Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хемилюминесценция фагоцитов цельной крови, стимулированная кристаллами сульфата бария

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Хемилюминесценция фагоцитов цельной крови, стимулированная кристаллами сульфата бария"

на правах рукописи

РГ6 о/!

2 0

ШРЯЗЕВ Алексей Павлович

ХЕШШМШЕСЦЕНЩШ ФАГОЦИТОВ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ, СШ1ШРОВШШ1 КРИСТАЛЯШ! СУЛЬМГА ВАР1Ш

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ Российской Федерации.

Научный руководитель: академик РАШ, доктор биологических наук, профессор Владимиров Ю.А.

Официальные оппонент:

доктор биологических наук, профессор Журавлев А.И., доктор медицинских наук Журавлев А.К. '

Ведущая организация:

институт биохимической физики ш. Н.М.Змануэля РАН

Защита состоится "____"............1697 г. Б "..." часов

на заседании диссертационного совета Д.084.66.01 в Научно-исследовательском-институте физико-химической медицины Ш Российской Федерации по адресу: 119328, Москва, ул. Малая Пироговская, д.1-а.

С диссертацией молшо ознакомиться в библиотеке института фязико-хданческой медицины Ш Российской Федерации.

Автореферат разослан "____" ...............1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук_

Мурина U.к.

■ Сблая ^иггк?ргст:*ка ргбага

Актуальность исследования. В современном мире существует жого болезней, обусловленных инфекционным началом. Эпидемическая обстановка в отношении инфекционных болезней и болезней связанных с нарушением клеточного иммунитета, в различных частях дара, вгапочая и развитые страны, время от . времени достигает опасной напряженности. Ватаость проблемы распространения инфек-дий определяет значимость иммунологических исследований и, в частности, исследований клеточного иммунитета.

Важную роль в обеспечении клеточного иммунитета играют по-ишорфно-ядерные. легасоциты (1МП) к мононуюхеарные. фагоциты. От ix деятельности зависят реакции фагоцитоза и продукция гуморальных неспецифических факторов защиты (А.Н.Иаянский, 1989). Отме-гаэтся, что ГШ принимают участие в опосредованных антителами йшунных реакциях организма (Р.Б. Колвин, 1983). В более широком аспекте изменение функции фагоцитов наблюдается при любом повреждении тканей.

Функциональная активность фагоцитов проявляется под действием различных" стимулирующих факторов. При стимуляции клеток развивается "дыхательный взрыв", под которым понимает резкое 'силение потребления кислорода стимулированными фагоцита,®. При фагоцитозе ПМЛ и тканевые макрофаги генерируют активные формы скслорэда (АФК), которые разрушают мембраны бактерий, способствуют лизису чужеродных, объектов ливосомальными ферментами и, дадовательно, определяют бактерицидную активность фагоцитов.

Существует ряд методов изучения АФК: спектрофотометричес-ий, флуорометрический, биохимически! с использованием различных химических веществ (щгаохрома С, нитросинего тетразолия, тайро-¡а, адреналина), метод электронного парамагнитного резонанса. )собое место среди них занимает хемилюминесцентный метод.

Многими исследователями показано изменение интенсивности •.е}яиюшшесценции выделенных ГШ относительно нормы при бактериальных инфекциях, неспецифических воспалительных заболеваниях, ■иперхолистеринемш, хроническом граяулеиатозе, дефиците миело-героксидазы, метшгите, пиотораксе, хронической почечной недос-■аточности, инфаркте миокарда и онкологических заболеваний (Van tyke К. ,1986). Дня исследования НАД выделяют в градиенте плот-ссти с использованием различных реагентов. Однако, изучение хе-

милюминесценции (ХЛ) фракционированных клеток связано со зказд тельными трудностями препаративного характера.

В последнее время получила распространение методика регим рации ХЛ цельной крови. Простота процедуры измерения поаволяе использовать эту методику в клинической практике. Недостатке этой методики является необходимость учитывать экранирующий зд фект эритроцитов, входящих в состав цельной крови.

Хемилюминесцентный ответ возникает при действии на фагоцич различных стимуляторов (Владимиров Ю.А., 1989). Все они вызывай: вспышку ХЛ. Тем не менее, следует указать, что стимуляция фаге цитоза , плохо поддается стандартизации, что, в свою очередь ухудшает воспроизводимость хемилюминесцентных измерений.

Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы был; разработка простой и удобной для клинического применения методу ки регистрации ХЛ фагоцитов цельной периферической крови, дающе возможность оценивать их способность генерировать активные фор^ гаслорода. Для достижения указанной цели требовалось решеня следующих задач:

1) разработать способ стимуляции-фагоцитов цельной крови позволяющий достаточно просто, быстро и с хорошей воспроизводи мостыо определять их способность генерировать активные форм кислорода; ^

2) исследовать основные особенности генерации ХЛ фагоцитам цельной крови, при их. стимуляции кристаллами сульфата бария;

3) изучить стимулированную кристаллами сульфата бария X фагоцитов цельной крови больных некоторыми острыми и хронически ми воспалительными заболеваниями..

Научная новизна работы. Впервые разработана и предложен для клинического применения методика регистрации стимулирование кристаллами сульфата бария ХЛ фагоцитов цельной крови. Изучен основные особенности, -генерации ХЛ фагоцитами цельной, крови присутствии кристаллов сульфата бария. Проведен корреляционны анализ между амплитудой вспышки ХЛ и клинико-лабораторными пока зателями. Показано увеличение амплитуды вспышки ХЛ фагоцито цельной крови при ряде острых и хронических воспалительных забо леваний.

Практическое значение работы. Предложен новый класс стимуляторов фагоцитоза - труднорастворимые кристаллы сульфата барил. Применение этого стимулятора значительно упрощает использование хемилюминесцентного метода для изучения функциональной активности фагоцитирующих клеток. Разработана методика регистрации люми-под-зависимой хемилюминесценвди фагоцитов цельной крови, позволяющая определять степень активности воспалительного процесса, например, при ревматоидном артрите, ювенидьном ревматоидном артрите, флегмонах, а так ле контролировать эффективность проводимых лечебных мероприятий.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XVII Симпозиуме Европейского общества остеоартрологов (Будапешт, 1988), IV научной конференции молодых учепих НИИ физико-химической медицины КВ РФ, VI Всеросийском съезде дерматологов и венерологов (Москва, 1989), Международной научной конференции "Школа академика А.И.Черкеса: идеи, развитие, перспективы" (Клев, 1994), Международной конференции: "Клиническая хемшпоминесценция" (Берлин, 1994), конференции отдела биофизики НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Получено 2 авторских свидетельства на изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, включая 29 рисунков и 9 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Библиографический указатель содержит 131 источник.

Со^ргзйкта работа

• Материалы и- методы исследования. Объектом исследования слу-гжда цельная кровь кроликов и человека. Кровь у кроликов брали из ушной вены в объеме -1 мл с 5% раствором цитрата натрия в качестве антиксагулянта. 'Соотношение крови и цитрата натрия 4:1. У

- Б -

людей кровь брали из подушечки четвертого пальца левой руки объеме 80 мкл с добавлением 20 мкл 5% раствора цитрата натрия. Д проведения анализов кровь хранили от 30 -минут до 6 часов при тем пературе около +4°С. Регистрацию ХЯ проводили на хемилюминометр лабораторного изготовления, собранным из стандартных блоков. Де тектором свечения служил ЮУ-127. При измерении свечения переме шивания среды измерения не производили. Температура инкубацн среды при измерении составляла +37 ± 1°С.

Для регистрации кинетики ХЯ использовали среду следующег состава (мМ): 165 NaCl, 15 трис-НС1, .2.25 Са012, 25 BaS04 (pH 7.4 ± 0.05). Сульфат бария находился в этой среде в виде сус пензии. Для ее приготовления смешивали равные объемы 0.2 М раст вора ВаС12 и 0.2 М раствора Na2S04. Люминол в концентраци 1.13'Ю"2 М растворяли в диметклсульфоксиде и использовали зт раствор как маточный. Непосредственно перед измерением маточны раствор люминола разводили в дистиллированной воде в 80 раз. Из мерение интенсивности XJI проводили в кварцевых кюветах, диаметре 22 мм, без перемешивания, при температуре +37°С. При этом в кове ту наливали 1 мл среды и 0.1 мл рабочего раствора люминола. В зт систему добавляли 20 мкл цельной ■крови-. После - добавления -кров встряхивали и ставили в темновую камеру хемилюминометра. При это форменные элементы крови оседали на дно кюветы, установленной на фотокатодом ФЭУ. После латентного периода развивалась вспышка XJI Измеряли амплитуду (максимальное значение интенсивности) вспыж ХЯ.

Регистрацию люцигенин-зависимой УЛ (ХЯ-БА) проводили при те же условиях, что и ХЛ-Л. Конечная концентрация дюцигешша состав ляла 10~4 М. При этом к 1 мл буферного раствора, содержащег кристаллы сульфата бария, добавляли 0.1 мл 1.12'Ю-3 М раствор люцигенина в дистиллированной воде и 20 мкл цельной крови. Кювет помещали в" темновую камеру хемилюминометра.

Для регистрации люминол- или люцигенин-зависимой ХЛ синовиальной. жидкости к 1,- мл буферного раствора, содержащего кристалл сульфата бария, добавляли 0.1 мл 1.13*10-4 М раствора люминол или 0.1 мл 1.12-10"3 М раствора люцигенина плюс 20 мкл синовиальной жидкости. Кювету помещали в темновую камеру хемилюминометра Измерения проводили без перемешивания при температуре +37°С.

Спектр флуоресценции стекла ЖС-15Г измеряли по обычной ыето-

ике (Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов, 1980) на спектрофлуориметре 3F (Япония) в области длин волн 460 + 700 нм, при постоянной пине волны возбуждения 420 hií. Измерение концентрации ионов Н* заводили на тонометре ЭВ-74, по стандартной методике, припосто-аной температуре.

Нами было обследовано, с использованием методики регистрации И-Л фагоцитов цельной крови, 72 больных распространенным псориа-эм, 46 больных ревматоидным артритом (РА), 30 больных ювенильным эвматоидным артритом (ЮРА). У всех больных артрит и псориаз в гадки обострения. Кроме того, были обследованы 35 больных гной-э-воспалителышш процессами шеи и. гсшоеы, 18 больных трофически язвами ниши конечностей и 30 доноров, практически здоровых.

Полученные в работе результаты обработаны по статистически!.« эитериям Стьюдента-Фкпера. Все значения показателей представлены ак средние величины ± ошибка средней. Коэффициенты линейной кор-гляции обсчитаны специально составленной программой на программу емом микрокалькуляторе Ж-61.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка стандартного источника люминесценции для опреде-;ния абсолютной интенсивности хемидюминесценции.

Нами был разработан доступный -стандартный источник, излуче-ая, -позволяющий проводить калибровку и проверь чувствительности гмилюминометров, а так же использовать его для оценки интенсив-эсти ХЛ в абсолютных единицах.

Эталон разработан на основе стекла ЕС-19 (ГОСТ 9411-81), ис-/скащий свет в видимой области спектра и прокалиброванный в аб-жотных единицах квант/с-4тС'мг по стандартному жидкому радиолю-таесцевтному источнику. Стандартный радиолюминесцентный источник эедставлял собой раствор стеариновой кислоты, содержащей С14, в злу аз е. В качестве сцшщилдяторов использовались 2,5-дифенилок-азол и 2,2'-п-фенил-бис-5-феншюксазол.

По результатам измерений трех образцов из стекла йС-19 его 19львая интенсивность-равняется-1.45:103 квянт/c-4тгмг.

Подбор оптимальных-условий измерения хемидюминесценции сЬаго-стов цельной ¡фови в присутствии кристаллов сульфата бария.

Существующие методики регистрации ХЛ цельной крови имеют ряд

недостатков. Основной их причиной является то, что измерения X. проводят в режиме перемешивания. В этом случае, происходит удаление источников ХЛ от фотокатода ФЗУ и возрастает экранирующий эф фект эритроцитов. Данные недостатки, в значительной мере, могу: быть устранены если источник ХЛ будет находится на дне иоветы, ; ФЭУ располагаться вертикально под ней. Для проверки этого предположения был поставлен опыт по определению экранирующего эффект; эритроцитов цельной крови и влияния перемешивания на интенсивность регистрируемого свечения. При зтсм, к 2 мл буферного раствора без кристаллов сульфата бария, содержащего 600 мг порошк; приготовленного ив' стекла ЖС-19, добавляли разные количеств; цельной крови кролика. Порошок стекла ЖС-19 использовался в качестве источника люминесценции. В результате данного исследовашй было установлено, что увеличение количества цельной крови в кювете приводит к уменьшению интенсивности люминесценции порошк; ЖС-19. При этом, интенсивность люминесценции порошка ЖС-19, пр] одном и том же количестве добавленной цельной крови, без перемешивания была значительно выше, чем с перемешиванием. Уменьшен® регистрируемой интенсивности люминесценции порошка ЖС-19 с увеличением количества цельной крови.в кювете связано с _увеличение1 экранирующего эффекта эритроцитов, входящих в состав цельной крови, (рис.1).

Еще одной причиной препятствующей широкому внедрении методики ХЛ-Л фагоцитирующих клеток в практику ' клинико-лабораторньв исследований является отсутствие стандартных стимуляторов фагоцитоза. Применяемые нерастворимые в воде стимуляторы фагоцитоза, такие как аимозан, латекс, активированный уголь, клетки живых ши убитых бактерий, обладают различными физико-химическими свойствами, зависящими от метода их получения, фирмы производителя, штамма бактерий и т.д. Поэтому была разработана методика люминод-зависимой ХЛ-Л фагоцитов цельной крови, стимулированной труднорастворимыми кристаллами ■ сульфата бария.

Через 3-6 минут после добавления цельной крови к буферном} раствору, содержащему кристаллы сульфата бария, в присутствии'лю-минола, развивается вспышка ХЛ, достигающая своего максимальное значения через 6-8 минут при исследовании цельной крови человек; и через 20-25 минут при исследовании цельной крови кролика. Посж этого наблюдается медленный спад интенсивности ХЛ до нуля в тече-

ние ¿0-50 >глнут (рис.2).

[/[макс

Л

ркс.1, зшсюжгь отес-сзтс-гьзой 1мечиш е2" твншнсет люмгавсцея-¡щ ворот ЖС-19 от хо-цзяшй гром крива 5 шета икию-игвекярг. ОбазвачезЕС 1- без Езряжп гягз, 2-с Еэдшгтвтач, Ьяк,- иакзаиию шчетэ птаясшостз иженкцепцы ! данной ссргг иаириштоз, I -гзгявив пткнекнзггз гюккзесцвЕзгга щ разком МЛК0СП9 ЕрСБНГ

100 •

250

Хедодтеинесценция, 10 И5ан?/с-4й

0.

человек Фошк - ^ .

Ра:. 2. Кгаетш ярме-пел-згвгккз! гегаюге-еосцзнцее фшкут-оз цежлгё чешай я грелка) сикузи-рЕззня язетаяя гуж^г-га ¿рве.

12 14

Время, мин

Для изучения кинетики осаждения хемшяоминесцирувдих клеток в присутствии кристаллов сульфата бария был поставлен опыт, дачные которого приведены на рис.3.-- Цельную кровь- кролика добавляли к буферному раствору,-, содержащему кристаллы сульфата бария. Через равные промежутки времени инкубации при +22°С без перемешивания, осторожно удаляли супернатавт (1,5" мл) и переносили этот объем в кварцевую ¡совету для измерения его ХЛ (рис.3.1.). Параллельно из-

меряли интенсивность ХЛ нижней фракции суспензии, объемом 0.7 мл (рис. 3.2). С увеличением времени инкубации интенсивность ХЛ нижней фракции увеличивалась, что отражает процесс оседания клеток в присутствии кристаллов сульфата бария. " .

йс.3. Зшшмость отно-сгтельзой вешаны лш; Ш-2шшой ЮЮШЭЙ ЕЕсцешрш фагоцитов целшгё гровг кролш от временя туйцн в буфер нон растворе, содержащем грмягш судЦй Етз, прж теетературо ¡¿оС до момента хзушю-ш Ентенсгансш Й; обозиачевд 1- амшиту-да всшгвн ХЯ сусергз-тантз, 2- аимгща всшят ХЛ осади, 1г зяэтеше амшщы еспьеш ХЛ арегастрнр» ваяной без предварительно! КИуЙЦЮЦ 1" ЗЗД8* из аммпуды вашин П в даишй шшят времен!

Нами была изучена зависимость латентного периода и амплитуды вспышки ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кролика от количества цельной крови, добавленной в реакционную кювету. Для этого в кзозету хемилюминометра, содержащую 1 мл буферного .раствора с кристаллами сульфата бария, добавляли разные количества цельной крови кролика. Было обнаружено, что при увеличении количества цельной крови в кювете от ю до 40 ыкл амплитуда вспышки ХЛ возрастает, фи дальнейшем увеличении объема добавленной крови.амплитуда вспышки ХЛ имеет тенденцию к снижению. На рис.4 представлена зависимость между анализируемым объемом цельной крови кролика и продолжительностью латентного периода вспышки ХЛ.

Под латентным периодом мы понимаем время от момента добавления анализируемой пробы крови: к буферному раствору с кристаллами сульфата бария, до начала развития вспышки'ХЯ. •

Результаты показали, что с увеличением количества цельной крови, добавленной в кювету хемилюминоыетра, линейно увеличивается- латентный период вспышки ХЛ. Эта зависимость свидетельствует о наличии в плазме крови веществ, тормозящих развитие вспышки ХЛ.

Врбнг, шя

îm.4. Заметит no. дмжиташоста ЛаТМТНО-ro ПАрИДа Х6МЫШНН8С-

цэецш фагоцитов цельной ipois ющ стякухн-рмазш грнетшакк суяфгабарм, отобьем ¿рОЕН В ШМв ЯЕКЕ-гаимр.

Объем цашой крои,га

Нами так же была изучена зависимость амплитуды вспышки ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кролика от концентрации 'кристаллов сульфата бария, от температуры измерения, от времени инкубации крови при тепературе +4°С с использованием в" качестве антикоагулянта цитрата натрия или натриевой соли ЭДТА. Последний эксперимент показал, что с увеличением времени хранения крови при +4°С с натриевой солью ЭДТА, в качестве антикоагулянта, происходит увеличение амплитуды вспышки XI. Применение цитрата натрия позволяет хранить пробы цельной' крови прн*+4°С в течение нескольких часов до проведения анализов; .при атом, в процессе хранения изменения величины амплитуды вспышки не происходит (рис.5).

Хемидпмшесценция,10'квант/с __

Pœ.5. Заиаамсть амя-

: ÏSTygH кеыяи ÏEVffi-: т-гавсзкзй ZSKSÎEKiï-: Е8СЦ9НЦНК фаГОДЛТОВ i цзшо4 иоев гролш, еншупрогиий Ерняал-ккв сувфата барк, от tpeusss етубаци spssa ! EpS 4эС (ИШШ кн' цешащ татриевой солг ЭДТА в цшной грогн состаша 1 нгДя). Обогвивнш: 1- шиь с цитратом три,' 2-грсвь с напнэвой сдаю gpjL

5 .

Врио, чаш

Проведенные здектротгашкроскоЕическке исследования внйвйеи у ШЛ большое количество цитоплазиатических отростков, при помад которых они захватывает кристаллы сульфата барид. В некоторых клетках видны фагосомы с кристаллами сульфата бария. • Гранулы ■ в цитоплазме не видны, так произошла деграяуляция. Кристаллы сульфата бария попадают внутрь ШЯ, но внутрь эритроцитов они не попадает. Не отмечена так не адгезия кристаллов сульфата бария к поверхности эритроцитов.

Роль ионов Са2"*" в стимулированной кристаллами сульфата баоия

хеыидюминесцешши фагоцитов цельной крови.

Нами было изучено влияние содержания ионов Са21" в среде инкубации на ХЛ-Л фагоцитов цельной крови человека и кролика. Для этого ъ кювету хемшгоминоыегра содержащую 1 мл буферного раствора, содержавшего кристаллы сульфата бария, с Сайг и без него, добавляли 100 ыкл раствора лшинола и 20 ыкл цельной крози человека или кролика.

Оказалось, что если измерение интенсивности ХЛ фагоцитов цельной крови человека проводили в среде не содержащей иолов Са2+, амплитуда вспышки ХЛ была, в среднем, на 57% шс.е, чем в •среде с ионами Са2+ (рис.6). • ■ •

Хеыилшинесценция, 107 квант/с 4rt

Рис.6.

Квиягга гонвш-заххк-моя юмякмшгецевцх фагоцгтог цйьг oí крегг чемьега, спмухзуош-hoú ¡¡ргттатамя сутЦат;

йр к5, 8 отстутстш 10-яоз щы$я в cpsxs 12"

кубадзз я в вркоутствга кош тыщ (ювгтггя кяцеятрцза воепв ель-ция сосггзмга 2 иМ)

20 25 . 30 ,

• - ' Бремя, минута •

При добавлении раствора СаС1г, в конечной концентрации 2 мМ,

на максимуме вспышки XI, регистрируемой в среде бев ионов Сз?г, наблюдалось увеличение интенсивности вспышки ХЛ до уровня интенсивности вспышки ХЛ измеряемой в среде с ионами Са2+.

При исследовании ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кроликов раз-

ичил в результатах кгмерэхшя интенсивности ХЛ в среде ионами а2+" и бег гонов Сз2+ бага еще богее разительными: в присутствии онов Са2"1" в среде инкубации интенсивность ХЛ была вшзе в 4-5 зз, чем в среде бе? ионов Са2+ (рис.7).-Хешшшанесценщи, 10' квант/с-

Рге.7. йшетта ищ-ао-шискмоя вкяяиа-игсцзщга факищтов цельной кро!Е граяяа гтнмуявршний Еркстая-шя сульфата барки, 5 среде мштцей гом шьцня (1) н в среда и

СОШЩ84ЕОНН ШШ, (21 ктчш мщ5етр5" щ ненов шьцга 2 мЛ

- время, мяв

Так же было обнаружено резкое увеличение интенсивности ХЛ ри добавлении раствора СаС12 к бескальциевой среде.

Иятибирование хемкюзмнесценции фагоцитирующих клеток ката-дазой и супероисиддисыутазой.

Было изучено влияние каталааы и супероксиддисиутааы на кн-знсивность ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кролика, стимулированной ристаллами сульфата бария. В каждом случае ингибиторы добавляли буферному раствору в конечной концентрации 1.79 мкг/мл до вве-эния пробы крови. Было установлено, что-амплитуда вспышки ХЛ в рисутствии. каталааы и супероксиддисмутагы снижается, в среднем, а 40%. Наряду со снижением интенсивности ХЛ увеличивается латен-шй 'период вспышки ХЛ.

Добавление цианистого натрия (конечная концентрация 85 ■сг/мл) как до введения крови, так и на максимуме вспышки ХЛ соп-эводдалось ингибированием свечения на 85-90%. ,

Таким образом, учитывая результаты, полученные с исподьэова-аем сывороточного альбумина (результаты представлены ниже),- -эти энные свидетельствуют об определяющей роли системы миелоперокси-ага-перекись водорода-хлор- в возникновении ХЛ-Л фагоцитов цель-эй крови кролика, стимулированной кристаллами сульфата бария.

даза-перекись водорода-хлор- в возникновении ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кролика, стимулированной кристаллами сульфата бзрия.

Совместное действие кристаллов сульфата барин о другими стимуляторами хемилюминесцеяции фагоцитов цельной крови.

При одновременной стимуляции ХЛ фагоцитирующих клеток различными веществами, как корпускулярными, так и растворимыми появляется возможность получить дополнительную информацию о механизме возникновения данной ХЛ-реакции. ' Поэтому было изучено сочетанное действие кристаллов сульфата бария и других стимуляторов фагоцитоза на Хй-Л фагоцитов цельной крови кролика.^

В начале был изучен опсонизированный зимозан (03). Опыты показали, что при смешивании цельной крови с буферным раствором, содержащим одновременной кристаллы сульфата бария и 03, вспышка ХЛ была несколько ниже, чем при использовании раствора, содержащего одни кристаллы сульфата бария. Введение 03 на максимуме интенсивности вспышки ХЛ не вызывало изменений1 в ее кинетике и интенсивности. Можно предположить, что механизмы возникновения ХЛ-Л при стимуляции фагоцитов цельной крови кристаллами сульфата бария и 03 сходны между собой.

В следующей серии экспериментов изучали сочетанное действие на ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кролика кристаллов сульфата бария и водорастворимых стимуляторов; кокканавалина А и фитогемагглшти-нина. В том случае если митогенные лектины находились в буферном растворе, содержащем кристаллы сульфата бария, до введения цельной крови, вспышка ХЛ не регистрировалась. Если же конканавалин А или фктогемагглвтинин добавляли на максимуме интенсивности вспышки ХЛ - наблюдалось ее увеличение в 1.5 - 2 раза.

Полученные результаты можно объяснить следующим образом. Если цельную кровь добавлять в среду, содержащую как кристаллы сульфата бария, так и митогенные стимуляторы, под их действием происходит взаимная адгезия (агрегация) лейкоцитов. Агрегированные лейкоциты не способны к фагоцитозу кристаллов сульфата бария.

В .том случае, когда митогенные стимуляторы добавляли.на максимуме вспышки ХЛ фагоцитов цельной крови, стимулированной кристаллами сульфата бария,- происходила дополнительная активация НАДФН-оксидазной системы фагоцитов, которая вызывает увеличение интенсивности ХЛ-Л.

Влияние компонентов плазмы на хемшаомкнесценщш фагоцитов.

При регистрации ХЛ цельной крови, основной трудностью является определение вклада фагоцитирующих клеток и вклада компонентов аутологичной плазмы, крови в развитие данной реакции.

Поэтому было изучено непосредственное влияние аутологичной плазмы крови на ХЛ-Л суспензии форменных элементов (СЮ) крови кроликов, стимулированную кристаллами сульфата бария. Оказалось, что обладает очень низкой интенсивностью ХЛ-Л, которая, однако, возрастает с увеличением количества аутологичной плазмы в кювете хемилюминометра до 20 мкл. Дальнейшее увеличение количества плазмы вызывает уменьшение аплитуды вспышки .ХЛ.(рис.8).

1/^макс

, Рвс.8. Зшямость тег ' гатимой ишии аж-■ туян винтя лш-гга-ззтезж^ леншт-яесцещш суспенаш фор-меяти мененгов гром, сткмуигрогагаой сухЦа-тои бары, от юлетеетз дсбамшй в язгету гу тиошной пшмы ¿ром. Обозначены: 1мггс -катальное шчешз ' амлшуды шш кхг-дганнещенцн в дггай серп мшернментов, I-зяачезив амшитудн гошм гендашнесцЕя-цга при данном обмме добшгнной пшмы крова.

60

Обьем шнзмы,мы

Можно предположить, что присутствие аутологичной плазш обеспечивает опсонизацию объектов фагоцитоза, в нашем случае, кристаллов сульфата бария. Уменьшение амплитуды вспшки ХЛ с увеличением количества аутологичной плазмы свыше 20 мкд мы объясняем наличием в ней такого перехватчика гипохлорида как альбумин. Для подтверждения этого предположения была построена зависимость величины амплитуды вспышки -ХЛ-Л фагоцитов цельной крови кролика, стимулированной кристаллами сульфата бария, ст :к;пц5птрацки сывороточного' альбумина в среде инкубации. Имеет-место резкое сниже--ние амплитуды вспышки ХЛ с увеличением концентрации альбумина.

Изучение хемшаощшесценцик фагоцитов цельной крови при пользовании в качестве активатора люцигекина. Из литературных источников известно, что. дшинол-зависим ХЛ и лвдш'енин-зависимая ХЛ (ХЛ-БА) фагоцитирующих клеток отрзж ют разные процессы происходящие при их активации и в процессе ф гоцитоза. В отличие от ХЛ-Л, ХЛ-БА не зависит от миедоперокскда ной системы, а является зондом на суперокисдный анион-радикал.

Нами был проведен сравнительный анализ ХЛ-Л и ХЛ-БА фагоц тов цельной 1фови, стимулированных кристаллами сульфата бария, 44 стационарных больных ревматоидным артритом и 15 донорах. Т же была исследована ХЛ-Л и ХЛ-БА цельной синовиальной жндкост стимулированная кристаллами сульфата бария, у 28 больных РА.

Было обнаружено, что амплитуда вспышки ХЛ-Л превышала так вую ХЛ-БА, б среднем, в £1 раз кач у Сольных РА, так. и у доноре Такое же соотношение ые.жду амплитудами вспышек ХЛ-Л и ХЛ-БА на лвдалось при исследовании синовиальной жидкости. Различались к нетичеекке кривые ХЛ-Л и ХЛ-БА цельной крови к по времени дост кения амплитудой вспышки своего максимального .Биачения. Кинет ческаа кривая ХЛ-БА цельной крови достигала своего максимально значения, в среднем, в 1.3 раза быстрее, чем кинетическая крш ХЛ-Л.

"Обнаружилось наличие параллелизма между амплитудой вспьш ХЛ-Л и ХЛ-БА цельной крови с высоким коэффициентом корреляг между ними (г=0.82; р<0.001) как у здоровых доноров, так и бог ных РА.

Измерение хемилюминесценшш цельной крови при воснадитед ных процессах у людей. Исследования ХЛ-Л фагоцетов цельной крови, сгимулированг кристаллаьж сульфата бария, у 46 больных РА доказали зависимость ХЯ-ствета от степени активности воспалительного процесс различия были достоверны между практически здоровыми людью бальными с III степенью активности, а также между группами Со.1 ных o I и III степенями активности (таблица).

Была обнаружена положительная корреляция между амплитуде вспышки ХЛ-Л и.такими клинико-лабораторными' показателями как с держание серомукоида (г= +0.45; р<0.01), уровнем фибриноген; крови (г= +0.65; pcQ.Ol), активностью церудоплазмина в сыворо-: крови (г= +0.40; р<0.01).

Тгблвда. .Аммятуда кишмя гсмятол-ззввсимой кмшзмкесцещи фагоджтов дельной поеи, сткмрирошной грзстатаня сульфата баргя, у багьяш ревюток'цяыи гртрнтом пря разящ степгвя гтмостя восшятедьвого процесса

степень активности воспалительного процесса! количество обследованных амплитуда вспышки ХЛ, хЮбквант/с-4я: 1 Ш ± м) j

' I 9 3.3 ± 1.0 |

И 25 З.б ± 0.7*

III 12 19.4 ±3.1 !

норма 1 30 2.6 ± 0.3 {

Примечание: * - р<0.05 относительно нормы

Таким образом, появление в крови белков воспаления сопровождалось увеличением интенсивности вспышки ХЛ-Л.

Как и у взрослых больных, при обследовании детей больных ЮРА было обнаружено увеличение интенсивности ХЛ-Л фагоцитов цельной крови. Чем выше была выражена активность ревматоидного процесса, тем выше была амплитуда вспыяки ХЛ-Л.

При обследовании больных с флегмонами головы и иеи нами было установлено, что развитие гнойно-воспалительных процессов сопровождается увеличением ХЛ-ответа фагоцитирующими клетками цельной периферической крови. При этом, обнаружено увеличение интенсивности ХЛ-Л по мере возрастания тяжести состояния больных; значения ХЛ-Л нормализовываяись в процессе лечения.

Таким образом, мы предлагаем использовать методику регистрации ХЛ-Л фагрцитов цельной крови, стимулированную . кристаллами сульфата бария, для оценки степени тяжести патологического процесса, прогноза течения заболевания, оцени! эффективности лечебных мероприятий.

извода

1. Дана квантово-метрическая характеристика твердого радиолюминесцентного источника на базе стекла НС-19. Источник рекомендован в качестве "стандарта х лшзоминссценции1' для применения в мед;ко-биологических исследованиях.

2. Разработана методика измерения хешузоминесценши фагоцитов цельной крови, основанная на одновременном стимулировании хе-мшпоминесценции клеток и их осаждении кристаллами сульфата бария. Осаждение фагоцитов способствует их приближению к фотокатоду ФЭУ.

снижению светорассеяния хемилюминесценции ка эритроцитах, повьше-нию чувствительности методики. Электронная микроскопия показала, что кристаллы сульфата бария поглощаются фагоцитами с развитием дегрануляции. 1

3. При сравнении действия хемилюминесцентных зондов лшинола или люцигенина на стимулированную кристаллами сульфата бария хе-милюминесценщю фагоцитов установлено, что интенсивность свечения активированная люминолом, на порядок выше, причем как для фагоцитов цельной крови, так и для фагоцитов синовиальной жидкости.

4. Ионы Са2+ оказывают влияние на люминол-зависимую хемилюми-несценцию фагоцитов цельной крови. При отсутствии в среде инкубации ионов Са2+ хемилюминесценция цельной кровк кролика'значительно снижается, -либо исчезает полностью. Доказано существование кальций-зависимого и кальций-независимого путей генерации хемилюминесценции фагоцитов цельной крови, стимулированной кристаллами сульфата бария.

5. Супероксиддисмутаза и каталаза ингибируют хемиломинесцен-■ цию фагоцитов цельной крови на 30-40Х каждая. Цианид натрия и альбумин ингибируют хемшшминесценцко на 85-90%. Аутологичная плазма крови увеличивает хемилюминесценцию изолированных лейкоцитов периферической крови, когда соотношение плазмы и форменных элементов-соответствует физиологическому. Увеличение-количества" .плазмы приводит к снижению интенсивности хемилюминесценции. Данные результаты свидетельствуют об определяющей роли системы ми&-лопероксидаза-пероксид водорода-хлор" в возникновении шишол-ва-висимой хемилюминесценции фагоцитов цельной крови.

6.Амплитуда,вспышки хемилюминесценции фагоцитов цельной крови, стимулированная кристаллами сульфата бария, увеличивается у больных гнойно-воспалительными заболеваниями иди заболеваниями, сопровождающимися развитием воспалительного процесса. Степень увеличения амплитуды вспышки хемилюминесценции коррелирует со степенью выраженности воспалительного процесса. Указанная зависимость использована для диагностики стадий и фаз в. течении заболеваний, а также для контроля за эффективностью проводимого лечения.

- 18 -

СПИСОК РАБОТ ОПУБйНКОЗЛИНЫХ ПО TBS ДИССЕРТАЦИИ

1.Piryazeva N.,Piriazev A.P.'.Sherstnyov М.Р., Muravsov Y.V., Muldiyarov P.Y. Whole blood and Synovial fluid chemlluminescence in rheumatoid arthritis:- In: 17h Symposium of the European Society of osteoarthrology. Budapest, 1988, 61.

2.Владимиров ¡O.A., Шерстнев М.П., Пирязев А.П. .Беляков В.А. Квантово-метрическая характеристика хемилюминесценции биологических объектов.-Ж.прикл. спектроскопии, 1989, т.50, N2, 341.

3.Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Пирязев А.П. Стимулированная кристаллами сульфата бария хемшпоминесценция лейкоцитов цельной крови.-Биофизика, 1989, т.34, N6, 1051-1054.

4.Пирязев А.П. Изучение методом люминол-зависимой хемилюминесценции физико-химических особенностей стимуляции лейкоцитов цельной крови труднорастворимыми кристаллами сульфата бария.- В кн.: Тр.IV научной конф. молодых ученых НИИ ФХМ Ш РСЯСР. Деп.ВИНИТИ 18.10.1989г., N6311-B89, 1989, 53-63.

5.Петрова И.В., Каухова О.Я., Каменных Е.В., Шерстнев М.П., Пирязев А.П. Состояние системы фагоцитирующих лейкоцитов в патогенезе хронических дерматозов.- В кн.: VI Всеросс. съезд дерматологов и венерологов. М.: KG РСЯСР, 1989, т.2 , 460-461.

6.Юнусходжаев Э.; Баканов"H.H.', Владимиров КЗ.А.',' Шерстнев М.П., Пирязев А.П. Метод оценки состояния тяжести больных и прогнозирования клинического течения гнойно-воспалительных процессов с применением хемилюминесценции.- Стоматология, 1989, т.8, N8, 7-9.

7.Гартаковский И.А., Шерстнев М.П., Пирязев А.П., Шайков A.B. Клиническая'оценка хемилюминесценции цельной крови при юве-нильном ревматоидном артрите.-Ревматология, 1989, N4, 39-42.

8.Мульдияров П.Я., Пирязева H.A. , Пирязев А.П. Хемилюминес-цекция цельной крови и цельной синовиальной жидкости при ревматоидном артрите.- Ревматология, 1992, N1, 16-18.

9.Козловский Ю.И., Шерстнев М.П., Пирязев А.П., Губченко П. П. Влияние облученного феназепама на стимулированную сульфатом бария люминолтзависимую хеыилюминесценцию цельной крови человека.- в кн.: Актуальные проблемы военной и экстремальной медицины. Ред.Е.Г.Ееляев. М.: МО ГО, 1994, 297-298.

10.Шерстнев М.П., -Козловский Ю.И., Пирязев А.П.. Губченко И. П. Влияние облученного феназепама на стимулированную сульфатом бария люминол-8авис1Емую хемилюминесценции) цельной крови челове-

ка. - В кн. г Международная научная конференция "Школа академике А.К.Черкеса: идеи, развитие, перспективы". Киев: Наукова думка. 1994, 54.

ll.Sherstnev М.Р., Piryazev А.Р., Vladimirov N.V. Ваг1ш sulfate - stimulated l'uminol - dependent chemiluminescence' of Whole blood in diagnostics.- In: Clinical chemiluminescence, Ed. Y.A.Vladirnirov, Berlin, Intern. Conf, 1994, 27p.

12.Владимиров Ю.A., Шерстнев М.П., Грудина H.B., Пирязеь А.П., Козловский Ю.И. Хемилюминесцентньм метод при обследование животных подвергшихся воздействию ионизирующего излучения.-Еюлл.экспер.биол.и мед. , 1996, Т.121, N1, 39-41.

СПИСОК ИЗОБРЕТЕНИИ -

1.Юнусходжаев Э. .Важанов H.H. .Владимиров Ю. А. .Шерстнев М.П., Пирязев А.П., Пербокас $. Способ оценки тяжести состояния больного флегмоной. A.c. N1545162 от 17.11.1987г. (22.10.1989) СССР.д01 N33/483

2.Юнусходхаев Э..Бажанов H.H..Владимиров ¡O.A. .Шерстнев М.П., Пирязев А.П., Тер-Асатуров Г.П., Патарая Г.Р., Верховская П.Б. Способ прогнозирования неблагоприятного течения флегмоны. A.c. N1553900 от 17.11.1987 г. (01.12.1989) СССР, Д 01 N33/483.

- ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОШЩАЩЖ • -

1.Методика регистрации люминол-зависимой, стимулированной сульфатом бария хемшпоминесценции фагоцитов цельной крови. Может быть использована для оценки способности фагоцитов крови генерировать активные формы кислорода и выявления состояния дефицита клеточного иммунитета, а также для изучения изменений способности фагоцитов генерировать активные формы кислорода при различных па-тадогических состояниях и внешних воздействиях.

2.Методика регистрации люминол-зависимой, стимулированной сульфатом бария хемилшинесценцш фагоцитов цельной крови може! быть использована для оценки изменения степени тяжести заболевания, и контроля эффективности проводимых лечебных мероприятий у различных групп больных.

3. Разработанный твердый радиолзоминесцектный источник изготовляемый из Стелла КС-19.-может быть использован в качестве "стандарта слабой люминесценции" научно-исследовательскими и клиническими лабораториями использующими в своих исследованиях хеми-люминометры различного происхождения.