Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и апробация тест-систем на основе гелевых биочипов для изучения генетического полиморфизма человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка и апробация тест-систем на основе гелевых биочипов для изучения генетического полиморфизма человека"

ГЛОТОВ Андрей Сергеевич

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ГЕЛЕВЫХ БИОЧИПОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЧЕЛОВЕКА

специальность: 03.00.15 - генетика

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ Научно-исследоватетьский институт акушерства и гинекологии им. Д.О Отта РАМН и Лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В А Энгельгардта РАН

Научные руководители

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Татьяна Эдуардовна Иващенко

клпидат биологических чаук, старший научный сотрудник Татьяна Васильевна Наседкина

Официальные оппоненты

доктор биолог ических наук, профессор Виктория Николаевна Горбунова ,джтор биологических наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков

Ветлиее учреждение Институ! циюлогии российской академии наук

Зашита состоится -/,-■• ^¡¿{/Н' '-1 2006 г в часов на заседании Диссертационно!о совета

I

Л 212 232 12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора био.кмичсских наук при Санкт-Петсрбургском Государственном универешеге по адресу 199034 Санкт-Петербург, Университетская паб 7/9. С'ПбГУ. биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С шссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственною университета

г]

Автореферат разослан '•<5 2005 т

| 1

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л А Мамон

¿CO^f

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сегодня современное развитие науки невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить анализ множества генетических изменений одновременно. Это связано с тем, что лавинообразное нарастание интереса к изучению генетической предрасположенности требует разработки новых подходов к идентификации и анализу ДНК-полиморфизма. С другой сторонык известно, в развитие патологии сердечно-сосудистой системы вовлечены полиморфные варианты большого числа различных генов. В связи с тем, что данная патология является самой распространенной причиной смертности во всем мире, изучение сс патогенеза имеет большое значение не только для фундаментальной медицинской науки, но и для решения задач профилактической (предиктивной) медицины. Уже на сегодняшний день для многих социально-значимых заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз и другие, показана ассоциация определенных полиморфных вариантов некоторых генов с данными болезнями (Нефедова и Шварц, ! 998, Баранов и др., 2000: Babunova et а!, 2003) Очевидно, что для более точной оценки роли генетического полиморфизма в этиологии заболевания необходимо использование системного подхода, заключающегося в выборе и анализе генов, продукты которых находятся в биохимически последовательно связанных реакциях В связи с чем, особый интерес представляет изучение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, принимающих участие в регулировании артериального давления и обмене электролитов Показано, что генетический полиморфизм данны\ систем существенно меняет их активность, что и является зачастую причиной сердечно-сосудистой патологии (Пузырев, 2003, Chistiakov et al, 2000: Naber et al, 2004a,b). С другой стороны большое значение имеет анализ генетического полиморфизма у больных в детском возрасте, где значительно сильнее проявляются внутренние, генетические факторы, на которые во взрослом состоянии накладывающиеся факторы внешней среды (Obraztsova et al 1998). Работа бьпа поддержана грантами Мэрии Санкт-Петербурга (M0I-2 6Д-735, М02-2.6Д-576, М05-2.6К-433), Минобразования России (АОЗ-2.12-16), Федерального агентства по образованию России (А04-2.12-225), CRDF (ST-012-0). МНТЦ (3086/4), Государственного контракта Федерального агентства по науке и инновациям (1-04). Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка тест-систем на основе гелевых биочипов для анализа генетического полиморфизма человека и их использование при изучении генетической предрасположенности к артериальной гипертензии у детей Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

1. Разработать алгоритм создания биочип-тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека на примере детекции мутаций в генах CYP1A1 (4887С>А, 4889A>G и 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A и 2637delA), GSTMI (делеция), GSTTI (делеция), NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G), MTHFR (677С>Т), CYP2C9 (430С>Т и 1075С>Т) и CYP2C19 (681G>A) ("фармакогенетический биочип").

2 Разработать биочип для анализа генетического полиморфизма генов REN (19-83G>A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C), MTHFR (677C>T), ADRB2 (48A>G и 8IC>G) ("кардиочип"). 3. Проанализировать полиморфные варианты генов REN (I9-83G>A), AGT (М235Т), ACE (I/D), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C и I/D) у детей, больных артериальной гипертензией, и в популяционном контроле.

4. Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем в подгруппах больных артериальной гипертензией с различными клиническими проявлениями.

5. Провести комплексную оценку влияния полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем на развитие артериальной гипертензии у детей

Научная новизна работы. В данной работе предложен алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма человека Впервые создан «фармакогенетический биочип» для идентификации полиморфных вариантов генов CYP1A1 (48870А, 4889A>G и 6235Т>С), CYP2D6 (!934G>A и 2637delA) GSTM1 (делеция), CSTT1 (делеция). NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G), MTHFR (677С>Т), CYP2C9 (430С>Т и 10750Т) и CYP2CI9 (681G>A). На базе разработанного алгоритма впервые создан «кардиочип» для идентификации полиморфных вариантов генов REN, AGT, AGTR1, AGTR2, MTHFR BKR2, ABRB2. Впервые проведено комплексное исследование полиморфных вариантов 6-ти генов ренин ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем REN (I9-83G>A), ЛОГ (М235Т), ACE (I/D), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C и I/D) у детей, больных артериальной гипертензией. и в популяционном контроле. Выявлено, что аллели генов BKR2 (Г-аллель) и AGTR2 (/(-аллель) ассоциированы с развитием артериальной гипертензии у мальчиков. Показано, что наличие вариантов генов REN (/f-аллель и А/А генотип) ЛОТ (Т-аллель) и АСЕ (D-алпепь) ассоциировано с формированием стабильной формы артериальной гипертензии у детей Обнаружено, что показатели диастолического АД значимо выше у пациентов с TT генотипом гена AGT по сравнению с М/М и'или М/Т генотипами Впервые применен метод комплексной оценки полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, который подтвердил роль данных каскадов в развитии артериальной гипертензии (АГ) и формировании стабильного артериального давления (АД). Практическая значимость. Предложенный алгоритм создания биочипов может быть применен при разработке широкого спектра диагностических и исследовательских тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека Созданные «фармакогенетический биочип» и «кардиочип» могут быть использованы при скрининговыч исследованиях генетической предрасположенности к различным мультифакториальным заболеваниям и для оценки чувствительности к большой группе лекарственных препаратов. Использование технологии биочипов позволит снизить трудоемкость и себестоимость анализа (в 2-3 раза), а также обеспечить высокий уровень современного исследования Анализ генетического полиморфизма ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска развития стабильной АГ у детей.

Основные положения, выносимые на защиту: Разработан алгоритм создания биочип-тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека. Созданы биочипы для анализа генетического полиморфизма: "фармакогенетический биочип" и "кардиочип". Показано, что метод гибридизации на «кардиочипе» обладает высокой специфичностью (99%) и может быть предложен для использования при массовом скрининге образцов ДНК пациентов для изучения генетической предрасположенности к заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Показано, что аллели генов BKR2 (С-аллель) и AGTR2 (/(-аллель) ассоциированы с развитием артериальной гипертензии у мальчиков, а наличие вариантов генов REN (/(-аллель и А/А генотип), AGT (Т-аллель) и АСЕ (D-аллель) - с формированием стабильной формы артериальной гипертензии у детей вне

зависимости от пола Предложен оригинальный метод комплексной оценки влияния полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем на развитие артериальной гипертензии у детей. Апробяпия работы. Результаты работы были представлены на Европейских конгрессах по генетике человека в 2003г. (Бирмингем, Великобритания), в 2004г (Мюнхен, Германия), в 2005г (Прага, Чехия), 3-ей Ежегодной Встречи Международного Общества Фармакогеномики (Санторини, Греция, 2004), Научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002), 3-ей Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва. 2004), Э-ем съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы" (Москва. 2004).

Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории иренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им Д О.Огга РАМН. Лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В А.Энгельгардта РАН, Кафедры генетики и селекции СПбГУ

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 31 работа.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 117 источников. Работа изложена на 142 странице машинописного текста и содержит 35 рисунков и 11 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика исследуемых групп. Было обследовано 179 детей в возрасте от 9 до 17 лет с артериальной гипертензией (АГ) Всем детям было проведено суточное мониторирование артериального давления (СМАД) с целью подтверждения наличия АГ и уточнения ее выраженности Деление больных детей на подгруппы (без АГ (группа 1), лабильная АГ (группа 2), стабильная АГ (группа 3) проводили в соответствии с методическими рекомендациями по диагностике, лечению и профилактике артериальной гипертензии у детей и подростков (Образцова и др 2005: Flynn. 2004) В качестве группы сравнения выбрали группу (популяционную выборкл). которую составили 158 школьников из Санкт-Петербурга в возрасте от 7 до 17 лет

Синтез олигоиуклеотидов и изготовление микрочипов. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer ("Applied Biosystems", США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Микроматрица была приготовлена путем фотополимеризации пористого полиакриламидного геля. Объем каждой капли был равен примерно 0,2 нл. Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия. Выделение ДНК проводили в соответствии с методикой приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989), с некоторыми модификациями.

Проведение полимеразиой цепной реакции. Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов выбирали из интернет-базы "Nucleotide" ("NCB1", США). Праймеры, необходимые для проведения ПЦР этих фрагментов, подбирали с использованием программы "Oligo б" (США). Специфичность праймеров проверяли в программе "Nucleotide-nucleotide BLAST' ("NCBI", США).

Методом полимеразной цепной реакции исследовали полиморфизм двух генов: АСЕ d/D полиморфизм) и BKR2 (I/D полиморфизм).

При проведении ПЦР фра1 ментов ДНК для анализа методом гибридизации на олшон>клеотидном биочиме /ены системы биотрансформации и метаболизма лекарств («фармакогенетического биочипа») объединяли в ipyiinbi. соответствуйте блокам олигонуклестидных проб на биочипе Продукт первого этапа ПЦР (1 мкл) использовали в качестве матрицы на втором этапе ГТЦР Аналогичным образом амплифимировали фра> менты генов сердечно-сосудистой системы («кардиочипа»).

Анализ ПЦР продуктов методом ПААГ. Продукты амплификации фра/ ментов генов АСЕ (I/D полиморфи !м) и BKR2 (i/D полиморфизм) разделяли в 6% ПААГ

Гибридизация меченого продукта на микричиле. Гибридизацию на микрочипах проводили с использованием ф |уоресцентно меченых образцов, полученных на второй стадии мультиплексной ПЦР.

Регистрация изображения и его обработка. Флуоресцентный сигнал о; ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов «Чипдетектор-01-«БЧ-ИМБ»

Статистическая обработка данных. При сравнении результатов использовали точный критерий Фишера ГЖивотовсний. 1991). пакеты программ "GraphPad InStat" и STATIST ICA 5 5 (США)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание "фармако!ене! ического биочипа". Выбор генов и полиморфных вариантов. На основе анализа многочисленных ланиых зарубежной и отечественной литературы, были выбраны аллельные варианты С'1С1\Ю[1И\ генов, представляющих наибольший интерес ш определения индивидуальной чувствительности к фармацевтическим препаратам и изучения генетической предрасположенности к некоторым му льлифакториальныч заболеваниям в том числе и онкологическим CYP141 (48870>А, 4889A>G и 623лТ>С) CYP2D6 ( 1934G>A и 2637del<\) GSTMI (деления). G S'777 (лелеция) Х4Т2 (481Т>С, 590 V>G и 8'57Д>П) WHFR (677С>Т) С YP2C9 (410С>Т и 1075С>Т) и CYP2C19 (681 G>A) (Akhmedova et al 1996 Баранов и dp 2000 2003 Krajmovic et al 2002. Ляхович и Вавилин. 2001) ^ти гены кодируют белки участвующие в метаболизме ксенобиотиков Для изучения нами выбраны функционально значимые аллели встречающиеся с наибольшей частотой (Баранов ибр 2000. 2001. Ляхович и Вавилин. 2003)

Конструирование биочипа. Блочный подход Схема биочипа представлена на рис 1 Олигон\клеотитные зонды обозначены цифрами, каждой из них соответствует определенная аллель или гаплотип конкретного гена

2Ч <Vi en. мк ii " i'i'i It Алчся)7'.'(/(/'Л

Рис I Схема "фарчакотенетического биочипа" Ячейки серою цвела соответствуют олигонуклеотидам комплементарным

последовательностям "дикого типа*' ячейки черного цвета - последовательностям "мутантного типа" Ячейки светло-серого цвета соответствуют олигонуклеотидам.

комплементарным последовательностям гена СУР ¡А! с одной мутацией, а белого цвета - с двумя мутациями Каждый олигонуклеолил на биочипе продублирован

Олигонуклеотидные пробы в составе биочипа сгруппированы в блоки Блок №1 предназначен для выявления полиморфных вариантов генов С'УР!А1 и СУР206 (рис 2) На рис 2А представлены схема и принцип

расположения олигонуклеотидных проб блока №! на микрочипе. Определение генотипа в исследуемом образце ДНК проводили следующим образом При выявлении флуоресцентного сигнала во всех ячейках двух верхних строк (кроме ячеек второго столбца) считали, что образец содержит только аллели дикого типа генов CYP1A1 и CYP2D6. Аллели *2А гена CYP1AI соответствовал сигнал с двух нижних ячеек третьего столбца, аллели *4 -сигнал с двух верхних ячеек второго столбца, а аллель *2В определяли при наличии сигнала в двух нижних ячейках первого и третьего столбцов Аллели *4 и *3 гена CYP2D6 определяли по появлению сигнала в двух нижних ячейках четвертого и пятого столбцов соответственно На рис 25 показан пример гибридизационной картины для образца, гетерозиготного по мутации 6235Т>С в гене CYP1A1 (*2Ai*l) и гомозиготного по аллели дикого типа гена CYP2D6 (* 1 /* 1) Значения сигналов в ячейках биочипа, содержащих С в позиции 4887 и А в позиции 4889 (первый столбец, две верхние строки) более чем в 2 раза превышают значения сигналов в ячейках, содержащих А в обеих позициях или С в позиции 4887 и G б позиции 4889 (верхние ячейки второго столбца и нижние ячейки первого столбца соответственно), а также в ячейках, содержащих двойную замен) в позициях 4887 и 4889 (нижние ячейки второго столбца) Значения сигналов в верхних и нижних ячейках в третьем столбце (полиморфизм 62351>С) находятся на одном уровне, что свидетельствует о гетерозиготном состоянии этого варианта и наличии в искомой ДНК аллели *2А гена CYP1AI. Значения сигналов в верхних ячейках как четвертого, так и пятого столбца более чем в 2 раза превышают значения таковых в нижних ячейках, что свидетельств)ет об отсутствии в образце ДНК аллелей *4 и *3 гена CYP2D6 Точность обнаружения этих алле ieü подтверждает разница в интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек на диаграмме (рис 2В).

Рис 2 Блок биочипа для выявления полиморфизма в генах CYPIAI и CYP2D6 А -Схема и принцип расположения олигонуклеотидных зондов (указаны только вариабельные позиции). В двух верхних и двух нижних строках содержи гея идентичная информация (для продублированных на биочипе зондов). Б - Пример гибридизационной картины для образца с генотипом CYPIA1 t'2A/"l), CYP2D6 (*1/Ч) Стрелками указан выяв1енный "мутантный" вариант В Диаграмма относительных сигналов флуоресценции

Блок №2 предназначен для выявления полиморфных вариантов генов GSTT1 и GSTMI С помощью данного биочипа можно анализировать протяженные внутригенные делении, что позволяет выявлять, так называемые, "нулевые" аллели этих генов (Иващенко и др . 2004), а также идентифицировать образцы, в которых есть хотя бы одна копия гена OST! 1 или гена GSTMI. Специфичность гибридизации ПЦР продукта с пробой подтверждали, используя в качестве "внутреннего" контроля олигонуклеотид с искусственно введенной заменой одного основания в центре пробы В качестве внешнего контроля использовали сравнение с положительными контрольными образцами Блок №3 предназначен для анализа полиморфизма по генам NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G) и МТНГЯ (677С>Т), а блок №4 - для анализа полиморфизма по генам CYP2C9 и CYP2C19. Выявление мутаций проводили так же, как и для гена CYP2D6 блока № I.

Таким образом, разработанный биочип позволяет анализировать 14 мутаций в восьми различных генах. На рис. 3 приведен пример гибридизационной картины, включающей все блоки биочипа .

СVPIAI «*2А», ¥*2В», «*4» и «*1» CYP2t>6 «*4», «*3» и «*1»

ОЮТЧи \4S89G ТМЯС С19У4А 1>е1Л2637

< TT i TT

1 п с гт

< TT С TT С TT { TT

Генолшл СУР1Л1 Г2АУ1). CYP20B {'1 Г1}

< «V:

.2

• •

.АЛ

Генотип:

СУИД» С2ВГ1), сто» (чту, ваш (*/*), 0*1ни (*/*),

НЛП ($2/Н},

шпткск).

СПЧСЯГГП). СУР2С11С2Г1)

Рис 3 Пример гибридизацнонной картины, полученной на биочипе для анализа полиморфизма по генам СУР1А/, СУР206. СБТМ1, С57Т/, N472, МТНт, СУР2С9 и СУР2С19 Стрелками указаны обнаруженные "мутантиые" варианты

Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода. Микрочип протестирован на 30-ти контрольных и более 100 диагностических образцах При тестировании контрольных образцов результаты анализа методом ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами При анализе диагностических образцов (тестирование на биочипах и методом ПДРФ проводили параллельно), несовпадение результатов обнаружено только в двух случаях из 715-ти проанализированных полиморфных вариантов (табл. 2).

Таблица 2 Специфичность метода гибридизации.

II шч гТ" V * £ |9 : 42 с 2 ¿И ¡\Vi\i ¿Л

' УИЛМ 4-Г \ ♦

< м»1 м I 4У

'И' Ом 14 -И

( ^Г"!*' ».-О»" . Л' V | 1 «

'.ЧГП 1 МН« 1

ГММ1 ■», 1.1111Я *

' \1 < 4М Г > ,ч ' «<

\ М.О V Л •л 1 *

л* 4Н | |<».

мгн»»<<*- 1 А- |И

< 4.»г V \ V"

Г . Г'Ч ' \ 1 »'М * * ' 1«

1 )1-Х 1*«.ли ч ч 1 |«.

' " Ж. Ш. 3 . -Г *( * 1

Таким образом, специфичность метода гибридизации на биочипах составила 99 7%. Чувствительность биочипа оценивали, проанализировав 40 контрольных образцов с разным количеством исходной геномной ДНК (от 0,1 нг до Юмкг) Было показано, что минимальным количеством ДНК, необходимым для однозначной идентификации мутаций, было 1 Онг

Алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма. На основе обших принципов, выработанных при разработке "фармакогенетического биочипа" нами предложен алгоритм (рис 4) для соиания «тематических» биочипов, состоящий из шести этапов.

АЛГОРИТМ СОЗДАНИЯ БИОЧИПОВ

Выбратьганы, полиморфны*иснаиш

Вивршп, муклаотидную юйшл*

Этап 1

Груплиромть гены (полиморфны* варианты)

Подобрать праЛморы

(¿тал 3....."1" *

ПроаостиПЦР I

Этвп в

Промети ПЦР

......./

Смаишъ продукты ПЦР II

Ра»0«ботать сяаму биочипа бпает программ

гивридмдо £пмат программ

I-

Оцашп» эффаитиност» штптшлЯ псяиморф^т аарйРигоа не иеигротмыж ВИОЧИП

Рис 4 Алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма человека.

Создание "кардиочипа". При создании "кардиочипа" был использован разработанный нами алгоритм Для выявления генетической предрасположенности к артериальной гипертемзии были выбраны полиморфные варианты следующих генов- RFK (I9-83G>A), AGT (М235Т), АС,TRI (1166А>С), AC,TR2 (3123С>А), BKR2 (-58Т>С), MTHFR (677С>Т), ADRB2 (48A>G и 8lC>G) Белковые продукты генов ренин-ангиотензиновой системы (REN. AGT. AGTRl, AGTR2) являются одними из самых важных регуляторов кровяною давления и гомеостатической функции почки, обеспечивая поддержание жизненно необходимых процессов в организме Схема "кардиочипа" показана на рис 5 Олигонуклеотидныс зонды обозначены ячейками, каждой из которых соответствует определенная аллель или гаплотип конкретного гена Олигонуклеотидныс пробы в составе биочипа также сгруппированы в блоки Блок Xsl предназначен для выявления полиморфизма по генам RF.N, А ОТ, AGTRl, AGTR2 Блок №2 предназначен для выявления попиморфи-зма по генам MTHFR, BKR2 и AÜRB2. Таким образом данный биочип позволяет анализировать 8 почиморфных вариантов в семи различных icnax.

АдТ AGTR1 AGJR2

REN / * \ t

Ч\ МИ НИ! I ИИ

1ИКИЙ 1НП М\ Ы1ГГННЛ (НЛ~

Рис 5 Схема "картиочипа" Ячейки светло-серого цвета соответств>ют олигон>клео-тидам, комплементарш ?ч пос !е ювательиостям дикого типа темно-серого цвета -последовательностям "м\ таш -ного типа"'. Каждый олию-нчктеотид на биочипе иреа ставлен четырьмя копиями

MTHFR BKR2 ADRB2

На рис 6 привезен пример гибридизационной на "кардиочипе" Гф ^ ш ш ^^ Генотип;

!• • * ,

у» ф<-

9 •

I,- .-«.. .V-

• • • • • ф

* • > «

i

Рис 6 Пример гибрилимционной картины полученной на биочипе для анализа полиморфизма по генам ЮТ AGTRL 1GTR2. BKR2 MTHFR 4DRB2

Стрелками чказаны обнаруженные ABRB2 (А/А и С/С) "м>татные" варианты (кругом выделены четыре такие ячейки).

REH (в/А) АвТ(МГГ) AGTRl (А/А) AGTR2 (С/С) MTHFR (СГ) BKR2 (Т/С)

Анализ полиморфизма генов ренин-аигиотензиновой и кинин-брадикиииновой систем у больных артериальной гипергензией и в контроле. Для изучения комплексного влияния генетических факторов на предрасположенность того или иного индивидуума к артериальной гипертензии мы выбрали ренин-ангиотензиновый и. примыкающий к нему, кинин-брадикиииновый каскады Данные каскады представляют собой целостную систему последовательно и параллельно связанных биохимических реакций Такая особенность данной системы создает возможность анализа влияния не только каждого отдельно взятого полиморфного варианта на предрасположенность к заболеванию, но и позволяет проанализировать и разработать подходы комплексной оценки взаимодействия этих вариантов

Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов Для выявления возможной взаимосвязи генотип-фенотип мы провели сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов между выборкой детей, больных I ипертонией, и контролем, а также между подгруппами больных При сравнении анализируемой группы

и группы сравнения учитывали различия по полу, если распределение генотипов для мальчиков и/или девочек было различно. Для большей точности группа детей, больных гипертонией (только для которых было проведено суточное монигорированис артериального давления (СМАД), была разделена на две подгруппы В первую подгруппу (1) включили детей без подтвержденной в результате СМ АД артериальной гипертензии (группа I) и детей с лабильной формой АГ (группа 2) Во вторую подгруппу (2) включили детей со стабильной формой АГ (группа 3) В результате проведенного исследования показано, что для всех изученных генов отсутствуют статистически значимые отличия в частотах генотипов между обшей выборкой детей, больных АГ. и контрольной выборкой. Однако были отмечены различия в частотах аллелей генов ВКЯ2 (С-аплель) и АОТЯ2 (А-аллель) для пациентов мужского пола по сравнению с лицами мужского пола из контрольной группы (рис. 7)

RENA

-AGTT

RENA

v

AGÎT

Рис 7 Частоты распределения «мутантных» аллелей изученных генов у больных гипертонией и в контроте

AGTR1 С □ больные □ контроль

Известно, что ген рецептора 2 к брадикинину {BKR2) колирует белок, участвующий в вазорелаксацин сосудов, посредством стиму шрования выработки зндотелиальной NO-синтазы и последующей генерацией ею NO (Lung et al 1997 Mukae et al 2002, Dhamrait et al 2003: Williams et aI 2005) Согласно исследованиям последних лет. у носителей /"-аллели экспрессия гена выше, чем у носителей С-аллети Высокая экспрессия гена обуславливает появтение большего числа рецепторов на клетку, а значит и более выраженную вазодилатацию Таким образом, наличие С"-аллели может приводить к более выраженным вазоконстрикторским свойствам, а. с 1едовательно, рассматриваться как один из маркеров риска развития АГ Другой ген - ген рецептора 2 к ангиотензину 11 (AGTR2) кодирует белок, который также опосредует вазодилататорную функцию Полиморфный вариант 3123С>А. изученный нами, тесно сцеплен с вариантом +!675G>A в интроне 1. влияющим на старт транскрипции. Наличие А-аллели, по-видимому, сопряжено с более низкой эффективностью транскрипции гена (Jones et al, 2003а). и. как стедсгвие. со сниженной вазодилататорской способностью При анализе частот I енотигюв и аллелей изученных генов в ipynnax детей, больных АГ с различными клиническими проявлениями нами были выявлена ассоциация между вариантами генов REN, AGI" и АСЕ и развитием стабильной АГ (рис. 8) Интересным является факт того, что наличие АГ у мальчиков ассоциировано с аллелями генов, контролирующих заключительные этапы ренин-ангиотензинового и кинин-брадикининового каскада (BKR2 и AGTR2). а формирование стабильной АГ у детей вне зависимости от пола - с аллелями и генотипами генов, контротирующих начальные этапы {REN, AGT и АСЕ) Так как первое утверждение справедливо только для пациентов мужского пола, можно предположить, что на первичное повышение АД помимо генетических факторов могут оказывать влияние другие факторы, например, гуморальные, зависимые от пола На стабильное же повышение АД у больных детей (как мальчиков, так и девочек) в большей степени влияют наследственные факторы - гены, полиморфизм которых обуславливает первичное накопление ангиотензина И в крови

и

AGTR2A\~

BKR2 Cr

Рис 8 Частоты распределения распределения «мутантных» аллелей изученных генов у детей, больных гипертонией (в различных

подгруппах)

AGTR1С

BKR2I

Dбогъны« (подгруппе 2) ООшъиы» (подгруппа 1J

Анализ ассоаиании показателей ИМТ, САЗ. ДАД и генотипов изученных генов у детей, больных артериальной гипертонией. При анализ клинических показателей у больных детей выявлено, что Т/Т гомозиготы по гену ЛОТ по сравнению с носителями М-аллели (генотип М/-) имеют статистически значимо более высокие показатели ДАД С76,19 мм рт ст. против 7 i ,47 мм рт ст . р=0.002) По данным литературы (Pereira el al, 2002; Tsai el о/. 21)02; Mondry el al 2005; Fox el al, 2005) у носителей Г-аллели повышен уровень ангиотензина I в крови (на ] 5-20%), влияющий в свою очередь на повышение АД Можно предположить, что по1ичорфный вариант данного гена в большей степени оказывает влияние на диастолическое. чем систолическое артериальное давление.

Комплексный анализ ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикнниновой систем у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле. Генная сеть заболеваний сердечно-сосудистой системы включает значительное число генов, и заболевание может возникать в результате вклада многих полиморфных генов. И брадикининовый каскад, служат наиболее удобной моделью для подобных исследований Ферменты данных каскадов связаны последовательными и параллеткными химическими реакциями, что пошоляет оценить систему в целом Одним из формальных вариантов такой оценки может сзужить введение бальной системы В работе предложены два подхода В одном варианте анализа (Анализ "суммы баллов генотипов") гомозиготам "дикого типа" присваивали значение I. гетерозиготам - 2, гомозиготам по "мутантной" аллели - i Далее проводили счммирование баллов по генотипам у каждого индивидуума с вычетом числа анализиоуемых лок\сов В тру го м подходе - Анализе "суммы неблагоприятных баллов" - чисзенное значение присваивали только гомозиготам по "мутантной" аллели - I, остальным генотипам - 0 Далее баллы генотипов суммировали с вычетом чиста анализируемых локусов Для сравнения суммы баллов в обоих случаях использовали критерий Манна-Уитни. Анапа "сумны баллов генотипов". Анализ "суммы баллов генотипов", оценивающий полиморфизм как генов ренин-ангиотензиновой. так и генов кинин-брадикининовой систем показал что мальчики, больные АГ, статистически значимо отличаются от мальчиков контрольной группы (р=0 01), тогда как девочки - нет (р=0 73) Аналогичные результаты были получены при сравнении баллов между группами детей со стабильной АГ и без таковой' значимые отличия были выявлены только для девочек (р=0 003), тогда как для мальчиков таких отличий выявлено не было (р=0 43), хотя группы в целом также были различны (р=0 03) Л пали] "суммы неблагоприятных баллов". Анализ "суммы неблагоприятных баллов", оценивающий полиморфизм как генов ренин-ангиотеизиновой, так и генов кинин-брадикининовой систем также не выявил статистически значимых отличий между группами детей, больных гипертонией, и контролем (р=0 12. р=0 08 и р=0 61 для групп в целом, мальчиков и девочек, соответственно) При сравнении суммы неблагоприятных вариантор, оценивающих состояние генов как ренин-ангиотензиновой, так и генов кинин-брадикининовой систембыло показано, что

между группами детей со стабильной АГ и без таковой были выявлены значимые отличия для девочек (р=0 003). тогда как для мальчиков и в целом для групп таких отличий выявлено не было (р=0 97 и р~0 18, соответственно) Таким образом, нами было показано, что два различных формальных подхода Анализ "суммы баллов генотипов" и Анализ "суммы неблагоприятных баллов" демонстрируют схожие закономерности и позволяют выявлять некоторые различия между изученными группами Кроме того, использование при анализе генов двух систем (а не только ренин-ангиотензиновой) позволяет выявлять достоверные отличия с более высокой степенью точности

ВЫВОДЫ

1 Пвегпоженный алгоритм создания биотипов позволяет с высокой эффективностью разрабатывать тест-системы для анализа генетического полиморфизма человека

2 Разработан «кардиочип» для идентификации полиморфных вариантов генов REN AGT AGTRI AGTR2. MTHFR BKR2 ADRB2

3 Метоп гибридизации на «кардиочипе» обладает высокой специфичностью (99%) и может быть предложен для использования при массовом скрининге образцов ДИК пациентов для изучения

заболеваний сердечно-сосудистой системы

4 Аллели i снов BKR2 (í-аллегь) и AGTR2 Ы-аллель! ассоциировачы с рагритиеч артериальной гипергензииу мальчиков

5 На жчие вариантов генов RF\ (//-аллель и А'А генотип) 4G7 (Г-аллсль) и 4С L (/J-алле ассоциировано с формированием стабильной формы артериальной гиггертснзии ) детей

h Показатели диастолического АД значимо выше у пациентов с Т/Т генолигом гена ЛОТ по сравнению с М/М и/или М'Т генотипами

7. Комплексная оценка полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кимин-брадикининовой систем подтверждаег роль данных каскадов в развитии АГ и формировании стабильного АД

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЬ ДИСХ FP ГАЦИИ Статьи, патенты

1. Глотов О С , Глотов А.С . Тарасенко О А , Иващенко Т Э , Баранов В С Исследование функционально-жачимого полиморфизма ACE, AGTRI, ENOS, МТНГК, MTRR и АРОЕ генов в популяции Северо Западного региона России // Экологическая генетика 2004 В 3. Стр. 32-35.

2. Глотов A.C., Глотов ОС.. Москаленко М.В. Рогозкин В.А., Иващенко 1 Э. Баранов В.С Анализ полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы в популяции Северо-западного региона России, у атлетов и у долгожителей // Эколо! ическая генетика. 2004. В. 4. Стр 40-43.

3. Глотов A.C., Наседкина Т В , Иващенко Т.Э., Юрасов Р А , Суржиков С А., Паньков С В . Чудинов А В , Баранов В.С. Заседателев А.С Создание биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации Н Молекулярная биология 2005 Т 39 №3 Стр 403-412.

4. Брускин С А., Глотов A.C.. Наседкина Т В , Радкевич Л А , Голденкова И В Разработка микрочипа быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования для метаболической и генетической паспортизации человека с целью ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии /' Материалы XIII международной конференции и дискуссионного научного клуба Новые информационные технологии в

медицине, биологии, фармакологии и экологии 31 мая-9 июня 2005 года, Ялта-Гурзуф, Крым, Украина Приложение к журналу "Открытое образование" Стр. 201-203.

5. Глотов О.С, Глотов А.С., Демин Г.С, Баранов В С., Иващенко Т Э Способ диагностики сердечнососудистых заболеваний и диагностический набор для его осуществления Патентная заявка №2005131568

6. Глотов А.С., Наседкина Т В., Заседателев А.С Способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к онкологическим заболеваниям и индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам, с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа). Патентная заявка №2005124996.

Тезисы.

1 Glotov O.S., Vakharlovsky V.G., Glotov A.S., Ivashchenko Т.Е., Shaposhnikov A.M., Baranov V.S. Analysis of ACE, eNOS and MTHFR genes polymorphisms in the elderly people from the north-west region of Russia // European Journal of Human genetics - European Congress of Human Genetics Conference 2003, May 3 - 6, 2003, Birmingham, England. P. 254.

2 Glotov A.S., Gryadunov D A., Ivaschenko T E, Baranov V.S., Nasedkina T New perspective approaches in diagnostics of predisposition to cardiovascular diseases on the example of mutation C677T of gene MTHFR // European Journal of Human gcnetics - European Congress of Human Genetics Conference 2003, May 3 - 6, 2003, Birmingham, England P. 249

3. Nasedkina TV., Zarinov V.S., Isaeva E.A., Fedorova O.E, Glotov A.S., Mityaeva O.N., Sinitka O., Tichomirova L. Application of gel-ba->ed microarrays tor genodiagnostics of cancer // European Journal of Human genetics - European Congress ot Human Genetics Conference 2003, May 3 - 6, 2003, Birmingham. England. P. 80.

4. Glotov Andrey, Glotov Oleg, Ivaschenko Tatyana, Petrov Michael, Rogozkin Victor Association renin-angiotensin genes polymorphisms with physical performance in rowers // Conference lor young scientists, PhD students and students of molecular biology and genetics. Kyiv. Ukraine. September 25-27. 2003. P. 13

5. Fedorova O., Glotov A., Krunetski E , Krunetskaya N , Chupova N , Nasedkina T. & Mirzabekov A Analysis of point mutations in human thiopunne S-methyltransferase gene by hybridization with oligonucleotide microchips // Conference for young scientists, PhD students and students of molecular biology and genetics Kyiv Ukraine September 25-27. 2003. P. 240.

6. Glotov A.S., Ivaschenko Т.Е., Baranov V.S, Zasedatelev A. S., Nasedkina T.V. Biochip Development for Polymorphism Detection of Biotransformation System Genes i! European Journal of

Human genetics - European Congress of Human Genetics Conference 2004, June 12 - 15, 2004, Munich, Germany P 324.

7. Glotov O. S., Glotov A. S., Tarasenko О. A , Ivaschenko Т. E., Baranov V. S. Analysis of ACE, AT1R, cNOS, MTHFR, MTRR and ApoE genes polymorphisms in the population of North-West of Russia // European Journal of Human genetics - European Congress of Human Genetics Conference 2004, June 12 - 15, 2004, Munich, Germany. P. 307.

8. Nasedkina T V . Fedorova O.E, Glotov A.S., Samochatova E.V.. Chupova N V., Barsky V.E., Zasedatelev A. S. Genetic polymorphism studies in Russian population using biochips // European Journal of Human gencucb - European Congress of Human Genetics Conference 2004, June 12 -15, 2004, Munich, Germany. P. 331.

9 Glotov A.S., Ivaschenko T E , Baranov V S , Zasedatelev A S , Nasedkina T V Diagnostic Biochip Development for Polymorphism Detection of Biotransformation System Genes // Clin Chem Lab Med - Biologie Prospective -Santorini Conference 2004 (Уй Annual Meeting of the International Society of Pharmacogenomics), September 30 -October 4, 2004, Santorini Island. Greece V. 42(8). P 47

10 Glotov О S , Glotov A.S., Moskalenko M V , Rogozkin V.A., Ivaschenko Т.Е., Baranov V.S. Analysis of ACE, AGT, AGTRl, ENOS, MTHFR genes polymorphisms in the elderly people, athletes and population of North-West region of Russia // Clin Chem Lab Med - Biologic Prospective - Santorini Conference 2004 (3rd Annual Meeting of the International Society of Pharmacogenomics), September 30 - October 4, 2004, Santorini Island, Grccce. V. 42(8) P 47.

11 Glotov A.S., Ivaschenko Т.Е., Baranov V.S, Zasedatelev A. S., Nasedkina T V. Biochip Development for Polymorphism Detection of Biotransformation System Genes // European Journal of Human genctics - European Congress of Human Genetics Conference 2005, May 7 -10, 2005, Prague, Czech Republic. P 249.

12 Nasedkina T V , Fedorova O.E , Glotov A.S., Samochatova E V., Chupova N V., Roudneva A. E., Zemlyakova V V , Ko/hekbaevd Z M Krynciskiy E Y, Krynctskaia N.F., Ribeiro R,C , Evans W.E, Koumyamsev A.G., Zasedatelev A.S Rapid TPMT-gcnotyping for clinical applications using DNA-biochips // European Journal of Human genetics -European Congress of Human Genetics Conference 2005, May 7 -10, 2005, Prague, C/ech Republic. P 249.

13 Glotov A.S, Stcpanova TV, Obraztsova G I., Ivaschenko Т.Е., Baranov VS Analysis of insertion/deletion polymorphisms of angiotensin converting enzyme and bradykimn receptor genes (ACE and BKR2) in children and adolescents with arterial hypertension from North-West region of Russia // European Journal of Human genctics -European Congress ot Human Genetics Conference 2005, May 7 - 10, 2005, Prague, Czech Republic. P. 332.

14 Obraztsovd G.l, Stepanova T V , Glotov A.S., Ivaschenko T E , Baranov V S , Kruchkova E.A . Nasedkina T.V , Cheremnych T.V., Vitina N I., lvashikina T M , Erman L.V., Kovalev Y.R. Gene polymorphisms of the candidate genes and essential arterial hypertension in children // International Congress "Hypertension - from Korotkov to present days", September 15-17, 2005, Saint-petcrsburg, Russia. P. 100.

15 Глотов A.C.. Наседкина ТВ. Грядунов ДА, Иващенко Т.Э.. Баранов B.C. Мирзабеков АД Новые перспективные подходы в диагностике предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям на примере мутации С677Т в гене MTHFR // Научно-практический симпозиум "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины". Москва. 20-21 июня 2002 г. Стр. 4-5.

16. Глотов А.С Олиголуклесггидные микрочипы как новый подход для определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям // Седьмая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Санкт-Петербург. 2002. Стр. 43.

17. Федорова О Е., Глотов А.С., Крынецкий Е Ю, Крынецкая Н.Ф., Чупова Н.В.. Наседкина Т.В Анализ точечных мутаций в гене тиопурин-Я-метил трансферазы (ТПМТ) человека, приводящих к потере активности фермента, с использованием технологии биочипов II 7-я Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 13-18 апреля 2003г., стр 134-135.

18. Наседкина Т В., Жаринов В.С . Исаева Е А., Митяева О Н , Федорова О.Е., Глотов А.С., Мирзабеков А.Д. Молекулярно-генетический анализ онкологических заболеваний с использованием технологии биочипов II Материалы III симпозиума Биологичесие основы терапии онкогематологических заболеваний у детей 6-7 февраля 2003 года, Москва. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии Т. 1 2 Стр. 83

19. Глотов A.C.,. Иващенко Т Э , Наседкина Т В Разработка биочип-тест-системы детекции SNP на примере анализа полиморфизма в генах CYP1A1, CYP2D6, GSTM1 и GSTT1 // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины III Конференция молодых ученых России с международным участием. 20 - 24 января 2004 г. Москва. Стр 175.

20. Глотов A.C., Иващенко Т Э , Баранов В С , Наседкина Т В Создание биочипа для фармакогенетических исследований // Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы III съезд ВОГиС 6-12 июня 2004 г Москва. Т 2. Стр 8.

21 Наседкина Т В. Федорова О F, Глотов A.C., Заседателев А С Гелевые биочипы в изучении генетического полиморфизма // Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы III съезд ВОГиС 612 июня 2004 г Москва Т 2 Стр 35

22. Глотов О С , Глотов A.C., Тарасенко О А , Рогозкин В А , Иващенко Т Э , Баранов В С Анализ I/D полиморфизма гена ангиотензин-конверируюшего фермента у зиц пожилого возраста, спортсменов и больных ИБС // Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы 111 съезд ВОГиС 6-12 июня 2004 г Москва Т. 2 Стр 62

23 Глотов A.C., Глотов О С . Москаленко М В . Асеев М В . Иващенко Т Э , Баранов В С Генетический паспорт // Первая международная научно-практическая конференция МГДБИОТЕК-2005 Биологические и медицинские технотогии от научных результатов к иннвационным разработкам 3-4 марта. 2005г Президиум РАН. Москва. Стр. 71-73

24. Глотов A.C., Иващенко Т Э, Баранов В С . Заседателев А С . Наседкина Т В Создание биочипа для фармакогенетических исследований Н Меаицинская генетика Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков (часть I) 2005 Т 4 № 4 Стр 173

25. Образцова Г И , Глотов A.C., Крушкова Е А . Наседкина Т В.. Черемных Т В . Витина Н И Частота полиморфизмов генов-кандидатов в группе детей с первичной артериальной гипертензией '/ Сибирский медицинский журнал Сборник материалов IV всероссийского семинара памяти профессора Н А Белоконь "Артериальная гипертентия в детском возрасте" 6-7 октября 2005г Томск Т 20 Стр 104

Отпечатано на ризографе в типографии ООО "Вичи". Тираж 100 экземпляров.

РНБ Русским фонд

2006-4 ^"^Vrr-T 30801

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Глотов, Андрей Сергеевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава I 1 Обзор литературы.

1.1 Микрочипы в диагностике и научных исследованиях.

1.1.1 Нанотехнологии на основе биологических микрочипов.

1.1.2 Перспективные методы анализа генетического полиморфизма.

1.1.3 Биочипы для изучения генетической предрасположенности.

1.2 Изучение генетического полиморфизма репин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой системы.

1.2.1 Генетический полиморфизм и сердечно-сосудистая система.

1.2.1.1 Определение генетического полиморфизма. Его значение в современной медицинской генетике.

1.2.1.2 Сердечно-сосудистые заболевания.

1.2.1.3 Гены «предрасположенности» к сердечно-сосудистым заболеваниям.

1.2.2 Артериальная гипертензия.

1.2.2.1 Этиология и патогенез.

1.2.2.2 Формирование представлений о генетической природе артериальной гипертензии.

1.2.3 Ренин-ангиотензиповая и кинин-брадикининовая системы.

1.2.4 Гены «предрасположенности» к артериальной гипертензии.

1.2.4.1 Рении.

1.2.4.2 Ангиотензиноген.

1.2.4.3 Ангиотензинпревращающий фермент.

1.2.4.4 Рецептор 1 к аигиотензину II.

1.2.4.5 Рецептор 2 к аигиотензину II.

1.2.4.6 Рецептор 2 к брадикинину.

1.2.5 Комплексное изучение ассоциации полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы с предрасположенностью к артериальной гипертензии.

Глава II 2 Материалы и методы.

2.1 Характеристика исследуемых групп.

2.2 Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов.

2.3 Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия.

2.4 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.4.1 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом ПААГ.

2.4.2 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе.

2.5 Анализ ПЦР продуктов методом ПААГ.

2.6 Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле.

2.7 Гибридизация меченого продукта на микрочипе.

2.8 Регистрация изображения и его обработка.

2.8.1 Анализ "фармакогенетического биочипа".

2.8.2 Анализ "кардиочипа".

2.9 Статистическая обработка данных.

Глава III 3 Результаты и обсуждение.

3.1 Разработка алгоритма создания биочип-тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека.

3.1.1 Создание "фармакогенетического биочипа".

3.1.1.1 Выбор генов и полиморфных вариантов.

3.1.1.2 Выбор нуклеотидных последовательностей и длин ПЦР продуктов, последовательностей концевых праймеров и последовательностей иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.

4 3.1.1.3 Особенности проведения мультиплексной ПЦР и гибридизации.

3.1.1.4 Конструирование биочипа. Блочный подход.

3.1.1.5 Блочная организация микрочипа.

3.1.1.6 Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода.

3.1.1.7 Алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма.

3.2 Создание "кардиочипа".

3.2.1 Выбор генов и полиморфных вариантов.

3.2.2. Схема и структура микрочипа.

3.2.3 Анализ контрольных и диагностических образцов.

3.3 Сравнение метода гибридизации на биочипах с классическими методами анализа генетического полиморфизма.

3.4 Применение биочипов в медицине и биологии.

3.5. Анализ полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем у больных артериальной гипертензией и в контроле.

3.5.1 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле.

3.5.1.1 Аиализ соответствия распределений закону Харди-Вайнберга.

3.5.1.2 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов.

3.5.2 Анализ ассоциации показателей ИМТ, САД, ДАД и генотипов изученных генов у детей, больных артериальной гипертонией.

3.5.3 Корреляционный анализ взаимосвязи генотипов изученных генов, 4 ИМТ, САД и ДАД у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле.

3.5.4 Комплексный анализ ренин-апгиотензиновой и кинин-брадикининовой систем у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и апробация тест-систем на основе гелевых биочипов для изучения генетического полиморфизма человека"

Лавинообразное нарастание интереса к изучению генетической предрасположенности требует разработки новых подходов к идентификации и анализу ДНК-полиморфизма. Современное развитие науки невозможно без создания новых технологий, позволяющих'проводить анализ множества генетических изменений одновременно. Одним из наиболее перспективных методов для решения этой задачи является метод мультиплексной ПЦР с дальнейшей гибридизацией на олигонуклеотидной матрице (Kolchinsky and Mirzabekov, 2001; Nasedkina et al, 2003; Колчинский и др., 2005; Wang et al, 2005).

Сердечно-сосудистая патология является самой распространенной причиной смертности во всем мире. Изучение патогенеза и диагностика генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям имеет большое значение не только для фундаментальной медицинской науки, но и становиться важным инструментом, для решения задач профилактической (предиктивной) медицины. Уже на сегодняшний день для многих социально-значимых заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз и другие, показана ассоциация определенных полиморфных вариантов некоторых генов с данными болезнями (Нефедова и Шварц, 1998, Баранов и др., 2000, 2003; Иващенко и др., 2004, Babunova et al, 2003). Очевидно, что для более точной оценки роли генетического полиморфизма в этиологии заболевания необходимо использование системного подхода, заключающегося в выборе и анализе генов, продукты которых находятся в биохимически последовательно связанных реакциях. В связи с чем, особый интерес представляет изучение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, принимающих участие в регулировании артериального давления и обмене электролитов. Показано, что генетический подиморфизм данных систем существенно меняет их активность, что и является зачастую причиной сердечно-сосудистой патологии (Пузырев, 2003; Chistiakov et al., 1998, 2000; Rupert et al., 2003; Zhu et al., 2003; Naber et al., 2004a,b). С другой стороны большое значение имеет анализ генетического полиморфизма у больных в детском возрасте, где значительно сильнее проявляются внутренние - генетические факторы, накладывающиеся на факторы внешней среды во взрослом состоянии (Obraztsova et al., 1998).

Таким образом, разработка методических (биочипы) и методологических основ современного анализа генетического полиморфизма человека является актуальной проблемой современной молекулярной биологии и медицинской генетики.

Цель работы заключается в разработке тест-систем на основе гелевых биочипов для анализа генетического полиморфизма человека и их использование при изучении генетической предрасположенности к артериальной гипертензии у детей. Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

1. Разработать алгоритм создания биочип-тест-систем для анализа генетического ч/ — , полиморфизма человека на примере детекции мутаций в генах CYP1A1 (48870А, 4889A>G и 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A и 2637delA), GSTM1 (деления), GSTT1 (делеция), NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G), MTHFR (6770Т), CYP2C9 (4300Т и 10750Т) и CYP2C19 (681G>A).

2. Разработать биочип для анализа генетического полиморфизма генов REN (19-83G>A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C), MTHFR (677С>Т), ADRB2 (48A>G и 81C>G) ("кардиочип"). 3. Проанализировать полиморфные варианты генов REN (I9-83G>A), AGT у

М235Т), ACE (I/D), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C и I/D) у детей, больных артериальной гипертензией, и в популяционном контроле. N

Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикиииновой систем в подгруппах больных артериальной гипертензией с различными клиническими проявлениями. Провести комплексную оценку влияния полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем на развитие артериальной ги-пертензии у детей. у .^ ' ' ' ;

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Глотов, Андрей Сергеевич

Выводы.

1. Предложенный алгоритм создания биочипов позволяет с высокой эффективностью разрабатывать тест-системы для анализа генетического полиморфизма человека.

2. Разработан «кардиочип» для идентификации полиморфных вариантов генов REN, AGT, AGTR1, AGTR2, MTHFR, BKR2, ADRB2.

3. Метод гибридизации на «кардиочипе» обладает высокой специфичностью (99%) и может быть предложен для использования при массовом скрининге образцов ДНК пациентов для изучения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

4. Аллели генов BKR2 (С-аллель) и AGTR2 (Л-аллель) ассоциированы с развитием артериальной гипертензии у мальчиков.

5. Наличие вариантов генов REN (А-аллель и А/А генотип), AGT (Г-аллель) и АСЕ (.D-аллель) ассоциировано с формированием стабильной формы артериальной гипертензии у детей.

6. Показатели диастолического АД значимо выше у пациентов с Т/Т гепотипом гена AGT по сравнению с М/М и/или М/Т генотипами.

7. Комплексная оценка полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем подтверждает роль данных каскадов в развитии АГ и формировании стабильного АД.

Заключение.

Лавинообразное нарастание интереса к изучению генетической предрасположенности к развитию социально значимых заболеваний требует разработки новых подходов к идентификации и анализу ДНК-полиморфизма. Современное развитие науки требует создание новых технологий, позволяющих проводить анализ множества генетических изменений одновременно. И в настоящий момент одним из наиболее перспективных методов для решения этой задачи является метод мультиплексной ПЦР с дальнейшей гибридизацией на олигонуклеотидной матрице. Нами предложен алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма на примере детекции мутаций в генах CYP1A1 (4887С>А, 4889A>G и 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A и 2637delA), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G), MTHFR (677С>Т), CYP2C9 (4300Т и 1075С>Т) и CYP2C19 (681G>A). На основе разработанного алгоритма нами создан биочип для анализа полиморфизма генов REN (I9-83G>A), AGT (М235Т), AGTRl (1166A>C), AGTR2 (31230A), BKR2 (-581>C), MTHFR (677C>T) и ADRB2 (48A>G и 81C>G) с целью изучения генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям (артериальной гипертонии).

Как известно, основной причиной смертности на сегодняшний день является сердечно-сосудистая патология. Наиболее распространенные ее формы - ишемическая болезнь сердца и артериальная гипертония. И хотя в настоящее время достигнут большой прогресс в лечении сердечно-сосудистых заболеваний, разработки ученых, направленные на профилактику данных недугов представляются наиболее актуальным и востребованным направлением современной медицины. Основой его служит исследование генетической предрасположенности к развитию заболевания. Однако, учитывая то, что сейчас известно более 150 генов, полиморфизм которых влияет на развитие патологии сердца и сосудов, существует острая необходимость в разработке новых подходов к идентификации и анализу ДНК-полиморфизма. Разработка, создание и применение "кардиочипа" позволило существенно снизить трудоемкость и себестоимость анализа (в 2-3 раза), а также обеспечить высокий уровень современного исследования.

Наряду с новыми методиками и технологиями, не менее важным для медицинской генетики является разработка методологических основ анализа генетического полиморфизма, которая заключается, прежде всего, в адекватном выборе генов-кандидатов, групп обследуемых пациентов и методов анализа данных. Для выяснения роли генетических факторов в развитии артериальной гипертензии были выбраны полиморфные варианты генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем REN (I9-83G>A), AGT (М235Т), ACE (I/D), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (31230A), BKR2 (-58T>C и I/D), контролирующих уровень АД. Продукты, изученных нами генов, вовлечены в последовательно связанные биохимические реакции. С целью выяснения наследственной составляющей заболевания (и для исключения влияния факторов окружающей среды) наше исследования было проведено на образцах ДНК пациентов в молодом возрасте (9-17 лет).

В результате сравнительного анализа частот аллелей и генотипов изученных генов показано, что наличие АГ у мальчиков ассоциировано с аллелями генов, контролирующих заключительные этапы ренин-ангиотензинового и кинин-брадикининового каскада (BKR2 и AGTR2). Формирование стабильной АГ у детей вне зависимости от пола ассоциировано с аллелями и генотипами генов, контролирующих начальные этапы (REN, AGT и АСЕ). Таким образом, наличие закономерностей, обнаруженных у больных детей, в значительной степени свидетельствует о том, что развитие гипертонии, ее прогрессирование связано с генетическими факторами, а именно, с полиморфизмом ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовых систем.

Для оценки комплексного влияния полиморфизма изученных генов нами предложен подход на основе анализа суммы баллов. Применение данного подхода показало, что полиморфизм генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем оказывает существенное влияние на развитие АГ у мальчиков. С другой стороны, он в большей степени ответственен за формирование стабильно повышенного АД у девочек, чем у мальчиков. Кроме того, существенным плюсом такого подхода является то, что он позволяет сравнивать достаточно небольшие выборки по значительному числу полиморфных генов.

И хотя изучение генетической предрасположенности к различным мультфакториальным заболеваниям как область медицинской генетики быстро и активно развивается, становиться, очевидно, что ее совершенствование в будущем не возможно без развития методической базы, прежде всего, технологии биологических микрочипов, и выработки определенных методологических подходов, позволяющих анализировать полиморфизм по многим генам одновременно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Глотов, Андрей Сергеевич, Санкт-Петербург

1. Александров A.A. Повышенное артериальное давление в детском и подростковом возрасте (ювенильная артериальная гипертония) // РМЖ. 1997. Т. 9. Стр. 559-565.

2. Баранов B.C. Баранова Е.В. Иващенко Т.Э. Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности» (Введение в предиктивную медицину) // СПб. Интермедика. 2000.263с.

3. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. Научные основы предиктивной медицины. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике // Новосибирск. Альта Виста. 2003. Стр. 3-19.

4. Брязгунов И.П. Первичная артериальная гипертензия у детей и подростков // Вопросы современной педиатрии. 2003. Т. 2(3). Стр. 68-71.

5. Глотов A.C., Глотов О.С., Москаленко М.В., Рогозкин В.А., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Анализ полиморфизма генов репин-апгиотепзиновой системы в популяции Северо-западного региона России // Экологическая генетика. 2004. В. 4. Стр. 40-43.

6. Животовский J1.А. Популяционная биометрия // М. Наука. 1991.271с.

7. Коваленко С.П. Персонифицированный подбор лекарственных препаратов при онкологических заболеваниях. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике // Новосибирск. Альта Виста. 2003. Стр. 158-165.

8. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е., Заседателев A.C. 2004. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекуляр. биология. Т. 38. Стр. 5-16.

9. Ляхович В.В., Вавилин В.А. 2003. Фармакогенетика сегодня. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике // Новосибирск. Альта Виста. 2003. Стр. 20-27.

10. Нефедова Ю.Б., Шварц Е. Молекулярно-генетические механизмы развития артериальной гипертензии // Артериальная гипертензия. 1998. Т. 4. №. 1. Стр. 63-71.

11. Пузырев В.П. Генетика артериальной гипертензии (современные исследовательские парадигмы) // Клиническая медицина. 2003. Н. 1. Стр. 12-18.

12. Ратова Л.Г., Дмитриев В.В., Толпыгина С.Н., Чазова И.Е. Суточное мониторирование артериального давления в клинической практике // Клиническая фармакология и терапия Consilium medicum. 2001. Вып. 2. Стр. 3-4.

13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA // Москва. Издательство Медиа Сфера. 2003. 305с.

14. Фомина И.Г., Брагина А.Е. Достижения и перспективы в изучении генетических аспектов артериальной гипертензии // Кардиоваскулярная терапия и профилактика 2003. Т. 2(5). Стр. 90-92.

15. Шляхто Е.В., Конради А.О. Роль генетических факторов в ремоделировании сердечно-сосудистой системы при гипертонической болезни // Артериальная гипертензия. 2002. Т. 4. Н. 3.

16. Akhmedova S.N., Pushnova Е.А., Anisimov S., Bogdanova L.A., Bova L.K., Schwartz E.I. CYP2D6 genotyping in a Russian population using a novel approach for identification of the CYP2D6A mutation // Biochem. Mol. Med. 1996. V. 58(2). P. 234-236.

17. Benetos A., Safar M.E. Aortic collagen, aortic stiffness, and ATI receptors in experimental and human hypertension // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1996. V. 74(7). P. 862866.

18. Case-Green SC, Mir KU, Pritchard CE and Southern EM: Analysing genetic information with DNA arrays // Curr. Opin. Chem. Bio.l 1998. V. 2. P. 404-410.

19. Chistiakov D.A., Kobalova Zh.D., Tereshchenko S.N., Moiseev S.V., Nosikov V.V. Polymorphism of vascular angiotensin II receptor gene and cardiovascular disorders // Ter. Arkh. 2000. V. 72(4). P. 27-30.

20. Dufour C., Casane D., Denton D., Wickings J., Corvol P., Jeunemaitre X. Human-chimpanzee DNA sequence variation in the four major genes of the renin angiotensin system // Genomics. 2000. V. 1;69(1). P. 14-26.

21. Favis R., Day J.P., Gerry N.P., Phelan C., Narod S., Barany F. Universal DNA array detection of small insertions and deletions in BRCA1 and BRCA2 //Nat Biotechnol. 2000. V. 18(5). P. 561-564.

22. Flynn J.T. Differentiation between primary and secondary hypertension in children using ambulatory blood pressure monitoring // Pediatrics. 2002. V. 110(1 Pt 1). P. 89-93.

23. Fotin, A., Drobyshev A., Proudnikov D., Perov A., Mirzabekov A. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1515-1521.

24. Fox C.S., Heard-Costa N.L., Vasan R.S., Murabito J.M., D'Agostino R.B. Sr., Atwood L.D. Genomewide Linkage Analysis of Weight Change in the Framingham Heart Study // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. V. 15. P. 3197-3201.

25. Frossard P.M., Gonzalez P.A., Fritz L.C., Ponte P.A., Fiddes J.C., Atlas S.A. Two RFLPs at the human renin (ren) gene locus // Nucleic. Acids. Res. 1986. V. 27;14(10). P. 4380.

26. Frossard P.M., Lestringant G.G., Elshahat Y.I., John A., Obineche E.N. An Mbol two-allele polymorphism may implicate the human renin gene in primary hypertension // Hypertens. Res. 1998. V. 21(3). P. 221-225.

27. Frossard P.M., Lestringant G.G., Malloy M.J., Kane J.P. Human renin gene Bgll dimorphism associated with hypertension in two independent populations // Clin. Genet. 1999. V. 56(6). P. 428-433.

28. Gerold D., Rushmore T. and Caskey C.T. DNA chips: promising toys have become powerful tools // Trends. Biochem. Sei. 1999. V. 24. P. 168-173.

29. Giner V., Poch E., Bragulat E., Oriola J., Gonzalez D., Coca A., De La Sierra A. Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and salt sensitivity in essential hypertension // Hypertension. 2000. V. 35(1 Pt 2). P. 512-517.

30. Haywood G.A., Gullestad L., Katsuya T., Hutchinson H.G., Pratt R.E., Horiuchi M., Fowler M.B. ATI and AT2 angiotensin receptor gene expression in human heart failure // Circulation. 1997. V. 4;95(5). P. 1201-1206.

31. Heux S., Morin F., Lea R.A., Ovcaric M., Tajouri L., Griffiths L.R. The methylentetrahydrofolate reductase gene variant (C677T) as a risk factor for essential hypertension in Caucasians // Hypertens. Res. 2004. V. 27(9). P. 663-667.

32. Hilgers K.F., Langenfeld M.R., Schlaich M., Veelken R., Schmieder R.E. 1166 A/C polymorphism of the angiotensin II type 1 receptor gene and the response to short-term infusion of angiotensin II // Circulation. 1999. V. 28;100(13). P. 1394-1399.

33. Huber M., Losert D., Hiller R., Harwanegg C., Mueller M.W., Schmidt W.M. Detection of single base alterations in genomic DNA by solid phase polymerase chain reaction on oligonucleotide microarrays // Anal. Biochem. 2001. V. 1;299(1). P. 24-30.

34. Hubert C., Houot A.M., Corvol P., Soubrier F. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene//J. Biol. Chem. 1991. V. 15;266(23). P. 15377-15383.

35. Hunt C.C., Burley J.E., Chapman C.M, Beilby J.P. A high-throughput MS-PCR method on MADGE gels for ANG II type-1 receptor A1166C polymorphism // Physiol. Genomics. 1999. V. 31;1(2). P. 71-73.

36. Iqbal M.P., Mahmood S., Mehboobali N., Ishaq M., Fatima T., Parveen S., Frossard P. Association study of the angiotensin-converting enzyme (ACE) gene G2350A dimorphism with myocardial infarction // Exp. Mol. Med. 2004. V. 30;36(2). P. 110-115.

37. Jin J.J., Nakura J., Wu Z., Yamamoto M., Abe M., Chen Y., Tabara Y., Yamamoto Y., Igase M., Bo X., Kohara K., Miki T. Association of angiotensin II type 2 receptor gene variant with hypertension // Hypertens. Res. 2003. V. 26(7). P. 547-552.

38. Jones A., Woods D.R. Skeletal muscle RAS and exercise performance // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2003. V. 35(6). P. 855-866.

39. Kolchinsky A., Mirzabekov A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips // Hum. Mutat. 2002. V. 19(4). P. 343-360.

40. Landi S., Gemignani F., Gioia-Patricola L., Chabrier A., Canzian F. Evaluation of a microarray for genotyping polymorphisms related to xenobiotic metabolism and DNA repair //Biotechniques. 2003. V. 35(4). P. 816-820, 822, 824-827.

41. Landi S., Gemignani F., Gioia-Patricola L., Chabrier A., Canzian F. "MetaboChip" // Biotechniques. 2003. V. 35(4). P. 816-820, 822, 824-827.

42. Lifton R.P., Gharavi A.G., Geller D.S. Molecular mechanisms of human hypertension // Cell. 2001. V. 23; 104(4). P. 545-556.

43. Liljedahl U., Karlsson J., Melhus H., Kurland L., Lindersson M., Kahan T., Nystrom

44. F., Lind L., Syvanen A.C. A microarray minisequencing system for pharmacogenetic profiling of antihypertensive drug response // Pharmacogenetics. 2003. V. 13(1). P. 7-17.

45. Lipshutz R.J., Fodor S.P., Gingeras T.R. and Lockhart D.J. High density synthetic oligonucleotide arrays //Nat. Genet. 1999. V. 21. P. 20-24.

46. Lung C.C., Chan E.K., Zuraw B.L. Analysis of an exon 1 polymorphism of the B2 bradykinin receptor gene and its transcript in normal subjects and patients with CI inhibitor deficiency//J. Allergy. Clin. Immunol. 1997. V. 99(1 Pt 1). P. 134-146.

47. Masharani U., Frossard P.M. Mbol RFLP at the human renin (ren) gene locus // Nucleic. Acids. Res. 1988. V. 25; 16(5). P. 2357.

48. McCarthy J.J. and Hilfiker R. The use of single-nucleotide polymorphism maps in pharmacogenomics //Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 505-508.

49. Meyer J.M., Ginsburg G.S. The path to personalized medicine // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. V. 6. P. 434-438.

50. Mondry A., Loh M., Liu P., Zhu A.L., Nagel M. Polymorphisms of the insertion / deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension: surprising new findings and metaanalysis of data// BMC. Nephrol. 2005. V. 11;6(1). P. 1-10.

51. Mukae S., Itoh S., Aoki S., Iwata T., Nishio K., Sato R., Katagiri T. Association of polymorphisms of the renin-angiotensin system and bradykinin B2 receptor with ACE-inhibitor-related cough // J. Hum. Hypertens. 2002. V. 16(12). P. 857-863.

52. Naber C.K., Siffert W., Erbel R., Heusch G. Genetics of human coronary vasomotion // Arch. Mai. Coeur. Vaiss. 2004. V. 97(3). P. 255-260.

53. Naber C.K., Siffert W. Genetics of human arterial hypertension // Minerva. Med. 2004. V. 95(5). P. 347-356.

54. Nasedkina T., Domer P., Zharinov V., Hoberg J., Lysov Y., Mirzabekov A. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays // Haematologica. 2002. V. 87(4). P. 363-372.

55. Nazarov I.B., Woods D.R., Montgomery H.E., Shneider O.V., Kazakov V.I., Tomilin N.V., Rogozkin V.A. The angiotensin converting enzyme I/D polymorphism in Russian athletes // Eur. J. Hum. Genet. 2001. V. 9. P. 797-801.

56. O'Shaughnessy K.M. The genetics of essential hypertension // Br. J. Clin. Pharmacol. 2001. V. 51(1). P. 5-11.

57. O'Sullivan J.J., Derrick G., Griggs P., Foxall R., Aitkin M., Wren C. Ambulatory blood pressure in schoolchildren // Arch. Dis. Child. 1999. V. 80(6). P. 529-532.

58. Papp F., Friedman A.L., Bereczki C., Haszon I., Kiss E., Endreffy E., Turi S. Renin-angiotensin gene polymorphism in children with uremia and essential hypertension // Pediatr Nephrol. 2003. V. 18(2). P. 150-154.

59. Pastinen T., Kurg A., Metspalu A, Peltonen L. and Syvanen A.C. Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays // Genome. Res. 1997. V. 7. P. 606-614.

60. Pereira A.C., Mota G.F., Cunha R.S., Herbenhoff F.L., Mill J.G., Krieger J.E. Angiotensinogen 235T allele "dosage" is associated with blood pressure phenotypes // Hypertension. 2003. V. 41(1). P. 25-30.

61. Popov V., Fomicheva E., Kovalev J., Schwartz E. Absence of association between the angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and borderline hypertension in men of St Petersburg, Russia // J. Hum. Hypertens. 1996. V. 10(8). P. 557-559.

62. Procopciuc L., Popescu T., Jebeleanu G., Pop D., Zdrenghea D. Essential arterial hypertension and polymorphism of angiotensinogen M235T gene // J. Cell. Mol. Med. 2002. V. 6(2). P. 245-250.

63. Rupert J.L., Kidd K.K., Norman L.E., Monsalve M.V., Hochachka P.W., Devine D.V. Genetic polymorphisms in the Renin-Angiotensin system in high-altitude and low-altitude Native American populations // Ann. Hum. Genet. 2003. V. 67(Pt 1). P. 17-25.

64. Sachse C., Brockmoller J., Bauer S., Roots I. Cytochrome P450 2D6 variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic consequences // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. P. 284-295.

65. Sachse C., Brockmoller J., Bauer S., Roots I. Cytochrome P450 2D6 variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic consequences // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. P. 284-295.

66. Safar M.E., Lajemi M., Rudnichi A., Asmar R„ Benetos A. Angiotensin-converting enzyme D/I gene polymorphism and age-related changes in pulse pressure in subjects with hypertension // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004. V. 24(4). P. 782-786.

67. Sambrook J., Fritsch EP., Maniatis. Molecular cloning: a Laboratory Coldspring Harbour Lab. Coldspring Harbour. NY. 1989.

68. Takahashi N., Hagaman J.R., Kim H.S., Smithies O. Minireview: computer simulations of blood pressure regulation by the renin-angiotensin system // Endocrinology. 2003. V. 144(6). P. 2184-2190.

69. Takahashi N., Smithies O. Human genetics, animal models and computer simulations for studying hypertension // Trends. Genet. 2004. V. 20(3). P. 136-145.

70. Tanaka C., Kamide K., Takiuchi S., Miwa Y., Yoshii M., Kawano Y., Miyata T. An alternative fast and convenient genotyping method for the screening of angiotensin converting enzyme gene polymorphisms // Hypertens. Res. 2003. V. 26(4). P. 301-306.

71. Tillib S.V., Strizhkov B.N., Mirzabekov A.D. Integration of multiple PCR amplifications and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip // Anal. Biochem. 2001. V. 1;292(1). P. 155-160.

72. Wen S.Y., Wang H., Sun O.J., Wang S.Q. Rapid detection of the known SNPs of CYP2C9 using oligonucleotide microarray // World. J. Gastroenterol. 2003. V. 9(6). P. 13421346.

73. Whitcombe D., Newton C.R. and Little S. Advances in approaches to DNA-based diagnostics // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9. P. 602-608.c

74. Yu H., Zhang Y., Liu G. Relationship between polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene and the response to angiotensin-converting enzyme inhibition in hypertensive patients // Hypertens. Res. 2003. V. 26(11). P. 881-886.

75. Zhu X., Chang Y.P., Yan D., Weder A., Cooper R., Luke A., Kan D., Chakravarti A. Associations between hypertension and genes in the renin-angiotensin system // Hypertension. 2003. V. 41(5). P. 1027-34.117. Интернет-ссылки:1. Биочип: www.biochip.ru

76. Интернет сайт молекулярных биологов: www.molbiol.ru

77. Affvmetrix: www.affvmetrix.com

78. Amersham Biosciences: www.amershambiosciences.com

79. Applied Biosystems: www.europe.appliedbiosvstems.com

80. Asper Biotech: www.asperbio.com

81. GeneCards: www.bioinfo.weizmann.ac.il/cards/index.shtml8. Jurilab: www.jurilab.com9. Nanoeen: www.nanocen.com

82. National centre for biotechnology information (NCBI): www.ncbi.nlm.nih.gov1. Благодарности.

83. Говорю отдельное "спасибо" моим коллегам из Санкт-Петербургской педиатрической академии будущему д.м.н. Галине Игоревне Образцовой и Татьяне Степановой - за проведение совместной работы, сбор коллекции ДНК и тесное медико-биологическое сотрудничество.

84. Однако больше всего я благодарен своему брату Олегу, маме Ольге Владимировне, отцу Сергею Александровичу, брату Ярославу и жене Тане, без помощи которых, эта работа просто не состоялась бы, да и не имела бы никакого смысла.