Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние канцерогенных нитрозоаминов и их неканцерогенных предшественников на систему биотрансформации ксенобиотиков в печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние канцерогенных нитрозоаминов и их неканцерогенных предшественников на систему биотрансформации ксенобиотиков в печени крыс"

Р Г Б ОД АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ . _ ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ

2 2 МАИ 1995

УДК 577.121:577.152.1:577.152.2

СЕМАК Игорь Викторович

ВЛИЯНИЕ КАНЦЕРОГЕННЫХ НИТРОЗОАМИНОВ И ИХ НЕКАНЦЕРОГЕННЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ НА СИСТЕМУ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии Белорусского государственного университета

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор,_

Заслуженный работник образования Республики Беларусь Пнкулев А.Т,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чиркин А.А.

доктор химических наук, старший научный сотрудник Костюк В.А.

Оппонирующая организация • Минский государственный медицинский институт

Защита состо1ггся "31" мая 1995 г. в 1430 часов на заседании совета Д 006.30.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте радиобиологии АН Беларуси по адресу: 220600, г. Минск, ул. Жодинская, 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан ><7" апреля 1995 г.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук

А.М. Ходосовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интенсивное применение азотсодержащих соединений (АС) в сельском хозяйстве и промышленности значительно повышает вероятность поступления нитратов, нитритов, аминов и нитрозоаминов (НА) в организм человека и животных. Многие из этих соединений или исходно обладают канцерогенными свойствами, или же приобретают таковые в результате метаболической трансформации в организме. Поэтому понятен и оправдан интерес к проблемам, связанным с изучением вл1. лия потенциально опасных для человека и животных АС на систему биотрансформации ксенобиотиков (СБК), обеспечивающую не только опосредованное цитохромом Р-450 превращение липофильных соединений в падрофильные (I стадия биотрансформации) и последующее включение последних в различного рода реакции конъюгации (II стадия), но и ферментативную, а также неферментативную защиту клетки от реакционноспособных продуктов метаболизма ксенобиотиков (III стадия) (Guengerich F.P., 1990; Listowsky I., 1993).

Несмотря на существование большого объема информации об ответной реакции СБК на поступление в организм АС, в данной области исследований обнаруживаются определенные пробелы.

В настоящее время достаточно убедительно показана возможность эндогенного синтеза канцерогенных НА из попавших в организм неканцерогенных предшественников (Рубенчик БЛ., 1990). Однако, действие последних на СБК при их совместном и раздельном введении пока мало изучено.

Не проводилось сопоставление ответных реакций СБК на хроническое и однократное введение одной и той же дозы нитрозоамина.

Не сравнивалось влияние, оказываемое НА различной химической структуры на СБК, при кх поступлении в организм в дозах, вызывающих одинаковый токсический эффект.

Кроме того, до настоящего времени анализ ответной реакции СБК на поступление в организм АС, как правило, основывался на изучении лишь отдельных компонентов, участвующих в той или иной стадии биотрансформации. Между тем, очевидно, что биологический эффект, обуславливаемый ■ ксенобиотиком, в конечном итоге будет зависеть от сбалансированности процессов, протекающих во время всех стадий его биотрансформации. Поэтому особую актуальность приобретает комплексный подход, включающий в себя одновременный анализ наиболее важных параметров, характеризующих основные направления метаболизма ксенобиотиков.

является частью плановой темы кафедры биохимии Белгосуниверситета "Установить закономерности совместного действия внешнего облучения и нитросоединений - ксенобиотиков на обмен веществ в головном мозге и

функциональное состояние систем обезвреживания ксенобиотиков в животном организме (№ гос. регистрации 01010043612).

СБК в печени крыс при пролонгированном и однократном действии на организм канцерогенных НА ра- ичной химической структуры, а также их неканцерогенных предшественников. Для этого было необходимо решить ряд задач:

- провести комплексный биохимический анализ ферментных систем, обеспечивающих первую (монооксигеназная система), а также вторую и третью (каталитическая редокс-система глугатиона) стадии биотрансформации ксенобиотиков в печени крыс:

а) при поступлении в организм в течение месяца разных доз N-нитрозр-диэтиламина (ДЭНА) и его возможных предшественников - нитрита натрия (НН) и диэтиламина (ДЭА);

б) после однократного воздействия на животных алифатических (ДЭНА) и ароматических (N-нитрозодифениламин (НДФА)) интрозоаминов.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный биохимический анализ состояния СБК при поступлении з организм ряда АС. Установлено, что при пролонгированном введении 0,02% ДЭНА наблюдается снижение содержания и ферментативной активности основных компонентов монооксигеназной системы, а повышение активности большинства глугатионзависимых ферментов сопровождается существенным падением содержания свободных SH-rpynn. При десятикратном уменьшении суммарной дозы ДЭНА увеличение содержания и активности отдельных ферментов как первой, так и второй стадий биотрансформации ксенобиотиков происходит на фоне роста содержания SH-rpynn, не связанных с белком. Обнаружено, что совместное введение в течение 1 месяца 0,005% НН и 0,02% ДЭА, в отличие от действия этих же соединений отдельно друг от друга, приводит к росту содержания и активности ферментов всех стадий биотрансформации ксенобиотиков. Найдено, что при однократном поступлении в организм ДЭНА достоверные изменения в содержании ферментов I стадии биотрансформации ксенобиотиков отмечаются на 2, 8 и 15 сугкл после введения, а функциональные сдвиги, затрагивающие II и III стадии, наблюдаются в основном на 8, 15 н 31 сутки. Выявлено, что на 2 сутки после однократного введения НДФА повышение активности ферментов II и III стадий биотрансформации ксенобиотиков параллельно росту содержат« цитохрома Р-450. Установлено, что ДЭНА практически не вступает в реакцш неферментативного или ферментативного взаимодействия с восстановленнык глугатионом (GSH). Показано, что цАМФ - зависимое фосфорнлированш глутатнон S-трансфераз цнтозоля печени крыс является одним из механизме.)] регуляции активности этих ферментов.

Дать оценку функционального состояния

Научно-практическое значение, Полученные данные существенно расширяют имеющиеся в ксенобиохимии представления о характере влияния канцерогенных НА и их неканцерогенных предшественников на СБК и могут быть использованы как для поиска путей целенаправленной коррекции патологий, обусловленных АС, так и для разработки научно обоснованных принципов повышения резистентности организма к действию ксенобиотиков.

- пролонгированное поступление е организм больших доз ДЭНА, в отличие от относительно малых, вызывает отчетливо выраженный дисбаланс в функционировании СБК, проявляющийся в снижении содержания и ферментативной активности основных компонентов монооксигеназной системы, а также в повышении активности большинства глутатионзависимых ферментов на фоне значительного падения свободных SH-rpynn;

- длительное совместное введение больших доз НН и ДЭА, в отличие ог действия этих же соединений порознь, приводит к росту содержания и активности ферментов всех стадий биотрансформацни ксенобиотиков;

- при однократном поступлении в организм ДЭНА статистически достоверные изменения в содержании ферментов I стадии биотрансформации отмечаются на 2, 8 и 15 сутки после введения, а функциональные сдвиги, затрагивающие II и III стадии, наблюдаются в основном на 8, 15 и 31 сутки:

- характер ответной реакции СБК на 2 сутки после однократного поступления в организм НА зависит от химической структуры вводимых соединений. В отличие от НДФА, вызывающего повышение активности ферментов II и III стадий биотрансформацни, а также рост содержания цитохрома Р-450, введение ДЭНА приводит к уменьшению содержания гемо-протеина и не влияет на активность ряда глутатионзависимых ферментов;

- цАМФ зависимое фосфорилирование растворимых глутатион S-транс-фераз является одним из механизмов регуляции активности этих ферментов.

Личный вклад. Работа выполнена автором самостоятельно. Научный руководитель принимал участие в определении цели и задач исследования, а также в обсуждении полученных результатов.

Апробация работы и публикации. Результаты работы представлены на международной конференции "Критические аспекты свободных радикалов в химии, биохимии и медицине", Вена, Австрия, 14-17 февраля 1993.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (две главы), главы "Материалы и методы исследования", двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы (253 источника). Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 19 таблиц и 14 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили па беспородных белых крысах-самцах массой 180-210 г., содержавшихся на стандартном рационе вивария. Животные первой (второй) группы в течение одного месяца получали с питьевой водой 0,02% (0,002%) ДЭНА, крысы третьей (четвертой) группы - 0,02% (0,002%) ДЭА, крысы пятой (шестой) группы - 0,005% (0,0005%) НН. Седьмая (восьмая) группа получала одновременно 0,02% (0,002%) ДЭА и 0,005% (0,0005%) НН. Кроме того, ДЭНА вводили однократно перорально в виде водного раствора и в дозе равной 1/3 LD50 ДЭНА. НДФА вводили перорально в виде водной суспензии навески, соответствующей 1/3 LD50 НДФА. Контрольные животные как при пролонгированном, так и при однократном введении получали чистую воду.

При пролонгированном воздействии НН, ДЭА и ДЭНА животных декапи-тнровалн через 30 дней после начала эксперимента, а при однократном введении - на 2, 8, 15 и 31 сутки. Крыс, шггоксицнрованных НДФА, брали в опыт на 2 сутки. Цитозольную и мпкросомальную фракции печени получали методом дифференциального центрифугирования (Edery М. ct al, 1985).

В микросомальной фракции определяли общее содержание цитохромов Р-450 и Ь5 rio общепринятому методу Omura Т. и Sato R. (1964), а также активности НАДФН-специфичного флавопротенна (ФП) (Карузина И.И., Арчаков Ф.И., 1977) и мембраносвязанной глутатиоп S-трансферазы (мГТ) (Nishino Н., Ito А., 1989). Общую глутатиоп S-трансферазную активность (ГТ1) цитозоля оценивали но скорости конъюгации 1-хлор-2,4-динитробензоля (1Х2.4ДНБ) и GSH (Habig W.H. et al., 1974). Дополнительно в качестве субстратов использовали 1,2-дихлор-4-ннтробензол (1.2ДХ4НБ) и п-нитро фенэтнл бромид (НФБ), позволяющие в основном детектировать глутатиоп S трансферазную активность изоферментов класса мго (ГТ2) и изофермента 5-5 (ГТЗ), соответственно (Habig W.H. et al., 1974; Ketterer В., 1986).. Глутатиоп пероксидазную активность измеряли по скорости восстановления гидроперекиси трет-бутила (ГП-ГПТБ) и перекиси водорода (ГП1) (Hafeman D.G. et al.. 1974). Активность Se-независнмон глутатионперокендазы (ГП2) оценивали по разнице между скоростью восстановления гидроперекиси трег-бутила (ГПТБ) и перекиси водорода (Колесниченко Л.С. и др., 1987). Глутатионредуктазную активность (ГР) определяли по скорости окисления НАДФН (Герасимов A.M., 1976). Содержание свободных SH-групп оценивали по методу Sedlak J. et al (1968). При изучении неферментагнвного связывания ДЭНА с GSH реакционную смесь, содержащую 0,1 М фосфатный буфер (рН 6,0-8,0) или 0,1 М Трис-НС1 (рН 8,5, 9,0), 2 мМ GSH, 2 мМ ДЭНА, инкубировали в течение 30 мш при 37° С. В случае фермент опосредованного взаимодействия ксенобиотика i GSH в реакционную смесь такого же состава добавляли цитозольную фракции

печени крыс. Содержание GSH определяли по методу Sedlak et al. (1968). SDS-злектрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле (Laemmli U. К., 1970). Фосфорилирование белков цитозоля печени крыс эндогенными протешшг-иазами осуществляли согласно Дзгоеву С. Г. и др. (1990). Концентрацию белка измеряли по методам Lowry О.Н. et al. (1951) и Peterson G.L. (1977). Экспериментальные данные обрабатывали статистически (Рокицкий П.Ф., 1973).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние пролонгированного введения 0,005% нитрита натрия, 0,02% диэтиламнна и 0,02% N-нитрозодиэтиламина на систему метаболизма ксенобиотиков в печени крыс

Установлено, что совместное введение НН и ДЭА, в отличие от действия этих же ксенобиотиков отдельно друг от друга, вызывает практически двухкратное повышение содержания цитохрома Р-450 и рост активности НАДФН-специфичиого флавопротеина (рис. 1).

При введении ДЭНА и ДЭА обнаруживается в целом однотипная реакция моноокенгеназной системы, выражающаяся в уменьшении содержания цитохрома Р-450 и активности НАДФН-специфичного флавопротеина (рис. 1).

Согласно данным литературы введение ДЭНА инициирует в печени крыс процессы перекисного окисления лшшдов (ПОЛ) (Perera M.I. et al., 1985). В то же время известно, что интенсификация ПОЛ может приводить к активизации механизмов протеолнтическои деградации цитохрома Р-450 (Сербннова Е.Л. и др., 1983). Не исключено, что угнетение НАДФН-цитохром Р-450 редуктазнон системы в печени крыс, получавших ДЭНА и ДЭА, частично обусловлено избыточным накоплением в клетке продуктов ПОЛ.

Очевидно, что поддержание стационарной концентрации реакционно-способных метаболитов АС на безопасном для клетки уровне в конечном итоге будет определяется эффективностью процессов, протекающих во время II и III стадий биотрансформации. Поэтому было изучено влияние АС на каталитическую редокс-систему глутатнона, обеспечивающую не только реакции коныогации ксенобиотиков с GSH, по и ферментативную, а также неферментативную защиту клетки от свободнорадикальных и перекисных продуктов метаболизма чужеродных соединений.

Активность микросомалыгой глутатион S-трансферазы понижается в той или иной степени при раздельном введении каждого из изучаемых ксенобиотиков (рис. 1).

Во всех опытных группах отмечается уменьшение содержания свободных SH-групп (рис. 1). Обнаруженное истощение пула свободных SH-rpynn, 90% которых составляют SH-группы восстановленного глутатнона (Reed D.J., 1985), значительно повышает вероятность развития в организме различного рода

патологических процессов. Очевидно, что стимуляция глутатионредуктазы, наиболее ярко выраженная при совместном введении ДЭА и НН (рис. 1), не позволяет поддерживать содержание свободных БН-групп на уровне контроля.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

Рис. 1. Изменение содержания и активности отдельных компонпггов СВК п печени крыс при пролонгированием поедении больших доз НН, ДЭА, ДЭНА (в % к контролю). Условные обозначения и сокращения см. в тексте.

Одной из возможных причин наблюдаемого истощения пула свободных SH-групп может быть повышение глутатионпероксидазной и общей глутатнон S-трансферазной активности в цитозоле печени крыс, получавших АС (рис. 1).

Изученные в работе ксенобиотики но силе и характеру их воздействия на суммарную активность растворимых глутатнон S-трансфераз (урави. [1]), а также на активность отдельных нзоферментов класса мю (уравн. [2] и изофермеита 5-5 (уравн. [3]) можно расположить следующим образом: НН = Контроль < ДЭА < ДЭНА < ДЭА + НН [1] НН < ДЭА < Контроль < ДЭНА < ДЭА + НН [2] НН = ДЭА = Контроль < ДЭНА < ДЭА + НН [3] Следует подчеркнуть, что канцерогенный ДЭНА, в отличие от иеканцерогенного ДЭА, индуцирует активность нзоферментов 3-3 и 3-4 (класс мю). Полученные результаты коррелируют с данными литературы, согласно которым содержание изофермеита 3-3 существенно возрастает именно на начальных стадиях геиатоканцерогенеза (Kelterer В., 1986).

Рассмотрим возможные механизмы изменения глутатион S-трансфераз-ной активности.

Известно, что кроме регуляции активности ферментов СБК на уровне синтеза белка de novo, являющейся достаточно медленным процессом (Pickett С. et al„ 1989), существуют относительно быстрые способы модификации ферментативной активности, в частности, зависимое от циклических нуклео-тпдов фосфорилирование глутатион S-трансфераз (Кулииский В.И. и др., 1990; Pyerin W. et al„ 1987).

Нами было показано, что преинкубация цитозоля, предварительно освобожденного от эндогенных циклических нуклеотидов, в присутствии цАМФ, а также АТФ приводит к увеличению не только суммарной глутатион S-трансферазной активности, но и к стимуляции отдельных изоферментов данного семейства белков (рис. 2).

+ 60 -¡

+40 -

+20

100

1_1

1Х2ДДНК

1.2ДХ4НБ

п-НФБ

Рис. 2. Влияние цАМФ на активность глутатион Э-трансфераз цитозоля печени крыс (я % к базальной активности).

За базальную активность принята ферментативная активность, измеренная посте инкубации цитозоля в реакционной смеси, содержащей нее компоненты, кроме цЛМФ. Условные обозначения и сокращения те же, что и дли рис. 1.

Анализ авторадиограммы белков цитозоля, подвергавшихся фосфорилированию эндогенными протеинкиназами, подтвердил существование цАМФ-завнсимой регуляции активности растворимых глутатион S-трансфераз. Было обнаружено, что добавление в среду инкубации цАМФ стимулировало фосфорилирование цитозольного белка с молекулярной массой в районе 25 кДа (рис. 3). Данные литературы (Sato К., 1989), а также результаты собственных исследований позволяют идентифицировать этот белок как одну из субъединиц глутатион S-трансфераз.

-" i i i I ....

• «v. - •• . Г ' *' " ' '■***•' »v к •">*' ¿0 lift! iI'l^H

кДа 67 43 25 11,7

Рис. 3. Автораднограмма цитозольных белков, после их фосфорилирования эндогенными протеинкшшзами в отсутствии (•) и в присутствии (+) 1 мкМ цАМФ.

Стрелками обозначено положение белков, фосфорнлироваиие которых активировалось под влиянием цАМФ.

В качестве белков-маркеров использовали бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумни (45 кДа), химотрипешюген А (25 кДа) л цнтохром С (11,7 кДа).

Таким образом, уместно предположить, что повышение глутатнон S-трансферазной активности при пролонгированном введении ДЭНА может быть обусловленно двумя' наиболее вероятными, на наш взгляд, причинами: благодаря индукции синтеза белка de novo, а также за счет зависимого от цАМФ фосфорилирования глутатнон S-трансфераз.

Известно, что в печени крыс, получавших длительное время 0,02% ДЭНА, наблюдается снижение активности аденилатциклазы и содержания цАМФ (Санина КЛ. и др., 1986; Антоненко С. Г. и др., 1990). На основании этого правомерно допустить, что регуляция активности растворимых глутатнон S-траисфераз при введении ДЭНА осуществляется скорее всего на уровне белкового синтеза. В пользу последнего говорит следующий факт. Установлено, что механизм регуляции экспрессии гена одной из субьедншш глутатнон S-траисфераз включает в себя снижение внутриклеточной концентрации GSH (Bergelson S. et al., 1994). Исходя из этого, представляется заманчивым предположить наличие определенной взаимосвязи между падением содержания свободных SH-групп в цнтозоле печени крыс, получавших ДЭНА, И наблюдающимся при этом повышении активности растворимых глутатнон S-трансфераз (рис. 1).

Отсутствие строгой субстратной специфичности ферментных систем, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, создает условия для существования различных путей метаболизма одних и тех же соединений. При нарушении по какой-либо причине "основного" пути бнотранформации ксенобиотика могут компенсаторно усиливаться "вспомогательные" процессы его детокенкации.

Можно допустить, что ДЭНА способен метаболнзироваться в ходе II стадии бнотрансформацин ксенобиотиков без предварительной активации ферментами монооксигеназной системы. В этом случае рост суммарной глутатион S-трансферазной активности, обнаруженный при введении крысам ДЭНА (рис. 1), мог бы частично компенсировать снижение интенсивности процессов, протекающих во время I стадии метаболизма ксенобиотиков.

Для проверки данного предположения была изучена возможность неферментативного и ферментативного связывания ДЭНА с GSH in vitro. Оказалось, что инкубация ДЭНА в присутствии эквнмолярных количеств GSH приводит к слабо выраженному снижению содержания последнего, что скорее всего свидетельствует об отсутствии прямого взаимодействия НА с глутатионом (рис. 4). Добавление в реакционную смесь цитозолыгай фракции печени лишь незначительно ускоряло процесс расходования GSH (рис. 4).

100 75 ^ 50 25 0

6.5

7.5

8.5

pH

Рис. 4. Содержание восстановленного глутатиона (в % по отношению к контролю) после его инкубации в реакционной среде с различным значением рН о присутствии ДЭНА (1) и ДЭНА + цитозоль (2). Контроль - 100 %.

Все это дает основание полагать, что вероятность детоксикации ДЭНА без участия ферментов I стадии бнотрансформацин ксенобиотиков крайне мала и, по-видимому, в качестве субстратов для глутатион S-трансфераз выступают электрофильные продукты цитохром Р-450 - опосредованного метаболизма НА.

Учитывая то, что в результате действия цитохрома Р-450 на ДЭНА, образуются метаболиты, представляющие по сравнению с исходным соединением большую опасность для клетки, можно допустить, что рост активности ферментов II и III стадий бнотрансформацин ксенобиотиков при введении ДЭНА и одновременное снижение содержания гемопротенна (рис. 1) является началом реализации специальной фенотипической программы, направленной на повышение резистентности злокачественно трансформируемых клеток и тканей к цитотоксическому действию канцерогена (Сапрнн А.Н., 1990; Harrison D.J., 1990).

Влияние пролонгированного введения 0,0005% нитрита натрия, 0,002% дштнламина и 0,002% N-шггрозоднэтнламипа на систему метаболизма ксенобиотиков в печени крыс

Известно, что конечный биологический эффект, вызываемый длительным введением ДЭНА, в значительной степени зависит от количества нитрозоамина, поступившего в организм (Рубенчик Б.Л., 1990; Schweinsberg F., 1979). Поэтому на следующем этапе наших исследований животные подвергались хроническому воздействию в десять раз меньших доз АС.

Введение ДЭА и ДЭНА, а также ДЭА одновременно с НН, приводит к повышению содержания цитохрома Р-450 и росту активности НАДФН-спецнфичного флавопротеина. (рис. 5).

Активность микросомальной глутатион S-трансферазы вырастает в той или иной степени при раздельном введении АС и не изменяется при совместном действии ДЭА и НН (рис. 5).

Ксенобиотики, а также их метаболиты, не обезвреженные мембрано-связанной формой фермента, могут подвергаться дальнейшей биотрансформации с участием растворимых глутатион S-трансфераз.

Суммарная активность цитозольных глутатион S-трансфераз увеличивается под влиянием ДЭНА и снижается у крыс, получавших ДЭА одновременно с НН (рис. 5).

Известно, что биохимические процессы, протекающие во время I стадии биотрансформацни, сопровождаются генерацией активных форм кислорода (АФК) (Жуков A.A., Жирнов Г.Ф., 1988). Не исключено, что стационарная концентрация последних существенно возрастает как при введении ДЭНА, так и при сочетанном действии НН и ДЭА вследствие интенсификации реакций, опосредованных цитохромом Р-450. Установлено, что АФК способны активировать как мембраносвязанную, так и растворимые глугатион S-трапсферазы (Aniya Y„ Anders M.W., 1989; Murata Т. et al„ 1990). Причем в случае цитозольных трансфераз АФК стимулируют нзофермепты класса мю и ингибируют изоферменты класса альфа (Murata Т. et al., 1990). В связи с этим уместно предположить, что рост суммарной глутатион S-трансферазной активности при действии ДЭНА в какой-то мере вызван стимуляцией изоферментов класса мю под влиянием АФК.

В то же время, при совместном введении НН и ДЭА, ингибирующий эффект АФК по отношению к изоферменгам класса альфа, по-видимому, преобладает над феноменом активации изоферментов класса мю, что в конечном итоге и предопределяет наблюдающееся падение суммарной глугдтион S-трансферазной активности (рис. 5).

+ 150 + 100 -+ 50 -100 -50 --100 -

□ Цит. Р-450 U Цит. Ъ5 ШФИ ПГТ1

! агтз

I ОмГТ

i arm ! Drm

□ гр

□ своб. SH-группы

0.0005% нн 0.002% дэл 0.002% дэна 0.0005% ни + 0.002% дэл

Рис. 5. Изменение содержания и активности отдельных компонентов СБК в печени крыс при длительном введении относительно малых доз НН, ДЭА, ДЭНА (в % к контролю). Условные обозначения н сокращения те же, что и для рис. 1.

Поступление в организм как самого ДЭНА, так и его предшественников -ДЭА и НН подавляет активность изофермента 5-5 (рис. 5). Поэтому было изучено влияние этих же ксенобиотиков на изоферменты класса альфа семейства глутатион S-трансфераз, так как известно, что они, подобно изоферменту 5-5, способны восстанавливать органические гидропероксиды, обуславливая тем самым Se-независимую глутатионпероксидазиую активность (Ketterer П. et al., 1989). НН и ДЭА, вводимые отдельно друг от друга, повышали активность Бе-независимой глутатионпероксидазы и снижали ее в результате совместного действия (рис. 5).

Зги данные можно расценивать как дополнительный аргумент в пользу высказанного выше предположения о том, что коррекция суммарной глутатион S-траисферазной активности при введении ДЭНА, а также ДЭА одновременно с НН. осуществляется благодаря изменению активности отдельных изофермен-тов классов мго и альфа под влиянием АФК.

После введения НН активность Se-завнснмон глутатионпероксидазы увеличивается и понижается под влиянием ДЭА и ДЭНА (рис. 5).

Установлено, что супероксидный радикал способен инактивнровать Se-зависимуго глугатиоппероксидазу (Blum J. et al., 1985). Учитывая это, уместно допустить, что обнаруженное при действии ДЭА и ДЭНА угнетение Se-чависим".' глутатионпероксидазы частично обусловлено повышенной генерацией АФК в результате интенсификации процессов, протекающих во время I стали» метаболизма ксенобиотиков. В свою очередь следует подчеркнуть, что

совместное поступление в организм НН и ДЭА не влияет на активность изучаемого фермента, несмотря на отмечающийся при этом рост содержания цитохрома Р-450 и активности НАДФН специфичного флавопротенна (рис. 5). Тем не менее, на наш взгляд, это в целом не противоречит высказанной выше гипотезе, так как стимулирующий эффект НН но отношению к Se-зависимой глутатионпероксидазе может нивелировать вызванное сунероксидным радикалом ингнбироваиие ферментативной активности.

Содержание свободных SH-групп увеличивается при добавлении в питьевую воду ДЭНА и существенно уменьшается в случае совместного действия ДЭА и НН (рис. 5). Повышение содержания свободных SH-групп в цитозоле печени крыс, получавших нитрозоамнн, скорее всего обусловлено интенсификацией биосинтеза восстановленного глутатиопа, так как введение ДЭНА не влияет на активность глутатиопредуктазы (рис. 5),

Подобно результатам, рассмотренным и предыдущем разделе, простое суммирование эффектов, наблюдаемых при введении порознь НН и ДЭА, не обьясняет реакцию отдельных ферментов СБК на сочетанпое действие этих же ксенобиотиков. Не исключено, что обнаруженный феномен совместного введения ДЭА и НН в какой-то мере обусловлен влиянием эндогенного ДЭНА на СБК. Известно, что косвенным доказательством эндогенного синтеза нитро-зосоединений является то, что введение конкретного нитрозоамина, а также совместное поступление в организм его потенциальных предшественников вызывают однотипные биологические эффекты, не выявляемые при раздельном действии этих же предшественников (Рубенчик Б.Л., 1987,1990). Исходя из этого, увеличение содержания цитохрома Р-450, а также повышение суммарной активности глутатион S-трансфераз при введении 0,002% ДЭНА можно интерпретировать как указание на возможность эндогенною синтеза нитрозоамина 1.ри сочетанном действии как больших, так и малых доз ДЭА и НН.

Сравнение результатов, представленных в настоящем и предыдущем разделах, показывает, что в случае 0,002% ДЭНА изменения, претерпеваемые СБК, носят сбалансированный характер и, по-видимому, позволяют сохранять стационарную концентрацию ДЭНА и его реакционноспособных метаболитов на относительно безопасном для клетки уровне. В то же время, существенное истощение пула свободных SH-групп на фоне слабо выраженной стимуляции ферментов II и III стадий метаболизма ксенобиотиков, отмечающееся при введении в десять раз больших количеств ДЭНА, -начительно снижает эффективность функционирования внугриклеточных защитных систем. Это в свою очередь повышает вероятность развития в организме различного рода патологических процессов, сопровождающихся повреждением внугриклеточных структур (Иващенко Ю.Д. и др., 1990; Санина К.Л. и др., 1986; Delpino A. et а!.. 1984).

Динамика изменения функционального состояния системы биотрансформации ксенобиотиков в печени крыс после однократного введения М-ннтрозоднэтнламина При пролонгированном введении 0,002% раствора ДЭНА количество тггрозоамнна, выпавшее на долю каждой крысы на протяжении всего эксперимента, в среднем соответствует 1/3 Ы^о ДЭНА. Принимая это во внимание, было изучено состояние СБК в печени крыс н.> 2, 8, 15 и 31 сутки после однократного введения 1/3 ЬО») ДЭНА.

Уменьшение содержания цитохрома Р-450, наблюдающееся на 2 сутки после интоксикации крыс ДЭНА, в более отдаленные сроки (8 и 15 сутки) сменяется ростом концентрации гемопротеина. На 31 сутки содержание цитохрома Р-450 снижается до уровня контрольных значений (рис. б).

1'нс. (>. Динамика шмеиения содержания и активности отдельных компонентов СБК и печени крыс после однократного введения ДЭНА (и Те к кошролш).

Услонныс обозначения и сокращения те же, что и для рис. 1.

Динамика изменения активности микросомальной глутатион Б-трансфе-разы носит фазный характер. Снижение ферментативной активности, слабо выраженное на 2 сутки после введения ДЭНА, достигает своего максимума на 8, На 15 сутки отмечается стимуляция микросомальной глутатион Б-трансфе-разы. И, наконец, на 31 сутки эксперимента активность фермента не отличается от контрольных значений (рис. 6).

Суммарная глутатион 8-трансферазная активность под влиянием ДЭНА незначительно падает на 2 и 8 сутки и повышается па 15 н 31 (рис. 6).

Не исключено, что наблюдающаяся картина обусловлена динамикой изменения активности изоферментов класса мю (рис. 6), вносящих существенный вклад в суммарную активность семейства глугатион Б-урансфераз (КеНегег В., 1986).

Статистически достоверные колебания содержашю свободных $Н-групп выявляются на 8, 15 и 31 сутки (рис. 6).

Картина, обнаруженная на 31 сутки после однократного введения ДЭНА, по некоторым параметрам совпадает с таковой при длительном действии НА. В обоих случаях отмечается рост суммарной глутатнон 8-трансферазнон активности и увеличение содержания свободных 8Н-групп (рнс. 5, 6). В то же время, в отличие от пролонгированного введения, вызывающего повышение содержания цнтохрома Р-450, концентрация гемопротеина при однократном воздействии НА практически не изменяется (рис. 5, 6).

Влияние однократного введения ¡Ч-ннтрозоднфенпламина на систему метаболизма ксенобиотиков

С целью изучения зависимости ответной реакции СБК от химической структуры НА, попавшего в организм, крысам вводили НДФА, достаточно широко применяемый в промышленности (Шефтель В.О., 1991).

Установлено, что однократное введешю животным 1/3 ЫТЬ» НДФА приводит к увеличению содержания цитохрома Р-450 (рис. 7).

+ 250 -| + 200 -+ 150 -+ 100 + 50 -1 100

□ Цнт. 1'-450 ВЦ»г. )>5

□ ГГ1 ШТ2 . Ы ГП ОмГТ ИГР

□ си( П. Ь'И-груп.

-Он

Рис. 7. Изменение содержания и ферментативной пктинопч отдельных компоненте! СВК в печенн крыс на 2 сутки после однократного введения НДФЛ (п % к ктпролго). Условные оГнпначения и сокращения те же, что и для рнс. I

Активность микросомальной глутатион S-трансферазы под влиянием НДФА возрастает более, чем втрое. Не исключено, что наблюдаемый эффект обусловлен окислением SH-группы фермента АФК и/или реакционно-способными метаболитами НДФА (Aniya Y„ Anders M.W., 1989; Haenen G.R. et al., 1991). Заметно меньшие изменения активности были выявлены у цитозольных ферментов: общая глутатион S-трансферазиая. активность при действии НДФА выросла в 1,6 раз (рис. 7).

При введении НДФА обнаруживается явное преобладание процессов, расходующих GSH, над глутатионредуцирующими (рис. 7). Исходя из этого, можно предположить, что повышение содержания свободных SH-групп в цитозоле печени крыс, получавших нитрозоамин, скорее всего вызвано не редокс-превращениямн, а интенсификацией синтеза GSH (рис. 7).

Обобщение полученных результатов свидетельствует о том, что ответная реакция СБК на поступление в организм НДФА значительно отличается от таковой в случае ДЭНА. Так, если при интоксикации крыс НДФА наблюдается рост содержания и ферментативной активности практически всех основных компонентов СБК, то на 2 сутки после введении ДЭНА выявляется падение содержания цитохрома Р-450 и отсутствие существенных сдвигов в функционировании ряда глутатионзависимых ферментов (рис. 6, 7).

Известно, что конечным канцерогенным метаболитом НДФА является нитроксильный радикал, обладающий способностью повреждать жизненно важные клеточные структуры (Appel К.Е. et al., 1987). Не вызывает сомнения, что в случае нормального функционирования ферментативных и неферментативных защитных механизмов вероятность реализации повреждающего действия продуктов метаболизма НДФА в значительной степени снижается. В связи с этим стимуляцию глутатион S-траисферазной активности и рост содержания свободных SH-групп под влиянием НДФА на фоне повышения содержания цитохрома Р-450 можно расценивать как внутриклеточную адаптацию к избыточному поступлению в организм нитрозоамнна (Голиков С.Н. и др., 1986).

ВЫВОДЫ

1. Продотированное поступление в организм больших доз N-нитрозоди-этиламина, в отличие от относительно малых, вызывает ярко выраженный дисбаланс в функционировании системы биотраисформацин ксенобиотиков, проявляющийся в снижении содержания и ферментативной активности основных компонентов монооксигеназнои системы, а также в повышении активности большинства глутатионзависимых ферментов на фоне значительного изделия содержания свободных SH-групп.

2. Д/штельное совместное введение больших доз нитрита натрия н диэтиламнна, в отличие от действия этих же соединений порознь, приводит к росту содержания и активности ферментов всех стадий биотрансформации ксенобиотиков.

3. Прн однократном поступлении в организм Ы-нитрозодиэтнламина статистически достоверные изменения содержания ферментов I стадии биотрансформации ксенобиотиков отмечаются на 2, 8 н 15 сутки после введения, а функциональные сдвиги, затрагивающие II и III стадии, наблюдаются в основном на 8, 15 и 31 сутки.

4. На 2 сутки после однократного введения N-нитрозодифеннламнна повышение активности ферментов II и III стадий биотрансформации ксенобиотиков параллельно росту содержания цитохрома Р-450.

5. N-нитрозодиэтиламнн практически не вступает в реакции неферментативного или фермент - опосредованного взаимодействия с восстановленным глутатноном.

6. Зависимое от цАМФ фосфорилирование растворимых глутатлон S-трансфераз является одним из механизмов регуляции активности данных ферментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семак И.В., Пикулев А.Т., Шолух М.В. Регуляция глутатион S-трансферазной активности циклическими нуклеотидами // Доклады АН РБ. -1992. - T.XXXVI. - С.281-283.

2. Семак И.В., Пикулев А.Т. Функциональное состояние системы био-тпансформации ксенобиотиков при интоксикации животных дифениламином и М-нитрозодифениламнном // Биохимия. - 1993. -Т.58. - С. 1314-1317.

3. Semak I. V., Pikulev А. Т. Possibility of Regulation of Membrane Bound Glutathione S-Transferase Activity by Radicals Products of N-Nitrosodiphenyl-amine and Diphenylamine Metabolism // International Conference of Critical Aspects of Free Radicals in Chemistry, Biochemistry and Medicine. Vienna, Austria, February 14th-17th, 1993. Book of Abstracts / Eds. H. Nohl, Wien H. Esterbauer. - Vienna, 1993. - P.165 (P-III-34).

4. Semak I.V., Pikulev A.T. The Functional State of the Xenobiotic Metabolizing System in Rat Liver Following Chronic Administration of Diethylnitrbsamine or its Precursors II Drug Metab. and Drug Interact. - 1994. -V.ll. - N.3. - P.237-244.

5. Семак И. В., Пикулев А. Т. Влияние диэгнламина и N-нитрозо-диэтиламина на ферменты системы биотрансформацни ксенобношкоп в печени крыс // Вестник Б ГУ. Сер. 2. - 1994. - N.3. - С.45 49.

РЕЗЮМЕ

Ссмак Игорь Викторович. Влияние канцерогенных нитрозоампиов п их неканцерогенных предшественников на систему бнотрансформацни ксенобиотиков в печени крыс.

Ключевые слопа: цитохром Р-450, глутатпоизавненмые ферменты, канцерогенные питрозоамииы, нсканцероГснныс предшественники.

Изучено влияние хронического и однократного введения нитрита натрия (НН), канцерогенных ннтрозоаминсв (НА) и соответствующих аминов (СА) на состояние системы биотрансформации ксенобиотиков (СБК) в печени крыс.

При выполнении работы использовались спектрофотометрические, электрофоретнческие и авторадиографнческие методы исследования.

Установлено, что хроническое введение животным 0,02% водного раствора N-ннтрозодиэтиламнна (ДЭНА) в отличие от 0,002% ДЭНА вызывает дисбаланс в функционировании СБК, проявляющийся в снижении содержания и ферментативной активности основных компонентов монооксигеназпон системы, а также в повышении активности большинства глугатионзависнмых ферментов на фоне значительного падения содержания свободных SH-rpynn. Ответная реакция СБК на совместное хроническое воздействие НН и диэтнламина (ДЭА) не соответствует простому суммированию эффектов, вызываемых этими же соединениями, вводимыми отдельно друг от друга. При однократном поступлении в организм ДЭНА достоверные изменения в содержании ферментов I стадии бнотрансформацни ксенобиотиков отмечаются па 2, 8 и 15 сутки после введения, а функциональные сдвига, затрагивающие II н III стадии, наблюдаются в основном на 8, 15 и 31 сутки. В отличие от N-нитрозодифениламина, вызывающего па 2 сутки после однократного введения повышение глутатнон S-транрферазной активности, а также рост содержания цитохрома Р-450, поступление в организм ДЭНА приводит к уменьшению содержания гемонротеина и практически не влияет на активность ряда глутатионзависимых ферментов. Показано, что зависимое от цЛМФ фосфорнлировапне растворимых глутатнон S-трансфераз является одним из возможных механизмов регуляции активности этих ферментов.

Полученные результаты дополняют существующие в ксенобиохимни представления о характере воздействия НА, НН и СА на СБК и могут быть использованы для разработки научно обоснованных принципов повышения резистентности организма к действию азотсодержащих ксенобиотиков.

РЭЗЮМЕ

Сямак Irap BiKTapaiiiM. Уплыу канцэрагенных штрозамшау i ix нсканцэрагешшх папярэдшкау на а'стэму бштрансфармацьн ксеиаб1етыкау у печаш пацукоу.

Ключавыя словы: цытахром Р-450, глутатыензалежныя ферменты, канцэра-гснныя H¡Tpo3aaM¡Hbi, неканцэрагенныя папярэдшкк

Даследавапы уплыу храшчнага i аднаразовага увядзення нарыта натрыю (НН), канцэрагенных штрозаамшау (НА) i адиаведных амшау (АА) на функцыянальпы стан астэмы б)ятрансфармацьп ксенаб}етыкау (СБК) у печаш пацукоу.

Падчас выканання работы выкарыстоувалшя спектрафотаметрычныя, электрафарэтычныя i аутарадыеграф1чныя метады даследавання.

Установлена, што xpaiiÍ4Hae увядзенне жывелам 0.02% воднага раствору N-штрозадыэтыламшу (ДЭНА) у адрозненне ад 0,002% ДЭНА выклкае ярка выражаны дисбаланс у функцыяванш СБК, як1 праяуляецца у зшжэнш утрымання i актыунасщ асноуных кампанентау монаакагеназнай астэмы, а таксама у павышэиш актыунасц! бальшыш глутатыензалежных ферментау на фоне значнага падзення утрымання вольных SH-груп. Адказная рэакцыя СБК на сумеснае храшчнае уздзеянне НН i дыэтыламшу (ДЭА) не адпавядае нростаму сумаваншо эфектау, urro выкшкаюцца 1этым1 ж злучэння.кп, уиадз1мым! асобна адзш ад друшга. Пры аднаразовьш пастугuienni у аргашзм ДЭНА дакладныя змяненш у утрыманш ферментау I стадьп б1ятрансфармацьн ксенаб1етыкау адзначаюцца на 2, 8 i 15 cyrKÍ пасля увядзення, а функцыянальныя 3pyxi, што закранаюць И i III стадьи, наз1раюцца на 8, 15, 31 cjtkí. У адрозненне ад N-штрозадыфеноламшу, што выклжае павышэнне глутатыен S-трансферазнай актыунасц! i рост утрымання цытахрому Р-450, увядзенне ДЭНА прыводзщь да змяншэння утрымання геманрате1ну i практична не уплывае на актыунасць шэрагу глугатыензалежных ферментау. Выяуле11а, што залежнае ад цАМФ фасфарыляванне растварымых глутатыен S-трансфераз з'яуляецца адным з магчымых мехашзмау рэ1уляцьп актыунасш гэтых ферментау.

Атрьшаныя Bbmixi дапауняюць icnyKme у Kceira6ÍHxÍMÍi уяуленне аб характеры уздзеяння НА, НН i СА на СБК i могущ. быць викармсгоупаны для распрацоук! навукова абгрунтаваных прынцынау павмшэпня рэзкпнтнасш аргашзма да дзеяння азотаутр!>шальных ксенаСнетыкау.

SUMMARY

Semak I. V. The effect of carcinogenic nitrosamines and their non-carcinogenic precursors on the xenobiotic metabolizing system in rat liver.

Key words: cytochrome P-450, glutathione dependend enzymes, carcinogenic nitrosamines, non-carcinogenic precursors.

The effect of the single and chronic oral administration of sodium nitrite (SN), carcinogenic nitrosamines (NA) and corresponding amines (CA) on the functional state of the xenobiotic metabolizing system (XMS) in rat liver was investigated.

The spectrophotometric, electrophoretic and avtoradiographic methods were

used.

It was found that chronic 0,02% water N-nitrosodiethylamine (DENA) solution administration, in contrast to 0,002% DENA, caused a pronounced disbalance in the functional state of XMS. It was expressed in the decrease in the content and the activity of the main components of the monooxygenase system and in the increase of the activity of the most glutathione dependend enzymes against a background of the significant diminution in the level of free SH-groups. The response of individual components of XMS to chronic administration of diethylamine (DEA) simultaneously with SN cannot be understood by simple addition of the effects seen when the two compounds are given separately. The changes in the content of the enzymes of the first step of the xenobiotic biotransformation were observed on the 2, 8 and 15 days after the single administration of DENA. At the same time, the material changes in the functioning of the enzymes of the second and third steps were found on the 8, 15 and 31 days after the introduction of the nitrosamine. In contrast to N-nitrosodiphenylamine, increasing glutathione S-transferase activity and cytochrome P-450 content, DENA decreased the hemoprotein level and did not change the activity of glutathione dependent enzymes on the 2 day after the introduction. It was found that cAMP dependent phosphorilation of the soluble glutathione S-transferases is one of the possible mechanisms of enzymatic activity regulation.

The results obtained supplement the existing information in xenobiochemistry about the nature concerning the influence of NA, NN and CA on XMS and may be used for working out scientifically based principles of raising of organism resistance to nitrogen-containing xenobiotics.

Подписано к печати 19.04.95 г. Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. {Л Тираж 100 экз. Заказ № 492.. Песплатно

220080, Минск, ул. Бобруйская, 7. Ротапринт, БГУ.