Разработка хемилюминесцентных методик исследования плазмы и клеток крови для оценки состояния больных

Шерстнев, Михаил Пантелеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка хемилюминесцентных методик исследования плазмы и клеток крови для оценки состояния больных
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка хемилюминесцентных методик исследования плазмы и клеток крови для оценки состояния больных"

\х

^ На прайах рукомис

ШЕРСТНЕВ Михаил Пшипелеевич

РАЗРАБОТКА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ МЕТОДИК ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛАЗМЫ И КЛЕТОК КРОВИ ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ БОЛЬНЫХ

03.00,02. - биофизика

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РФ

Научные консультанты:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Владимиров Ю.А. академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Лопухин Ю.М

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Иванов И.И.

Доктор медицинских наук Никушкин Е.В.

Доктор медицинских наук, профессор Сороковой В.И.

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной

медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябина.

Защита диссертации состоится "_''_1997 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 084.66.01 в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РФ (119828 Москва, у л. М. Пироговская, Д.1а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

канд. биол. наук Мурина М.А.

ОЫЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной m основных юндеппип современно медицины за последние 20 лет является речкое расширение числа клпнпк< диагностических методов, сопряженное с автоматизацией и компьютеризации' поскольку 'но обеспечивает эффективность п быстроту получения пиформацн о состоянии здоровья пациентов []0 Л.Владимиров, 1987; Ю.М.Лопухпн и лр 1978; К).М Лопухин. 1984]. В частости, п в России ц за рубежом все больше распространение получают методы. основанные на пзмеренп хемплюмпиесценцип (XJI) биологических жидкостей и клеток организм [Ю.А.Владимиров и др., 1983; I-.McCapra ct al„ 1985; B.Rulh, 1979; C.Smitl 199(1]. Проведение таких исследований отличается быстротоП п удобство [G.Barnard el al., 1985; W.Seitz el al., 1985; K.Van Dyke. 1985]; в то же время с и помощью можно решать практические задачи общего клпнико-лабораторног обследования, в том числе проводить диагностику некоторых заболевани [L.Kricka et al., 1986; H.Meighen el al.. 1985; M.Pazzagli et al., 1985] профилактическое обследование больших контингентов населени ПО.М.Лопухин п др., 1982; Y.Vladimirov. 1986]. Высокая специфичное! некоторых хемнлюмпнесцентных методик позволяет применять пх для анализ активности ферментов п их субстратов [В.С.Данилов и др., 1981; W.Bostick i al., 1985; B.Branchini et al., 1985]. Кроме этого привлекательными качествам являются простота н сравнительная дешевизна аппаратуры [G.Pekoe, 198. K.Van Dyke. 1985; J.Wampler, 1985].

В большинстве исследований, посвященных использованию XJI в клиник< метод измерения ХЛ до настоящего времени применяли в качестЕ биохимического пли иммунологического теста: 1) Как одну из разновидносте биохимического анализа для определения концентрации определенны веществ; гормонов, антител, антигенов - метод пммуннофермеитного анализ [W.Bostick et al.. 1985; T.Gorimar. 1985; KAVulff, 1985]. 2) Для оценки состоят) рецепторнои системы фагоцитирующих клеток - хемилюминесценци стимулированных клеток [А.А.Барсуков п др.. 1983; 1986; В.М.Земсков. 1985 Вместе с тем осталось вне рассмотрения применение хемилюмпнесцентнот метода как одного из направлении клинического лабораторного анализа дл изучения свободнораднкальных реакций. Между тем исследование ХЛ, наряд с методами электронного парамагнитного резонанса спектрофотомстрическнмн методами [Ю.А.Владимиров п др., 1991], относится одним из основных инструментов изучения свободнораднкальных реакций биологических системах [Ю.А.Владимиров п др., 1972; П.П.Иванов и др., 1972 Как способ регистрации свободных радикалов хемилюмпнесцентнын мето чувствительнее большинства других используемых методов; электронног парамагнитного резонанса, НСТ-теста [О.В.Лебедева и др., 1986; F.Gorus et al 1979; L.Kricka et al., 1982].

Надо отметить, что в последнее время появился ряд сообщений применении ХЛ, связанной со свободнорадпкальпыми реакциями, для оценк состояння больных при различных заболеваниях [А.Н.Журавлев, 1972; 197. А.П.Журавлев и др., 1975]. Были проведены систематические нсследованп перекпепон ХЛ (ПХЛ) [А.К.Журавлев н др., 1988; Я.И.Серкиз и др., 1981]

железошпшипроканной XJ1 (ЖХЛ), используемой для оценки состояния больных при заболеваниях ночек и острых воспалительных заболеваниях органов брюшной полости [Р.Р.Фархугдшюв. 1984: Р.Г.Фатихов н др., 1977; Ю.Л.Федоров, 1974]. Изучалась XJI стимулированных клеток [R.Allen ct al.,1972; 1976; R.Allen, 1986], использовалась XJI в присутствии иероксидазы для определения антпоксидантноп активности биологических жидкостей [Т.Whitehead, 1994]. В каждом из этих исследований был использован какой-либо один метод и не было проведено сопоставление с другими хемплюминеспентнымн методами. Кроме того, в ряде случаев не были решены такие вопросы, как простота п быстрота измерения XJL не удалось добиться достаточной чувствительности, и для анализов требовалось использовать большие объемы крови.

Цель и задачи исследования. Целью работы было систематическое изучение XJI плазмы, клеток крови и некоторых биологических жидкостей для оценки состояния больных при различных заболеваниях, а также определение аитпоксндантноп активности плазмы крови этих больных хемилюминесцентнымп методами. Решение такой задачи предполагает адаптацию существующих методов регистрации ХЛ к условиям клшшко-лабораторного анализа. Такая адаптация включает в себя: 1. Уточнение механизма реакций. 2. Упрощение процедуры измерения ХЛ. 3. Уменьшение количества требуемого для анализа материала. Основное внимание в наших исследованиях было уделено повышению чувствительности методов для уменьшения объема пробы кровп и се составных компонентов; были поставлены также эксперименты, направленные на уточнение механизма наблюдаемой ХЛ в тех случаях, где оказалось это возможным.

В процессе данного исследования решались следующие конкретные задачи:

1.Разработка методик клинико-лабораторного анализа, основанных на регистрации хемнлюминесценцпн плазмы кровп в присутствии двухвалентного железа, н нх применение для оценки _ состояния больных с пшерлипопротендемнямн.

2.Разработка методик оценки ашиокислптсльпой активности (АОА) плазмы крови н лекарственных препаратов, основанных на пнгнбпровании железопнмцпированпой хемнлюминесценцпн модельных систем. и использование измерении АОА плазмы крови для оценки состояния больных гипертонической болезнью.

3.Разработка методик клпнпко-лабораторною анализа, основанных на регистрации хемилюмпнесценцип биологических объектов в присутствии перекиси водорода, и использование IIXJ1 для оценки состояния больных острыми сосудистыми заболеваниями.

4.Разработка методик клинико-лабораторного анализа, основанных на регистрации хемплюмннесцсппип цельной крови п слюны, п их применение для определения активности фшоцшов у i руины больных с различными воспалптелыплми заболеваниям п.

5.Разработка на основании полученных данных паучпо-пракшческнх рекомендации к применению каждою из перечисленных хемплюмпиесцсшпых методов и к.тииико-лаГюраторных псс.тедошжт.

Научная понизиа работы. Показано существование дв\ хемшноминссцен шых реакции при перекпепом окислении лшшдо! инициированном двухвалентным железом. Обнаружена активация красшеля.м родамином Ж и нильским еппим хемплюминссцсшшп лицидсодержапш биологических объектов, включая плазму крови. При этом усилен) интенсивности свечения » ряде случаев достигало 30-35 pas. Покачано, ш методики регистрации собственной н активированной железошпшнированно хемилюмпиесцсицип можно использовать оценки степени тяжест

состояния больных и степени выраженности патологического процесса пр гинсрлипопротендсмиях и воспалительных заболеваниях, в частности, пр остром перитоните.

Разработана методика измерения железоиниццпрованно

хемилюмннееценции для оценки антнокендантных свойств плазмы крови, также манннта, этанола и понола (разрабатываемых и уже используемых качестве лекарственных препаратов). Показано изменение аишоксидангны свойств плазмы крови больных гипертонической болезнью.

В качестве метода оценки состояния системы свободнорадпкалыюго пут разложения перекиси водорода была предложена регистрация перекисно хемплюмпнесцсицип плазмы крови и раневого экссудата. Показано увеличен! ПХЛ при тромботпческом состоянии гемостаза.

Разработана методика регистрации люминолзависнмо

хемилюмннссцешши лейкоцитов, стимулированной кристаллам труднорастворимых солен. Было показано, что степень увеличения вспышк хемняюмннесцешши коррелирует со степенью выраженности воспалнтелыюг процесса; это позволяет использовать данную методику для диагностик стадий и фаз в течении заболевании, а также для контроля за эффективность) лечебных мероприятий.

Теоретическая значимость работы. Показано существование дву хемилюмннссцентных реакций, протекающих при развити железоиннцннрованной ХЛ лппидсодержапшх систем. На основами полученных экспериментально-клинических данных обосновывается новс направление в проблеме клпнпко-лабораторного анализа для диагностик заболеваний. Показана принципиальная возможность использования комплекс хемилюмннссцентных методов в клинике. Использование метода регистрами XJI показало, что при заболеваниях человека и животных услови возникновения свободных радикалов и уровень свободнорадикальных реакцц могут значительно изменяться, восстанавливаясь до уровня нормы в хоi лечения. Проведено изучение особенностеП свободнорадикальных процессов организме при различных заболеваниях.

Практическая значимость работы. Разработаны новые направления неспецифичсскон п прогностической диагностике заболеваний, основанные н изменении различных видов XJI, пригодные для таких нозологических едншн как атеросклероз, воспаления, острые сосудистые заболевания. Получеинь представления о прогеканип свободнорадикальных процессов в организм были использованы для разработки практических мероприятий, к которы относятся диагностика, коррекция лечебных воздействий, оценка физике

химических свойств лекарственных препаратов, рекомендации по разработке способов лечения. Использование хемплюмннесцентных методик диагностики для коррекции свободнорадикального статуса больных позволило снизить частоту осложнений в течении заболеваний н повысить эффективность лечения больных.

На основе разработок хемплюмннесцентных методик диагностики и оценки состояния систем гомеостаза разработана специальная хемилю.минссцентная измерительная аппаратура. Разработаны и изготовлены в виде малой серии средства обеспечения проведения хемилюмннесцентного анализа, в частности, эталон хемилюминесценции СФХМВ-1 в количестве 65 штук. Эталон является уникальным изделием, не имеющим аналогов в мировой практике.

Измерение активированной родамином Ж железонннцинрованной хемилюминесценции сыворотки и плазмы крови позволяет выявлять больных с гиперлипопротеиденями и проводить объективную оценку тяжести нарушений перекисного гомеостаза у больных. Измерение антиокислптелыгоп активности сыворотки и плазмы крови позволяет выявлять нарушения в системе антиоксидантноп защиты у больных с ннфекционно-воспалительными заболеваниями и осуществлять контроль за эффективностью проведения лечебных мероприятий.

По результатам исследований разработаны способы диагностики, защищенные авторскими свидетельствами: I. A.c. № 694181 "Способ дифференциальной диагностики инфаркта миокарда от стенокардии''. 2. A.c. № 1118353 "Способ диагностики фаз в течении острого перитонита''. 3. A.c. № 1194396 "Способ дифференциальной диагностики инфаркта миокарда от хронической ишемической болезни сердца". 4. A.c. № 1209175 "Способ прогнозирования течения реларативного процесса в ране". 5. A.c. № 1285900 "Способ диагностики злокачественной опухоли". 6. A.c. № "Способ выявления сенсибилизации организма при аллергических заболеваниях''. 7. A.c. № 1545160 "Способ определения физической работоспособности человека". 8. A.c. № 1545162 "Способ оценки степени тяжести состояния больного флегмоной". 9. A.c. № 1553900 "Способ прогнозирования неблагоприятного течения флегмоны". 10. Пат. № 2077487 "Установка для очистки сточных вод''.

Разработан способ подбора сорбентов п оценки эффективности гемо- и лимфосорбции при остром панкреатите (рац. предложение № 0-2151 от 16.12.83), способ активации хемилюминесценции плазмы крови в присутствии попов Fe^+ (рац. предложение № 13 от 26.01.88), система регистрации хемилюмннесценцнп ПФХМВ-1 (рац. предложение № 18 от 15.08.88).

Разработанные методики использовались в научно-исследовательской работе н учебном процессе НИИ физико-химической медицины и Российског о государственного медицинского уннверсн i ета.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: II Всесоюзном сими. "Острая ишемия органов и ранние посгшнемнчсские рассфойства" (Москва, 1978): Всесоюзном сими. "Липиды биолгпчеекпх мембран" (Ташкент', 1980): Выездном заседании президиума нраил. BIIMOT (Poei ов-на-Дону, 1980); 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982): Паучно-прак конф. офчальмолоюв '¡ападион.

Восточной Сибири и Дальнею Востока "Фпшо.'югни » патология механизме лдашакпп органа "¡рения" (Владивосток, 1983); III Всесоюзном сьез; i acipoiiicpojioroi) (Москва. 1984); Всесоюзной конф. "М.В Ломоносов Север" (Архангельск, 1986); Симпозиуме "Ьпохемилюминесцепция в медпцш и сельском хозяйстве" (Ташкент. 1986); XYII сими. Европейского общее™ остеоаргрологов (Будапешт. 1988); YI Всероссийском съезде дерматологов венерологов" (Челябинск, 1989); Всесоюзном научной конф. "Оценк фармакологической активности химических соединений; принципы и подходы (Москва, 1989); Всесоюзной школе-семинаре бпотермохемилюмипеспенцн (Суздаль. 1990); 1-ой междунар. школе "Биологическое свечение" (Вроцла! 1990); Всероссийской научной конф. "Эфферентные методы в медицине (Анапа, 1992); Международной конф. "Клиническая хемплюминесценцп* (Берлин. 1994); Международной научной конф. "Школа академик Л.П.Черкеса: идеи, развитие, перспективы" (Киев, 199-4); Научно-практическо конф. "Актуальные проблемы военной и экстремальной медицины" (Москв. 1994); Научно-практической конф. "Организация медицинского обеспечен!! населения в чрезвычайных ситуациях" (Москва, 1994); 2-ом Российском liai конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995); 2-ом снмп. "Неиивазивнь методы диагностики" (Москва, 1995); Объединенной паучно-практпческо конф. отдела биофизики НИИ физико-химической медицины МЗМП РФ кафедры биофизики Российского государственного медицинског университета.

Результаты работы были удостоены бронзовой медали (удостоверение ï 21985 за 1987 г.) На экспозиции в павильоне "Здравоохранение" ВДНХ СССР.

Апробация работы проведена на совместном заседании отдела биофизик НИИ физико-химической медицины МЗМП РФ п кафедры биофизик Российского государственного медицинского университета (1996 г.). По тем диссертации опубликовано 78 печатных работ, включая 4 отдельные книги.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показано существование двух хем»люминесцентных реакций пр перекненом окислении лнпндов, инициированном двухвалентным железо s Первая является кнелородзавненмой, протекает в липидной фазе и, п< видимому, связана с рекомбинацией перекисных радикалов лнпндов. Вторг протекает в условиях низкого потребления кислорода и в основном в водно фазе.

2. Инициированная ионами Fe:+ хемилюминесценцня лнпидсодержащп объектов, включая плазму крови, может быть усилена в 30-35 раз красителям родамином Ж и нильским синим, которые действуют как физнческ! активаторы хемилю.минесценцпи.

3. Регистрация собственной п активированной железопниципрованно хемилюминесценцни может быть использована для оценки степени тяжест состояния больных и степени выраженности патологического процесса пр пшерлнпопротепдемнях н воспалительных заболеваниях, в частности, пр остром перитоните.

4. Измерение кинетики железошпщинрованной хемилюмииесценци липопротеидов яичного желтка позволяет определить антиокендантнуч

активность плазмы крови и ее составляющих частей, различных соединений, включая используемые в качестве лекарственных препаратов. Было показано, что при аппендиците происходит существенное подавление системы антпоксидантной защиты в плазме. С другой стороны, развитие осложнений при гипертонической болезни сопровождается увеличением антнокислнтелыюи активности плазмы крови.

5. В качестве метода оценки состояния системы свободнораднкального пути разложения перекиси водорода была предложена регистрация перекнсной хемилюминесценции плазмы крови и раневого экссудата. Было показано, что при тромботическом состоянии гемостаза происходит повышение интенсивности перекнсной хемилюминесценции плазмы, указывающее на усиление процессов свободнораднкального окисления в организме больных с этими сосудистыми заболеваниями. Было также обнаружено снижение перекнсной хемилюминесценции раневых экссудатов по мере заживления ран и предложено использование данной методики для контроля за эффективностью лазеротерапии ран.

6. Разработана методика регистрации люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов, стнмулнровапнной кристаллами труднорастворимых солен. Было показано, что при воспалительных и гнойно-воспалительных заболеваниях интенсивность стимулированной сульфатом бария вспышкп люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови выше, чем в норме; при этом степень увеличения вспышки хемилюминесценции коррелирует со степенью выраженности воспалительного процесса.

7. Разработанные методики могут быть использованы в качестве дополнительного показателя при постановке диагноза и оценке состояния больных, а также для контроля за эффективностью проводимых лечебных мероприятий.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 331 страницах машинописного текста, состоит из введения, ^четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа содержит 15 таблиц и 101 рисунков. Библиографический указатель литературы включает 247 отечественных и 263 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основу работы положен анализ результатов, полученных при проведении модельных экспериментов, в опытах на лабораторных животных и в клинике. Для решения поставленных задач в эксперименте была проведена работа па крысах и собаках для моделирования различных заболеваний и оценки методов лечения (рис. 1).

Число ЛШвОТМЫХ 35

JO 25 20 15 10 5 О

Рис. 1. Характеристика экспериментального материала: 1 - гипертензи (крысы), 2 - искусственное кровообращение (собаки), 3 - эмболи магистральных артерий (собаки), 4 - раны (собаки).

Клинический раздел работы представлен результатами исследована свободнорадикального статуса у 835 больных с различными заболеваниями i I. 6, 53, 55 городских клинических больниц г.Москвы. В качестве контрольно группы были обследованы 133 практически здоровых человека. Распределен! больных по нозологическим формам представлено в табл. 1.

У 161 больного хемилюминесцентные исследования осуществлялись динамике лечения с применением целенаправленных методов коррекци нарушений свободнорадикального гомеостаза.

Реактивы. Гепарнн кристаллический ("Chemapol"), L-гистидин и манни ("Reanal"), каталаза ("Boehringer"), перекись водорода ("Реахим"), пероксидаз хрена ("Serva"), бычин сывороточный альбумин и Tpi (гидроксиметиламннометан) ("Sigma"), Остальные реактивы - отечественнь марки 'хч".

Методы обследования больных. 1) Определение белкового состава плазм крови производили спектрофотометрическим способом в полиакриламидно геле фирмы "Реанал" (Венгрия) методом диск-электрофореза с последующе денситометрнен на приставке для скенннрования хроматограмм многоцелевому спектрофотометру МПС-50Л фирмы "Шимадзн" (Япония).

2) Состояние системы гемостаза оценивали по данны тромбоэластограммы на отечественном приборе "Тромб-1" в соответствии методическими рекомендациями В.А.Шестакова [1976].

3) Оценка содержания продуктов перекнсного окисления лнлпдов исследуемых образцах по цветной реакции с 2-тиобарбнтуровой кислото [R.Mcknight et al..1966].

4) Количество фосфолипидов в пробе определяли по неорганическом фосфору [P.Chen е( al., 1956].

5) Измеряли спектры флуоресценции [Ю.А.Владимиров и др.,1980] и спектры поглощения активаторов хемнлюмннесценции. Использовали водные и этанольные растворы в различных концентрациях.

Таблица 1. Распределение больных по группам заболеваний.

№ Заболевание Число

п/п больных

I Гипертоническая болезнь, 122

в том числе I стадии 22

II стадии 46

III стадии 54

2 Псориаз 102

3 Острая непроходимость артерий, 82

в том числе тромбоэмболии магистральных артерий

конечностей 56

артериальный тромбоз 26

4 Ревматоидный артрит 76

5 Острый венозный тромбоз 68

6 Острый аппендицит, 51

в том числе простои 28

деструктивный 23

7 Сиалозы и сиаладениты 48

8 Острый перитонит, 48

в том числе реактивная фаза 36

терминальная фаза 12

9 Послеоперационный период и раны 44

10 Осложнения атеросклероза, 43

в том числе ненаследственныи атеросклероз 27

семейная гиперлипопротеннемия II типа 16

11 Острая пневмония, 42

в том числе очаговая 26

крупозная 16

12 Флегмоны мягких тканей головы и шеи 36

13 Хронические заболевания печени, 30

в том числе вирусной этиологии 20

алкогольной этиологии 8

медикамснтознои этнологии 2

14 Инфекционно-аллергические заболевания, 25

в том числе туберкулез 13

острый вирусный гепатит 8

бронхиальная астма 4

15 Трофические язвы голени 18

Хемнлюмппсспентиые исследования. Измерения проводились па сиепнальн разработанном нами хемилюмпнометре ИФХМВ-1 (рис. 2). Прибор включает себя электронную часть, юоветное отделение н регист рирующее устройство.

Рис. 2. Схема хемилюминометра для измерени железоинициированной хемилюминесценции. Цифры: 1 - электромото механической мешалки, 2 - мандрен трубочки для введения раствор двухвалентного железа, 3 - темновая камера, 4 - шторка, 5 - блс фотодетектора.

Определяли следующие хемилюминесцентные показатели:

1) Интенсивность ЖХЛ в виде двух основных модификаций: собственна хемилюмннесценция и активированная хемилюминесценция сыворотки/плазм крови и выделенных из нее лнпопротеидов.

2) Антнокислительную активность и интибирование стационарно хемилюминесценции (ИСХ) сыворотки и плазмы крови в нескольки модификациях: в зависимости от модельной системы (желточные липопротеид (ЖЛП), рибофлавин) и в зависимости от используемого активатор хемилюминесценции желточных липопротепдов (родамин Ж, 6С, нильски синий, кумарин).

3) Интенсивность ПХЛ сыворотки/плазмы и цельной крови.

4) Интенсивность люмпнолзависимой хемилюминесценции цельно крови и смешанной слюны при стимуляции труднорастворимыми солями хемилюминесценция стимулированных клеток (ХСК): сульфатом бария (СБ) Ва804, карбонатом кальция - СаСОз, гидроокисью кальция - Са(ОН)г.

Большая часть из этих методик была предложена или усовершенствована данной работе (см.главы).

Общая характеристика хемилюминесцентных методов исследования и количество обследованных с их помощью лабораторных животных и больных представлены на рис. 3.

| 400

1 350

| 300

| 250

I 200

| 150 %

| 100

I 50

1 0

■ 172

152

333

жхл

АОА

194

я-

пхл

374

-11:

■-а

хек

Рис. 3. Общая характеристика хемилюминесцентных методов исследования и количество обследованных с их помощью лабораторных животных и больных. Столбики слева - число больных, справа - число лабораторных животных. Примечание: общее число обследованных меньше, чем суммарное число обследованных по отдельным методикам, т.к. одно лабораторное животное или больной в некоторых случаях обследовались с помощью двух и более методов.

Результаты обрабатывались по [-критерию Стьюдента [Б.С. Бессмертный, 1967]. В таблицах и на рисунках даны средняя величина±ошибка средней. В ряде случаев проводилась обработка в соответствии с клиническими статистическими показателями: рассчитывались точность, чувствительность и специфичность диагностики [Я.Оа1еп е! а!., 1975;

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение железошшцпированной хсмнлюминесценции как метод оценки нерскисного гомеостаза в организме

Между Интенсивностью ХЛ и скоростью перекисного окисления лппидов наблюдается качественный параллелизм, объясняемый обычно тем, что свечение обусловлено образованием продуктов в возбужденном состоянии в результате взаимодействия двух перокенраднкалов.

Однако, имеется ряд данных, не укладывающихся в эти представления. Tai при ношорных добавлениях ионов Fc^+ наблюдается примерно одинакова активация процесса ПОЛ с соответствующей убылью кислорода, тогда ка интенсивность хемилюмпнссцснтных ответов при этом непрерывно растс [Ю.А.Владимиров и др.,1972]. 11рн ферментативном п нефермеитативном ПО. в микросомах скорость процесса окисления примерно постоянна, а ХЛ растс почти линейно во времени (Т.Л.Александрова и др., 1971]. Эти и другие факт заставляют предположить, что по мере развития ПОЛ происходит увеличен! квантового выхода ХЛ, т.е. количества фотонов, деленное на число молеку. вступивших в реакцию (например, молекул кислорода).

В нашей работе вопрос об изменении квантового выхода ХЛ в хо/ перекисного окисления изучался более подробно.

После добавления ионов Fe-+ к суспензии ЖЛП наблюдалось развитие X. с выходом на плато через 12-15 мин (рис. 4). Выключение перемешнвани раствора (стрелка 1 на рис. 4), при котором резко снижалось поступлен! кислорода в суспезию вначале не приводило ни к каким изменениям и сравнению с образцом, в котором перемешивание продолжалось, но черс некоторое время (точка 2,'там же) ХЛ внезапно и резко падала, хотя н не д нуля (точка 3, там же). Объяснение наблюдаемого явления может заключаться том, что скорость ПОЛ слабо зависит от концентрации кислорода до тех по] пока последняя не достигнет очень низких величин. Поэтому на участке 1-(рис. 4) как скорость ПОЛ, так и интенсивность ХЛ не снижены по сравнению контрольным образцом. В точке 2 кислород исчерпан и это приводит к резком падению ХЛ.

Интенсивность ХЛ, 10 квант/с 4п

30 25

5 0

0 5 10 15 20 25 30

Время, мин

Рис. 4. Кинетика хемилюминесценции желточных липопротеидов присутствии ионов при отключении мешалки в момент времени Ь Пунктиром показана кинетика при постоянном перемешивании: 1

момент выключения мешалки; 2 - момент спада интенсивности свечения; 3 - уровень интенсивности хемилюминесценции в конце спада свечения; 4 - момент включения мешалки; 5 - момент достижения максимума хемилюминесценции; " время, в течение которого записывалась кинетика без перемешивания.

Очень существенно, что резкое падение ХЛ после выключения перемешивания наблюдалось на всех стадиях развития процесса, но время между моментом выключения мешалки и спадом свечения (т.е. между точками 1 и 2 на рис. 4) было разным в зависимости от того, на какой стадии процесса выключали мешалку. Зависимость между Ц и 12 приведена на рис. 5. Видно, что и почти линейно растет со временем Ц. Но это означает, что скорость потребления кислорода (V), которая обратна 12, падает по мере развития процесса (рис. 5, кривая 3).

Время 11. мин

Рис. 5. Зависимость интенсивности хемилюминесценции (1), интервала времени 12 (2) и величины V, характеризующей скорость потребления кислорода (3) от времени Ц. По оси ординат: 1 - интенсивность хемилюминесценции, 10^ квант/с 4п; 2 - время 12, мин; 3 -относительная скорость потребления кислорода, мин"1.

В факте снижения скорости ПОЛ (оцениваемой по V) со временем нет ничего удивительного, поскольку идет постепенное расходование участника процесса - двухвалентного железа и, возможно, также субстратов окисления. Важно, что, интенсивность ХЛ при этом растет. Отношение (интенсивность ХЛхкорость процесса), отражающее квантовый выход ХЛ. растет со временем еще более резко и увеличивается па несколько порядков величины за время от 1 до 15 мин. Все это указывает па то, что на стадии стационарной ХЛ включается

кнслородиезавнспмая реакция (или, по крайней мере реакция, идущая с очен шпкнм потреблением кислорода), которая и вносит на данном эта1 существенный вклад в высвечивание квантов ХЛ. Поэтому хотя расхо кислорода снижается, но квантовый выход ХЛ и ее интенсивность возрастаю что обусловлено развитием кислороднезависимой реакции.

'Гакнм образом, в развитии вспышки ЖХЛ можно выделить две фазы: преобладанием кнслородзависнмоп реакции (на стадии медленной вспышки) кнелороднезавпепмоп реакции (на стадии стационарной ХЛ).

В последнее время были получены данные, подтверждающие сугцествоваш двух хемилюминесцентных реакций при перекненом окислении лпппде [Е.Опеггппа е( а!., 1996]. Существование двух хемилюминесцентных реакций пр определенных условиях может увеличить количество информации, получаемо при измерении ХЛ.

Важной задачей медицинского хемилюминесцентного анализа являете увеличение интенсивности ХЛ, т.к. чем выше квантовый выход свечения, те меньшее количество биологического материала требуется для исследования.

Одним из решений этой проблемы может быть использование вещесп увеличивающих квантовый-выход ХЛ (активаторов). Нами была проведен работа по отбору активаторов ХЛ из числа различных флуоресцентны красителей. Было изучено более 60 различных соединений. Вначале нами бы изучен люминол. Однако, это соединение оказалось непригодным да активации железоинициированной хемилюминесценцна, т.к. пр взаимодействии с ионами железа люминол дает вспышку свечения даже отсутствии лкпидного материала.

Добавление в раствор плазмы крови таких красителей как акриднновы желтый, акридиновый оранжевый, ализариновый красный, . азобензо. бромфеноловый красный, бромфеноловый синий, бромфеноловый голубо! конго красный, метиловый синий, пропиловый красный, крезоловый красньп тпазпновый красный, судан Ж и флуоресцеин в концентрациях до 1-Ю-5 М I увеличивало интенсивности железоиннциированного свечения желточны липопротендов. В то же время некоторые другие красители (эозин, родамин 'Л родамин 6Ст, нильский синий, нильский красный и кумарины) увеличивал интенсивность ХЛ. Мы провели сравнение эффектов этих красителей боле подробно.

Эозин и родамин Ж не давали сами по себе медленной вспышки ХЛ реакции с ионами двухвалентного железа. Вместе с тем, они заметно усиливал интенсивность ЖХЛ в присутствии плазмы кровн. Так, в присутствии эозин интенсивность ЖХЛ плазмы кровн человека увеличивалась примерно в 2 раз: По сравнению с эозином родамин Ж активировал ЖХЛ в 5-6 раз сильнее (ри 6), не давая при этом реакции с раствором двухвалентного железа.

Хемилюминесценция. 10 квакт/с 4п

-Плазма

И±£Ж_'

15 20

Всемя, мин

Рис. 6. Кинетика железоинициированной хемилюминесценции гепаринизированной плазмы крови здорового человека в фосфатном буфере при активации эозином, родамином Ж и без активаторов (-РЖ).Стрелками отмечено введение раствора соли Яе2+ в конечной концентрации 2,5 мМ. Конечная концентрая липопротеидов сыворотки крови составляла 2 мг/мл по фосфолипиду.

Увеличение количества вводимой в кювету плазмы крови от 0 до 500 мкл, при конечной концентрации активатора 2-Ю-5 М, приводило к росту амплитуды медленной вспышки ХЛ активированной родамином Ж (рнс. 7). С увеличением количества плазмы крови при активации родамином Ж наблюдался прямо пропорциональный рост интенсивности хемилюминесценции. При активации эозином увеличение амплитуды вспышки ХЛ мало зависело от количества плазмы крови в кювете хемилюминометра.

В последующем нами была использована методика измерения ЖХЛ плазмы/сыворотки крови с применением родамина Ж в качестве активатора ХЛ. Для исследования достаточно 50 мкл плазмы крови, что отвечает современным требованиям лабораторного обследования больных. Основными параметрами активированной ЖХЛ были амплитуда медленной вспышки (Нм) и стационарный уровень ХЛ (Н). Эту методику использовали для обследования больных с гиперлнпопротеидемиями.

Измерение ХЛ проводилось при поступлении больных в городскую клиническую больницу №6 и многократно при проведении гемосорбционного лечения.

На рис. 8 показано сравнение типичных кривых ХЛ сыворотки крови здорового человека и больного с гиперлинопротепдемией при исследовании без родамина Ж и в присутствии родамина Ж в процессе лечения: до и после 1 смосорбций. Без активатора не обнаружено различия между практически здоровым донором и больным (сравните кривые слева п справа). Оказалось, что при использовании методики регистрации активированной родамином Ж хемплюмпнссценцпп в присутствии ионов даухвалешпого железа

Рис. 7. Зависимость амплитуды медленной вспышк железоинициированной хемилюминесценции плазмы крови здоровог человека от ее количества в присутствии различных активаторов.

Хелеэоинициированиая ХЛ сыворотки крови здорового человека и больного с гиперлипопротеидемией

Время, мим

Рис.8. Активированная родамином Ж хемилюминесценция сыворотк крови больного с гиперлипопротеидемией (справа) и здоровог

человека (слева). Обозначения: -РЖ - без активатора, +РЖ - в присутствии родамина Ж. В кювете: 50 мкл сыворотки крови, 20 мкл 1 мМ раствора родамина Ж в 5 мл фосфатного буфера рН 7,4 и 0,5 мл 25 мМ раствора соли Ре2+

интенсивность вспышки ХЛ у больного с гиперлипопротеидемией была значительно выше, чем у практически здорового человека. После снижения уровня липопротеидов в крови в результате гемосорбционного лечения интенсивность вспышки ХЛ снижалась. Измерение ХЛ сыворотки кровн без активатора до и после лечения дало практически одинаковые результаты (р< 0,05) - на рисунке не показано.

Было показано, что амплитуда медленной вспышки активированной родамином Ж ЖХЛ сыворотки крови возрастала в ряду от практически здоровых людей до больных с осложнениями атеросклероза и была максимальной у больных с гиперлипопротеидемией (рис. 9). Гемосорбция приводила к снижению амплитуды медленной вспышки активированной родамином Ж хемилюмпнесценции сыворотки крови через 1-7 суток после ее проведения. Это снижение сопровождалось улучшением клинической картины заболевания.

Рис. 9. Амплитуда медленной вспышки активированной родамином Ж железоинициированной хемилюминесценции сыворотки крови в норме (1), при осложнениях атеросклероза (2), при гиперлипопротеидемии II типа (3) и при гиперлипопротеидемии II типа после гемосорбции (4). * -р<0,05 относительно группы 1.

Аналогичные результаты были получены и при использовании в качестве параметра оценки интенсивности стационарной ЖХЛ сыворотки крови в присугствни родамина Ж (рис. 10).

Актияированнач родаминсм Ж хемилкмямесценция сыворотки крови в норке (1), при осложнениях атеросклероза (2) , при 171П II типа (3) и при ГЛП II типа после гемосорбции (4).

5 30

•5 20 г

5 1»

о X

в *

5 »

Рис. 10. Интенсивность стационарного свечения активирование родамином Ж хемилюминесценции сыворотки крови в норме (1), пр осложнениях атеросклероза (2), при гиперлипопротеидемии II типа (3) при гиперлипопротеидемии II типа после гемосорбции (4). * - р<0,0 относительно группы 1, ** - р<0,05 относительно группы 2.

Таким образом, статистический анализ результатов показывает, что имеете достоверная разница между различными состояниями у больных гиперлипопротеидемии, как фактором риска развития атеросклероза.

2. Изучение антиокиелнтельнон активности биологических объектов лекарственых веществ с помощью железоиницнированнон хемилюминесценцш

Сохранение организма от интенсивного протекания свободнорадикальны процессов осуществляется системой антиоксидантной защиты [Е.Б.Бурлакова др., 1975]. Изучение антиоксидантной активности веществ позволяет выбират наиболее эффективные антиоксиданты и дает информацию о механизме п действия на свободнораднкальные процессы рО.А.Владимнров,1987].

Для оценки антиоксидантной активности можно использоват хемплюминесцентный метод. В нашей работе этот метод был применен дл оценки АОА синтетических глнцерофосфолипидов. Было изучено 21 липидне соединение нового типа, представляющие собой глицерофосфолипиды остатками фенолов. Была построена зависимость относительной амплитуд стационарной хемилюминесценции от концентрации антиоксидантов в кювез (рис. 11). Антнокислнтельную активность измеряли как величину обратно концентрации исследуемого соединения, при которой величина параметр вспышки хемилюминесценции снижалась наполовину. Было установлено, чт несколько глнцерофосфолипидов обладали антиокиелнтельной активностью пределах 10^ моль"'. Эти соединения обладали примерно такой *

антиокислительной активностью, как и ионол, антнокпслительная активность которого составляла как раз 1,0010 ^ моль"'. Наибольшей АОА из глицерофосфолипидов обладала натриевая соль 1,2-дипальмитоил-гас-глицеро-3-(4-окси-3,5-ди-трет-бутилфенил) фосфата: Аа= 1,061О7.

Относительная амплитуда стационарной ХЛ, %

Рис. 11.Типичные графики зависимости интенсивности стационарной хемилюминесценции (выраженной в процентах от исходного значения) от концентрации антиоксидантов. По оси абсцисс: обратный логарифм концентрации исследуемых соединений. Вертикальные линии указывают концентрации соединений, при которых интенсивность ХЛ снижается на 50 %.

Таким образом, была доказана антнокислительная активность нового типа веществ, представляющих собой соединения глицерофосфолипидов с остатками фенолов.

При использовании в качестве стандартной хемилюминесцентной системы желточных липопротеидов без активаторов нами было установлено снижение антиокислительной активности супернатанта, оставшегося после отделения из сыворотки крови апо-В содержащих липопротеидов (апо-В ЛП). у больных острым деструктивным аппендицитом (рис. 12). Вначале было показано, что интенсивность вспышки ЖХЛ сыворотки крови у больных острым деструктивным аппендицитом была повышена в среднем на 80 %. Это может быть обусловлено тремя причинами. Во-первых, усилением окисляемости апо-В содержащих липопротеидов, являющимися субстратом перекисного окисления липидов, лежащим в основе железоинициированной хемилюминесценции. Во-вторых, увеличением количества апо-В содержащих липопротеидов в сыворотке крови. В-третьих, уменьшением АОА сыворотки крови. Нами было проведено изучение всех трех предположений. Оказалось, что интенсивность вспышки железоинициированной хемилюминесценции апо-В содержащих липопротеидов повышена у больных по сравнению с нормой, но не настолько.

чтобы быть явной причиной усиления интенсивности железонницннрованно хсмнлюминссненпии сыворотки крови. Уровень апо-В ЛИ у больных остры аппендицитом и у здоровых людей практически не различался. А вс антиокислнтельная акт ивность сыворотки крови у больных была, значительн ниже, чем в норме. Таким образом, по ряду хемилюмннесцентных показателе оцененных в комплексе можно судить о состоянии свободнорадиалыгог гомеостаза у больных. В данном случае у больных острым аппендицитом основе увеличения вспышки железошшцнированной хемилюминесценци сыворотки крови лежит снижение ее антиокнслительной активности.

Рис. 12. Изменение хемилюмннесцентных показателей свободнс радикального гомеостаза у больных острым аппендицитол Примечание: * р<0,05 относительно нормы.

В процессе динамического наблюдения за группой больных остры аппендицитом было установлено, что уже на следующие сутки после операци происходит повышение антиокнслительной активности супернатанта д нормальных значений (рис. 13).

В то же время интенсивность хемилюминесценции апо-В Л1 непосредственно после операции еще больше увеличивалась, с последующи снижением до нормальных значений к 7 дню после операции (рис. 14).

Однако, суспензия ЖЛП в качестве системы для изучения АОА имеет ря недостатков: низкую интенсивность свечения, сложность механизма самой К (свечение представляет собой результат протекания по меньшей мере дву хемилюмннесцентных реакций, см.выше). Поэтому нами была проведен оценка АОА различных объектов с использованием активаторов, в частносп родамина Ж, а также кумарина, нильского синего и нильского красного.

На рис. 15 приведены данные о влиянии антиоксиданта ионол (бутилированного гидрокснтолуола) на активированную родамин У хемилюминесценцию ЖЛП. Ионол снижал интенсивность медленной вспышки

АОА суп*рн»танта у Больных острый ляплндхцктон.

Время поел* олерждо, сут.

Рис. 13. Динамика антиокислительной активности супернатанта после осаждения из сыворотки крови апо-В содержащих липопротеидов больных острым аппендицитом. Здесь и на рис. 14 горизонтальные линии показывают значения удвоенной ошибки средней величины в норме. Примечание: * р<0,05 относительно исходных значений показателей.

Апо-В ЛП оыворотки у больных оотрьм Аппендицитом.

Время поел* операции, сут.

Рис. -.14. Динамика интенсивности стационарной хемилюминесценции апо-В содержащих липопротеидов сыворотки крови больных острым

аппендицитом. Примечание: * р<0,05 относительно исходных знамени показателей.

при использованных нами концентрациях до 60-70 % и замедлял развитт вспышки в четыре раза по сравнению с контролем, что проявлялось увеличении времени наступления максимума медленной вспышки до 4 мин.

Влияниб ионола на РЖ ЖХЛ

Время, иин

Рис. 15. Влияние ионола на активированную родамином ) хемилюминесценцию желточных липопротеидов в присутствии Fe2 Цифры у кривых - конечная концентрация ионола, в мкМ. В кювете 0, мл липопротеидов, содержащих 0,05 мг фосфолипида, 50 мк родамина Ж (1 мМ), 50 мкл ионола, 5 мл фосфатного буфера рН 7,7 0,5 мл 25 м M раствора соли Fe2*

При изучении действия антиоксидантов ингибирование ХЛ можн наблюдать либо при добавлении исследуемого вещества до введения соли Fe: (назовем этот эффект антиокислительной активностью, АОА), либо пост добавления антноксиданта fia стадии стационарной ХЛ (назовем эт ингибнрованисм стационарной XJI, ИСХ). Эти параметры в ряде случаев был разными даже для одного и того же вещества.

Значения антнокислительной активности по быстрой вспышке (AOAg антнокислительной активности по стационарному свечению (АОА) и ИСХ системе ЖЛП с родамином Ж для ряда известных ингибиторе свободнораднкальных реакции представлены в табл.2. Видно, что наибольше АО A Ç-, обладал ионол. На втором месте был альбумин, затем мочевая кислот, суперокснддисмутаза (СОД) и этанол. Антпокислнтельная актпвносл определяемая по быстрой вспышке, для СОД была в 25 раз меньше, чем АОА такого неспецифического антноксиданта, как альбумин [B.Hallivvell,l988 Наибольшим значением АОА также обладал ионол, затем альбумин, СО,? мочевая кислота и этанол Наибольшим значением ИСХ. как и в дву

предыдущих случаях, обладал понол, затем СОД. альбумин, мочевая кислота и этанол.

Таблица 2. Антнокислительная активность и ингибированне стационарной хемнлюминесцепцин некоторых типичных ингибиторов свободнорадикальных реакций, оцененные по методике регистрации активированной родамином Ж хемилюминесценции желточных липоиротендов.

Препарат АОА, АОА ИСХ

Этанол 0,27±0,2 0,64±0,02 0,43±0,05

Ионол (0,8±0,2) 105 (1,4±0,1) 105 (0,29±0,07) 105

Мочевая кислота (1,7±0,1) 103 (0,3±0,1) 103 (0,2±0,1) 103

Альбумин (25+1,8) 103 (12±1,0) 103 (11±1,1) 103

СОД (СОДн-СОД„) (1+0,1) 103 (7,8±0,3) 103 (22 ±1,7) 103

Примечания: Цифры - величины, обратные концентрации, вызывающей 50 % снижение ХЛ (М-1); СОД инактивировали нагреванием при 70 °С в течение 30 мин. Истинную активность СОД вычисляли как разницу между АОА нативной СОД и АОА ннактивированнон СОД.

Антиокислительную активность и ИСХ ингибиторов свободнорадикальных реакций определяли также с помощью активированной кумарином ЖХЛ. Значения АОАд, АОА и ИСХ для каждого исследованного вещества представлены в табл.3. Видно, что наибольшим значением АОА^ обладал ионол. На втором месте был альбумин, затем мочевая кислота и этанол. Наибольшим значением АОА также обладал ионол. затем идут альбумин, мочевая кислота и этанол. Следует отметить, что после ионола наибольшей ингибируютцей активностью в отношении изученных параметров хемилюминесценции обладал альбумин (в расчете на моль антиоксиданта). Последовательность убывания величин ингибирующих характеристик исследованных препаратов сохранялась при введении их на любом этапе развития ХЛ.

Некоторые ингибиторы свободнорадикальных реакций, в частности, ионол были изучены с помощью активированной нильским синим ЖХЛ. Ионол увеличивал латентный период ХЛ.

Использование модельной системы из желточных липопротеидов в качестве стандарта затруднено вариабельностью состава куриного желтка. Поэтому нами была разработана другая модельная система: растворы рибофлавина. Оказалось, что эти растворы давали как быструю, так и медленную вспышки ХЛ при введении ионов двухвалентного железа. Значения АОАд, АОА и ИСХ в рибофлавиновон системе были близки данным, полученным в суспензии

Таблица 3. Антиокислительиая активность и ннгибирование стационарно хемилюминесценцнн (М"') некоторых типичных ингибиторе свободнорадикальных реакций, оцененные методом регистрацн активированной кумарином железоинициированной хемилюмннесценци желточных липопротеидов.

Препарат АОА, АОА ИСХ

Этанол 0,96±0,9 0.66±0,08 0,5±0,08

Ионол (5,5±0,09) 105 (5,3±0.9) 105 (10+1.9) 105

Мочевая кислота (0.18±0,06) 103 (0.22±0,04) 103 (0,24±0,06) 103

Альбумин (4,5±0.5) 103 (3,0±0,5) 103 (2.9±0,6) 103

лнпопротеидов. Наибольшим значением ИСХ обладат ионол, затем шл альбумин, этанол и мочевая кислота.

При сравнении действия антиоксидантов в различных модельных система видно, что водорастворимые антиоксиданты (этанол, мочевая кислота) мене активны в лнпидных системах (ЖЛП), чем лииофильный антиоксидант - ионо. В водной модельной системе (рибофлавин) активность водорастворимы антиоксидантов по всем показателям увеличивалась, достигая значений ионол;

Нами была исследована антиоксидантная активность плазмы крови путе измерения степени тушения ХЛ при добавлении определенного количеств плазмы крови человека. Предварительные опыты показали, что величин АОА, полученные без родамина Жив присутствии родамина Ж близки п значениям, но интенсивность активированной родамином ~>

хемилюминесценцнн была выше. В среднем, уровень ХЛ уменьшался в 2 раз при концентрации плазмы крови 16 мкл/мл суспензии.

Было изучено изменение АОА плазмы крови у лабораторных животных экспериментальной гипертензией, а также у людей с гипертоническо болезнью. Все больные были разделены в зависимости от тяжести на группь больные с гипертонической болезнью без осложнений, больные гипертоническим кризом, больные с инсультом. В результате проведенног исследования было установлено, что при увеличении тяжести состояни больных гипертонической болезнью параллельно развитию осложнений в ряд; гипертоническая болезнь без осложнений - гипертонический криз - инсульт, величина хемнлюминесцентных показателей состояния антиоксидантно системы возрастала (табл.4). С увеличением тяжести заболевания наибольше увеличение отмечалось для АОАд. При этом наблюдалось достовернс различие между обобщенной группой больных гипертоническим кризом инсультом, с одной стороны, и больных гипертонической болезнью ос осложнений, с другой.

Нарушение антноксидантиого статуса организма у больны гипертонической болезнью проявлялось не только в увеличении АО. железопннциированной ХЛ рибофлавина, но и в снижении активности СОД каталазы. Таким образом, с помощью измерения АОА^ железонннциированно хемилюминесценции рибофлавина можно оценивать степень тяжести сосгоянп

Таблица 4. Хемилюмпнесцсптные показатели состояния антиоксидантной системы кропи у больных гипертонической болезнью при развитии у них осложнений.

Показатели Норма Гипертоническая болезнь без осложнений п=22 Гипертонический криз п=19 Инсульт п=18

Система ЖЛП+РЖ: aoar 0,32 ±0,04 0,33±0,04 0,3410,01 0,39±0,02 <

аоам 0,35±0,04 0,41 ±0.05 0,3410,04 0,3610,0!

ИСХ 0,30+0,03 0.2810.03 0.32Ю.04 0.2810,01

Система рибофлавина: aoar 0,43Ю,05 0,42 ±0,05 0,57±0,0б"" 0,4910,03

aoav( 0.35±0,04 0,37±0.04 0.39Ю.05 0.39±0,02

ИСХ 0,38±0,04 0,42 ±0,05 0.38±0,04 0,41+0,02

Примечания: * р<0,05 относительно здоровых людей, ** р<0,05 относительно группы больных с гипертоническим крупом, *** р<0,05 относительно группы больных гипертонической болезнью без осложнений.

больных гипертонической болезнью.

3. Псрекисная хемилюминесценция биологических объектов

Хемилюминесцентные реакции в присутствии перекиси водорода изучали уже в начале этого века [Н.Albrecht, 1928; K.Gleu et а1.,1935]. С диагностической целью ХЛ биологических объектов в присутствии НзО: стали исследовать в последние 10-15 лет.

Добавление перекиси водорода к плазме/сыворотке крови приводило к развитию хемилюминесценции. На рис. 16 представлена типичная кинетика вспышки перекпсной хемилюминесценции плазмы крови здорового человека. Видны следующие стадии вспышки: нарастание свечения (время нарастания вспышки 2-3 мин), максимум вспышки, спад к стационарный уровень хемилюминесценции.

Было показано, что при добавлении к сыворотке крови кролика азида натрия (NaNj), ингибитора гемсодержащнх ферментов [М.Г.Шафран,1981], вспышка XJI в присутствии Н2О2 исчезала практически полностью (рис. 17). Аналогичные результаты были получены при использовании перитонеального экссудата больных перитонитом. Эти опыты говорят о том, что в основе ПХЛ лежит реакция, катализируемая гемсодержащими белками.

Добавление к плазме (рис. 17) и перитонеальному экссудату (рис. 18) каталазы приводило к снижению вспышки ПХЛ. Таким образом, ПХЛ прямо зависит от пероксидазной, и обратно - от каталазной активности в исследуемых биологических жидкостях.

Хемилюминесценция, квант/с 4п

Время, мин

Рис.16. Измеряемые параметры вспышки перекисной хемилюму несценции плазмы и сыворотки крови. Стрелками отмечено момен открывания шторки (шт.) и момент введения раствора Н2О2 (ПВ Обозначения: Н - амплитуда вспышки хемилюминесценции максимальное ее значение, Т - время достижения максимальног значения интенсивности хемилюминесценции (так называемы индукционный период).

Амплитуда вспышки ХЛ. 10* квант/с 4П

ШЕ..... ИшЛаД

Контроль ЭДТА НЖК »^инолКат=лаза

Рис. 17. Интенсивность перекисной хемилюминесценции плазмы кров здорового человека при добавлении к ней различных вещест! Обозначения: ЭДТА - этилендиаминтетраацетат в исходно концентрации 2 мМ, НЖК - ненасыщенные жирные кислоты, НЖК Ретинол - НЖК с ретинолом в исходной концентрации 2 мМ, Каталаза

0,1 мг/мл раствор каталазы, Азид натрия - 15 мМ раствор азида натрия К 1 мл цитратной плазмы крови добавляли 3 мл фосфатного буфера рН 7,4. После введения добавок в объеме 0,2 мл и перемешивания раствора в течение 1 мин добавляли 6 мл 0,88 М раствора перкиси водорода. * - р<0,05 относительно контроля.

Амплитуда вспышки ХЛ. 10 квант/с 4п

Катэлэза, мг/мл

Рис. 18. Зависимость амплитуды вспышки перекисной хемилюми-несценции перитонеального экссудата от концентрации каталазы.

Однократная отмывка цельной крови в избытке 0,85 % растворе ЫаСЛ (физиологический раствор) приводила к более чем десятикратному снижению интенсивности вспышки ПХЛ. По-видимому, на поверхности форменных элементов крови находятся ассоциированные белки, обладающие пероксидазной активностью, которые удаляются при отмывании.

Метод регистрации ПХЛ плазмы крови был использован при обследовании 134 больных с острым сосудистыми заболеваниями (острые артериальные тромбозы, эмболии магистральных артерий конечностей, острые венозные тромбозы). Наряду с измерениями светосуммы ПХЛ были использованы показатели тромбоэластограммы, толерантность крови к гепарину, содержание фибриногена в крови, показатели фибринолнза и агрегации тромбоцитов и эритроцитов.

Проведенное исследование выявило повышение уровня перекисной хемилюминесценцин у больных с тромботическим состоянием гемостаза (рис. 19), которое соответствовало степени повышения тромботического состояния гемостаза, оцененного по принятым на кафедре факультетской хирургии 2-го Московского медицинского института критериям [В.А.Шестаков н др., 1976; В.С.Савельев и др., 1978]. Таким образом, данные ПХЛ могут быть использованы при диагностике тромботического состояния гемостаза у больных с острой сосудистой патологией.

20 г

/ЙЗ

гтт

¡¡¡»й

Норма Посттромботическое Н степень ' степень состояние

Рис. 19. Средние величины светосуммы перекисной хемилюмк несценции у больных с различным состоянием гемостаза. Обозначена I - тромботическое состояние I степени, II - тромботическое состояние степени, 1 - р<0,001 относительно нормы, 2 - р<0,01 относительн больных с посттромботическим состоянием, 3 - р<0,01 относительн больных с тромботическим состоянием II степени.

Представляло интерес изучить, с какими показателями систем свертывания, противосвертывающей системы крови и агрегационно активности коррелирует повышение перекисной хемилюминесценции.

Было показано, что ряд показателей системы свертывания кров статистически достоверно коррелирует с перекисной хемилюминесценцие (рис. 20). Так, для максимальной амплитуды тромбоэластограмм коэффициент корреляции был равен +0,61 (р<0.01).

Значения коэффициентов корреляции

Рис 20 Значения коэффициентов корреляции между светосуммо перекисной хемилюминесценции и показателями свертывани5

фибринолиза и агрегации форменных элементов крови. Обозначения: 1 - агрегация тромбоцитов при добавлении тромбина (п=13), 2 - Ма тромбоэластограммы (п=107), 3 - агрегация тромбоцитов при добавлении АДФ (п=13), 4 - уровень фибриногена в плазме крови (п=86), 5 - активатор плазминогена (п=22), 6 - антиплазмин (п=22), 7 -агрегация эритроцитов (п= 13), 8 - протромбиновый индекс (п=23), 9 - к тромбоэластограммы (п=107), 10 - Б тромбоэластограммы (п=104), 11 -г тромбоэластограммы (п=129), 12 - толерантность крови к гепарину (п=52), 13 - Т тромбоэластограммы (п=104), 14 - общий фибринолиз (п=37).

Таким образом, псрекисная хемилюминесцениия может дополнить имеющиеся коагулологические методики и указывает на степень выраженности патологического процесса, в данном случае, на степень тромботического состояния гемостаза у больных с острыми сосудистыми заболеваниями.

Нами было также изучено изменение интенсивности перекисной хемилюмпнесценцин в динамике у 69 больных. Всех больных разделили на 2 группы. В группу №1 вошли 22 больных с различными острыми сосуднстами заболеваниями, у которых но тем или иным причинам не проводилось консервативное лечение реополиглюкином, гепарином и никотиновой кислотой.

В группу № 2 вошли 47 больных, которым проводилось лечение реополиглюкином, никотиновой кислотой и гепарином по схеме, принятой в клинике факультетской хирургии лечебного факультета 2-го медицинского института им.Н.И.Пирогова. Эта группа была в свою очередь разделена на две подгруппы. Подгруппа № 2А состояла из 17 больных, которых лечили только консервативно. Подгруппа № 2Б состояла из 30 больных, лечение которых производилось после операции.

Как видно из рис. 21, у больных группы № 1 (традиционное лечение) происходило постепенное снижение интенсивности перекисной хемилюмпнесценцин, уровень которой на 2-ой неделе заболевания снижался на 21 % от исходного уровня.

Снижение хемилюминесценцни происходило и в группе № 2. Однако, у больных оперированных и неоперированных ход снижения несколько различался: так, у больных подгруппы № 2А на 1-3 сутки от начала лечения происходило статистически достоверное (р<0,05) снижение перекисной хемилюминесценцни на 35 % от исходного уровня. Затем на 4-7 сутки, т.е. после отмены внутривенного введения реополиглюкина и никотиновой кислоты у этих больных наблюдался резкий подъем интенсивности ПХЛ.

Одним из грозных по своим последствиям и весьма распространенным заболеванием является венозный тромбоз, как самостоятельное заболевание, так и тромбогическое осложнение после различных хирургических вмешательств. Особую опасность в плане эмболизации легочной артерии представляет флотирующий тромб. Поэтому диагностика в этом плане представляет особый интерес.

Светосумма хемилюминесценции, отн ед

60'

Срок лечения,

СУТ

Рис. 21. Изменение светосуммы за 3 мин перекисно хемилюминесценции в зависимости от применяемой терапт Традиционное лечение - группа №1, активное консервативное подгруппа №2А, после операции - подгруппа №2Б. * р<0,0 относительно исходного значения этой же подгруппы.

Среднее значение светосуммы вспышки ПХЛ у больных с окклюзирующи тромбом оказалось статистически достоверно ниже (р<0,01), чем у больных флотирующим тромбом и составляло в группе с окклюзирующим тромбом 36 3 отн. ед., В группе с флотирующим тромбом - 63±7 отн.ед.

Была произведена проверка чувствительности метода в отношени диагностики флотирующего тромбоза. В качестве границ доверительног интервала при вероятности 95% были взяты удвоенные ошибки средних. Дл окклюзирукмцего тромба они составили 31-42 отн.ед. Все, что было ниже 4 отн. ед., мы относили к окклюзирующему тромбу. Все, что было выше 49 от1 ед., относили к флотирующему тромбу.

Проведенный анализ показал, что всего из 22 больных правильный диагнс был поставлен у 20 больных (91%) и ошибочный диагноз - у 2 больных (9% Такие результаты позволяют рекомендовать данный метод к внедрению клиническую практику.

Нами было проведено обследование 55 больных с тромбоэмболиям магистральных артерии конечностей, 26 больных с артериальными тромбозам и одного больного с тромбоэмболией легочной артерии. Изучение Г1Х. плазмы крови у больных осуществляли в динамике до и в процессе лечения н 1-3, 4-7, 8-11 сут. Терапия проводилась реополиглюкин-гепариновой смесью никотиновой кислотой. Проведенное исследование у больных с острым окклюзнями магистральных артерий показало, что у всех больных данно категории, как и у больных с острой венозной окклюзией, в процесс антптромбогического лечения светосумма вспышки ПХЛ спижалас

Практически нормализация данного параметра ПХЛ наблюдалась на 8-11 сутки от начала лечения. Одновременно со снижением ПХЛ происходила нормализация клинически картины: исчезновение болен, улучшение общего состояния больных.

Таким образом, метод регистрации ПХЛ плазмы крови может быть применен в качестве дополнительного клиннко-лабораторного теста для выявления нарушений в системе гемостаза и для оценки адекватности проводимой антитромботической терапии у больных с острой окклюзией магистральных артерий и вен.

4. Изучение хемилюммнесценцни фагоцитов

Хемилюминесценция стимулированных клеток нашла широкое применение в клинической диагностике для обследования больных с различными заболеваниями. С помощью этого метода определяют способность фагоцитов крови генерировать активные формы кислорода в ответ на действие стимула. Заманчивым представляется измерение ХЛ цельной крови без выделения фракции лейкоцитов, которое было впервые предложено в 1980 г. [А.Ошбк! е1 а1.,1980]. Однако, при этом исследователи столкнулись с методической трудностью - экранирующим действием эритроцитов, которые поглощают ХЛ.

Для преодоления этой проблемы нами была разработана методика регистрации ХЛ фагоцитов цельной крови после добавления к ней труднорастворимых кристаллов сульфата бария.

Методика основана на том, что фагоциты крови адгезируют на тяжелые кристаллы сульфата бария и вместе с ними оседают на дно кюветы. Приближение за счет быстрого оседания стимулированных лейкоцитов к фотокатоду увеличивает светосбор. При этом сводится к минимуму эффект экранирования эмиттера ХЛ (рис. 22). Это позволило уверенно измерять кривые ХЛ при использовании всего 20 мкл крови.

Были подобраны оптимальные условия проведения анализов: время инкубации, концентрации ингредиентов. На основании полученных данных были выбраны концентрации, которые использовались при рутинном обследовании в клинике.

С помощью разработанной нами методики была обследована большая группа больных с различными заболеваниями. Результаты представлены в табл.5. Видно, что при большинстве заболеваний интенсивность ХЛ статистически достоверно изменяется по сравнению с нормой.

При этом заметное усиление ХЛ обнаруживается при воспалительных и инфекционно-воспалнтельных заболеваниях, таких как ювенильный ревматоидный артрит или туберкулез. При заболеваниях с пониженной легочной вентиляцией, например, бронхиальной астме, наблюдалось, наоборот, снижение интенсивности вспышки ХЛ цельной крови.

Представляло интерес изучить ХЛ клеток также и в тканях другой локализации, в частности, в слюне. Были обследованы группа практически здоровых людей и больных с сиалозамн и сиаладенитами различной степени тяжести заболевания.

Кювета

ФЭУ ФЭУ

Рис. 22. Схема распределения лейкоцитов по объему кювет разбавленной крови (слева) и после оседания фагоцитов вместе кристаллами сульфата бария (справа).

Таблица 5. Амплитуда вспышки стимулированной сульфатом барн люминолзависнмой хемилюминесценции цельной крови у больных различными заболеваниями._

N п/п Заболевание Число больных Н, 106 квант/с 4п

1 Бронхиальная астма 4 0,6±0,5

2 Острый вирусный гепатит 8 1,4±0,6

3 Норма 30 2,6+0,4

4 Хроническая гипертоническая энцефалопатия 36 3,4±0,5

5 Обострение гипертонической болезни 6 3,6±0,4

6 Хроническая ишемическая болезнь сердца 6 4,0±0,9

7 Гипертонический криз 21 4,9±0,5

8 Сиалозы и сиаладениты 48 7,2±0,7

9 Артропатический псориаз 18 7,3±0,6

10 Трофические язвы голени 18 8,9±1,8

II Ревматоидный артрит 46 9,7+1,1

12 Псориаз 84 9,8±2,1

13 Флегмоны мягких тканей головы и шеи 36 10,1 ±2,3

14 Ювенильныи ревматоидный артрит 30 11,8±1,5

15 Туберкуле; 13 16,4±2,4

Результаты проведенных исследований показали, что у практически здоровых лиц стимулированная сульфатом бария люмннолзавпенмая хемилюмпнссцениия слюны не наблюдалась (рис. 23). При легкой степени заболевания также не возникала вспышка ХЛ при добавленн сульфата бария к расгвору слюны. В процессе лечения при исследовании смешанной слюны было, однако, отмечено появление вспышки ХЛ у данной группы больных. Перед их выпиской при контрольном исследовании слюны ХЛ не была з а регистр иров а н а.

Рис. 23. Амплитуда вспышки хемилюминесценции смешанной слюны стимулированной кристаллами сульфата бария у больных сиалозами в зависимости от степени тяжести заболевания. Обозначения: Д - при поступлении, 1-2 - 1-2 нед. Лечения, П - при выписке. 1 - р<0,05 относительно больных с I степенью тяжести заболевания, 2 - р<0,05 относительно больных со И степенью тяжести заболевания.

В группе больных со II степенью тяжести заболевания при поступлении в клинику ХЛ слюны была обнаружена у всех больных. К концу лечения отмечалось увеличение амплитуды вспышки ХЛ. Наиболее высокая интенсивность вспышки ХЛ была обнаружена у больных с Ш степенью тяжести заболевания.

Таким образом, стимулированная сульфатом бария люмннолзависимая хемилюминесценция смешанной слюны наблюдалась при заболеваниях слюнных желез и отсутствовала у практически здоровых люден. Высокая чувствительность методики позволяет рекомендовать ее в качестве клинико-лабораторного теста для выявления ранних стадий сиалозов.

ВЫВОДЫ

1. Сравнение скорости потребления кислорода и интенсивности хемилюминесценции в с успензип липопротендов, подвергнутой Fe2+-иннцинроваиной пероксидацин, показало наличие двух реакций, ответственных за хемилюмннесценцию при перекисном окислении липидов. Первая протекает на ранних стадиях окисления липидов (стадии быстрой и медленной вспышек),

для нее характерно потребление больших количеств кислорода и относительн низкая интенсивность свечения. Вторая реакция сопровождается интенсивны свечением при низком потреблении кислорода (стадия стационарног свечения).

2. Обнаружена активация железошшциированной хемилюминесценцн рядом красителей и предложено их применение для клннико-лабораторног хемилюмннесцентного анализа. Показано, что родамин Ж и нильский сини позволяют усилить интенсивность свечения в 30-35 раз. В присутстви родамина Ж свечение наблюдается в основном в области 535-580 нм, а присутствии нильского синего - в области 400-450 нм. что соответствус максимумам их флуоресценции. Совокупность данных, включая измеренг накопления продуктов перекисного окисления липидов, позволило сделат вывод, что предложенные вещества действуют как физические активатор хемнлюмннесценции, сопровождающей перекисное окисление липидов.

3. При обследовании больных с гиперлипопротеидемнями показан увеличение активированной родамином Ж железоинициированно хемилюминесценции в 2,5 раза по сравнению с нормой, что можн использовать для оценки степени выраженности патологического процесс; Увеличение интенсивности свечения у больных с гиперлипопротеидемиям наблюдалось как на стадии медленной вспышки, так и на стади стационарного свечения. Эта методика может быть полезной для оценк эффективности проводимых лечебных мероприятий у больных данно категории.

4. Предложена методика определения антиоксидантной активност лекарственных препаратов и плазмы крови с использование железоиницнированной хемилюминесценции липосом, желточны липопротеидов и рибофлавина в фосфатном буфере. Методика заключается оценке степени ингибирования стационарной хемилюминесценции присутствии изучаемой пробы. Степень ингибирования интенсивност стационарного свечения может служить диагностическим критерием дл оценки состояние больных с нарушением в системе антиоксидантной защить При обследовании больных острым аппендицитом показано сннжеш антиокислительной активности сыворотки крови в 2,9 раза по сравнению нормой, при обследовании больных гипертонической болезни этот показател был, наоборот, в 1,4 раза выше, чем в норме.

5. В качестве метода оценки состояния системы свободнорадикального пуг разложения перекиси водорода была предложена регистрация перекисно хемилюминесценции плазмы крови и раневого экссудата. Перекпсна хемилюминесценция является обобщающим показателем, отражающи патологическое состояние системы гемостаза и зависящим от совокупног изменения ряда параметров системы свертывания крови, фибрннолиза агрегационноГ) активности форменных элементов кровн. При тромботпческо состоянии гемостаза происходит повышение интенсивности перекисно хемилюминесценцпн плазмы крови в 3,2 раза по сравнению с нормой, чт указывает на усиление процессов свободнорадикального окисления организме больных с острыми сосудистыми заболеваниями. '>ю нозволяс

предложить измерение интенсивности перекпсной хемнлюмпнесценцнп для прогнозирования и контроля за эффектпвиостыо проводимой терапии

6. Разработана методика регистрации люмиползавнспмоП хемплюминесценцни лейкоцитов, стимулированной кристаллами труднорастворимых солей. Введение сульфата бария в суспензию крови приводит к осаждению фагоцитов с одновременной их стимуляцией. Благодаря этому происходит приближение стимулированных фагоцитов к фотокатоду фотоумножителя. Это сопровождается уменьшением поглощения квантов света эритроцитами и, как следствие, к повышению чувствительности методики. Было показано, что при воспалительных и гнойно-воспалительных заболеваниях интенсивность стимулированной сульфатом бария вспышки люминолзавнеимой хемилюмннесценции цельной крови в 3,8-6,4 раза выше, чем в норме. Степень увеличения вспышки хемилюмннесценции коррелирует со степенью выраженности воспалительного процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Методика регистрации активированной родаминами хемилюмннесценции может служить адекватным тестом для скринингового обследования населения с целью выявления гиперлипопротеидемий.

2. Стандартную хемилюмпнесцентную систему на основе рибофлавина можно использовать для оценки антиокислительной и антирадикальной активностей различных химических соединений и биологических объектов.

3. Методика оценки антиокислительной активности по стационарной хемилюмннесценции с использованием в качестве модельной системы желточных липопротеидов в присутствии родамина Ж может быть использована для контроля за эффективностью проведения лазеротерапии у больных с острыми воспалительными заболеваниями органов дыхания.

4. Методику регистрации перекисной хемилюмннесценции плазмы крови можно использовать для оценки тромботнческого состояния гемостаза у больных с заболеваниями сосудов.

5. Методику регистрации люминолзавнеимой стимулированной сульфатом бария хемилюмннесценции цельной крови можно использовать для оценки способности фагоцитов крови генерировать активные формы кислорода в ответ на действие стимула. Это может быть использовано для оценки клеточного иммунитета у больных с различными заболеваниями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Журавлев А.К..Шерстнев М.П. Диагностическое значение метода сверхслабого свечения плазмы крови больных прн инфаркте миокарда и лечении острых окклюзпй магистральных артерий и вен // Физиология и патология сердца и сосудов: Тр. 2-го Моск. мед. ин-та. - М. ,1977. -С. 59-63.

2. Шестаков 13.А.,Киликовский В.В..Шерстнев М П. Определение степей ишемии у больных с эмболиями магистральных артерий конечностей помощью линейной дискриминантной функции по данным перекпсно хемилюминесценцни плазмы крови // Острая ишемия органов и ранш постишемическпе расстройства: II Всесоюзный симпозиум. - М. ,1978. -С. 22'. 223.

3. Горбунов Ф.Е.,Шерстнев М.П. Перекисное окисление при остро окклюзии магистратьных артерий конечностей н его значение в патогене: поражений нервной системы // Нарушения мозгового кровообращения: Тр. 2-г Моск. мед. ин-та. - М. ,1979. -С. 46-50.

4. Шерстнев М.П.,Курочкина Т.А. К вопросу профилактик тромбоэмболий легочной артерии // Новости мед. мед. техники. - 1979. - № 12. С. 27-35.

5. Шестаков В.А..Бойчевская Н.О..Шерстнев М.П. Хемилюминесценци плазмы крови в присутствии перекиси водорода // Вопр. мед. химии. - 1979. - Í 2. -С. 132-137.

6. Шестаков В.А..Истомин Н.П .Нупубидзе О.Б. и др. Сверхслабое свечеш плазмы крови при экспериментальной эмболии магистральных артерн конечностей // Бюлл. экспер. биол. - 1979. - № 9. -С. 304-306.

7. Шестаков В.А..Шерстнев М.П. Комплексный анализ кривой вспышк инпцнированного сверхслабого свечения биосубстратов // Биофизика. - 1979. № 2. -С. 363.

8. Шерстнев VI.П..Ли В.С.,Сергиенко В.И. и др. Перекисное окислен! липидов в мембранах эритроцитов при гнперхолестеринемии по данны хемнлюминеспентного метода // Липиды биологических мембран: Всесоюзны симпозиум. - Ташкент.1980. -С. 226-227.

9. Мурашко В.В..Журавлев А.К..Шерстнев М.П. Значение комплексног исследования при ишемической болезни сердца в целях дифференциации исключения ошибок // Материалы выездного заседания президиума правлени ВНМОТ: ВНМОТ. - М, 1980. -С. 18-19.

10. Мнсюлпн С.С..Дворжак М..Шерстнев М.П. и др. Некоторые сторон обмена эмбрионов при развитии в условиях изменения концентрацп простагландина Fia // Функциональная морфология эмбрионального развит» человека и млекопитающих: Тр. 2-го Моск. мед. ин-та. - М. .1981. -С. 71-77.

11. Ссргпенко В.И..Шерстнев М.П. Современное состояние гемосорбции ВНИИМИ: М„ 1981.- 88С.

12. Мурашко В.В..Журавлев А.К..Шерстнев VI.П. Новый мето дифференциальной диагностики инфаркта миокарда от стенокардии // Всесоюзный биофизический съезд: АН СССР. - М., 1982. -С. 164.

13. Шерстнев M.II .JIii В.С..Халилои ').М. и др. Хемилюминесценци эритроцитов разного возраста в присутствии перекиси водорода // Проб, гематологии. - 1982. - № 10. -С. 50-52.

14. Шерстнев М.П..Ссргпенко В.П.,Халилов 'ХМ. и д) Хемплюмппеспенция эритроцитов, насыщенных холестерином, в прпсутстви перекиси водорода // Биофизика. - 1982. - № 2. -С. 335.

15. I Перст ней M.II. Удаление ,-цером с помощью шелковой лигатуры // Хпруршя. - 1983. - № 4. -С'. 90-91.

16. Гусева М.Р..Клебанов Г.1I,Шерстнев МП. н др. Особенное! м лерекиспого окнслення у больных с патологией сосудистою тракта // Физиология и патология механизмов адаптации органа зрения: Науч. -пракг. конф. офтальмологов Зап. Вост. Сиб. Дальнего Востока. - Владивосток,!983. -С. 54-55.

17. Журавлев А.К.ЛПерстнев М.П..Мп:ьковец JI.II. и др. Корреляционные связи псрскнсной хемнлю.мннссценции и ряда клинических и биохимических показателен гомсостаза при ишемпческон болезни сердца // Атеросклероз: Тр. 2-го Моск. мед. пн-та. - М., 1983. -С. 53-56.

18. Журавлев А.К.ЛПерстнев М.П. Ранняя диагностика злокачественных опухолей // ВНПНМИ: М., 1984. - 61С.

19. Григорьев П.Я..Клебанов Г.И.Лковенко Э.П. и др. Перекисное окисление липпдов мембран гепатоцитов при хронических заболеваниях печени // III Всесоюзный съезд гастроэнтерологов: Всссоюзн. науч. общ-во гастроэнтерологов. - М., 1984. -С. 267-268.

20. Журавлев А.К.,Мурашко В.В.,Шерстнев М.П. и др. Мембраны эритроцитов при злокачественном росте//Бюлл. экспер. биол.- 1984. - № 11. -С. 596-598.

21. Гусева М.Р..Комаров О.С..Котяшева Г.II. и др. Комплексная клиннко-лабораторная оценка тяжести, эффективности лечения и прогноза увеитов у детей // Возрастные особенности органа зрения в норме и при патологии у детей: Тр. 2-го Моск. мед. ин-та. - М., 1984. -С. 66-72.

22. Марзоев А.И.,Клебанов Г.И.,Шерстнев М.П. и др. Перекисное окисление липидов сыворотки крови кроликов с различным тнреоидным состоянием // Вопр. мед. химии. - 1985. - № 2. -С. 14-16.

23. Журавлев А.К..Шерстнев М.П. Метод регистрации перекисной хемилюминесценцип плазмы крови //Лаб. дело. - 1985. - № 10. -С. 586-587.

24. Шерстнев М.П..Клебанов Г.И.,Владимиров Ю.А. Антиокислительная активность синтетических глицерофосфолипидов II Ж. физ. химии. - 1985. - № 9. -С. 2283-2286.

25. Каган М.А..Шерстнев М.П.,Герчнков А.Н. О влиянии ультразвука на хемилюмннесценцию влаги передней камеры глаза кролика // Новые методы применения ультразвука в офтальмологии: Тр. Моск. HI-III глазных болезней. -М., 1985. -С. 72-76.

26. Устинов А.В.,Теселкин Ю.О..Шерстнев М.П. и др. Хемилюминесценцня апо-В содержащих липопротепдов сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа при хронических заболеваниях печени // Диагностика и лечение хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы: Тр. 2-го Моск. мед. нн-та. - М., 1985. -С. 63-69.

27. Шерстнев M.II..Клебанов Г.И.,Сергиенко В.И. и др. Хемилюминесценцня липопротепдов сыворотки крови в диагностике гиперхолестерпнсмпп // Биохемилюминссценцня в сельском хозяйстве: Тр. MBA. - М„ 1986. -С. 71-74.

28. Сюсюкнн Ю. 11. .Филатов О.Ю., Шерстнсв МП. Пзмеиеш хемилюмпнесценции лейкоцитов пернфричсской крови при действи охлаждающего фактора // М.В.Ломоносов и Север: Всесоюзн. конф. - М., !98< -С. 459-461.

29. Ромм А.Р.,Шерстнев М.II..Клебанов Г.И..Волков В.В. п др. Действ! лазерного излучения на перекисную хемилюминесценцшо раневого экссудата Бюлл. экспер. биол. - 1986. - № ю' -С. -426-428.

30. Шерстнев М.П. Применение метода регистрации перекисно хемилюмпнесценции для диагностики продолженного тромбоза при эмболия магистральных артерий конечностей // Хирургия. - 1986. - № 12. -С. 118-120.

31. Шерстнев М.П.,Прибыш П.Г. Хемнлюминесцентное исследоват сыворотки крови при остром аппендиците II Хирургия. - 1987. - № 3. -С. 41-44.

32. Новокшонов А.И..Гукасов В.М.ДПерстнев М.П. и д] Хемилюминесценция сыворотки крови в присутствии двухвалентного желез при длительном искусственном кровообращении // Бюлл. экспер. бпол. - 1987. №7.-С. 104-106.

33. Файзиев Х.Н.,Шерстнев М.П. Перекпсная хемилюминесценция плазм крови при острой окклюзии магистральных артерий конечностей // Мед. >: Узбекистана. - 1987. - № 12. -С. 43-45.

34. Шерстнев МП. Хемилюминесценция плазмы крови при остро окклюзии магистральных артерий конечностей // Биохемилюминесценцня медицине и сельском хозяйстве: Фан. - М.. 1987. -С. 73-75.

35. Piryazeva N.,Piryazev A.P..Sherstnyov М.Р. et al. Whole blood and synovi: fluid chemiluminescence in rheumatoid arthritis // 17th symposium of the Europea society of osteoarthrology: Budapest.1988. -P. 61.

36. Владимиров Ю.А..Шерстнев М.П.,Пирязев А.П. и д) Квантомстрическая характеристика хемилюмпнесценции биологически объектов II Ж. прикл. спектроскопии. - 1989. - № 2. - С. 341.

37. Шерстнев М.П.Атанаев Т.Б..Владимиров Ю.А. Активирования родамином Ж хемилюминесенпия плазмы крови в присутствии ионе двухвалентного железа II Биофизика. - 1989. - № 4. -С. 684-687.

38. Петрова М.В.,Каухова О.Я..Каменных Е.В. и др. Состояние систем фагоцитирующих лейкоцитов в патогенезе хронических дерматозов // Всероссийский съезд дерматологов и венерологов: Минздрав РСФСР. - М 1989. -С. 460-461.

39. Шерстнев М.П..Атанасв Т.Б..Владимиров Ю.А. Система регистраци хемилюмпнесценции ИФХМВ-1 //Мед. Техника,- 1989.-№4.-С. 25-28.

40. Владимиров Ю.А, .Шерстнев M.II. Хемилюминесценция клето животных//ВИНИТИ: М„ 1989,- 176С.

41. Владимиров Ю.А.,Шерстнев М.П.,Пухальская В.Г. и др. Оцснк интенсивности хемилюмпнесценции спленоцнтов при воздействн пммуподепрессора биогенного происхождения. Возможности применения д:, скрппиша //Оценка фармакологической активности химических сосдннсши принципы п подходы: Мннмеднром СССР. - М.. 1989.-С. 65.

42. Юнусходжаев 'У.Бажанов II II..Владимиров Ю.А. и др. Метод оцснк состояния iяжести больных н npoi позирования клиническою течения пюГик

воспалительных процессов с применением хемплюмпнесценпип // С'тмаю.км пя - 1989. - № 6 -С 7-9.

-13. Чар таковский П.А. .Шерстнев МЛ.Лпрязев АН. и др. Клиническая оценка хемплюмпнесценпип цельной крови при ювепилыюм ревмаюидном артрите // Ревматология. - 1989. - № 4. -С. 39-42.

44 Владимиров IO.A..IUepcmeB МЛ.Лпрязев А.11. Стимулированная кристаллами сульфата бария хемилюминссценция лейкоцитов цельной крови II Биофизика. - 1989. - № 6. -С. 1051-1054.

45. Койчиев К.К.,Шерстнев M.1I.„Атанаев Т.Б. Изменение физико-химических свойств липидов тканей животных при экспериментальном канцерогенезе//Вопр. мед. химии.- 1989.-№ 6.-С. 143.

46. Шерстнев М П..Комаров О.С. Химия и биология нуклеиновых кислот // Просвещение: М., 1990. - 159С.

47. Атанаев Т.Б..Калинин В.В..Шерстнев МЛ. и др. Активация хемплюмпнесценпип, сопровожающей перекпсное окисление липидов в суспензии однослойных липосом // Биофизика,- 1990. - № 2.-С.269-272.

48. Шерстнев М.Г1. Тушение хемилюминесценцнп клеток плазмой крови // Методические указания Всесоюзной школы-семпнИСХ биотермохе.милюминесценция: Моск.ин-т ПКРРС.- М., 1990.-С.75-76.

49. Атанаев Т.Б.,Шерстнев М.П.,Владимиров Ю.А. Две фазы в развитии хемнлюминесценцин при перекисном окислении липидов, инициированном ионами Fc2+ II Биофизика.- 1990,- № 4.-С.6Ю-613.

50. Абдугафурова М.А.,Ли B.C..Шерстнев М.П. и др. Исследование антнокпслительных свойств глицирризиновой кислоты и их влияния на микросомальную монооксигеназную систему печени // Вопр.мед.химии.- 1989.-№ 5.-С.29-31.

51. Sherstnev М.Р. Chemiluminescent express-methods in clinical medicine // Biological luminescence: World Scientific.- Singapore, 1990,- P. 504 - 531.

52. Атанаев Т.Б..Мамаев О.М.,Азимбаев Т.К. и др. Инициирование перекпсного окисления липидов в плазме крови в присутствии фосфата железа // Здр. Киргизии. - 1989. - № 5.-С. 36-37.

53. Владимиров Ю.А..Шерстнев М.П. Основы хемилюминесцентного диагноза // Биофизические методы диагностики: Тр. 2-го Моск. мед. ин-та,- М., 1990.-С. 3-40.

54. Шерстнев М.П. Аденилциклазная система регуляции хемилюминесцентного ответа фагоцитов // Вопр.хемилюминесценцпи - 1990.-№ I.-C. 1-7.

55. Шерстнев М.П. Методиа регистрации активированной родамином Ж хемилюминесценцнп плазмы и сыворотки кровп в присутствии ионов двухвалентного железа// Вопр.хемнлюминесценцин.- 1990- № I.-C. 19-2!.

56. Шерстнев М.П. Кальцпйзависимый и кальцийнезависимый пути генерации хемилюмпнесценцип клеток // Вопр.хемилюмпнесценцпп.- 1991.- № 2.-С. 1-4.

57. Шерстнев М П. Методика определения антнокис.пптелыюй активности химических соединений и биологических объектов с помощью регистрации

хсмнлюминесценцпп в присутствии ионов двухвалентного железа Вопр.,хемнлюминесценцни.- 1991.- № 2.-С 13-15.

58 Шерстнев МП. Значение хемилюминеспентных исследований клинической медицине//Вопр.хемп.тюмпнеспенпин - 1991.-№ 1.-С. 5-10.

59 Шерстнев М.П. Методика регистрации перекисиой хемнлюминесценцп плазмы и сыворотки крови // Вопр.хемплюминесценцип.- 1991,- № 1.-С. 16-18.

60. Шерстнев М.П. Методика регистрации люминолзавнспмо хемнлюминесценцни цельной крови стимулированной кристаллами сульфат бария // Вопр.хемнлюмпнесценцпп.- 1991,-№ 2.-С. 20-22.

61. Yladimirov Y.A..Sherstnev М.Р. Biophysical chemiluminescent analysis Sov. Med. Rev. B. Phvsicochemical Aspects of Med.- 1991.- V. 2.-P. 1-43.

62. Шерстнев М.Г1. Стимулированная хемнлюминесценция лимфоците периферической крови // Вопр.хемплюминесценцип.- 1992,- № 1.-С. 15-17.

63 Шерстнев М.П. Нормированная железопнициированнг хемнлюминесценция апо-В содержащих липоиротеидов в процесс гемосорбцпп при экспериментальной гиперхолестерннемии // Эфферентнь методы в медицине: Всеросс. научн. конф.- М.,1992.-С. 152-153.

64. Владимиров Ю.А .Шерстнев М.П..Азимбасв Т.К. Оценк ангиокнелптельной и антирадикальнон активностей веществ и биологически объектов с помощью железоинициированной хемнлюминесценцни Биофизика.- 1992.- № 6.-С. 1041-1047.

65 Vladimirov Y.A..Atanayev T.B..Sherstnev М.Р. Enhancement < chemiluminescence associated with lipid peroxidation by rhodamine dyes // Fri Radical Biol. Med.- 1992,-N1.-P. 43-52.

66. Sherstnev M.P. Effect of glycvrrhizic acid salts on the blood phagoevtt chemiluminescence // Clinical chemiluminescence: Intern. Conf.- Berlin. 1994.-P. DK

67. Sherstnev M.P.,Pir\a/.ev A.P..Vladimirov N.V. Barium sulfate-stimulate luminol-dependent chemiluminescence of whole blood in diagnostics // Clinic; chemiluminescence: Intern. Conf.- Berlin. 1994.-P. D27.

68. Козловский IO.I I..Шерстнев М.П.Лирязев А.П. н др. Влпяш облученного феназепама на стимулированную сульфатом барг люмиползавпепмую хемилюминесценцню цельной крови человека Актуальные проблемы военной и экстремальной медицины: МО РФ,- М.. 1994 С 297-298.

69. Шерстнев М.П., Козловский Ю.ПЛнрязев А.П. и др. Влияш облученного феназепама на стимулированную сульфатом барг люмпнолзависимую хсмилюминесцснцию цельной крови человека Международная научная конференция: "Школа академика А.II.Черкеса: иде| развитие, перспективы": Наукова думка.- Киев. 1994. -С. 54.

70. Козловский Ю.II..Шерстнев М.П Методология и методы оценк последствий радиационного воздействия на лекарстенные препараты Opi анпзацня медицинского обеспечения населения в чрезвычайных еппаппя. ВЦМК "Защита".- М.. 1994-С. 92-93.

71. Шерстнев М.П.. Козловский IO II..Владимиров Ю.А. н ;t| Хемнлюмннесценгный меюд в оценке изменений свойств лекарственны пренар.'пов после радпаниопою облучения // Opi апнзация меднцннско!

обеспечения населения в чрезвычайных сш гацпях. BI |МК "Защита".- М.. 1994 -

С 96.

72 Козловский ЮЛ [..Шерстнев М.11,,Жиляев К.Г. и др. Оценка качества облученных лекарственных средств хемплюмииссценшым меюдом // 2-ой Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": РЦ "Фармсдннфо",- М., 1995. -С. 51.

73. Владимиров Ю.Л.,Шсрстнсв М.П..Азнмбасв Т.К. Активированная кумарином хемилюминесценция лнпопротепдов низкой плотности в присутствии ионов двухвалентного железа // Биофизика.- 1995.- № 2.-С. 323-327.

74. Шерстнев М.П.,Азимбаев Т.К..Владимиров Ю.А. Активированная нильским синим железопшшнпрованная хемилюминесценция желточных липопротеидов // Биофизика.- 1995.- № З.-С. 531-535.

75. Владимиров Ю.А..Шерстнев М.П.Лирязев А.П. и др. Оценка свободнораднкального гомсостаза у больных с помощью стимулировапнной сульфатом бария хемилюминесцспцнн слюны // Неинвазивная диагностика: НИИ ФХМ,- М.. 1995. - С. 44.

76. Lopukhin Y.M.,Shersinev М.Р. Clinical application of the chemiluminescence // Phys.Chem.Biol.Med.- 1995,- v.2,N2.-P. 65-73.

77. Владимиров Ю.А..Шерстнев M.П..Грудина Н.В. и др. Хемилюмннесцентный метод при обследовании животных, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения II Бюлл. экспер. биол. - 1996,- № 1.- С. 39-41.

78. Шерстнев М.П.Лирязев А.П.,Саидкаримова У.А. и др. Стимулированная сульфатом бария хемилюминесценция цельной крови и смешанной слюны у больных спалозами и хроническими сналаденнтами // И м м у нология, 1996,№6,68-69.

Информация о работе

Шерстнев, Михаил Пантелеевич
доктора медицинских наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы