигена в клетках Vero и органах цыплят, заражении метапневмовирусом птиц. Для заражения клеток Vero и 2-суточных цыпля использовали вакцинный штамм VC-03 в дозе 1,0 ТЦД50/кл и 100 ТЦЦ5о/цыпленка соответственно. Вируссодержащим материалом i исследования в ИФА служили пробы из зараженных клеток Vero через 6, 12, 2 36, 48, 72 часов после инокуляции. Результаты, приведенные в таблице показывают, что антиген МПВ выявляли методом ИФА уже через 12 часов поел заражения клеток, в то время как цитопатогенное действие вируса наступало чере 36 - 48 часов. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) гено металневмовируса обнаруживали также через 12 часов. Полученные данны свидетельствуют о высокой чувствительности «сэндвич» варианта ИФА.

Таблица 2

Обнаружение антигена металневмовируса птиц в клетках Vero

Показатели

Метод Время исследования, час

исследования 6 12 24 36 48 72

ИФА _ + + + + +

Титрация вируса - - - + + +

ПЦР - + + + + +

Результаты клинического наблюдения за течением экспериментально инфекции при интраназальном заражении цыплят показали, что у подопытнь цыплят не было отмечено развитие клинических признаков болезни. Антиге

МПВ в органах и тканях у зараженных цыплят выявляли в «сэндвич» варианте ИФА. Наблюдение вели в течение 11 суток и ежедневно по два цыпленка обескровливали и использовали для отбора проб оральных смывов, различных органов и тканей (ткани носовых раковин, трахеи, хоан, легких). Результаты исследований, приведенные в таблице 3, показывают, что антиген метапневмовируса был выявлен в ИФА в оральных смывах со 2 по 8 сутки, а с 3 по 11 сут. антиген был выявлен в тканях носовых раковин, трахеи и хоан. В легочной ткани антиген отмечали лишь на 6 сут.

Таблица 3

Результаты выявления антигена МПВ в смывах и пробах тканей органов цыплят в ИФА

Сроки взятия Пробы для исследования

проб, Ораль- Носо-

сут. ный ные Хоаны Трахея Легкие

смыв рако-

вины

1 - - - - -

2 + - - - -

3 + + + + -

4 + + + + -

5 + + + + -

6 + + + + +

7 + + + + -

8 + + + + -

9 - + + + -

10 - + + + -

11 - + + + -

2.23.3. Обнаружение антигена метапневмовируса птиц в патологическом материале. Патологический материал (смывы хоан, инфраорбитальных синусов и трахеи) от индюшат 15-20 - суточного возраста (ООО ПФ «Индюшкино») и цыплят 15-20- суточного возраста (ООО Абик-Септа) исследовали на

обнаружение антигена МПВ методами ИФА и ПЦР. Результаты представлены I табл.4 и на рис. 1,2.

Таблица 4

Выявление антигена МПВ в патологическом материале индюшат и цыплят методами ИФА и ПЦР

Метод исследования Вид птицы Показатели

Пробы для исследования (смывы)

хоаны инфраорби- тальные синусы трахеи

ИФА индюш. + + +

цып л. + + +

ПЦР индюш. + + +

цыпл + + +

Рис. 1. Наличие фрагмента генома метапневмовируса в патологическом материале (ООО ПФ «Индюшкино») 1 - исследуемая проба; 2 — положительный контроль.

Рис.2. Наличие фрагмента генома метапневмовируса

в патологическом материале (ООО «Абик-Септа») 1,2,3- исследуемые пробы; 4- положительный контроль.

Данные, представленные в таблице 4 и на рисунках 1 и 2 показывают, что антиген МПВ в патологическом материале больных индюшат и цыплят был выявлен «сэндвич» вариантом ИФА и ПЦР. Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что разработанный «сэндвич» вариант ИФА является высокочувствительным методом выявления антигена метапневмовируса, и результаты ИФА коррелируют с данными других методов исследования (ПЦР, вирусологический).

Таким образом, комплекс проведенных исследовательских работ позволил разработать тест-систему на основе «сэндвич» варианта ИФА для выявления и количественного определения антигена МПВ птиц в биологических материалах, включающая обоснования оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов и способ выражения концентрации антигена.

Результаты практического применения иммуноферментной тест-системы свидетельствуют о том, что данный экспресс-метод является высокочувствительным и специфичным для выявления и количественного определения антигена МПВ птиц в патологическом материале и сырье, предназначенном для производства вакцин на основе «сэндвич» варианта ИФА.

3. Выводы

Разработана тест-система для выявления и количественного определения антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах на основе «сэндвич» варианта ИФА. Определены оптимальные концентрации компонентов

реакции, условия их взаимодействия и способ выражения концентраци антигена.

В качестве специфических компонентов тест-системы получены стандартны препараты: очищенный концентрированный антиген метапневмовируса птиц дл контрольного ряда; ^С(Н+Ь) чистых метапневмовирусных антител и гипериммунной сыворотки цыплят для получения активного твердофазног иммуносорбента; чистых метапневмовирусных антител и

гипериммунной сыворотки цыплят, меченых пероксидазой хрена.

Разработанный «сэндвич» вариант ИФА на основе высокоочищенных антите выявляет антиген метапневмовируса в разведениях до концентрации 60 пкг/см3.

Дана сравнительная оценка «сэндвич» варианта ИФА с полимеразной цепно реакцией и методом титрации. Установлена высокая корреляция результатов ИФ и определения инфекционного титра вируса. Корреляция с титром ТЦЦ составила 1,0.

Показана высокая чувствительность и специфичность «сэндвич» варианта ИФ при выявлении антигена метапневмовируса в патологическом материале и оценк качества биологического сырья, предназначенного для производства вакцины н различных этапах ее изготовления.

Установлена репликация и персистенция метапневмовируса птиц с помощь «сэндвич» варианта ИФА в эпителии верхних дыхательных путей экспериментально зараженных цыплят и среди поголовья в птицехозяйствах.

С помощью разработанной тест-системы антиген метапневмовируса пти подтипа В выявили в пробах из 2 птицефабрик РФ в сопровождении вирусовыделением и обнаружением генома вируса в ПЦР.

Практические предложения Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академике секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медици Россельхозакадемии «Методические положения по выявлению антиген метапневмовируса птиц в биологических материалах «сэндвич» варианте» иммуноферментного анализа» от 10. 06. 2013 г.

Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе биологических и ветеринарных институтов и на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов.

4. Список используемой литературы

1. Борисова И. А., Борисов А.В. Метапневмовирусная инфекция птиц //РацВетИнформ. - 2009. - № 12,- С. 9- 11.

2. Никонова, З.Б. Разработка и применение методов диагностики метапневмовирусной инфекции птиц: автореф. дис. ... канд. биол. наук // Владимир, 2012. - 25 с.

3. Ирза, В.Н., Борисов А.В., Дрыгин В.В., Старов С.К. Проблемы респираторных заболеваний в современном птицеводстве // 1-й Междунар. ветер, конгресс по птицеводству. - М., 2005. - С.14-22.

4. Троценко, Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии // М.: «Колос», 2000. - С.272.

5. Alkhalaf, A.N., Ward L.A., Dearth R.N. and Y.M. Saif. Pathogenicity, transmissibility, and tissue distribution of avian pneumovirus in turkey poults // Avian Dis. - 2002. - V.46. - P.650-659.

6. Cook, J.K.A. Avian rhinotracheitis // Revue Scientifique et Technique, Office International des Epizooties. - 2000. - L.19. - P.602-613.

7. Cook, J.K.A., Cavanagh D., Detection and differentiation of avian pneumoviruses (metapneumoviruses)//Avian Pathol.-2002-V.31 - P. 117-119.

8. Jirjis, F.E., Noll S.L., Halvorson D.A., Nagaraja K.V., Shaw D.P., Pathogenesis of avian pneumovirus infection in turkeys // Vet. Pathol. - 2002. - V.39. - P.300-310.

9. Jones, R.C. Respiratory viral diseases - lessons to be learned? // Int. Poultry Prod. -2004. - V.12. - P.ll-15.

10. Kardi, V., Szegletes E. Use of ELISA procedures for the detection of Derzsy's disease virus of geese and of antibodies produced against it // Avian Pathologie. - 1996. - № 25. - P.25-34.

11. Nakane, P.K., Farr A.G Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a briefreview//J. of Immunological Methods.- 1981.- №47.-P. 129-144.

5. Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Трефилов Б.Б., Бочкарев B.C., Лисенкова A.C. Репродукци метапиевмовируса птиц при различной температуре // Ветеринарная практика. СПб, 2012. - № 1(56). - С. 15-17.

2. Никитина Н.В., Трефилов Б.Б., Лисенкова A.C. Влияние физик химических факторов на чувствительность и специфичность иммуноферментно анализа // Ветеринарная практика. - СПб, 2012. - № 2 (57). - С. 36-39.

Статьи, опубликованные в сборниках материалов конференций:

3. Лисенкова, A.C. Метапневмовирусная инфекция птиц. Диагностика профилактика // Материалы Международного агропромышленного конгресса . СПб, 2011.-С. 21-22.

4. Самусева, Г.Н., Дмитриева М.Е., Лисенкова A.C., Занько М.А Диагностика ассоциированного течения метапневмовирусной инфекции парамиксовирусной инфекции 2-го серотипа// Материалы XVII международно конференции ВНАП. - Сергиев Посад, 2012. - С. 604-606.

5. Трефилов, Б.Б., Никитина Н.В., Лисенкова A.C. Получени антиметапневмовирусных IgG из сыворотки крови кур для «сэндвич» мето ИФА. // Материалы XVII международной конференции ВНАП. - Сергиев Поса 2012.-С. 618-619.

6. Никитина Н.В., Трефилов Б.Б., Лисенкова A.C. Применение «сэндви варианта ИФА при метапневмовирусной инфекции птиц // Перспективы развит агропромышленного комплекса России в условиях членства в ВТО: мате междунар. конгр. - СПб, 2013. - С. 226 .

7. Lisenkova, A., Samuseva G, Dmitrieva M. The associated course metapneumovirus and type 2 paramyxovirus infections in laying hens/ XVIII Congre' World Veterinary Poultry Associatio French branch (GF-AMVA) 19-23 august 201. Nantes France, 2013. - C. 417 .

Подписано в печать « 10» октября 2013 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 2044

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Лисенкова, Анастасия Сергеевна, Санкт-Петербург

Министерство сельского хозяйства РФ

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии)

На правах рукописи

ЛИСЕНКОВА АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА

ЭКСПРЕСС - МЕТОД ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

<Ч| ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

^ О кандидата ветеринарных наук

* * СМ

см

СМ

Санкт-Петербург 2013 г.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Трефилов Борис Борисович

Оглавление стр.

1. Введение........................................................................................4

2. Основная часть...............................................................................17

2.1. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии..................17

2.2. Метапневмовирусная инфекция птиц................................................27

2.2.1. Распространение и ущерб, причиняемый этой болезнью.....................27

2.2.2. Характеристика рода Ме1арпеитоуип8 семейства Рагатухоушёае.........29

2.2.3.Эпизоотологические данные метапневмовирусной инфекции птиц.........33

2.2.4. Клинические признаки и патологоанатомические изменения...............36

2.2.5. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц.............................38

2.2.6. Профилактика метапневмовирусной инфекции птиц..........................43

2.3. Собственные исследования..............................................................47

2.3.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа.............................................................................................47

2.3.1.1. Получение контрольного антигена метапневмовируса птиц............47

2.3.1.2. Получение специфической сыворотки к метапневмовирусу птиц......50

2.3.1.3.Выделение специфических иммуноглобулинов О^т).....................50

2.3.1.4. Получение иммунопероксидазного конъюгата кур...............................52

2.3.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц................................................................................................54

2.3.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов.......................................................................................54

2.3.2.1.1. Определение сенсибилизирующих доз метапневмовирусных антител.............................................................................................55

2.3.2.1.2. Определение рН сорбирующего буфера....................................56

2.3.2.1.3. Определение времени и температуры сорбции антиметапневмовирусных антител...........................................................58

2.3.2.1.4. Определение времени и температуры инкубации антигенсодержащего материала с адсорбированными антиметапневмовирусными антителами...........59

2.3.2.1.5. Определение специфичности иммуноферментного анализа...........61

2.3.2.2. Оценка чувствительности иммуноферментной тест-системы............63

2.3.3. Практическое использование разработанного «сэндвич» варианта ИФА....64

2.3.3.1. Сравнительные исследования выявления антигена метапневмовируса птиц в клетках Vero «сэндвич» вариантом ИФА и методом титрации...............64

2.3.3.2. Обнаружение антигена в клетках Vero и в органах цыплят, зараженных мтапневмовирусом птиц........................................................................65

2.3.3.3. Обнаружение антигена метапневмовируса птиц в патологическом

материале..........................................................................................67

3. Заключение....................................................................................70

3.1. Выводы....................................................................................70

3.2. Обсуждение результатов исследований............................................................78

3.3. Практические предложения............................................................79

Список сокращений.............................................................................80

Список литературы..............................................................................81

Приложения..........................................................................................103

1. Введение

Актуальность темы исследования. Болезнь, вызываемая метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у индеек, так и у кур всех возрастов [6,21,148]. Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезный экономический ущерб из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и приводит к гибели, снижению мясной и яичной продуктивности взрослой птицы [91, 92]. Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания.

Многообразие подтипов А, В, С, Б возбудителя и вирулентных свойств метапневмовируса, также затрудняет правильную своевременную постановку диагноза и не позволяет дать оценку этиологической роли вируса в патогенезе и течении болезни [91].

Основными трудностями при выделении возбудителя является достаточно короткий период персистенции и ограниченный тропизм вируса в организме птицы [61, 145].

Степень разработанности темы исследования. Большинство методов, позволяющих выявить вирус в организме птицы, основано на иммуноферментном анализе [33,154].

Среди большого числа модификаций ИФА наибольшее распространение получил «сэндвич» вариант ИФА и ОТ-ПЦР для экспресс диагностики МПВИ [33]. Учитывая широкое распространение в Российской Федерации метапневмовируса птиц подтипов А и В и масштабное производство

биологических препаратов из данных подтипов, необходимо разработать чувствительный и специфический метод индикации антигена метапневмовируса в патологическом материале и исходном сырье при изготовлении и контроле вакцин и диагностикума.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

экспериментально зараженных цыплят. Показано, что данные ИФА имели высокий коэффициент корреляции (г= 1,0) с результатами титрации вируса в клетках Vero.

На основании проведенных исследований разработан высокоэффективный экспресс-метод выявления и количественного определения антигена МПВ птиц в патологическом материале и сырье, предназначенном для производства вакцины на основе «сэндвич» варианта ИФА.

Методология и методы исследования.

Вирус. В работе использовали вакцинный штамм VC-03 подтипа В метапневмовируса птиц [198], Nemovak Rhone Merilux (Франция). Вирус поддерживали в клетках Vero и хранили при температуре минус 20°С.

Инкубационные яйца и цыплята:

- яйца СПФ кур, фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 200 штук;

- цыплята, инкубированные из СПФ яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в ГНУ ВНИВИП, 50 голов.

Культура клеток:

- перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки, клетки Vero ( институт гриппа АМН, Санкт-Петербург).

Материалы, используемые в иммунологических тестах:

- механические дозаторы с объемом от 0,5 до 1000 мкл и 1-8- канальные;

- полистироловые планшеты производства Nunc, США;

- пероксидаза хрена производства "Serva", ФРГ, RZ = 3,0;

- иммуноферментный анализатор производства «Униплан». Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы:

- питательная среда Игла MEM или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином;

- питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином;

- сыворотка крови плодов коровы;

- трипсина раствор, 0,25% фирмы «US BIO»;

- версена раствор, 0,02%;

- Хенкса раствор;

Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производства ООО «Биолот»;

- альбумин бычий сывороточный, чистота > 95%, производства ООО «Биолот»;

- калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 4198, ОАО «Реактив»;

- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, ч.д.а., ГОСТ 2493,ОАО «Реактив»;

- карбонат-бикарбонатный буфер производства ООО «Биолот»;

- фосфатно-солевой буфер производства ООО «Биолот»;

- фосфатно-цитратный буфер производства ООО «Биолот»;

- натрия хлорид (NaCI), х.ч., ГОСТ 4233, ОАО «Реактив»;

- перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»;

- ортофенилендиамин (ОФД) производства фирмы Sigma;

- твин 20 (Р7949) производства фирмы Sigma;

Клетки Vero пересевали с интервалом 5-6 сут. бесцентрифужным методом. Для снятия монослоя клеток со стекла использовали растворы трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:9. Монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса, затем в матрас добавляли смесь растворов трипсина и версена,

подогретую до 37 С и инкубировали в термостате в течение 5-10 мин до начала отделения клеток от стекла.

Раствор версена с трипсином сливали, а клетки ресуспензировали в определенном объеме питательной среды. Клетки подсчитывали в камере Горяева, затем разводили питательной ростовой средой Игла, содержащей до 10% фетальной сыворотки и антибиотиков, до концентрации 150-250 тыс. кл./см3. Клеточную суспензию разливали в пробирки по 1,0 см3 и во флаконы PS "Orange Scientibic", культивировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)° С.

Титрование вируса по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в клетках Vero методом десятикратных разведений и с соответствующими

контролями. Из культуральной вируссодержащей жидкости готовили 10-кратные

1 8

разведения 10-10° на поддерживающей среде без добавления сыворотки. Предварительно монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса. Каждым разведением в объеме 1,0 см3 вируса заражали 4 пробирки с культурой клеток. Зараженные и контрольные культуры инкубировали при температуре Ежедневно в течение 5-7 суток проводили учет ЦПД, выражая его по 4-крестовой системе. Специфичность ЦПД подтверждали в реакции нейтрализации со специфической сывороткой.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench Н. и выражали в lg ТЦД5о в 1,0 см3 (тканевая цитопатогенная доза)[10].

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии [54].

РН ставили в культуре клеток со специфической сывороткой, полученной от иммунизированной птицы а-варианте (с постоянной дозой гомологичной сыворотки и десятикратным разведением вируса).

Сыворотку перед началом исследований освобождали от термолабильных неспецифических ингибиторов подогреванием в водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут. Смеси равных объемов вируса и сыворотки в соответствующих разведениях выдерживали при комнатной температуре в течение 60 минут, а затем в объеме 1,0 см3 вносили в 4 пробирочные культуры.

Титр вируса и конечную точку нейтрализации вычисляли по Reed L.J. & Muench Н. на основании ЦПД в культуре клеток через 5-6 суток инкубации после инокуляции клеток.

Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП) [42]. Макропористое стекло размером пор 1000А активировали концентрированной соляной кислотой в соотношении 1:2 и выдерживали при температуре 20-22°С 1-2 суток, периодически встряхивая. После этого кислоту сливали и МПС однократно промывали дистиллированной водой, затем его заливали равным объемом смеси Комаровского (6% раствор Н2О2 в 6 М растворе НС1 в соотношении 1:1). Смесь Комаровского с МПС нагревали на водяной бане при 56°С в течение 2 ч в вытяжном шкафу. Обработанное МПС промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и под вакуумом удаляли воздух из пор. Затем заливали двумя объемами 4% раствора ПВП в дистиллированной воде и перемешивали на качалке в течение 4-5 ч. Раствор сливали, а МПС отмывали от несвязанного ПВП дистиллированной водой до исчезновения желтой окраски. Колонку размером 80><2см заполняли модифицированным МПС и уравновешивали 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР), рН 7,3-7,5. После стабилизации колонки над поверхностью МПС оставляли слой буфера в 1 мм. После этого на МПС наслаивали вируссодержащую материал. Элюцию вируса осуществляли ФБР, рН 7,3-7,5 с использованием перистальтического насоса, прибора РЭППС-1М (регистратор

измерений электропроводимости и процента поглощения света элюатом при жидкостной хроматографии при длине волны 280 нм) со скоростью 0,7-1,0 см3/мин и собирали его отдельной фракцией. Выход очищенного вируса регистрировался на ленте самописца в своеобразном пике, затем вторым пиком выделялись примесные белки.

Выделение иммуноглобулинов G (IgG). Исходным сырьем для получения специфических IgG служила иммунная сыворотка крови клинически здоровых цыплят. Осаждение сывороточных иммуноглобулинов проводили 30% раствором сернокислого аммония, который добавляли по каплям при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Затем выдерживали 2 часа и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин. Осадок иммуноглобулинов разводили 0,01М фосфатным буферным раствором рН 7,2-7,4 , в объеме в 5 раз меньше исходного объема сыворотки, и диализировали раствор иммуноглобулинов против трех смен 0,01М фосфатного буфера, рН 7,2-7,4. Для выделения IgG применяли метод гельфильтрации на колонке с сефадексом G-200. В качестве элюата использовали 0,01М фосфатный буфер рН 7,2-7,4, скорость элюции была 28-30 см3/ч на 1см2 сечения колонки. Фракции собирали по 5см3, используя для этой цели автоматический коллектор фракций. Оптическую плотность элюата измеряли на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

Концентрацию иммуноглобулинов G определяли по формуле:

ОД 280 X р

1.3

где (1)

ОД280 - показатель оптической плотности раствора при длине волны 280 нм;

Р - показатель разведения раствора;

1.3 - коэффициент для пересчета белка.

Фракции, содержащие белок, объединяли, концентрировали путем диализа

против 0,01М фосфатного буфера рН 7,2±0,2 в течение 24 часов при температуре

4-6°С.

Получение иммунопероксидазного конъюгата проводили методом, основанным на образовании ковалентной аминосвязи между аминогруппами иммуноглобулина О и альдегидными группами пероксидазы, и ее последующем восстановлением до С-1М-связи с помощью боргидрида натрия.

Пероксидазу хрена использовали без дополнительной очистки. Для

приготовления конъюгата 4 мг пероксидазы растворяли в 1,0 см дистиллированной воды, к раствору фермента добавляли 0,2 см3 свежеприготовленного ОДМ периодата натрия (ТЧаЮ^ и выдерживали в темной стеклянной посуде 20 минут при комнатной температуре, осторожно помешивая (следили, чтобы не образовалась пена, что ведет к денатурации фермента). Затем раствор диализовали против 0,001М ацетатного буфера рН 4,4 при 4°С в течение 16-18 часов.

После диализа раствор защелачивали до рН 9,6 добавлением 0,02 см3 0,2 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,6. К этому раствору немедленно добавляли 8 мг специфических антител по белку, п

Информация о работе

Лисенкова, Анастасия Сергеевна
кандидата ветеринарных наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Экспресс-метод диагностики метапневмовирусной инфекции птиц на основе иммуноферментного анализа - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы