Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система перекисного окисления липидов в процессе дифтерийной интоксикации в эксперименте

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Система перекисного окисления липидов в процессе дифтерийной интоксикации в эксперименте"

2 ¿1 ДР 1397 (

На правах рукописи

СИСТЕМА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕ:

ИНТОКСИКАЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1997

Работа выполнена в Ростовском государственном медицинском университете.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Лауреат Государственной премии РФ, Заслуженный деятель науки Р< член-корреспондент Академии Естествознания, доктор медициною наук, профессор ШЕПЕЛЕВ А.П. ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник МИКАШИНОВИЧ З.И.

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник СВЕЧНИКОВА Л.В. ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Ростовский научно-исследовательский противочумный институт.

Защита состоится «-/У» /¡^/^¿¿¿¿■■Г' 1997 г. в часов на заседании да сертадионного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственной медицинск< университете (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государс венного медицинского университета.

Автореферат разослан «^Р » 1997 г

Учёный секретарь диссертационного

совета, доцент Корганов Н.

В последнее время дифтерия привлекает к себе всё большее внимание исследователей как в нашей стране, так и за рубежом.

После длительного времени относительного затишыг было зарегистрировано эезкое повышение заболеваемости этой грозной инфекцией как среди детского, так л среди взрослого населения.

Среди особенностей дифтерии в настоящее время следует отметить то, что эолезнь вызывается преимущественно высоко токсигенными штаммами биовара gravis с увеличением тяжёлых клинических форм и летальных исходов.

Новый эпидемический подъём заболеваемости активизировал исследования в области эпидемиологических, микробиологических и иммунологических аспектов шфтерийной интоксикации. Наиболее полно были выяснены биохимические меха--шзмы развития интоксикации, связанные с воздействием экзотоксина C.diphtheriae m систему биосинтеза белка, в частности, АДФ-рибозилирование фактора элонга-дш-2 (EF-2), приводящего к его инактивации (R. Collier, 1967).

Несмотря на то, что этот механизм, несомненно, является основополагаю-цим и ведущим в развитии интоксикации при дифтерии, имеются данные о клинических проявлениях дифтерийной интоксикации (ДВС-синдром, развитие почечной t сердечной недостаточности), которые не могут быть устранены даже специфиче-;кой серотерапией (Г.И.Градиль и др., 1994) и дающие основания предполагать на-шчие иных биохимических механизмов развивающихся при дифтерийной интокси-садии нарушений.

В настоящее время хорошо известно, что как в защите организма от чужерод-1Ых агентов (в том числе бактерий, токсинов), так и в проявлении токсических :войств многих веществ ведущая роль принадлежит свободнорадшсальным провесам (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972). Хорошо известно активирующее >лияние бактериальных эндотоксинов на перекисное окисление липидов (ПОЛ), шляющееся типичным представителем свободнорадикалъных процессов, и мета-5олическую активность фагоцитов (Е.В.Рябиченко, Ю.В.Езегсчук, 1989; В.Д.Ува-)ов, 1990; K.Sungino et al., 1987). Причём одним из проявлений всплеска метаболи-геской активности фагоцитов является генерация активных форм кислорода АФК), имеющая защитное значение (B.M.Babior et al., 1973).

Учитывая универсальность свободнорадикальных процессов как механизмов |ащиты и агрессии, представляется вполне вероятным их участие и в развитии проявлений дифтерийной интоксикации. В доступной литературе нам удалось найти только одну работу, посвященную влиянию дифтерийного токсина (ДТ) на фаго-

цитирующие клетки (Ю.В.Вертиев, 1971); продемонстрированная автором цито-токсическая активность ДТ, проявляющаяся в отношении клеток-фагоцитов, открывает новые перспективы в дальнейшем изучении биохимических механизмов развития токсических эффектов при дифтерийной интоксикации.

Целью н&ггошщего исследования явилось установление роли свободноради-кального окисления в патогенезе дифтерийной интоксикации на основе данных с состоянии ПОЛ в органах и тканях животных и реакции полиморфноядерных лейкоцитов при воздействии ДТ.

В соответствии с поставленной целью исследования было намечено решение следующих эксвернюевтальвых задач:

1. Определить содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и шиффо-вых оснований) в плазме крови, тканях печени, почек, миокарда в различные сроет после введения подопытным животным ДТ.

2. Изучить активность ферментов систем, утилизирующих как реакционно-способные кислородные радикалы и их метаболиты (СОД, кагал аза), так и перекиси липидов (глутатионпероксидазы, глугатионредуктазы, глугатион-Б-трансфера-зы) эритроцитов, тканей печени, почек и миокарда в различные сроки после введения ДТ.

3. Исследовать функциональные особенности реактивности полиморфноядер ных лейкоцитов в условиях воздействия ДТ как in vivo, так и in vitro.

4. Обосновать экспериментальным путём необходимость коррекции наруше ния процессов ПОЛ применением про- и антиоксида!гшьгх препаратов.

Нвучная иоьнззо.

В результате проведённых исследований получены новые сведения, касаю щиеся биохимических механизмов реализации токсических эффектов при дафте рийной интоксикации. Продемонстрировано, что свободнорадикальные процессы развивающиеся в чувствительном организме под влиянием экзотоксина C.diph theriae, претерпевают противоположно налравленные изменения: с одной стороны в органах и тканях наблюдается активация ПОЛ, с другой, - дифтерийная интокси кация приводит к выраженному подавлению спонтанной продукции полиморфное дерными лейкоцитами АФК и их реакцконноспособных метаболитов.

Впервые проведено детальное исследование динамики содержания в органа и тканях продуктов ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной защиты в услс виях экспериментальной дифтерийной интоксикации.

Выявлена фазность изменений активностей антиоксид антных ферментов накопление продуктов ПОЛ. Показано, что на фоне разнонаправленных изменени

активностей ферментов антиоксидантной защиты развивается дисбаланс между процессами образования АФК и их утилизации.

Продемонстрировано накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и шиффовых оснований) тканях миокарда, печени и почек, свидетельствующее о снижении эффективности антиоксидантной защиты и развитии комплекса метаболических нарушений с участием свободнорадикальных процессов.

Получены сведения об иигабирующем влиянии ДТ на способность поли-иорфноядерных лейкоцитов к продукции АФК и их биоцидных метаболитов, а гакже о возможности её коррекции с помощью препаратов, оказывающих проок-:идактное действие (антибиотиков антрациклического рада).

По результатам проведённых исследований на защиту выносятся следующие

- в условиях интоксикации, вызванной экзотоксином C.diphtheriae, происходи- выраженная активация процессов ПОЛ, возникающая на фоне снижения эффективности систем антиоксидантной защиты;

- экзотоксин C.diphtheriae, действуя как in vivo, так и in vitro, вызывает тор-жжение продукции полиморфноядерными лейкоцитами АФК и их реакционноспо-:обных биоцидных метаболитов;

- применение веществ прооксидантного действия (антибиотиков антрацикли-геского ряда) приводит к снижению токсических эффектов ДТ.

Научно-теорствчесвая и ирактэтесггая значимость работы.

На основании результатов собственных исследований и анализа имеющихся в мтературе сведений о роли процессов свободнорадикального окисления, пред-тавлен материал, существенно дополняющий биохимический механизм развития оксического эффекта при экспериментальной дифтерийной интоксикации.

Получены данные, указывающие на необходимость коррекции функциональ-ых нарушений, связанных с ПОЛ.

Основные положения работы доложены на заседании Ростовского биохими-еского общества (Ростов-на-Дону, 1997), на 1-й научной сессии РГМУ (Ростов-на-(ону, 1996) и на научной конференции "День науки студентов, молодых учёных и пециалистов РГМУ" (Ростов-на-Дону, 1996).

■ Публшздия материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 1 в центральной печати, Ъ в зарубежной.

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, иллюсгриро-ша 10 таблицами, 13 рисунками и 2 схемами. Работа состоит из введения, обзора

литературы в трёх главах, методической части, трёх глав с наложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 80 отечественных и 111 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Матерш&гаы а методы исследовашш.

В работе использован препарат дифтерийного токсина, полученный от АО «Биомед», представляющий производственную серию токсина Содержание экзо-токсического компонента в препарате дифтерийного токсина определяли с помощью иммуноферментной тест-системы «Дифтерия-монозим» (МНИИ ЭМ им. И. И. Мечникова).

Для оценки влияния ДТ на процессы ПОЛ (содержание его продуктов и активность антиоксидантньк ферментов в миокарде, почках, печени и эритроцитах) препарат ДТ вводили внутрибрюшинно морским свинкам в дозе 1 Dim в объёме, не превышающем 0,3 мл. Оценку биологической активности ДГ проводили по способу Спирмена-Кербера (Г.Ф.Лакин, 1990). За 1 Dim принимали такое количество токсина, которое при однократном внугрибрюшинном введении морским свинкам массой 250 г вызывало гибель 40% животных на 3-й сутки при явлениях поражения надпочечников (В.А.Фролов и др., 1990). Животные контрольной группы тем же путём получали соответствующий объём изотонического раствора хлорида натрия.

Животных подопытной и контрольной групп забивали декапитацией (с соблюдением требований Приказа № 755 от 12.08.1977 г. "О порядке работы с экспериментальными животными") через 1,24 и 72 часа с момента введения токсина или физиологического раствора соответственно. Забор крови производили с добавлением гепарина из расчёта 15 ед. на 1 мл крови. Все операции по обработке биологического материала производили с использованием растворов с температурой не выше +5°С.

Количество общих лнпйдов в экстрактах тканей, полученных по метод) J.Folch et al. (1957), определяли фосфованилиновым методом D.D.Woodman, C.P.Price, 1972. Содержание гемоглобина определяли унифицированным гемогло-бинцианидным методом. Количество шиффовых оснований (ШО) определили методом B.Fletcher et al., 1973. Содержание диеновых коньюгатов (ДК) определяла методом R.O.RecnageI, A.K.Choshal, 1966, и выражали количество ДК в микромолях в пересчёте на грамм общих липидов.

Активности антиоксидантных ферментов определяли в гемолизатах (глутвги онредукгаза, глугатион-Б-трансфераза, лизате эритроцитов (каталаза, СОД), атак же в надосадочной жидкости гомогенатов в пересчете на содержание общего белю

ли гемоглобина Активность каталазы (КАТ) определяли по скорости утилизации ероксида водорода методом R.F. Beers, I.W.Sizer, 1952. Активность супероксид-исмутазы (СОД) определяли по величине торможения скорости восстановления итросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анион-радикалом, генерируемым лстемой НАДН-феназинметасульфат методом M.Nishikimi et al., 1972. За единицу стивности принимали количество СОД, необходимое для 50% ингибирования ско-эсти восстановления НСТ (C.Beauch&mp, J. Fridovich, 1971). Активность глутати-нпероксидазы (ГП) определяли по скорости накопления окисленного глутатиона 3SSG) методом E.Berschneider, J.Ruben (патент ГДР 210983). Активность глута-тонредукгазы (ГР) определяли по накоплению окисленного НАДФ (R_E. Pinto, f.Bartley, 1969). Активность глутатион-Б-трансферазы (ГГ) определяли по накопляю конъюгата восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом ме->дом W.H.Habig с соавт., 1974.

Активность полиморфноядерных лейкоцитов (нейтрофилов) периферичес-эй крови исследовали с помощью хемилюминесцентного метода по H.Faden, .Maciejewski (1981), используя разведение крови 1:50, обеспечивающее полное ус-занение шшбирующего влияния плазмы на величину хемилюминесцентного от-rra(R.C.Allen, 1986).

Для проведения опытов in vivo использовали кровь, полученную при забое ивотных как до введения препарата ДТ в дозе 1 Dim, так и через 1, 24 и 72 часа эсле введения ДТ.

Опыты in vitro проводили с цельной кровью интакгных животных. Инкуба-ж крови с ДТ производили при 37"С в растворе Хенкса (рН 7,4), не содержавше-) феноловый красный, при соотношении объёмов крови и раствора Хенкса 1:4. репарат ДТ добавляли, доводя его концентрацию от 0,3 до 7,0.1o"1 Lf на 1мл кро-5. Пробы для хемилюминесцентного анализа отбирали через 5, 10, 20 и 40 минут с эмента начала инкубации.

Для оценки влияния соединений, проявляющих анти- и прооксидантные юйсгва, на токсические свойства ДТ изучали влияние ct-токоферола, эмокситша еществ - антаоксидантов) и фарморубицина (индуктора свободнорадикальных )оцессов) на выживаемость подопытных животных в условиях воздействия ДТ in vo. Перечисленные препараты вводили подопытным животным одновременно с юдением ДТ в дозе 1 Dim. Токоферол (масляный раствор I мг/мл; А/О "Октябрь", >ссия) и фарморубицин (водный раствор 2 мг/мл; Farmitalia Carlo Erba, Италия) юдили в дозе 1 мг на кг массы тела. Эмоксипин (Эстония) вводили в виде вод->го раствора в дозе 10 мг/кг массы. Животным контрольной группы помимо пре-»рата ДТ вводили соответственно изотонический раствор хлорида натрия или сте-шьное оливковое масло в тех же объёмах. Летальность животных подопытной и

контрольной групп регистрировали через 24, 48, 72 и 168 часов с момента введения ДТ и оценивали наличие корреляционной связи между выжиаемостью животных и использованием акта- и прооксвдвнгов (с помощью непараметрического коэффициента ассоциации Пирсона или тетраяорического показателя связи), статистическую достоверность которого оценивали t-крытерием Стьюдента.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили при помощи программы "Stadia" на ЭВМ типа IBM PC AT Am5x86-133.

О достоверности отличий оцениваемых показателей контрольной и подопытных. групп судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения в группах на нормальность. Статистически достоверными считались отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р<0,05. Наличие корреляции между признаками оценивали с использованием коэффициентов корреляции (параметрических и непараметрических), достоверность которых также проверяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. ■

Влияние экзотоксина Cdiphtheriae на свободнораднкальные процессы и, в частности, на процессы ПОЛ, остаётся до настоящего времени не изученным. С целью определения характера влияния ДГ на процессы ПОЛ в нашей работе проведено исследование содержания основных продуктов ПОЛ: шиффовых оснований и диеновых конъюгатов в плазме крови, тканях печени, почек и миокарда, а также способность антиоксидантных систем указанных тканей к утилизации АФК и перекисей липидов в различные сроки после введения ДТ экспериментальным животным.

Установлено, что в миокарде (таб. 1, стр. 9) через 1 час после введения ДТ происходит рост активности катаяазы на 51,2% и глугатион-З-трансферазы на 50,4%. В то же время отмечается падение на 22,9% активности глутатионредукта-зы Одновременно отмечается нарастание содержания шиффовых оснований и диеновых конъюгатов (260 и 185,7% в сравнении с контролем). К 24 часам опыта активность глутатионредукгазы продолжает снижаться, достигая 45,8% от контрольного значения. К этим изменениям присоединяется снижение активности СОД (на 31,%), в то время как активность глутагион-8-трансферазы снижается до контрольного значения. Содержание шиффовых оснований через 24 часа после введения токсина оказывается повышенным на 39,3%, в то время как отличия в количестве диеновых конъюгатов оказываются не достоверными. Через 72 часа в ткани миокарда отмечается рост активности СОД и глугатионпероксидазы на 150% и 41% соответственно. В то же время активность глутатионредукгазы остаётся сниженной (52,4% от контрольного значения). Содерзкание в ткани миокарда шиффовых оснований достоверно выше контрольного значения (на 58,7%), в то время как колнче-

пво диеновых коньюгатов также испытывает тенденцию к росту, но эти изменения татистически не достоверны.

Таблица 1

Активность антиоксидантных ферментов миокарда в условиях дифтерийной

интоксикации

Ферменты Катал аза *106МЕ/г белка сод усл.ед./г балка ГП мкМ ОЗЗв /г белка в мин ГР мкМ НАДФН/г белка в мин ГТ мкМ конъ- югата /г белка в мин

Конт] роль 8,14+0,53 53,70±2,55 1,17±0,15 2,8810,13 15,6010,82

1 ч 12,3011,09* 58,6014,90 1,33±0,09 2,2210,01" 23,4014,70^

)пьгг 24 ч 9,44+2,05 37,0015,81° 1,6310,23 1,32+0,42* 18,4011,47

72 ч 7,11+1,10 134,00+20,00* 1,65+0,03й 1,09+0,0115 8,1710,09*

1римечання:

. Число животных п=8 во всех группах. . * - р<0,05 в сравнении с контролем.

Таблица2

Активность антиоксидантных ферментов печени в условиях дифтерийной

интоксикации

Ферменты Кагал аза «10* МЕ/г белка сод усл.ед./г белка ГП мкМ /г белка в.мин ГР мкМ НАДФН /г белка в мин ГТ мкМ конъю-гата /г белка в мин

Конт] роль 2,9910,12 249,00135,55 1,2110,21 3,70+0,13 211,00115,90

1 ч 2,8810,42 240,00+30,90 1,1910,24 2,0110,12* 237,00+21,60

>пыт 24 ч 4,5610,27° 255,00150,60 1,0510,08 3,7510,33 219,00169,80

72 ч 2,1510,42* 197,00126,30 1,2810,04 4,27+0,58 309,00167,00*

римсчания:

Число животных п=8 во всех группах. * - р<0,05 в сравнении с контролем.

В ткани печени (таб. 2, стр. 9) уже к 1-му часу опыта, как и в миокарде, отмечается падение активности глутатионредукгазы. И, несмотря на возвращение значения этого показателя к контрольному уровню к 24 часам исследования и повышение активности СОД на 52,5%, содержание продуктов ПОЛ в ткани печени оказывается достоверно повышенным на протяжении всего времени эксперимента

Оценивая изменения в ткани почек (таб. 3, стр. 11), следует отметить, что угнетение активности глутатионпероксидазы и глутатионредукгазы (на 30,8% и 45,5% соответственно), наблюдаемое к 1 часу исследования, даже при росте активности СОД (на 31,7%) приводит к активации ПОЛ, проявляющейся в накоплении его продуктов к 24 часам с момента введения: препарата ДТ (содержание шиффо-вых оснований повышено на 113,9%, диеновых конъюгатов на 100% в сравнении с контролем). К 72 часам исследования вновь регистрируется снижение активности глутатионпероксидазы, что ещё более усугубляет развившиеся нарушения.

Схожая в отношении динамики активности анпгоксидантных ферментов картина наблюдается и в эритроцитах (таб. 4, стр. 11). Принимая во внимание рост активности каталазы (на 23,5%), отмечаемый к 1-му часу исследования, который затем сменяется её снижением (к 72 часам активность каталазы составляет 76% от контрольного значения), в сочетании с выраженным угнетением глутатионпероксидазы, регистрируемым как к 24, так и к 72 часам опыта (54% и 70,3% соответственно от контрольного значения), можно было бы ожидать, что в эритроцитах, как и в почках, произойдёт отчётливое повышение содержания продуктов ПОЛ. Однако, на самом деле отмечается лишь тенденция к их росту - отличия оцениваемых параметров от контрольных значений статистически не достоверны.

Сопоставляя данные об активностях антиоксидангных ферментов с динамикой содержания продуктов ПОЛ, можно выявить ряд интересных особенностей. Так, несмотря на то, что через I час после введения ДТ в миокарде только глугати-онредукгаза опекает свою активность (при одновременном росте активностей каталазы и глутатион-5-трансферазы на 51,1% и 50% соответственно), в этой ткани происходит быстрый рост содержания шиффовых оснований и диеновых конъюгатов. Обращает также на себя внимание тот факт, что активность глутатион-Б-трансферазы, повышаясь в начальный период интоксикации, к 72 часам исследования оказывается сниженной почти в 2 раза. По-видимому, возросшая активность глутатион-Б-трансферазы и глутатионпероксидазы, ферментов, ответственных за устранение уже образовавшихся перекисей лшшдов, оказывается не подкреплённой достаточным пулом восстановленного глутатиона вследствие сниженной активности глутатионредукгазы. В пользу этого предположения говорит то, что даже возросшие активности СОД и глутатионпероксидазы оказываются не способными противостоять возникшему окислительному стрессу.

Таблица 3

Активность антиоксидантных ферментов почек в условиях дифтерийной

интоксикации

Ферменты Катал аза «10е МЕ/г белка сод усл.ед./г белка ГП мкМ СвБв /г белка в мин ГР мкМ НАДФН /г белка в мин ГГ мкМ конъ- югата /г белка в мин

Конт] юль 5,32+0,36 89,60+5,30 1,1710,10 13,4010,80 57,5015,60

1 ч 4,66+0,29 118,00110,60° 0,8110,04® 7,3011,20й 70,1019,40

пыт 24 ч 3,0010,56" 69,8012,70 1,17+0,02 16,20+3,00 63,7018,00

72 ч 4,7610,58 42,2017,50" 0,8910,06 15,3012,40 57,0018,90

римечания:

Число животных п=3 во всех группах. 6 - р<0,05 в сравнении с контролем.

Таблица 4

Активность антиоксидантных. ферментов эритроцитов в условиях

дифтерийной интоксикации

Ферменты Каталаза .10е МЕ/г белка сод усл.ед./г белка ГП мкМ ОЗБС /г белка в м1ш ГР мкМ НАДФН/г белка в мин ГТ мкМ конъю-гата /г белка в мин

Конт роль 2,1710,08 10,2010,50 0,7410,16 5,1010,40 3,55+0,14

1 ч 2,6810,09* 11,8010,40 0,79+0,07 5,5010,40 3,4010,12

пыт 24 ч 2,20+0,05 9,90±1,90 0,40±0,02ш 4,9011,00 3,27 ±0,06

72 ч 1,6510,03*' 12,9010,80* 0,5210,05а 4,8010,70 3,6010,50

римечания:

Число животных п=8 во всех группах. й - р<0,05 в сравнении с контролем.

Неэффективность активации отмеченных ферментов, выразившаяся в накоп-:нии продуктов ПОЛ, становится очевидной, если принять во внимание данные

литературы, свидетельствующие о ключевой роли глутатионпероксидазы в фе; ментативной антиоксидантной защите и низкой эффективности СОД (M.Raes et а 1987; J.Remacie et al., 1992).

Активация свободнорадикального окисления липидов в ткани почек ста» вится объяснимой, если принять во внимание рассогласованность реакций со cri роны СОД и каталазы в данной ткани. В самом деле, рост активности СОД, см няющийся затем её снижением, на фоне угнетения активности каталазы несомна но приводит к отрицательным последствиям в виде накопления пероксида Еодор< да, который в свою очередь становится в реакции Фентона источником образов ния гидроксильного радикала - частицы, являющейся в силу своей чрезвычайке реакционной способности наиболее вероятным инициатором ПОЛ (RRoot S.Okada, 1975; B.Vanasbeck, 1991).

Быстрый всплеск свободнорадикального окисления в миокарде, по-видмм< му, объясняется относительно невысокой активностью антиоксидантных ферме] тов, в особенности глутатион-зависимых. В условиях дифтерийной интоксикаци1 вероятно, достаточно относительно небольшого их угнетения для того, чтобы пр< цессы ПОЛ приняли неконтролируемое течение. Учитывая то, что действию пр< дукгов ПОЛ в первую очередь подвержены именно мембранные структур (Ю.А.Владимирсв, А.И.Арчаков, 1972), столь значительное увеличение содерж ния шиффовых оснований свидетельствует о далеко зашедшем повреждении юн точных и особенно мембранных липидов и белков. Это положение в сочетании имеющимися в литературе сведениями о регистрируемых при дифтерийной инта сикации нарушениях в системе поддержания электролитного баланса на уровь тканей (А.В.Утюмова-Мшюва, 1974), падении показателей окислительного фосф< ршшрования (Г.И.Медведева, Л.И.Ниселовская, 1975), а также об активации и вь ходе в цитоплазму лизосомалъных ферментов (В.А.Фролов, Шкирманте Б.К., 1991 наблюдаемых уже в ранний период интоксикации, косвенно свидетельствующих с изменении характеристик мембран, и приводящих вначале к утрате функционала ных свойств, а затем и к некрозу (А.В.Утюмова-Малова, 1974; Н.Р.Палеев и др 1992), позволяет говорить об окислительном стрессе как об одном из механизме реализации токсического действия ДТ.

Одним из уникальных свойств нейгрофила является его способность к мет! болической перестройке под действием различных стимулов, которая наряду с mi грацией, адгезией, поглощением, образованием пищеварительных вакуолей, секр< торной дегрануляцией составляет комплекс процессов, именуемый реактивность] (А.Н.Маянский, Д.Н.Маянский, 1989). Внешними проявлениями метаболическо перестройки являются резкое увеличение окисления глюкозы по пентозофосфатш му пути (P.G.Quie et al., 1979) и продукции АФК, являющихся родоначальникам

утих реакционноспособных соединений, наиболее важными среди которых явится ионы гипогалогеннгов, в частности гипохлорита (Н.Ю.Говорова и др., 89).

В нашей работе продемонстрировано влияние ДТ на показатели спонтанной лпмулированной опсонизированным зимозаном хемилюминесценцим, отраэкаю-ю уровень базальной и активированной продукции нейтрофилами кислородных дикалов и их реакционноспособных метаболитов.

Полученные нами данные о влиянии ДТ нахемилюминесценцию клеток цель-й крови представлены на рисунке 1 (стр. 13).

/ч

169-

60- *

-4-

Ь

4

; I - > I

^Дез > .. , . —

Контроль Спонтанная ХЛ-ответ ХЛ

□Контроль □Через 1 час □Через 24 часа □Через 72 часа

Рис. 1

Хемилюминесценция цельной крови в условиях дифтерийной интоксикации (в % в сравнении с контролем) Примечание: в - р<0,05 в сравнении с контролем.

Уже к 1-му часу с момента введения препарата ДТ отмечается резкое падение тенсивности спонтанного свечения, в то время как величина ответа на опсонизи-ванный зимозан оказывается достоверно выше контрольного значения, что, од-ко, обусловлено не ростом абсолютной величины стимулированной ХЛ, а угнетаем спонтанной.

Наряду с указанными изменениями отмечается снижение угла наклона кри-й свечения в первую минуту регистрации ХЛ-ответа, свидетельствующее о по-

давлении работы миелопероксидазной системы. Через 24 часа с момента введена ДГ, сохраняется тенденция к аналогичным изменениям обоих параметров, но и: отличия от показателей контроля статистически не достоверны. При регистрацю ХЛ через 72 часа после введения экзотоксина указанные параметры уже не отли чаются от контрольных значений. Аналогичные данные получены в серии опыто: in vitro. Показано, что зависимость ответа на опсонизированный зимозан от кон центрации токсина в среде инкубации приближается к линейной, в то время как за висимость от времени оказывается нелинейной - наибольший спад активности на блюдается в первые 10 минут инкубации.

Таким образом, нашими исследованиями продемонстрировано, что подавля ющее действие ДТ на кислородный метаболизм нейтрофилов проявляется как npi непосредственном взаимодействии, так и в масштабе целого организма

Трактовка полученных нами данных представляет довольно сложную задачу Как известно, проникновение ДТ внутрь клетки происходит двухэтално: связыва ние В-фрагмента токсина с рецептором обусловливает встраивание его гидрофоб ного участка в мембрану с последующим формированием селективного катионноп канала, обеспечивающего интернализацию фрагмента А, ответственного за реапи зацию токсических свойств. Несмотря на всю привлекательность гипотезы о непо средственном инактивирующем влиянии ДТ на кальциевые каналы, нормальная ра бота которых необходима для метаболической перестройки фагоцита (W.F.Stenson C.W.Parker, 1979; E.L. Becker et al. ,1981), данный механизм тормозящего действ и. токсина на ХЛ представляется маловероятным. Трудно представить, что в странна ние единичных молекул токсина (вещества, способного проявлять цктотоксическо действие именно в таких количествах) в мембрану, приводит к столь значительно му изменению параметров функционирования ионных каналов.

Возможным механизмом реализации негативного влияния ДТ на реактив ность полиморфноядерных лейкоцитов могут быть изменение числа и состояли рецепторов, взаимодействующих со стимуляторами дыхательного взрыва (Г.И.Кде банов и др., 1990).

Учитывая, что начальным моментом ответа нейтрофила на стимулирующе воздействие является самосборка НАДФН-оксидазной системы с последующи! восстановлением молекулярного кислорода до супероксидного анион-радикал (АН.Маянский, Д.Н.Маянский, 1989), представляется вполне вероятным, что угне тение продукции биоцидных соединений под действием ДТ может произойти имен но на этапе формирования данного эффекторного комплекса. В то же время не ис ключена активация собственных антиоксидантных систем нейтрофила Так, п крайней мере, известно, что при стимуляции полиморфноядерных лейкоцитов час тицами латекса параллельно с активацией продукции АФК, или даже нескольк

ережая её, происходит рост активности СОД; более того, изначально высокая ак-вносгь данного фермента при различных патологических состояниях способна линять латентный период ответа фагоцита (Г.И.Клебанов и др., 1990). Однако в й же работе продемонстрировано, что указанная преактивация СОД нейтрофила ггровождается резким увеличением стимулированного свечения, свидетельствую-îm о повышении продукции АФК. Эти сведения, по нашему мнению, согласуются шводами А.Н.Маянского и Д.Н.Маянского (1989) о том, что СОД в нейтрофиле толняет не столько антиоксидантную функцию, сколько является участником за-ггного процесса образования АФК, в частности, обеспечивает наработку перок-да водорода для дальнейшего его использования в миелопероксидазной реакции.

Принимая во внимание тот факт, что индукторами НАДФН-оксидазного ком-екса являются диацилглицериды и активированная протеинкиназа С (T.Ohtsuka et , 1990; N. T. Thompson et al., 1990), нельзя также исключить ингабирующее дейст-е ДТ на данный регулятор нъгй механизм.

Помимо этого, известно, что обязательным моментом ингернализации ДТ штотся локальное снижение рН примерно до 5,3 (S.Eriksen et al., 1994; H.Zhan et , 1995) и повышение концентрации ионов кальция (S.Eriksen et al., 1994). В этой гуации представляется оправданным предположить, что рост содержания внут-клетечнего кальция, хотя и происходящий в данном случае лишь в узкой зоне топлазмы, прилегающей к мембране (op. cit.), может инициировать работу име-цихся в нейтрофиле Са2+-завмсимых лротеолитических ферментов, в частности гсьпаин 1-подобной протеазы (J.L.Legendre, H.P.Jones, 1988 - щгг. по Г.Й.Клеба-ву с соавт., 1990), что в сочетании с повышенной в условиях действия АФК чув-зительностью белков к гидролазам (K.J.A.Davies, 1987) и мембранной локализа-ей НАДФН-оксидазного комплекса, способно повлечь модификацию его функци-альных характеристик.

Возможное влияние ДТ на аденилатциклазную систему, как ещё один гипо-гический механизм подавления кислородного "взрыва" нейтрофила, представля-:я сомнительным, так как по данным А.Н.Маянского и Д.Н.Маянского (1989) на-пление в нейтрофиле цАМФ не влияет на продукцию АФК В то же время из-лно отрицательное действие бета-адреномиметиков на стимулированную опсо-зированным сульфатом бария хемилюминесценцию (М.П.Шерстнев, 1990). Хотя ; три указанных автором (op. cit.) возможных фактора снижения хеммлюминес-нции - подавляющее влияние циклического АМФ на систему транспорта каль-я, ингибирование фосфолипизы С и торможение скорости окисления глюкозы по нтозофосфатному пути ввиду активации гликолиза - могут иметь место в мольной системе, их реализация при дифтерийной интоксикации представляется орной. Исходя из имеющихся в литературе данных о снижении продукции эндо-

генных катехолаюгаов при дифтерийной интоксикации (Б.М.Розенман, 1976), ] участие в активации рассматриваемого механизма вряд ли может оказаться одн< из основных причин снижения реактивности нейтрофилов. Возможное прямое де ствие ДТ на аденилатциклазную систему, равно как и другие предполагаемые на» механизмы, нуждаются в экспериментальном подтверждении.

Основываясь на полученных ранее данных, свидетельствующих об актив: рующем влиянии ДТ на процессы ПОЛ в масштабе целого организма и о пода лягощем его влиянии на продукцию фагоцитами крови биоцидных соединени применение с целью коррекции метаболических нарушений веществ прооксидан ного и антноксидантного действия представляется нам вполне закономерным.

Эффективность применения того или иного вещества оценивали по влияни на функциональную активность нейтрофилов и на выживаемость экспериментал: ных животных в условиях дифтерийной интоксикации. В качестве антиоксидантс использовали а-токоферол и эмоксипин, а фарморубицин - в качестве прооксидаз та.

Для оценки динамики метаболической активности полиморфноядерных ле! коцитов под действием испытываемых препаратов забор крови у животных ко! трольной и подопытной групп производили череа 1 час, 24 часа и 72 часа с момся та введения ДТ и регистрировали спонтанную и стимулированную опсонизирова! ным зимозаном ХЛ.

Полученные нами данные представлены на рисунке 2 (стр. 17). У животны подопытной группы, которым наряду с ДТ вводили фарморубицин, регистрируете выраженное повышение уровня спонтанной ХЛ, причём её абсолютное знамени оказывается в несколько раз выше чем у интакгных животных. Интересно отш тить, что интенсивность спонтанного свечения у животных, получивших фармор) бицин, стабильно выше в сравнении с контрольной группой на протяжении всег времени эксперимента Что касается ответа на опсонизированный зимозан, то подопытной группе наибольшая величина этого параметра отмечается к 24 часа] исследования, снижаясь затем к 72 часам. Однако, данный показатель у животны получивших фарморубицин помимо ДТ, оказывается ниже такового в сравнении животными контрольной группы. Это явление становится объяснимым, если при пять во внимание снижение значения спонтанного свечения у животных, получив ших только препарат ДТ, и резкое его повышение в группе животных, получивши фарморубицин, в то время как абсолютное значение стимулированной ХЛ в под опытной группе оказывается выше, чем в контрольной. Вероятно, для объяснена эффекта фарморубицина имеет значение как активация базального метаболизма проявляющаяся в росте спонтанного свечения, так и увеличение максимума ответ, на стимулирующшее воздействие.

□Контроль

□Через 1 час

Ш Через 24 часа

□Через 72 часа

Контроль Спонтанная ХЛ-ответ ХЛ

Рис. 2

Влияние фарморубицина на хемшпоминесценцию цельной крови в условиях дифтерийной интоксикации (в % в сравнении с контролем) Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем.

Полученные нами данные о влиянии про- и янтиоксидантов на выживаемость (допытных животных при дифтерийной интоксикации представлены на рисунке 3 гр. 18).

Выживаемость животных, получивших фарморубицин на фоне введения пре-,рата ДТ, оказались достоверно выше в сравнении с животными контрольной гру-гы, получившими наряду с ДТ изотонический раствор хлорида натрия или олив->вое масло в эквивалентах объёмах. Летальность животных, получивших на фоне едения ДТ а-токоферол и эмоксипин, практически не отличалась от таковой у квотных контрольной группы. То есть, только прооксидантный препарат - фар-зрубицин - проявил протекгивное действие по отношению к выживаемости под-гытных животных.

Таким образом, подученные нами данные свидетельствуют о том, что фармо-'бицин способствует уменьшению токсических эффектов ДТ, увеличивая метабо-¡ческую активность полиморфноядерных лейкоцитов, сниженную в условиях диф-рийной интоксикации.

£30-

403-

2С0-

«

ж

У—I '

ига-

ico-I so ESTO

.S

СО 4030' 20-1<Ч 0'

1-

1

fn t

ti

- 4

. Л-

РГ

14

£ ц

4 !.:

i ft

t лг

P I i * Г

if; L

1 -l

Через Через Через Через

24 48 72 168

часа часов часа часов

Рис. 3

□Контроль □ Фарморубищш □Эмоксипин ВТокоферол

Влияние анти- и прооксидантных препаратов на выживаемость экспериментальных животных в условиях дифтерийной интоксикации (в % в сравнении с контролем) Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем.

ВЫВОДЫ

1. При дифтерийной интоксикации происходит накопление продуктов пер кисного окисления липидов (шиффовых оснований и диеновых конъюгатов) в тк нях миокарда, печени и почек.

2. В условиях дифтерийной интоксикации в тканях миокарда, печени и поч< наблюдаются разнонаправленные изменения активности антиоксидантных ферме] тов.

3. Экзотоксин C.diphíheriae, действуя in vivo, вызывает снижение продукт полиморфноядерными лейкоцитами АФК и их биоцидных метаболитов, особен* выраженное в первые часы интоксикации; аналогичный эффект действия токсина vitro характеризуется линейной зависимостью от его концентрации.

4. Антибиотики аятрацшслического ряда в условиях дифтерийной интоксик ции резко увеличивают как спонтанную, так и стимулированную продукцию пол] морфноядернымн лейкоцитами АФК и их реакционноспособных метаболитов.

5. Препараты прооксидантного действия - антибиотики антрациклическогс 1яда - увеличивают выживаемость экспериментальных животных в условиях диф-ерийной интоксикации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Система перекисного окисления липидов в процессе дифтерийной инток-;икации //1 научная сессия Ростовского государственного медицинского университета - Ростов-на-Дону, 1996. - С. 127 - 128.

2. Влияние дифтерийного токсина на систему перекисного окисления липи-юв и антиоксидантной защиты (Г.Г.Ясько). - // Анн. докл. 50-й итоговой научно? юнференции студентов, молодых учёных и специалистов РГМУ. - Ростов-наг Дону 996. - С. 46 - 47.

3. Хемилюмннесценция цельной крови морских свинок в условиях эксперт тентальной дифтерийной интоксикации // Там же, С. 49.

4. Система перекисного окисления лшгадов в реализации метаболическое |ффекта дифтерийного токсина (А.П.Шепелев). - // Материалы VII съезда Всерос-¡ийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 1997. - т [, С. 255.

5. The effect of С. diphtherias toxin on lipid peroxidation processes in animal A.Y.Antipov, A.V.Shestopalov). - // Actual questions of experimental & clinical medi-:ine (I-st Scientific conference of students and postgraduates). - Rostov-on-Don, 1995. • \ 5.

6. Metabolic disturbances in lipid peroxidation processes at experimental diphtherii ntoxication (E.Y.Nagluk, G.G.Yasko). - // Actual questions of experimental &. clinica nedicine (П-nd Scientific conference of students and postgraduates). - Rostov-on-Don [996. - P. 5.

7. Metabolic action of diphtheria toxin: view from lipid peroxidation (A.P.Shepe-ev). - // "Oxidative Stress and Redox Regulation", France, Paris, 21-24 May 1996, N' /П. - Paris, 1996. - P. 42.

8. The action of the diphtheria toxin on lipid peroxidation system and metabolic ac-ivity of phagocytes (A.P.Shepelev). - // 8-th Biennal Meeting Int. Soc. for Free Radical les., Barcelona, Spain, October 1996. - N9,112.