Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения системы глутатиона при токсическом действии ксенобиотиков и возможные методы их коррекции

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменения системы глутатиона при токсическом действии ксенобиотиков и возможные методы их коррекции"

005014657

Баторова Татьяна Матвеевна

ИЗМЕНЕНИЯ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ВОЗМОЖНЫЕ МЕТОДЫ ИХ

КОРРЕКЦИИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 [.1А? Ш

Новосибирск - 2012

005014657

Работа выполнена в Иркутском государственном медицинском университете Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Колесниченко Лариса Станиславовна Официальные оппоненты:

Суменкова Дина Валерьевна, доктор биологических наук, доцент, ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, с.н.с.

Меныцикова Елена Брониславовна, доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, в.н.с.

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Защита состоится « 3 » 2012 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.034.0] в ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН

Автореферат разослан « » ^¿¿/¡,/п^_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Русских Галина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Современный человек живет и работает в условиях непрерывного контакта с окислителями окружающей среды: отходами производства, загрязняющими почву, воду, воздух; синтетическими стабилизаторами, загустителями, ароматизаторами, содержащимися в продуктах питания; лекарственными препаратами, средствами бытовой химии.

Количество острых отравлений в развитых странах мира (в США -около 600 ООО, в РФ - 570 ООО человек в год), ежегодно возрастает, не снижается существенно и число их летальных исходов.

Под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды, веществ с прооксидантными свойствами, ксенобиотиков возможна интенсификация перекисного окисления липидов в организме [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2008; Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Левицкий E.JL и др., 2008]. В результате возникает дисбаланс в системе свободнорадикального окисления / антиоксидантной защиты со сдвигом в сторону первого. Это может привести к повышению содержания, прежде всего в печени, таких продуктов, как липоперекиси, радикалы жирных кислот, кетоны, альдегиды, кетокислоты, что, в свою очередь, сопровождается повреждением и увеличением проницаемости клеточных мембран, окислительной модификации структурных белков, ферментов, биологически активных веществ. Защиту тканей от окислительного стресса осуществляют эндогенные антиоксиданты и в первую очередь система глутатиона. Глутатион относится к основным звеньям антиоксидантной защиты, участвует в детоксикации ксенобиотиков и продуктов метаболизма, оказывает влияние на активность ферментов, регулирует обмен эйкозаноидов и простагландинов, влияет на биосинтез нуклеиновых кислот, выполняет другие не менее важные функции [Kulinsky V.l., Kolesnichenko L.S., 2009; Ballatori N., Krance S.M., Notenboom S„ 2009].

Все это позволяет рассматривать обмен глутатиона в качестве механизма обеспечения резистентности организма к действию токсикантов. В настоящее время синтезированы новые фармакологические препараты, на основе глутатиона, для профилактики и лечения токсических повреждений тканей [Куценко С.А., 2004]. Имеются данные о перспективности определения концентрации глутатиона в клетках крови при оценке тяжести отравлений различными токсикантами [Ливанов Г.А. и соавт., 2001].

Список используемых сокращений:

АФК - активные формы кислорода, ГГТ - гамма-глутамилтрансфераза, ГПО -глутатионпероксидаза, ГР - глутатионредуктаза, ГТ - глутатионтрансфераза, ЛК - а-липоевая кислота, ОС - окислительный стресс, ПОЛ - перекисное окисление липидов, ТБК - тиобарбитуровая кислота, ФЛ - феррум лек, ЦПА - >16-циклопентиладенозии, ЭГТА - птштенгликольтетраацетат, ОБН - восстановленный глутатион.

Положительное воздействие препаратов антиоксидантов при отравлении разными токсикантами известно, однако влияние на систему глутатиона в комплексе не изучалось.

Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона на острое воздействие токсичных химических веществ является важной проблемой, решение которой может способствовать существенному росту эффективности оказания помощи при отравлении, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.

Цель исследования

Изучение активности процессов перекисного окисления липидов и системы глутатиона при введении этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина в токсических дозах и разработка методов коррекции выявленных нарушений.

Задачи исследования:

1. Исследование токсического действия этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина на активность процессов перекисного окисления липидов и концентрацию восстановленного глутатиона в печени и почках экспериментальных животных.

2. Исследование токсического действия этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина на активность ферментов метаболизма глутатиона: глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы и гамма-глутамилтрасферазы в печени и почках экспериментальных животных.

3. Исследование влияния антиоксиданта липоевой кислоты и протекторных соединений других механизмов действия на процессы перекисного окисления липидов, концентрацию восстановленного глутатиона и активность ферментов его метаболизма в тканях лабораторных животных в условиях введения этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина.

Научная новизна:

В результате проведения комплексного сравнительного исследования токсического действия этиленгликольтетраацетата, феррум лека и метанола на активность процессов перекисного окисления и систему глутатиона впервые установлена эффективность применения Ы6-циклопентиладе1юзина, лидокаина и липоевой кислоты для предотвращения интенсификации свободнорадикального окисления липидов и коррекции системы глутатиона в условиях интоксикации этиленгликольтетраацетатом. Обнаружено, что активация процессов перекисного окисления липидов и нарушения системы глутатиона, возникающие в условиях токсического воздействия препарата железа феррум лека, эффективно нивелируются введением антиоксиданта липоевой кислоты. Установлена эффективность применения липоевой

кислоты для предотвращения процессов перекисного окисления липидов и коррекции системы глутатиона в условиях интоксикации метанолом. Обнаружено, что активация процессов перекисного окисления липидов и нарушения системы глутатиона, возникающие в условиях интоксикации депакином, предупреждаются введением адеметионина (гептрала) и иммунокала.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в ходе диссертационного исследования результаты позволяют расширить представления о состоянии перекисного окисления липидов, системы глутатиона и метаболизме глутатионзависимых ферментов: глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы,

глутатионтрансферазы и гамма-глутамилтрансферазы при интоксикации ксенобиотиками. Представленные результаты дают возможность уточнить состояние антиокислительных процессов и дифференцированно подойти к назначению антиоксидантной терапии. Обоснована возможность применения антиоксидантов в качестве корректора системы глутатиона в условиях интоксикации ксенобиотиками.

Внедрение результатов в практику

Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре химии, кафедре фармакологии и кафедре факультетской терапии Иркутского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Этиленгликольтетраацетат, феррум лек и метанол вызывают дестабилизацию системы глутатиона в печени мышей. Универсальными показателями нарушения системы глутатиона при отравлении разными токсикантами являются повышение содержания продуктов перекисного окисления и снижение концентрации восстановленного глутатиона.

2. Нарушение системы глутатиона при введении этиленгликольтетраацетата начинается со снижения активности глутатионпероксидазы, повышения активности глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы в печени мышей. При введении этиленгликольтетраацетата с 1Ч6-циклопентиладенозином и лидокаином нормализуется концентрация восстановленного глутатиона, активность глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы, предотвращается активация процессов перекисного окисления липидов.

3. Феррум лек вызывает активацию глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы только в высоких дозах, резко увеличивает активность гамма-глутамилтрансферазы.

Липоевая кислота при совместном введении с феррум леком значительно снижает активацию перекисного окисления, сглаживает снижение концентрации восстановленного глутатиона и нормализует активность глутатионпероксидазы и гамма-глутамилтрансферазы в печени.

4. При отравлении метанолом наблюдается выраженное напряжение системы глутатиона, проявляющееся снижением активности глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы как в печени, так и в почках. Этанол и липоевая килота предупреждают негативные сдвиги, при этом липоевая кислота дает наиболее выраженный эффект.

5. Депакин вызывает активацию гамма-глутамилтрансферазы и снижает активность глутатионтрансферазы. Адеметионин и иммунокал при совместном введении с депакином предупреждают активацию перекисного окисления липидов.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на V и VI Международных Пироговских научных медицинских конференциях (Москва, 2010, 2011); 78-й итоговой научно-практической конференции СНО им. И.И. Мечникова посвященной 350-летию г. Иркутска (Иркутск, 2011); Пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011); X Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула 2011); III итоговой конференции молодых ученых (Иркутск, 2011), научно-практической конференции Уральского федерального округа по клинической токсикологии с международным участием «Роль токсикологических центров в обеспечении химической безопасности на региональном уровне» (Екатеринбург, 2011).

Публикации

По теме опубликовано 15 работ, из них 7 статей, 8 тезисов, в том числе в центральных журналах и международных сборниках научных трудов. В российских рецензируемых ВАК научных журналах опубликовано 6 статей и 3 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследований, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 273 источников, из которых иностранных авторов 204. Работа иллюстрирована 1 схемой, 31 таблицами и

12 рисунками. Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместных работах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на 277 беспородных взрослых мышах обоего пола массой 28-31 г, 73 беспородных крысах массой 180-200 г. Грызунов получали из питомника Ангарского НИИ медицины труда и экологии человека СО РАМН. Все операции до конечного этапа - спектрофотометрического определения ферментативной активности - проводили при 4°С. Исследуемые органы (печень и почки) быстро извлекали, промокали фильтровальной бумагой, взвешивали и гомогенизировали в пробирке, погруженной в емкость со льдом. Стандартными спектрофотометрическими методами определяли концентрацию глутатиона (Anderson М.Е., 1989) и активность ферментов: глутатионтрансферазы (Habig W.H. et al., 1974), глутатионредуктазы (Mannervik В. et al., 1989), глутатионпероксидазы (Flohe L., 1988) и гамма-глутамилтрансферазы. В качестве маркеров перекисного окисления липидов проводили измерение ТБК-активных продуктов (Stocks J. et al., 1974; Волчегорский И.А. и др., 2000).

Все результаты были статистически обработаны (Закс Л., 1976; Гланц С., 1998). Серии сравнивали между собой по дисперсиям (критерий F) и средним (критерии t Стьюдента и t Велча). Различия считали значимыми, если вероятность случайности не превышала 5% (р<0,05).

Таблица 1.

Схема проведения экспериментального исследования

Препарат Дозы Сроки исследования Корректор Количество особей

1 ЭГТА 1,9 мг в 100 мкл - а-липоевая кислота, CPA, лидокаин 82

2 Железа (III) гидроксид полиизомальтозат -Феррум лек 5, 15, 30,75 мг 7 суток а-липоевая кислота 89

3 Метанол 40,5,81, 162, 324 мг 2, 4, 7, 10 и 16 ч Этанол, а-липоевая кислота 106

4 Депакин 600 мг/кг 14 и 28 суток Адеметионин, иммунокал 73

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведен комплексный анализ активности процессов перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы в тканях экспериментальных животных при введении этиленгликольтетраацетата,

феррум лека, метанола и депакина в токсических дозах. Определяли содержание ТБК-активных продуктов (маркер интенсивности перекисного окисления липидов), концентрацию восстановленного глутатиона и активность ферментов метаболизма глутатиона: глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы и гаммаглутамилтрансферазы в печени и почках мышей.

Проведенный сравнительный анализ показал, что при отравлении разными токсикантами универсальными показателями являются повышение содержания продуктов ПОЛ и снижение концентрации С8Н в печени. Со стороны активности ферментов - ГР, ГТ, ГПО и ГГТ наблюдаются разнонаправленные сдвиги, что в свою очередь может способствовать разной степени выраженности окислительного стресса.

Так, при внутрисердечном введении этиленгликольтетраацетата выявлено повышение содержания ТБК-активных продуктов в печени на 77%, в почках, напротив, снижение на 28%; при этом концентрация вБН снижается на 31 и 54%. Этиленгликольтетраацетат повышает в печени и почках активности ГР на 53 и 63%, ГТ на 44% и в 5,5 раз, ГПО в почках в 2,2 раза. В печени активность ГПО снижается на 30% (табл. 2).

Таблица 2

Динамика показателей системы глутатиона в печени при введении ЭГТА

Показатели ТБК- активные продукты взн ГТ ГР ГПО

Контроль (п=17) 50,9±3,84 6,38 ±0,17 1284±118 31,8±1,28 75,3±8,07

ЭГТА (п=12) 90,3±9,61 4,38 ± 0,45 1854±172 Т* 48,5±2,92 52,4±5,96

ЛК+ЭГТА (п=б) 39,4±0,96 4,31±0,44 2031± 15,9 31,3±1,52с 116±10,5 С

ЦПА+ЭГТА (п=6) 44,2±4,81 с 4,24±0,41 1*** 2925±555 | 45,4±5,92 Т* 72,9±6,6611

Лидокаин+ ЭГТА (п=6) 50,9±2,88 7,85±0,12 1612±149 21,5*2,21 1**-с 165±22,2

ЦПА+Лидокаин +ЭГТА (п=20) 32,7±3,84 6,39±0,26 ь 1228±115ь 28,9±2,27 с 115±19,7

Примечание: данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего; в таблице приняты следующие обозначения: * — р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001; а —р < 0,05, Ь — р < 0,01, с — р < 0,001 в сравнении с группой, которой вводили этиленгликольтетраацетат; активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; концентрация глутатиона выражена в мкмоль на грамм ткани, концентрация ТБК-активных продуктов выражена в нмоль/г ткани.

Увеличение концентрации маркеров перекисного окисления и снижение концентрации 08Н в печени экспериментальных животных свидетельствуют о развитии окислительного стресса. Таким образом,

введение этиленгликольтетраацетата сопровождается усилением свободно-радикальных процессов и снижением антиоксидантной защиты в печени мышей.

Повышение активности ферментов может быть обусловлено связыванием этиленгликольтетраацетатом ионов Са2+, которые, возможно, ее снижают. Дефицит ионов кальция повышает возбудимость сердца, нарушает множественные метаболические и функциональные эффекты. Что приводит к недостаточному мозговому кровообращению, повреждению клеток мозга и остановке сердца.

В качестве препаратов коррекции нарушений системы глутатиона и процессов ПОЛ изучали а-липоевую кислоту, лидокаин и циклопентиладенозин. При введении этиленгликольтетраацетата на фоне липоевой кислоты наблюдается нормализация концентрации ТБК-активных продуктов в печени и почках, однако концентрация СБН остается сниженной и в печени и в почках, так снижение составляет - 32 и 58%. Данный сдвиг, вероятно, связан с восстановлением внеклеточной среды дигидролипоевой кислотой за счет истощения НАДФН клеток на восстановление липоевой кислоты. При введении этиленгликольтетраацетата на фоне липоевой кислоты в печени повышается активность ГПО на 54%, остается повышенной активность ГТ - на 53%, активность ГР нормализуется. В почках активность ГПО снижается на 56%, активности ГР и ГТ нормализуются (табл. 2).

При совместном введении циклопентиладенозина и этиленгликольтетраацетата, концентрация СБН в печени остается сниженной - на 34%, но при этом содержание ТБК-активных продуктов снижается до показателей контрольной группы. Нормализуются активности ГПО в печени и в почках, ГР и ГТ в почках. Сохраняется повышенной активность ГР и повышается активность ГТ на 128% в печени (табл. 2). Из выявленных изменений при совместном введении этиленгликольтетраацетата и циклопентиладенозина, сохраняются только 3 показателя: сниженная концентрация вБИ, увеличеные активности ГТ и ГР в печени.

Совместное введение лидокаина и этиленгликольтетраацетата не сопровождается повышением концентрации ТБК-активных продуктов, но приводит к повышению концентрации вЗН на 23% в печени. В печени резко увеличивается активность ГПО в 2,2 раза, в почках остается повышенной. Активность ГР в печени снижается на 32%, в почках нормализуется (табл. 2). Активность ГТ в почках остается повышенной, но менее выраженной.

При введении циклопентиладенозина, затем через 3 часа лидокаина и через 15 минут этиленгликольтетраацетата предотвращается активация процессов ПОЛ в тканях, что выражается снижением концентрации ТБК-активных продуктов в печени на 36% и в почках на 59%; увеличивается в печени концентрация вЗН до уровня контрольной группы. В почках уровень Ст5Н остается сниженным, но менее выраженным. Активность ГР и ГТ и в печени и в почках полностью нормализуются, в отличие от введения на фоне циклопентиладенозина или лидокаина по отдельности. Активность ГПО повышается только в почках на 42%, тогда как на фоне

циклопентиладенозина активность ГПО нормализуется и в печени и в почках, а на фоне лидокаина активность в печени резко повышена (табл. 2).

Введение этиленгликольтетраацетата вызывает остановку сердца; глобальную ишемию головного мозга. В работе Гольдапель Э.Г., и соав. [2011] описано, что при введении этиленгликольтетраацетата продолжительность жизни мышей составляет 34 с. Введение этиленгликольтетраацетата на фоне циклопентиладенозина и лидокаина повышает продолжительность жизни животных в 4,4 раза до 2 мин 30 с, при этом 36% мышей выжило. Введение циклопентиладенозина с лидокаином ослабляет или устраняет повреждения и гибель клеток, вызванные введением этиленгликольтетраацетатом и возможно способствует регенерации тканевых структур и их функций. Совокупность полученных данных доказывает, что циклопентиладенозин обладает высоким защитным эффектом против повреждающих факторов.

Таким образом, анализ полученных данных показал, что липоевая кислота не полностью предотвращает дестабилизацию системы глутатиона при интоксикации этиленгликольтетраацетатом. Значительно лучше защищает аденозин. Аденозин — признанный ингибиторный нейротрансмиттер. Циклопентиладенозин - селективный агонист А,-рецепторов. Поэтому, возможный эффект на систему глутатиона реализуется либо в результате ингибирования аденилатциклазы, либо в результате активации фосфолипазы С, приводящей к увеличению образования инозитолтрисфосфата, диацилглицерола и мобилизации кальция. Кроме того А1-рецепторы сопряжены с К+-каналами. Введение циклопентиладенозина с лидокаином защищает лучше от такого сильного токсиканта, чем по отдельности циклопентиладенозин или лидокаин. Введение этиленгликольтетраацетата на фоне циклопентиладенозина и лидокаина способствует предотвращению активации процессов ПОЛ, нормализации концентрации GSH и активности ферментов. Отдельно циклопентиладенозин, лидокаин и липоевая кислота - не дают такого эффекта.

Число людей с дефицитом железа в мире, по данным ВОЗ, достигает 200 млн. человек. Ключевым компонентом стандарта лечения больных железодефицитной анемией (ЖДА) является терапия препаратами железа. Одной из функций железа является образование активных форм кислорода, которые выполняют двойную функцию: в низких концентрациях стимулируют защитные силы клеток, а в высоких приводят к развитию окислительного стресса, окислительной модификации многих клеточных структур и, как следствие, повреждению генетического аппарата клетки [Toxqui L., De Piero A., Courtois V. et al., 2010; Kuo K.L., Hung S.C, Wei Y.H. et al., 2008]. При исследовании свойств препаратов солей железа и железосодержащих комплексов получены данные о том, что они обладают способностью активировать свободнорадикальные процессы, то есть вызывают окислительный стресс [Swarnalatha G., Ram R., Neela P. et al., 2010; Kuo K.L., Hung S.C., Wei Y.H. et al., 2008; Bhatla N., Kaul N., Lai N. et al.,

2009; Zhuang J., Zhang Y., Zhang W. et al., 2010; Hodkova A., Cerna P., Kotyzova D. et al., 2010]. Поэтому изучение безопасности и возможных негативных воздействий на различные системы организма препаратов железа имеет большое научно-практическое значение.

Проведенное нами комплексное изучение при введении феррум лека позволило выявить активацию перекисного окисления и дестабилизацию системы глутатиона. Показано, что концентрация ТБК-активных продуктов и показатели системы глутатиона изменялись в зависимости от дозы вводимого препарата. Так введение феррум лека, начиная с дозы 15 мг, сопровождается повышением концентрации ТБК-активных продуктов в 2,9-4,9 раз и снижением содержания GSH на 35-77% в печени. В печени снижение концентрации GSH хорошо коррелирует с увеличением активности ГГТ. В эксперименте наблюдается повышение активности ГР на 42-126% в печени. Низкая концентрация GSH может индуцировать синтез ГР, однако повышение активности ГР не приводит к восстановлению концентрации GSH, что, вероятно, может быть связано с нарушением пентозофосфатного цикла, главного источника НАДФН.

Таблица 3

Динамика показателен системы глутатиона в печени при введении разных доз феррум лека

Показатели ТБК-акшвные продукты GSH ГГТ ГР

Контроль (п=17) 50,9±3,84 6,38±0,17 407±44,2 31,8 ± 1,28

ФЛ 5 мг (п=10) 79,8±16,3 6,46±0,14 354±69,0 45,1±3,35**

ФЛ 15 мг (п=8) 147±14,4 Т*** 4,12±0,33 [*** 1257±146*** 51,9±9,16*

ФЛ 30 мг (п=9) 143±16,3 Г** 2Л8±0,19 1748±178*** 51,7±2,60*

ФЛ 75 мг (п=12) 247±25,9 f*** 1,46±0,08 1*** 1818±136** * 71,8±1,61***

Примечание: Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение; * - р < 0,05. ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 в сравнении с контрольной группой; активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; концентрация глутатиона выражена в мкмоль на грамм ткани; концентрация ТБК-активных продуктов выражена в нмоль/г ткани.

Умеренное повышение активности ГТ и ГПО в печени может быть результатом их индукции вследствие развития окислительного стресса, и это можно рассматривать как благоприятный фактор. В почках происходит значительное увеличение активности ГТ на 54-182%, что, безусловно, является результатом индукции (рис. 1, 2). Отличия ГТ в двух органах, вероятно, могут быть связаны с содержанием разных изоферментов в печени и почках.

ГТ печень

в I

Ц

Контроль 5мг 15мг 30мг 75мг

ГТ почки

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Контроль 5мг 15мг 30мг 75мг

Рис. 1. Изменение активности ГТ в печени и почках мышей при введении разных доз феррум лека

Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклоненме; * - р < 0,05, * * - р < 0,01, *** - р < 0,001 в сравнении с контрольной группой

ГПО печень

ГПО почки

160 140

го

1 120 ю

2 100

1 80 X

I 60

§ 40 20 0

Контроль 5мг 15мг 30мг 75мг

Рис. 2. Изменение активности ГПО в печени и почках мышей при введении разных доз феррум лека

Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 в сравнении с контрольной группой

Еще более резкие изменения связаны с другими ферментами. В почках, в отличие от печени, изначально высока активность ГГТ, поэтому ее снижение можно рассматривать как компенсаторное сохранение концентрации С8Н, снижение активности ГР и ГПО тоже может свидетельствовать о минимизации редокс-дисбаланса и адаптации. Таким образом, выявлены тканевые различия в действии феррум лека на активность ГР, ГПО и ГГТ. Введение высоких доз феррум лека вызывает выраженный окислительный стресс, сопровождающийся активацией процессов перекисного окисления липидов (высокая концентрация ТБК-активных продуктов) и снижением

концентрации GSH в печени и в почках, в печени это усиливается высокой активностью ГГТ, а в почках снижением активности ГР и ГПО. В работе Hodkova A., Cerna P., Kotyzova D. et al. [2010] показано, что железо (III) вызывает активацию перекисного окисления липидов.

Липоевая кислота при совместном введении с феррум леком значительно снижает активацию ПОЛ и нормализует активность ГГТ в печени (рис. 3).

Рис. 3. Содержание ТБК-активных продуктов и активности ГГТ в печени мышей при введении феррум лека и на фоне липоевой кислоты

Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** -р < 0,001 в сравнении с контрольной группой; а - р < 0,05, b - р < 0,01, с - р < 0,001 в сравнении с группой, которой вводили феррум лек

Введение липоевой кислоты сглаживает увеличение активности всех трех ферментов метаболизма глутатиона, потенцируя работу системы глутатиона. Липоевая кислота обладает позитивным влиянием на систему глутатиона. В исследованиях Swarnalatha G. и соавт. [2010] показано, что N-ацетилцистеин предотвращает окислительный стресс при отравлении препаратами железа. Milczarek R. и соавт. [2010] установили, что мелатонин усиливает антиоксидантное действие альфа-токоферола и аскорбата при отравлении препаратами железа.

Отравления метанолом чаще всего связаны с ошибочным использованием его вместо этанола с целью опьянения. Реже встречаются производственные отравления парами. Отравления метанолом опасны, так как характеризуются высокой частотой смертельных исходов и высокой инвалидизацией отравленных. Установлено, что при алкогольной интоксикации интенсификация свободнорадикального окисления [Забродский ГГ.Ф., Киричук В.Ф., Серов В.В., 2007; Parthasarathy NJ, Kumar

300 250

s 200 х та hi

■fc 150

_o

к

О

| 100 50

контроль 15 мг ЛК+ 30мг Л К- 75 мг ФЛ+ ФЛ 15мгФЛ ФЛ 30мгфЛ ФЛ 75мгфЛ

ЯБ, Маткапс1ап Б, 2006; БапёЫг Я, Каиг К., 2006] связана, прежде всего, с угнетением функционирования антиоксидантной глутатионовой системы.

При введении метанола наблюдается выраженное напряжение системы глутатиона, проявляющееся снижением содержания ОБН и активности ферментов - ГР, ГТ и ГПО как в печени, так и в почках, на фоне повышения показателей перекисного окисления липидов (табл. 3). Показано, что функционирование системы глутатиона изменялось в зависимости от дозы вводимого препарата и времени экспозиции.

Таблица 4

Динамика показателей системы глутатиона в печем при введении метанола

Показатели СКН ГТ ГР ГПО

Контроль 6,17±0,13 1109±102 33,7±1,31 79,2±7,13

М 40,5 мг 2ч 6,09±0,20 1073±21,3 33,1±1,85 85,5±4,56

М 40,5 мг 4ч 5,96±0,78 980±22.9 28,7±0,87 64,1±3,16

М 81 мг 2ч 5,33±0,15 1039±21,6 30,7±2,29 80,1±5,67

М 81 мг 4ч 5.22±0,21 1** 1007±34.4 31,2±1,55 86,7±3,12

М 162 мг 4ч 4,87±0,10 ],*** 1014±29,8 26,0±0.60 1*** 61,8±2,04

М 162 мг 7ч 3,06±0,04|*** 864±14,5 1* 22,5±0,32 1*** 46,3±4,71 |**

М 324 мг 4ч 3,99±0,12 879±21,5 1* 21,1±0.84|*** 50.2±2,83 |*

М 324 мг 7ч 3,20±0,11 844±32,2 1* 22,6±0,63 4*** 60,3±5,10 4***

Примечание: Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение; * - р < 0,05, ** — р < 0,01, *** - р < 0,001 в сравнении с контрольной группой; активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; концентрация глутатиона выражена в мкмоль на грамм ткани.

Длительное поступление алкоголя вызывает индукцию микросомальной Р450-окисляющей системы. Активация микросомального окисления сопровождается генерацией активных форм кислорода, что приводит к интенсификации процессов ПОЛ. При этом уровень эндогенных веществ, удаляющих свободные радикалы, снижен. Развивающийся окислительный стресс приводит к нарушению функции основного структурного компонента клеточных мембран — фосфолипидов. Это ведет к повышению проницаемости мембран, нарушению трансмембранного транспорта, изменениям функционирования клеточных рецепторов и мембраносвязанных ферментов. Усиление ПОЛ является механизмом нарушения функции митохондрий: подавляется окисление жирных кислот и ацетальдегида, снижается активность цитохромоксидазы, цепи дыхательных ферментов и угнетается окислительное фосфорилирование. Уменьшение содержания вБН можно связать как со снижением синтеза глутатиона, так и с повышением его потребления, а также замедлением восстановления из окисленной формы. Выраженные изменения содержания ТБК-активных продуктов и системы глутатиона свидетельствуют об интенсификации свободнорадикального окисления и угнетении функционирования антиоксидантной системы глутатиона.

Учитывая, что этанол ингибирует превращение метанола в формальдегид, а также принимая во внимание, что этанол имеет значительно большее сродство к алкогольдегидрогеназе (20:1), его используют в качестве антидота при лечении отравлений метанолом. Это объясняется тем, что этанол уменьшает скорость окисления метанола почти на 50%, а, следовательно, понижает его токсичность. В то же время нельзя не отметить, что высокие дозы этанола не безразличны для организма. Они могут способствовать усилению церебральных и гемодинамических нарушений, а также метаболических сдвигов, главным образом за счет изменения соотношения НАДН/НАД+, образования значительных количеств ацетальдегида и ацетата, развитию ацидоза, гипогликемии. Это вместе с вредным действием этанола на мембраны и ацетальдегида на белки приводит к коме. Кроме того, этанол, судя по всему, не в полной мере отвечает реальным условиям оказания помощи и эвакуации пострадавших, поскольку на практике трудно поддерживать его концентрацию в крови, необходимую для эффективной конкуренции за фермент. Поэтому вполне оправданным представляется поиск других препаратов, способных подавлять интоксикацию. 8апс11нг Я, Каиг К. [2006] исследовали эффективность этанола в качестве противоядия при отравлении метанолом. Введение метанола привело к активации процессов ПОЛ и снижению концентрации вБИ. Результаты исследования свидетельствуют о благоприятном воздействии этанола.

Изучали ЛК в качестве препарата коррекции нарушений системы глутатиона, вызванных интоксикацией метанола. Механизм защитного действия ЛК связан со снижением концентрации токсических продуктов метаболизма метанола, снижением соотношения НАДН/НАД , снижением пероксидации липидов, повышением синтеза глутатиона, приводящим к преобладанию активности антиоксидантных систем над процессами свободнорадикального окисления. Доза 162 мг метанола оказалась токсичной, но не приводит к гибели мышей. Доза 324 мг метанола -высокотоксичной, гибель животных наступала через 7ч. На фоне этанола продолжительность жизни мышей увеличилась на 43% и составила 10 ч, а на фоне ЛК продолжительность жизни увеличилась в 2,3 раза, и составила 16ч.

Полученные данные свидетельствуют о возможности коррекции функционирования антиоксидантной системы при интоксикации метанолом с помощью этанола и липоевой кислоты, при этом липоевая кислота дает наиболее выраженный эффект. Имеются данные о защитном эффекте мелатонина при интоксикации метанолом [Кигсег Ъ., 0§иг Е., 1гаг М., 2007], Ы-ацетилцистеина и производных тролокса [РагЫз7_е\\'зк1 Я, \Vitek А, БкггусИешБка Е, 2000].

Эпилепсия является одной из распространенных болезней нервной системы, требующая применения в своей терапии специфических противосудорожных препаратов. Уже довольно длительное время в литературе встречается большое количество сообщений о тех или иных побочных реакциях на прием различных антиконвульсантов. Учитывая

длительный срок приема этих препаратов, зачастую высокие их дозировки и сложные межлекарственные взаимодействия с их участием, а также вызываемые многими противоэпилептическими препаратами биохимические сдвиги, естественным будет ожидать появления в определенном проценте случаев тех или иных побочных реакций и осложнений при их применении. Базисными противоэпилептическими препаратами широкого спектра действия, которые могут использоваться при различных формах эпилепсии, являются вальпроаты. Примерно у 11 % больных, получающих вальпроат натрия, выявляется бессимптомное повышение активности трансаминаз, которая снижается при уменьшении дозы или отмене препарата. Однако могут развиться и более тяжелые печеночные реакции вплоть до летального исхода. Страдают в основном дети и люди молодого возраста - от 2,5 мес до 34 лет, в 69% случаев возраст больных не превышает 10 лет. Появление первых симптомов наблюдается в течение 1-2 мес после начала приема препарата и не встречается после 6-12 мес лечения. К первым проявлениям относятся рвота и нарушение сознания, сопровождающиеся гипогликемией и нарушениями свертывания крови. Кроме того, можно выявить и другие признаки, характерные для синдрома мелкокапельного ожирения. При электронной микроскопии обнаруживают повреждение митохондрий [Борисова Е.В. и соавт., 2006; Ш. Шерлок, Дж. Дули, 1999].

Нарушение функций митохондрий, в частности окисление жирных кислот, вызывают сам вальпроат натрия и его метаболиты, особенно 2-пролилпентаноевая кислота. Вальпроевая кислота и ее соли вызывают нарушения обмена кальция и дефицит карнитина, кроме того, для них также описаны нарушения натриевого обмена [Уеггой1 А., 8саг(3арапе А., Ргапгош Е., 2008]. Нарушения обмена кальция и натрия вызывают широкий спектр патологических реакций, в том числе с непосредственным повреждающим воздействием на нервную ткань [Войтенков В.В., Борисова Е.В., 2005]. Полипрагмазия, предположительно путем индукции ферментов, повышает вероятность фатального токсического повреждения печени у детей младшего возраста. Отмечаемое при этом повышение уровня аммиака в крови свидетельствует о подавлении в митохондриях ферментов цикла мочевины. Вальпроат натрия подавляет синтез мочевины даже у взрослых людей, вызывая гипераммониемию. Тяжелые реакции на препарат, возможно, обусловлены врожденной недостаточностью карбомоилфосфаггрансферазы.

В работе [УеггоШ А. е! а1., 2003] подробно рассматриваются механизмы токсичности вальпроевой кислоты на примере энцефалопатии. Авторы считают основным патогенетическим фактором этой токсичности ингибирование захвата глутамата астроцитами с повышением внутриклеточной осмолярности и последующим отеком клеток, что в дальнейшем ведет к повышению внутричерепного давления. Таким образом, на уровне клинических наблюдений имеется определенное количество описаний весьма тяжелых энцефалопатий, в том числе с развитием угрожающих жизни состояний, связанных с приемом вальпроатов.

В результате полученных данных установлено, что введение депакина вызывает выраженный окислительный стресс, проявляющийся активацией процессов перекисного окисления липидов (высокая концентрация ТБК-активных продуктов), снижением содержания С5Н в печени и почках и повышением активности ГГТ в печени (табл. 5).

Таблица 5

Изменения содержания ТБК-активных продуктов, концентрации ввН и активности ГГТ в тканях крыс при введении депакина в течение 14 и 28 суток.

Показатель Орган Контрольная группа (п=14) Депакии 14 дней (п=16) Депакин 28 дней (п=9)

ТБК-активиые продукты, нмоль/г ткани печень 25,6±б,89 58,1±6,89 Г* 92,5±18,7 t**

почки 18,7±3,94 62,0±3,94 t*** 70,9±17,7 Т*

GSH, мкмоль/г ткани печень 5,74±0,13 4,51±0,09 j*** 4,44±0,28 1***

почки 2,87±0,12 2,48±0,12 1* 1,72±0,08

ГГТ печень 1294±132 1181±94,0 1825±91,5 ]**

почки 158±2,98 97,1±7,41 171±11,5

Примечание: В скобках количество мышей в опытах; данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение; * -р < 0,05, ** -р < 0,01, *** -р < 0,001 в сравнении с контрольной группой; f - увеличение показателя; активность ГГТ выражена в печени -нмоль на 1 мг белка, в почках - мкмоль на 1 мг белка

Установленный нами дефицит GSH может свидетельствовать об ослаблении антиоксидантной системы в целом и выступать в качестве наиболее раннего показателя усиления окислительных процессов в клетках. Такое резкое повышение ТБК-активных продуктов указывает, что введение депакина сопровождается признаками активного окислительного стресса. В литературе описано развитие окислительного стресса [Verrotti A., Scardapane A., Franzoni Е„ 2008; Chang Т.К., Abbott F.S., 2006; Schulpis К.Н., Lazaropoulou С., Regoutas S., 2006], истощение концентрации ключевого антиоксиданта - глутатиона [Cengiz М., Yuksel A., Seven М., 2000] при введении вальпроата натрия.

ГГТ катализирует перенос у-глутамильного остатка на нуклеофильные акцепторы, тем самым снижая концентрацию GSH. Повышение активности ГГТ хорошо коррелирует с понижением концентрации GSH в печени. Однако в почках происходит снижение и концентрации GSH и активности ГГТ.

Повышение содержания ТБК-активных продуктов на фоне снижения концентрации GSH, активности ГР и ГТ, свидетельствует о выраженном окислительном стрессе. Повышение активности ТОО в печени можно рассматривать как благоприятный признак.

Изучали адеметионин и иммунокал в качестве препаратов коррекции нарушений системы глутатиона, вызванных применением депакина. На фоне курсового введение адеметионина сохраняется повышение содержания ТБК-

активных продуктов в печени и почках (рис. 4А) и снижение концентрации глутатиона в печени (рис. 4Б). Нормализуется активность ГТ в печени и почках.

70 60 50

з ж

* 40

ё зо

0

г

1 20

10 - -о

Контроль Д

Д*А

А)

Б)

Рис. 4. Изменения содержания ТБК-активных продуктов в печени и почках (А) и концентрации СЯН в печени (Б) у крыс при введении депакина на фоне адеметионина в течение 14 суток

Данные представлены в виде среднее± стандартное отклонение; * - р < 0,05. ** - р < 0,01, *** _р < 0,001 в сравнении с контрольной группой

Установлено, что комбинированное применение иммунокала и депакина предотвращает активацию ПОЛ, нормализует содержание С8Н через 14 дней. Через 28 дней совместного применения иммунокала и депакина нарушения редокс-баланса, вызванные депакином, становятся менее выраженными (табл. 6).

Таблица 6

Содержание восстановленного глутатиона в печени и почках крыс при введении депакина _на фоне иммунокала в течение 14 и 28 суток_

Серия ОЭН, мкмоль/г ткани

печень почки

Контрольная группа (п=14) 5,74±0,13 2,87±0,12

Д 14дн (п=16) 4,51 ±0,09 1*** 2,48±0,12

И + Д Иди (11=7) 5,53±0,08с 2,61 ±0.08

Д 28дн (п=9) 4,44±0,28 1*** 1,72±0,08 1***

И + Д28дн(п=10) 4.73±0,03 2,93±0,03с

Примечание: В скобках количество крыс в опытах; значимость различий с контролем: * -р < 0,05, ** -р < 0,01, *** -р < 0,001; значимость различий между сериями: а-р < 0,05, Ь - р < 0,01, с - р < 0,001; 1 - снижение показателя, | - увеличение показателя

Полученные нами изменения активности ферментов указывают на то, что при отравлении в механизмы антиоксидантной защиты активно включаются практически все звенья антипероксидной системы глутатиона без перераспределения между ними приоритетности. Связанный с интоксикацией окислительный стресс, вероятно, является следствием одновременного увеличения генерации активных форм кислорода и снижением емкости антиоксидантной защиты.

Вполне закономерно, что при отравлении разными токсикантами, в механизмах антиоксидантной защиты кроме системы глутатиона принимают участие другие как ферментативные (каталаза, супероксиддисмутаза), так и неферментативные антиоксиданты.

Полученные данные дают возможность уточнить состояние антиокислительных процессов, особенности функционирования внутриклеточного звена антиоксидантной защиты, использовать установленные закономерности в разработке препаратов и технологий, направленных на резервные возможности по повышению функциональных и адаптационных механизмов в условиях интоксикации, а также будут полезны в разработках прогностических методик инновационного характера.

выводы

1. Этиленгликольтетраацетат вызывает дестабилизацию системы глутатиона в печени, проявляющуюся снижением концентрации восстановленного глутатиона, повышением активности глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы на фоне повышения концентрации ТБК-активных продуктов. Введение этиленгликольтетраацетата на фоне циклопентиладенозина с лидокаином предотвращает повышение ТБК-активных продуктов и нормализует показатели системы глутатиона.

2. Введение феррум лека сопровождается повышением концентрации ТБК-активных продуктов, снижением концентрации восстановленного глутатиона на фоне активации гамма-глутамилтрансферазы в печени. Выявлены тканевые различия в действии феррум лека на активность глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и гамма-глутамилтрансферазы. При увеличении дозы феррум лека изменения показателей системы глутатиона становятся более выраженными.

3. Антиоксидант — липоевая кислота при совместном введении с феррум леком значительно снижает концентрацию ТБК-активных продуктов и нормализует активность гамма-глутамилтрансферазы в печени. Введение липоевой кислоты сглаживает изменение активности всех трех ферментов метаболизма глутатиона, потенцируя работу системы глутатиона.

4. При отравлении метанолом наблюдается выраженное напряжение системы глутатиона, проявляющееся снижением содержания вБН и активности ферментов - глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы как в печени, так и в почках, на фоне повышения концентрации ТБК-активных продуктов.

5. При введении этанола с метанолом сохраняется повышенное содержание ТБК-активных продуктов, сниженная концентрация СБН. При введении липоевой кислоты с метанолом остается сниженной концентрация восстановленного глутатиона, остальные показатели нормализуются. Совместное введение с метанолом этанола увеличивает продолжительность жизни животных до 10 ч, а липоевой кислоты-до 16 ч.

6. Введение депакина вызывает выраженный окислительный стресс, проявляющийся увеличением концентрации ТБК-активных продуктов и уменьшением концентрации глутатиона в печени и почках; в печени он усиливается высокой активностью гамма-глутамилтрансферазы и низкой активностью глутатионтрансферазы.

7. Адеметионин при совместном введении с депакином нормализует активность глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы. Комбинированное применение иммунокапа и депакина предотвращает повышение концентрации ТБК-активных продуктов, нормализует содержание СБН.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

]. Баторова Т.М. Изменения в системе глутатиона мышей при введении этиленгликольтетраацетата. // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2010. - №2.

- С. 459. (Из списка ВАК).

2. Баторова Т.М., Колесниченко Л.С. Влияние этиленгликольтетраацетата на систему глутатиона. // Сибирский медицинский журнал. - 2010. -№8. - С. 47-49. (Из списка ВАК).

3. Баторова Т.М. Влияние феррум лека на систему глутатиона мышей. // Биомедицина. - 2010. - №5. - С. 68-69. (Из списка ВАК).

4. Баторова Т.М., Колесниченко Л.С. Коррекция процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты этанолом и липоевой кислотой при токсическом действии метанола. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2011. - №1. - С. 207-211. (Из списка ВАК)

5. Колесниченко Л.С., Баторова Т.М. Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы глутатиона мышей при воздействии препарата железа. II Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2011. - №1. - С. 227-230. (Из списка ВАК).

6. Баторова Т.М., Субботина Т.Д. Состояние системы глутатиона мышей при введении феррум лека. // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2011. - №1.

- С. 189. (Из списка ВАК).

7. Баторова Т.М., Субботина Т.Д. Влияние метанола на систему глутатиона печени мышей и возможные методы коррекции. // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2011.-№1.- С. 188-189. (Из списка ВАК).

8. Охремчук Л.В., Баторова Т.М., Колесниченко Л.С., Семинский И.Ж. Состояние системы глутатиона в тканях паренхиматозных органов, головном мозге, эритроцитах крови у беспородных крыс при введении вальпроата натрия в токсической дозе. // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - №4. - С. 41-44. (Из списка ВАК).

9. Баторова Т.М. Токсическое действие метанола на систему глутатиона мышей и возможные методы коррекции. // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс». Сборник статей. - Барнаул. - 2011. -С. 8-10.

10. Баторова Т.М. Система глутатиона печени мышей при токсичеком действии метанола и ее коррекция липоевой кислотой. // Материалы 78-й итоговой научно-практической студенческой конференции СНО

им. И.И. Мечникова посвященной 350-летию г. Иркутска. - Иркутск. -2011.-С. 230.

П.Баторова Т.М., Субботина Т.Д. Влияние препарата железа на перекисное окисление липидов, концентрацию восстановленного глутатиона и активность гамма-глутамилтрансферазы. // Сборник материалов X Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине. - Тула. - 2011. - С. 14-15.

12.Баторова Т.М. Изменения в системе глутатиона печени и почек крыс при введении вальпроата натрия и их коррекция иммунокалом. // Материалы Ш-й итоговой конференции молодых ученых. - Иркутск. -2011.-С. 9-10.

П.Баторова Т.М., Субботина Т.Д. Перекисное окисление липидов, содержание восстановленного глутатиона и активность гамма-глутамилтрансферазы у крыс при введении вальпроата натрия. // Материалы Пятой Всероссийской научно-практической конференции. -Новосибирск.-2011.-С. 18-19.

М.Колесниченко Л.С., Баторова Т.М. Изменения в системе глутатиона печени мышей при введении феррум лека, и их коррекция липоевой кислотой. // Тезисы научно-практической конференции Уральского федерального округа по клинической токсикологии с международным участием. - Екатеринбург. - 2011. - С.69-70.

15.Колесниченко Л.С., Баторова Т.М., Субботина Т.Д. Состояние системы глутатиона при токсическом действии вальпроата натрия. // Якутский медицинский журнал. -2011. -№4. - С. 33-35. (Из списка ВАК).

Подписано в печать02.03.12. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Заказ № 607. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Печать ризография. Усл. печ. л. 1,40 Отпечатано в типографии ИГМУ. г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баторова, Татьяна Матвеевна, Иркутск

61 12-3/693

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БАТОРОВА ТАТЬЯНА МАТВЕЕВНА

ИЗМЕНЕНИЯ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ВОЗМОЖНЫЕ МЕТОДЫ ИХ

КОРРЕКЦИИ

03.01.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Колесниченко Л.С.

Иркутск-2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................5

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................12

1.1. Система глутатиона.............................................................12

1.1.1. Глутатион........................................................................12

1.1.2. Глутатионпероксидаза........................................................17

1.1.3. Глутатионредуктаза...........................................................21

1.1.4. Глутатионтрансфераза........................................................24

1.1.5. Гамма-глутамилтрансфераза................................................28

1.2. Перекисное окисление липидов...............................................31

1.3. Роль системы глутатиона в процессах детоксикации и антиоксид антной защиты......................................................36

1.4. Антиоксиданты и протекторные соединения других механизмов действия............................................................................40

1.4.1. Альфа-липоевая кислота......................................................40

1.4.2.1Ч6-циклопентиладенозин.....................................................42

1.4.3. Адеметионин....................................................................44

1.4.4. Иммунокал......................................................................47

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................49

2.1. Объект исследования...............................................................................49

2.2. Использованные фармакологические соединения и пути их введения...........................................................................49

2.3. Материалы и методы исследования...........................................51

2.3.1. Получение супернатанта гомогената......................................51

2.3.2. Определение концентрации восстановленного глутатиона...........51

2.3.3. Определение активности ферментов.......................................52

2.3.4. Определение активности процессов перекисного окисления липидов...........................................................................54

2.4. Методы статистической обработки результатов..........................55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.........56

3.1. Активность процессов перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы при введении этиленгликольтетраацетата и его введение на фоне корректоров...........................................56

3.1.1. Влияние этиленгликольтетраацетата на активность процессов перекисное окисление липидов, концентрацию глутатиона и активность ферментов его метаболизма...................................56

3.1.2. Коррекция изменений показателей перекисного окисления липидов и системы глутатиона, вызванных введением этиленгликольтетраацетата............................................................58

3.2. Влияние разных доз препарата железа - феррум лек на активность процессов ПОЛ и состояние антиоксидантной системы.................67

3.2.1. Перекисное окисление липидов и система глутатиона при введении разных доз феррум лека........................................................67

3.2.2. Коррекция липоевой кислотой изменений показателей активности процессов ПОЛ и системы глутатиона, вызванных введением феррум лека............................................................................................72

3.3. Активность процессов ПОЛ и состояние антиоксидантной системы при токсическом действии метанола..........................................73

3.3.1. Перекисное окисление липидов и система глутатиона при интоксикации метанолом....................................................74

3.3.2. Коррекция этанолом выявленных изменений показателей ПОЛ и системы глутатиона в условиях интоксикации метанолом............79

3.3.3. Коррекция липоевой кислотой выявленных изменений показателей ПОЛ и системы глутатиона в условиях интоксикации метанолом........................................................................................83

3.4. Влияние противоэпилептического препарата - депакина на перекисное окисление липидов и систему глутатиона....................89

3.4.1. Состояние перекисного окисления липидов и системы глутатиона

при введении депакина в токсической дозе на разные сроки..;......89

3.4.2. Коррекция выявленных изменений с помощью адеметионина (гептрала)........................................................................92

3.4.3. Коррекция выявленных изменений с помощью иммунокала.........94

ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................95

ВЫВОДЫ.................................................................................108

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................111

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

в/б - введение внутрибрюшинно

ГГТ - гамма-глутамилтрансфераза

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

п/к - введение подкожно

С8Н - восстановленный глутатион

0880 - окисленный глутатион

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Современный человек живет и работает в условиях непрерывного контакта с окислителями окружающей среды: отходами производства, загрязняющими почву, воду, воздух; синтетическими стабилизаторами, загустителями, ароматизаторами, содержащимися в продуктах питания; лекарственными препаратами, средствами бытовой химии.

Количество острых отравлений в развитых странах мира (в США -около 600 ООО, в РФ - 570 ООО человек в год), ежегодно возрастает, не снижается существенно и число их летальных исходов.

Под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды, веществ с прооксидантными свойствами, ксенобиотиков возможна интенсификация перекисного окисления липидов в организме [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2008; Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Левицкий Е.Л. и др., 2008]. В результате возникает дисбаланс в системе свободнорадикального окисления / антиоксидантной защиты со сдвигом в сторону первого. Это может привести к повышению содержания, прежде всего в печени, таких продуктов, как липоперекиси, радикалы жирных кислот, кетоны, альдегиды, кетокислоты, что, в свою очередь, сопровождается повреждением и увеличением проницаемости клеточных мембран, окислительной модификации структурных белков, ферментов, биологически активных веществ. Защиту тканей от окислительного стресса осуществляют эндогенные антиоксиданты и в первую очередь система глутатиона. Глутатион относится к основным звеньям антиоксидантной защиты, участвует в детоксикации ксенобиотиков и продуктов метаболизма, оказывает влияние на активность ферментов, регулирует обмен эйкозаноидов и простагландинов, влияет на биосинтез нуклеиновых кислот, выполняет другие не менее важные функции [Kulinsky V.l., Kolesnichenko L.S., 2009; Ballatori N., Krance S.M., Notenboom S., 2009].

Все это позволяет рассматривать обмен глутатиона в качестве механизма обеспечения резистентности организма к действию токсикантов. В настоящее время синтезированы новые фармакологические препараты, на основе глутатиона, для профилактики и лечения токсических повреждений тканей [Куценко С. А., 2004]. Имеются данные о перспективности определения концентрации глутатиона в клетках крови при оценке тяжести отравлений различными токсикантами [Ливанов Г.А. и соавт., 2001]. Положительное воздействие препаратов антиоксидантов при отравлении разными токсикантами известно, однако влияние на систему глутатиона в комплексе не изучалось.

Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона на острое воздействие токсичных химических веществ является важной проблемой, решение которой может способствовать существенному росту эффективности оказания помощи при отравлении, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.

Цель исследования

Изучение активности процессов перекисного окисления липидов и системы глутатиона при введении этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина в токсических дозах и разработка методов коррекции выявленных нарушений.

Задачи исследования:

1. Исследование токсического действия этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина на активность процессов перекисного окисления липидов и концентрацию восстановленного глутатиона в печени и почках экспериментальных животных.

2. Исследование токсического действия этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина на активность ферментов

метаболизма глутатиона: глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы и гамма-глутамилтрасферазы в печени и почках экспериментальных животных.

3. Исследование влияния антиоксиданта липоевой кислоты и протекторных соединений других механизмов действия на процессы перекисного окисления липидов, концентрацию восстановленного глутатиона и активность ферментов его метаболизма в тканях лабораторных животных в условиях введения

этиленгликольтетраацетата, феррум лека, метанола и депакина.

Научная новизна:

В результате проведения комплексного сравнительного исследования токсического действия этиленгликольтетраацетата, феррум лека и метанола на активность процессов перекисного окисления и систему глутатиона впервые установлена эффективность применения Ы6-циклопентиладенозина, лидокаина и липоевой кислоты для предотвращения интенсификации свободнорадикального окисления липидов и коррекции системы глутатиона в условиях интоксикации этиленгликольтетраацетатом. Обнаружено, что активация процессов перекисного окисления липидов и нарушения системы глутатиона, возникающие в условиях токсического воздействия препарата железа феррум лека, эффективно нивелируются введением антиоксиданта липоевой кислоты. Установлена эффективность применения липоевой кислоты для предотвращения процессов перекисного окисления липидов и коррекции системы глутатиона в условиях интоксикации метанолом. Обнаружено, что активация процессов перекисного окисления липидов и нарушения системы глутатиона, возникающие в условиях интоксикации депакином, предупреждаются введением гептрала и иммунокала.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в ходе диссертационного исследования результаты позволяют расширить представления о состоянии перекисного окисления липидов, системы глутатиона и метаболизме глутатионзависимых ферментов: глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы,

глутатионтрансферазы и гамма-глутамилтрансферазы при интоксикации ксенобиотиками. Представленные результаты дают возможность уточнить состояние антиокислительных процессов и дифференцированно подойти к назначению антиоксидантной терапии. Обоснована возможность применения антиоксидантов в качестве корректора системы глутатиона в условиях интоксикации ксенобиотиками.

Внедрение результатов в практику

Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре химии, кафедре фармакологии и кафедре факультетской терапии Иркутского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Этиленгликольтетраацетат, феррум лек и метанол вызывают дестабилизацию системы глутатиона в печени мышей. Универсальными показателями нарушения системы глутатиона при отравлении разными токсикантами являются повышение содержания продуктов перекисного окисления и снижение концентрации восстановленного глутатиона.

2. Нарушение системы глутатиона при введении этиленгликольтетраацетата начинается со снижения активности глутатионпероксидазы, повышения активности глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы в печени мышей. При введении

этиленгликольтетраацетата с Ы6-циклопентиладенозином и лидокаином нормализуется концентрация восстановленного глутатиона, активность глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы, предотвращается активация процессов перекисного окисления липидов.

3. Феррум лек вызывает активацию глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы только в высоких дозах, резко увеличивает активность гамма-глутамилтрансферазы. Липоевая кислота при совместном введении с феррум леком значительно снижает активацию перекисного окисления, сглаживает снижение концентрации восстановленного глутатиона и нормализует активность глутатионпероксидазы и гамма-глутамилтрансферазы в печени.

4. При отравлении метанолом наблюдается выраженное напряжение системы глутатиона, проявляющееся снижением активности глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы как в печени, так и в почках. Этанол и липоевая килота предупреждают негативные сдвиги, при этом липоевая кислота дает наиболее выраженный эффект.

5. Депакин вызывает активацию гамма-глутамилтрансферазы и снижает активность глутатионтрансферазы. Гептрал и иммунокал при совместном введении с депакином предупреждают активацию перекисного окисления липидов.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на V и VI Международных Пироговских научных медицинских конференциях (Москва, 2010, 2011); 78-й итоговой научно-практической конференции СНО им. И.И. Мечникова посвященной 350-летию г. Иркутска (Иркутск, 2011); Пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным

участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011); X Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула 2011); III итоговой конференции молодых ученых (Иркутск, 2011), научно-практической конференции Уральского федерального округа по клинической токсикологии с международным участием «Роль токсикологических центров в обеспечении химической безопасности на региональном уровне» (Екатеринбург, 2011).

Публикации

По теме опубликовано 15 работ, из них 7 статей, 8 тезисов, в том числе в центральных журналах и международных сборниках научных трудов. В российских рецензируемых ВАК научных журналах опубликовано 6 статей и 3 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследований, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 273 источников, из которых иностранных авторов 204. Работа иллюстрирована 1 схемой, 31 таблицами и 12 рисунками. Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместных работах.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система глутатиона 1.1.1. Глутатион

Глутатион представляет собой трипептид у-

глутамилцистеинилглицин, образованный остатками трех аминокислот -глутаминовой кислоты, цистеина и глицина. Глутатион играет уникальную роль в жизнедеятельности клеток и организма в целом [Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Алеид Р. и соавт., 2010; Митева Л.П.-Е., Иванов С.В., Алексиева В.С., 2010; Wonisch W., Schaur R., 2001; Noctor G., Gómez L., Vanacker H. et al., 2002; Winiarska K., Drozak J., 2002]. В клетке глутатион находится в восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форме, имеющих следующую структуру:

L-y-Glu-CyS-Gly и y-Glu-CyS-Gly

i I

SH y-Glu-CyS-Gly

Основной антиоксидантный эффект глутатион оказывает в восстановленной форме за счет реактивной группы SH [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990, 2009, 2010; Comhair S.A., Erzurum S.C., 2005; Rahman I., Adcock I.M., 2006; Limón-Pacheco J.H., Gonsebatt M.E., 2010].

Глутатион синтезируется только в цитозоле всех клеток млекопитающих. Исключением не являются даже эритроциты, которые при созревании избавляются не только от субклеточных частиц, но и от подавляющего большинства метаболических процессов [Chen Y., Yang Y., Miller M.L. et al., 2007]. Синтез осуществляется из трех аминокислот -глутамата, цистеина и глицина и проходит в два этапа [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2009; Yokoyama Н., 2007]:

1) L-глутамат + L-цистеин + АТФ —> у-глутамил-Ь-цистеин + АДФ + P¡

2) у-глутамил-Ь-цистеин + L-глицин + АТФ —► GSH +АДФ + P¡

Первая реакция катализируется у-глутамилцистеинсинтетазой (ГЦС), состоящей из тяжелой каталитической (Мг ~ 73 кДа) и легкой модуляторной (Мг -30 к Да) субъединиц , кодируемых разными генами: GCLC и GCLM [Dickinson D.A., Levonen A.L., Moellering D.R. et al., 2004; Iles K.E., Liu R.M., 2005]. В каждом из этих генов есть антиоксидант-/электрофилреспонсивный элемент (ARE), обеспечивающий их редокс-регуляцию [Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б, 2006; Dalle-Donne I., Milzani А., Gagliano N et al., 2008]. Регуляция ГЦС проходит двумя путями: 1) обратной связью - конкурентным ингибированием глутатионом, являющимся неаллостерическим, и вовлекает GSH в связывание с глутаматным сайтом фермента; 2) доступностью цистеина, физиологическая концентрация которого в клетке составляет 0,02-0,2 мМ. Более высокие концентрации цистеина токсичны, поэтому его избыток надежно метаболизируется цистеиндиоксигеназой [Stipanuk М.Н., Domini J.E., Lee J.I. et al., 2006]. Вторую реакцию катализирует глутатионсинтетаза (ГС) (Mr ~ 118 кДа), которая состоит из