Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые показатели перекисного окисления липидов в процессе модифицирующего влияния питания на токсическое и канцерогенное действие афлатоксина В1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые показатели перекисного окисления липидов в процессе модифицирующего влияния питания на токсическое и канцерогенное действие афлатоксина В1"

4? 1 * 9

НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РЕГИОНАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ ПИТАНИЯ АН РК

На правах рукописи

КОЛЕСНИКОВА Любовь Георгиевна

НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛНИИДОВ В ПРОЦЕССЕ МОДИФИЦИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ПИТАНИЯ НА ТОКСИЧЕСКОЕ И КАНЦЕРОГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ АФЛАТОКСИНА В1

03.00.04 — биологическая хнмпя

Аатореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата — 1992

/

Работа выполнена в Алма-Атинском ордена Трудового Красного Знамени государственном медицинском институте имени С. Д. Асфендиарова и Научном Центре региональных проблем питания АН РК

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор медицинских паук, профессор Белозеров Е. С." Доктор медицинских паук, профессор Плсшкова С. М.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

Кандидат медицинских наук Божко Д. М.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских паук, профессор Утешев А. Б. Доктор биологических наук Оконенко Л. Б. Ведущая организация: Институт питания РАМН

Защита диссертации состоится « » _ 1992 г.

в часов па заседании специализированного совета Д 001.35.01 в Научном Центре региональных проблем питания АН РК (Алма-Ата, 480008, ул. Клочкова, 66).

С диссертацией можпо ознакомиться в библиотеке Научпого Центра региональных проблем пнтапня АН ГК.

Автореферат разослан « » _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор меднцшгеких наук'

Ж. С. НУГМАНОВА

— -" ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема Разработка проблемы охраны внутренней среды организма от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе от повревдаюыего действия многочисленных чужеродных соединений является одной из наиболее актуальных задач современной медико-биологической науки (Шицковн А. П. , 1987). Это обус лавливает необходимость усиления исследований самых разнообразных аспектов проблемы и прежде всего изучения особенностей функционировав,:л важнейших биохимических систем, имеющих непосредственное отношение к метаболизму ксенобиотиков и механизму их патогенного действия (Псковский А. А. , 1979; Бондарев Г. И. и соавт.-, 1987; Шарманов Т.Е. 1985;Тутельян Е А. , Кравченко Л. В. , 1985). Среди загрязнителей пищевых продуктов, обладающих токсическим эффектом на многие виды животных, важное место принадлежит анатоксинам - ядовитым метаболитам плесневых грибов рода Aspergillus. В силу широкой распространенности и высокой биологической активности они представляют проблему глобального значения (Кравченко Л. R , Тутельян Е А.. 1937; Ников П. С. ,1950). Наибольшее внимание специалистов привлекает афлатоксин В1, который, с одной стороны, превосходит остальных представителей семейства анатоксинов по токсическим, мутагенным и канцерогенным свойствам, имеющим преимущественно гепатотропнуы направленность, а с другой - чаще и в больших количествах продуцируется соотвествующими микромицетами (Тутельян В. А. , Кравченко Л. а , 1985; Busby V. F. J. , Wogan а N. , 1984; Singh Т. et al, 1982).

Последние годы значительное внимание уделялось разработке ряда медико-биологических аспектов, связанных с реализацией поврелдаюоего действия анатоксина В1. При этом показано, что для осуществления своего влияния ксенобиотик должен пройти этап предварительной метаболической активации, главным образом в печени, при участии многоцелевых оксида."? мик[юсом эндоплазматического ретикулума (Арчаков А. И. , 1975; Ляхович ЕЕ. Цнрлоь И. Я." 1987; Каган ЕЕ, Котельцев С. Е . 1974). В отдельных работах изучался вопрос о моди^ишфупярм влиянии различных Факторов на конечные биологические эффекты афлатоксина В1, которое, как оказалось, мож.-т осуществляться на различных этапах метаболизма ксенобиотика - всасыван:ш. распределения по органам, биотрансформации, выделения (Тутельяг Е А. , Кравченко Л. Е . 1985).

В ряде исследований в качестве агентов, модифицирующих афлзтокси-

новый канцерогенез и токсичность, рассматривается некоторые пишевые факторы (Newberne P.M. , Rogers А. Е. , 1973; Bailey G. S. . Taylor M. J. , 1982). Установлено, что питание может в значительной степени определить характер и конечные итоги взаимодействия организма и афлатоксина В1.

К настоящэму времени все-еше недостаточными остаются сведмия зависимости биологического действия афлатоксина В1 от состояния пере-кискиги окисления липидов (ПОЛ) - одного из важнейших механизмов структурной и функциональной модификации мембран. Более того, в имеются литературе практически полностью отсутствуют данные о возможности модификации с помощью питания токсического и канцерогенного действия данного ксенобиотика посредством целенаправленного изменения интенсивности процесоог липопероксидации.

Между тем углубленное изучение данного вопроса могло бы иметь важное значение в расшифровке механизмов развития вызываемых афлаток-сином В1 повревдений и разработке алиментарных подходов к повышению резистентности организма к его действиа

Цель работы - изучить вляние качественно различного питания нг процессы ГОЛ при воздействии афлатоксина В1.

Задачи исследования: '

1. Изучить особенности изменения микровязкссти мембран печеночных микросом под влиянием афлатоксина Ш в условиях качественно различного питания.

2. Изучить особенности изменения концентрации продуктов ПОЛ -диеновых коныогатов и оснований Шиффа в микросомлх и гомогепате печени при воздействии афлатоксина В1 в условиях качественно различного питания.

3. Изучить особенности изменения активности ферментов антиокси дантной защиты (супероксиддисмутазы и каталази) при воздействии афлатоксина В1 в условиях качественно различного питания.

4. Выяснить возможные взаимосвязи особенностями изменения параметров ГШ и конечными результатами токсического и канцерогенного влияния афлатоксина Б1 и дать им медика-биоло! иччскую оценку.

Ктучнзя новизна. Получены экспериментальные доказательства сти

мулирования ПОЛ в результате однократного введения остротоксической дозы афлатоксина В1. Показано, что скорость ПОЛ.в условиях воздей -ствия афлатоксина В1 имеет отчетливую зависимость от качества пита -ния. Обнаружено, что различная чувствительность к токсическому действию афлатокисна В1 у животных, получавших разнохаратерное питание, тесно связана с разной степенью интенсивности ПОЛ Повышенная токсичность ксенобиотика сопровождается резким повышением микровязкости мембран, накоплением в ней больших количеств продуктов ПОЛ -диеновых коныогатов и оснований Шиффа, а также индукцией активности супероксиддисмутазы (СОД).

Показано, что высокий уровень жиров в диете снижает токсичность афлатоксина В1 путем ослабления его мембранотоксического действия. Обнаружено, что введение в рацион антиоксидантных компонентов резко снижает скорость накопления в печени продуктов ПОЛ, однако не способствует снижению токсического влияния афлатоксина В1, что предполагает возможность других не менее важных механизмов реализации повреждающего действия ксенобиотика

Практическая ценность работы состоит в получении экспериментальных доказательств возможности целенаправленного воздействия алиментарными факторами на развитие повреждающего влияния афлатоксина В1 и других химических агентов, сходных с ним по механизму действия, в том числе с помощью модификации процессов липопероксидации.

Положения, выносимые на защиту: '

- о прооксидантном действии афлатокисна В1;

- о наличии в условиях развития афлатоксиновой интоксикации и канцерогенеза алиментарно-зависимых изменений параметров ПОЛ, в значительной степени определяющих силу конечных биологических эффектов афлатоксина В1;

- о возможности воздействия алиментарными факторами на структурно -функциональное состояние мембран гепатоцитов с целью профилактики и лечения токсического и канцерогенного поражения печени.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Мех-республиканской научно-практической конференции "Питание здорового и больного человека" (Ашхабад. 1989); Научной конференции с международ-

ним участием "Питание: здоровье и болезнь" (Москва, 1990); Советско-американском симпозиуме "Most Important Issues of Modern Nutrition Science" (Alma-Ata, 1990).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов,результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы (132 источника). Работа изложена на 121 странице машинописи, текст иллюстрирован 26 таблицами, 15 рисунками.

Публикации. По теме диссертации опубликовано б работ, полный перечень которых приведен в. конце автореферата.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 397 растущих крысах-самцах линии "Август" с исходной массой телг* 50-60 г, которые били разделены на 4 группы. Первая группа животных получала полноценный полусинтетический сбалансирования по основным пищевым веиествгш рацион (ПР), включающий 25,ОХ муки пшеничной, 46,отрубей пшеничных, 11,52 казеина, 6,42 лярда, 2,07. рафинированного подсолнечного масла, 12,12 крахмала, 3,02 сахарозы, 3,22 солевой смеси и 0,22 смеси витаминов. Вгорой группе (КЖ) - скармливали рацион с повышенным содержанием жиров, представленных, главным образом, кулинарным жиром (1в,Ъ2 в диете). Третья группа (ПМ) - также получала рацион с повышенным количеством жиров, однако в данном случае представленных ратинированным подсолнечным маслом (20,52 в диете). Четвертая группа (ЕСМ) - содержалась на полноценном рационе, обогащенном витамином Е (ЬОО МЕ/кг), селенитом натрия (2,3мг/кг), метионнном (Сг/кг).

В первой серии экспериментов животных 4 указанных групп (ПР, КЖ, ПМ и ЕСМ) содержали на соотвествуюаих диетьх в течениие 30 дней после чего им однократно интраперитонеалыю (и/г.) вводили растворенный в диметилсуль^оксиде (ДМ;0) афлатоксин В1 в д<ме 1,3 мг/кг массы тела. Использованная доза представляет собой №0 анатоксина В1 для крыс-самцов линии "Август" при кнтраперитон-альном введении (Божко Д. М. и соавт. , 1990). Забой животных проводили через 24 и 48 часов после затравки ксенобиотиком. В каждой диетической группе выделяли конт-

- н-

рольных -¡квотных, которым вводили 0,2 мл ДОСО без афяатоксипа В1 и забой которых , также осуществляли через 24 и 48 часов после иньекции растворителя.

Е+горую серию эксперимента проводили аналогично первой, однако животных, выживших после octi» »токсического воздействия афлатоксина и (1,3 мг/кг массы тела), забивали череп б и 12 месяцев от момента введения ксенобиотика.

Выделение микросом и получение цитозоля печени проводили по методу А. И. Арчакова (197Ь). Концентрацию диеновых коныогатов в мик-росомальной фракции оценивали по методу В. 15. Гавриловой и М.К. Млшко-рудной (1983). Уровень конечного продукта 1ХУ1 - оснований Шиффп определяли согласно методу С. J. Di Hard, A. L. Tappel (1Ив4). Активность ферментов алтиоксидантной системы (СОД и каталазы) - определяли по методам С. fit-aiichamp, J. Кг nlovich (I'jVl) и Н. Aeb) (1984). Определение микровязкости субклеточных мембран производили методом А. К. fill la, Е. Saclmvvm (1974).

Полученные данные обрабатывали об ну,-принят ими методгшн информационной статистики ( Гокицкий 11 Ф. 197,4).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОГГТВШШ ИО"ЛКЛОВА!М И ИХ СТСУВДЕНИЕ

Установлено, что при скармливании крысам-самцам линии "Август" в течение одного месяца [»алличних рационов питания (базового - ПР, а тлкл; рационов с повышенным содержанием кулинарного жира - КЖ; подсолнечного масла - ИМ: витамина К. селенита натрия и иетионина - ECU) существенных изменений величины микровязкости печеночных мнкросомаль-ных мембранах обнаружено не Сило. Воздействие остротоксической дозы ифл.чтоксина В1 (1.3 мг'кг массы тела) через 24 часа после затравки также не привело к зны-тнич изменениям изучаемого параметра у животных ьсех диетических групп, что свидетельствует об определенной стабильности в чтих условиях 4» •сфодипидного состава мембран печеночных микроеом. однако на чассвом сроке наблюдения было обнаружено рез-ют увеличение отн-ч-ительчо контроля жесткостностн липидного бислоя микротом у животных трех групп - ГО', КЗ и ЕСМ, и лишь некоторое воз-¡tii-танце научаемого показателя у крыс, получавших рацион ПМ.

В С'Тд.чл'-нные сроки (б и 12 месяцев) содержания контрольных (без затравки ксенобиотиком) крыс на различном фоне питания меда/ группами

-S-

животных, а также в динамике наблюдения сув?стБенных различий жест-костности липидного бислоя мембран макросом выявлено не было. В условиях воздействия афлатоксина В1 животные разных диетических групп через 6 и 12 месяцев достоверно но различались по коэффициенту микгсвязкости печеночных микросом, который однако на 6-месячном этапе наблюдения оказался несколько выше, тогда как па 12-месячном - несколько ниже относительно значений, обнаруженных п соответствующих контрольных группах.

Б связи с изложенными результатами опроделе<ный интерес в плане дальнейшего обсуждения вызывают данные, полученные совместо с сотрудниками лаборатории санитарно-пищевой микологии [ручного центра региональных проблем питания АН РК (Бойко Л М. и соазт. , 1090), о летальном действии афлатоксина ГП после однократного интраперитскеального введения его в дозе 1,3 мг/ кг массы тела крысам линии "Август", содержавшимся в аналогичных условиях питания. Ути исследования показали, что максимальная степень летальности животных была выявлена при скармливания рациона ЕСМ (52,77. ), которая при этом статистически достоверно превышала летальность, обнаруженную после затравки ксенобиотиком среди крыс других диетических групп - ИГ, КЖ и ГТМ (41,1; ЙО, 7 И 20,42, соответственно). £

Оценивая динамику изменении вследствие затравки анатоксином И показателей микровяокости у крыс в зависимости от различного питания и в связи с вкраглнностыо токсического влияния ксенобиотика, следует прежде всего отметить наличие определенного параллелизма между степей!« возрастания микровязкости мембран и летальностью животных (рис. 1).

Менее выраженное Действие афлатоксина В1 наблюдалось среди животных. получавших с диетой повышенное количество (:ч,-И) подсолнечного масла (группа ИМ - летал!.ность около 202). У крыс данной группы через 4Й часов после затравки ксенобиотиком отмечался наименьший польем микровязкости в печеночных микросомалышх мембранах (до 12У. относительно контроля). При скармливании рациона с повышенным содержанием кулинарного жира, летальность и увеличение микровязкости через 48 часов после затравки афлатоксином В1 имели более высокие значения (СО и соответственно) по сравнению с таковыми, найденными в группе , получавшей повышенное количество подсолнечного масла Наибольшее увеличение микровязкости мембран вследствие затравки ксенобиотиком были

выявлены у животных рационов ЕОМ и ПР - высокочувствительных к действию афлэтокеина Е1 ( до 140 и 17GX. соответственно). Эти данные позволяют заключить, что для реализации летального действия афлатоксина

200%

100 2

л-

I

У-

/—7

176

41Д

зи,1;

123

140

aw

Ь2,7

и.

пр ка пм есы

Рис. 1. Показатели летальности крыс линии "Август" после однократного г,ведения анатоксина В1 (в доле 1,3 мг/кг массы тела) в связи со степенью во.чраета/шя ми)фоня;;кости микросомальных мембран печени (через 48 часов после затравки ксенобиотиком)

Условные обозначения:

Я!' - базовый рацион; КЖ - диета с повышенным содержанием кулинарного *ура; 1М • диета с повышенным содержанием подсолнечного мк-ла: КОМ • листа, обогащенная витамином Е, селенитом натрия и м"ти::нином; 1* • *1 - показатель летальности: | | - показатель микровязкости

Н1 бол!»'-.- значение имеет структурно-функциональное состояние мембран в органе-миак-ни. И следовательно, ме^йранотоксическая активность ксенобиотика является существенным элементом патогенеза афлатокси-нового отравления, что согласуется с таким же выводом, сделанным на

основании достоверного повышения неседиментируемой активности фермент, лизссом печени при интоксикации чувствительных к афлатоксину В1 животных (Покровский А. А. , 1979).

Принимая во внимание то обстоятельство, что уровень микровязкости обусловлен прежде всего химическим составом мембран и интенсивность» происходящих в них процессов липоперокпидащш (Абрамова К. й. , Оксен-гендлер Г. И., 1985), следует предположить, что в условиях качественно различного питания животные отличаются и по указанны мембранным характеристикам, причем наиболее отчетливо в настэяшем Эксперименте это проявилось после затравки анатоксином В1. Приведенные на рисунке 1 данные свидетельс^уют, ч;о высокие уровни жире,^ в диете обладает способностью повышать резистентность животных к токсическому действию афл^токсина И. Механизм такого влияния жиров связан, по-видимому, с наличием в их составе большого количества насьаггнных, моно-и полине-насьщенных жирных кислот, а также природных соединений с антиокси-дантной активностью, создахадх устойчивую к действию ксенобиотика химическую структуру мембран и, вероятно, определящих оптимальный уровень происходяких в них процессов ПОЛ

Б то.же время указанные выше различия между высокожлровыми диетами ПМ и КЖ в увеличении микровиокости мембран и летальности животных в условиях воздействия аНатоксина В1 связаны, по- видимому, прежде всего о качественными различиями химического состава указанных рационов , а именно, со значительно большей (примерно в 2 раза) долей насыпанных, мононенасыщенных и меньшей (также примерно в 2 р.чза) - по-линенасыданних жирных кислот и витамина Е в кулинарном жире "Белорусский" (являющимся жировым компонентом диеты KJK) по орапнени! с количеством этот же ингредиентов в подсолнечном масле (состапляюшг» липидную часть рациона ПМ). С Другой стороны, корм с более низким! концентрациями жиров (по 10,37. в рационах IIP и ЕОМ) не обладал су оественным тормозящим влиянием на повышение микровязкости в печеночных мнкросомальных мембранах и не предотвращал развитие обшетоксичес ких У^ктов афлатоксина В1, даже несмотря на наличие в рационе ЕС комплекса антиоксидзнтов.

Исследованиями установлено, что использованные в настоящем экспе рименте диетические воздействия сами по себе существенным образом н повлияли на концентрацию диеновых коньюгатов в микросомах печен крыс. В тоже время затравка анатоксином BI (1,3 ur/кг массы тела

уже в первые сутки вызвала резкое увеличение содержания диеновых коныргатов в печеночных микросомах животных, получавших все без исключения изученные рационы литания (таблица 1).

Таблица 1

Влияние качественно различного питания и затравки афлатоксинсм В1

(1,3 мг/кг массы тела) на содержание диеновых коньюгатов в микросомах печени крыс через 24 и 48 часов после однократного введения ксенобиотика

! Содержание диексзнх кснъвтатов (нМ/мг белка)

1--------------------------------------------------------------

N п/п I Рацион (До затравки I_Посд>„?атра.ргз<_а^:згогекнрм_а_

_I_[_I через 24 часа, > через.48 часов_

2,3,4,* 2.4,*,*»

1. ПР 0,24 Ю, 02 1,01 ¿0,05 0,"?10.05

1.4,* 1,*.**

г. КХ 0,34 <0.01 0,76*0,08

1.4,* «,**

а ПМ 0,35*0,03 0,82+0.02 0,02*0,07

1,2,3,* 1.»,«*

4. КОМ 0,28*0,02 О.М¿0,02 0,42¿0,03

Примечание: в нзстоящ-Л и последуткей таС лицах индексы, лрнгеден-ные над значениями изучаемых на{«метров, указывает ка номер диетической группы с соответствующим показателем которой в даннг.й гочта соблюдения имеет место статистически значимые различия I ? * С, 25); различия достоверны (Г^О.Об) по сравнению со значения».«, получ'гннглй:: * - до затраьки, ** > Г-1 часа после затравки а^.ча.'оксиком И.

В течение вторых суток от начала воздействия ксенобиотика концентрация диеновых коньюгатов в мик;/оссмальной Фгакцни печени крг? всех чког.еримонт-иьных групп существенно снизилась, что, тек менее, не привело к достижению исходных значений, наеденных у тавотши соответствующих контроль;:!« груп1:. При этом на всех этапах остротоксического эксперимента наибольшие значения концентрации г.иолоеы/ коньюгатов были обнаружены у .-срыс диетической группы ПР (1.01*0,0*};

0,75+0,05), наименьшие - у животных ЕСМ (0,53+0,02; 0,42+0,03), про межуточное положение по данному показателю занимали крысы, получавшие) рационы ПМ И К« (0,7б+0,08;0,52+0,05 И 0,82+0,02; 0,62+0,07 нМ/ю] Селка, соответственно).

Таким образом, в результате токсического воздействия афлатоксина В1, судя по показателя концентрации диеновых коныогатов, в микросо-мальных мембранах печени происходит стимулирование ПОЛ, степень усиления которого у животных всех диетических групп (за исключением группы ЕСМ) обнаруживает в целом прямую зависимость от выраженности летального эффекта ксенобиотика. Б то же время минимальное накопление диеновых коньюгатов, наряду с максимальной токсичностью афлатоксина В1, выявленнные у животных в условиях скармливания диеты ЕСМ, свидетельствует: о наличии з данных условиях особенностей процесса ПОЛ, связанных с присутствием в рационе антиоксидантных компонентов, которые тем не менее не предотвращает развитие мембраяотоксического эф-4еста ксенобиотика, что подтверждается высокой степенью возрастания микровязкости мембран макросом у крыс данной группы через 48 часов после затравки указанным агентом.

Анализ данных о концентрации другой группы продуктов ПОЛ - шф-фовых оснований в гомогенате печени крыс в условиях качественно различного питания также свидетельствует об отсутствии существенной зависимости изучаемого показателя от использованных в эксперименте диетических воздействий (таблица 2). Примечательно, что и однократная остротоксическая доза ксенобиотика в течение первых суток после ее введений не вызвала резких изменений в содержании шиффовых оснований, что наблюдалось в этот период у животных всех диетических групп при рассмотрении показателя концентрации диеновых коныогатов. Лишь через 48 часов от начала эксперимента в гомогенате печени животных, полу-чавзих рационы ПР, КЖ, ПМ, но не ЕСМ, было обнаружено резкое накопление шиффовых оснований. Интересно отметить, что в условиях скармливания рациона ЕСЫ ухе через 24 часа после введения афлатоксина В1 уровень изучаемого показателя (3,23+0,34) оказался достоверно ниже по сравнению с таковым у крыс рациона ПР(4,54+0,Зб), а через 48 часов (4,87+0,79) - сущэственно ниже значений, выявленных у животных уже двух диетических групп - ПР и КХ (10,79+1,07 и 7,45+0,76 ед. флюоресценции, соответственно).

При сопоставлении концентрации шиффовых оснований в гомогенате

-

печени со степенью токсического эффекта ксенобиотика, как и при таком же анализе изменения концентрации диеновых коныогатов, было обнаружено, что уровень накопления шиффовых оснований к 48 часам от начала эксперимента соответствовал (в трех диетических группах ПР, КЯ и ПЮ степени выраженности афлатоксиновой интоксикации. И в данном случае исключением явилась группа животных, получавшая диету ЕСМ, наивысшая летальность в которой вследствие затравки ксенобиотиком сочеталась с самой низкой концентрацией шиффовых оснований. Согласно результатам собственных исследований повыиение концентрации продуктов ГОЛ (диеновых коныогатов и шиффовых оснований) вследствие воздействия афлаток- ' сина В1 обнаруживала некоторые интересные особенности. Выше уже было

Таблица 2

Влияние качественно различного питания и затравки афлатоксином В1 (1,3 мг/кг массы тела) на концентрацию сиффовых оснований в гомоге-нате печени крыс через 24 и 48 часов после однократного введения

ксенобиотика

! ! Содержание оснований Шиффа (ед. флюоресценции)

! I_

N п/п ! Рацион I I

I ! Без затравки f После затравки афлатоксином В1_

I t t _через_ 24_часа__1 _череа 48 часов

4 2,3,4,*,**

1. ПР 4.19+0.41 4,64+0,36 1 0,79+1,07

1,3,4, *, **

2. KS 4,33+0,55 3,38+0,50 7,45+0,76

1,2,*,**

3. ПМ 3.71+0,23 3,71+0,27 4,89+0,37

1 1.2

4. ЕСМ 4,12+0,44 3,23+0,34 4.87+0.79

отмечено налиаде "разрыва" во времени накопления изученных продуктов ПОЛ, один из которых (диеновые коньптаты) в наибольших количествах зпределялся в микросомах печени через 24 часа, тогда как концентрация другого (шиффовы основания) - достигала максимальных значений лишь :пустя двое суток после введения токсического агента. Очевидно, в те-

-п-

чение первых 24 часов после затравки афлатоксином В1 дальнейшее превращение днекови* коньюгатов ПНЖК через промежуточную стадию образования гидроперекисей у животных всех диетических групп происходило не г сторону превращения в малоновый диальдегид и далее в шиффовые осног.а-ния (О.Е.Колесова и соавт. , 1984), а осуществлялось, главным образом, по пути ферментативного восстановления глутатионпероксидазой с образованием структуры типа R-OH .( Burk Р. F. et al. , 1978; Tan К. H. et al., 1984). В связи с изложенным, отмеченный выше факт отсутствия резкого изменения концентрации шиффовых оснований в гомогенате печен!' животных, получавших рацион ЕСМ (содержаадй повышенные уровни селена) может указывать на сохранение в этих условиях высокой активности селен-зависимой глутатионперокисдазы.

Таким образом, полученные результаты о содержании продуктов ПОЛ (диеновые коньюгаты и шиффовы основания) до и после затравки ксенобиотиком свидетельствуют, во-первых, об отсутствии существенных различий в интенсивности процессов липопероксидации у контрольных животных в условиях диетических воздействий настоящего эксперимента; во-вторых, о стимулировании этих процессов в результате токсического влияния афлатоксина и у животных всех диетических групп; в-третьих, о выраженном защитном влиянии диет, содержащих в своем составе повышенное количество жиров; и в-четьертых, о наличии сложного взаимодействия между высокими уровнями в организме комплекса антиоксидантних компонентов (группа ЕСМ) и патогенезом афлатоксиновой интоксикации, которое осуществляется, по-видимому, на этапе реализации мембраноток-сических свойств указанного ксенобиотика.

Установлено также, что активность СОД в гемолизате и цитозоле печени контрольных животных различных диетических групп имела примерно одинаковую величину. Однако через 24 часа после остротоксич^ской зат-Гагки анатоксином В1 отмечено возрастание активности фермента в обеих изучаем»« средах у крыс„ получавших рацион ЕСМ, и диаъ несущественное изменение активности СОД к данному срок/ наблюдения у животных диетических групп IIP, га и Примечательно, что через 48 часов после затравки ксенобиотиком резкое увеличение активности данного фермента было выявлено в цитозоле печени животных, получавеих рационы ПР и IVM (до 42,03+5,68 к 35,64+3,19 ед. актив, /иг белка, соответственно), причем даже между этими значениями были обнаружены статистически достоверные различия (таблица 3).

Из этих результатов следует, что при скармливании крысам рационов ПР и ЕСМ после затравки ксенобиотиком и, в особенности через 43 часов после введения агента, происходит С/явственное увеличение концентрации в цитоэоле печени субстратов супероксиддисмутазной реакции (0£), образование которых в клетке может осуществляться в соответствии со следующими механизмами: радикал супероксида возникает при од-ноэлектроннсм восстановлении кислорода ферментами в процессе транспорта электронов по дыхательной цепи митохондрий и эндоплазматического ретикулума, а также при аутоокислении различных внутриклеточных компонентов - оксигемоглобина, НАД(Ф)Н, глутатионз, флавинов, цитохрома с, аскорбиновой кислоты и др. (Fridovich S. Е. ,

Таблица 3

Влияние качественно различного питания и затравки афлатсксином В1 (1,3 мг/кг массы тела) на активность супероксиддксмутазы в гемолизате и цитсзоле цитозоле печени крыс через 24 и 43 часов после однократного введения ксенобиотика

N п/п

1.

Рацион

IIP

КК

rai

Активность СОД ( ед. /мг гемоглобина или белка)

До затравки I После затравки анатоксином В1_ I через ! через _I 24 часа_I 48 часов _

гемолизат 54.04*3.14 58.42i3.00

3,*

цитозоль 22,74+2,83 гемолизат 54,80+5,05

30,53+5,31 42,03+5,68 53,91+3,55

цитозоль

24,23+1,38 27,26+3,59 36,66+11,66

гемолизат 57,11+2,36 58,76+2,14

1

32,05+5,11 23,85+6,41

60,61+ 4,36 - *

4 ЕСМ цитозоль 24,17+2,13 40,61+12,16 35,64+3,19

цитозоль 24,42+1.96 гемолизат 47,77+3,33

Porter N. А. , 1981). Анион-радикал кислорода можт окисляться и восс-

- /з-

танавливаться с образованием синглетного кислорода и гидроксильного радикала, явдяпцосся инициаторами ПОЛ (ПоОереакина Е Б. , Осинская Л.Ф. 1989).

Повышение супероксиддисмутазной активности рассматривается в ряде публикаций (Макаревич 0. а , Голиков П. а , 1983; Поберезкина Н. Е , Осинская Л.Ф., 1989) как защитная реакция, направленная на стабилизацию клеточных структур и ограничение ПОЛ. Тем не менее, в условиях настоящего эксперимента у животных, получавших рацион ПР и ЕСМ, которые после воздействия ксенг^иотика отличались наивысшей активностью супероксиддисмутазы в крови и цитозоле печени , наряду с повышенной токсичностью афлатоксина В1, обнаружено увеличение содержания в печени продуктов ПОЛ - диеновых коныогатов (группа ПР и ЕСМ). шиффовьи основания (группа ПР). что указывает, по-видимому, на усиленное образование в этих условиях активных форм кислорода, значительно перекрывающее возможности каталитического потенциала супероксиддисмутазы и приводящее к развитию реакций ПОЛ. Возникновение большого количества активных форм кислорода в условиях затравки афлатоксином В1 у животных рациона ПР и ЕСМ может быть обусловлено, с другой стороны, ускоренной метаболизацией ксенобиотика с образованием высокоэлектрофиль-ньк соединений типа эпоксида, а также, повышенной активностью микросомальной моноокснгеназной системы печени, многие компоненты которой при осуществлении своей ферментативной активности также способны, генерировать 0£и HgC^( Valenzuela A. et al.,1980; ПоберезкинаР. Е , Осинская Л.Ф. , 1989).

Показано также, что активность другого фермента антиоксидантной защиты - каталазы, в гемолизате и печеночном цитозоле крыс, находившихся в условиях качественно различного питания без воздействия ксенобиотика, имели практически одинаковые значения. В то же время, затравка афлатоксином В1 привела к резкому увеличению активности указанного фермента лишь в одной диетической группе ПЫ. обладающей повышенной резистентностью к токсическому действие ксенобиотика, тогда как в условиях скармливания других рационов питания, при которых животные демонстрируют высокую чувствительность к летальному эффект> афлатоксина В1 (группа ПР и ECU), несмотря на резкое повышение актив ности СОД, активность каталазы оставалась практически неизменной ни протяжении всего экспериментального периода. Учитывая наличие в физи ологических условиях высокой степени корреляции между двумя рассмат

риваемыми ферментами (А1тгиа В. Б., «¡гал и., 1978), следует предположить. что при действии афлатоксина В1 у животных указанных диетических групп возникает разобщенность супероксиддисмутазной и ка-талазной активностей, которая способствует накоплению в клетке перекиси водорода. 3 свою очередь повышение концентрации эндогенной перекиси водорода можгт приводить к развитию аутоинтоксикации, в механизме которой основную роль играет, по-видимому, денатурация белков, окисление сульфгидрильных соединений, а также иницировапие ШЛ (Абрамова НИ. , Оксенгендлер Г. И. , 1985).

Таким образом, оценивая приведенные данные, необходимо высказать предположение о существовании двух основных механизмов реализации токсического, в частности мембранотоксического эффекта афлатоксина 31, которые даже у животных высокочувствительных к действию ксенобиотика групп ПР и ЕСМ осуществляется, по-видимому, с различной степенью интенсивности. Один из механизмов состоит из усиления процессов липо-пероксидации с разборкой мембран ( повыпение жесткостности, увеличение содержания таких продуктов ПОЛ. как диеновые конысгаты и сиффовы основания), тогда как другой механизм Еключает, по-видимому, накопление перекиси водорода аз-за раз 0 алая с и ро в ки взаимодействия СОД и катал азы.

При обьяспении механизмов защитного влияния повышенного уровня диров в диете (группы ГШ и КЗ), следует, прежде всего иметь з виду возможное изменение в этих условиях химического состава мембран, а именно, увеличения доли в них фосфолипидов, содержащих остатки ИыК, которые первыми принимают на себя атаку высокореакционных интермэдиа-тов ПОЛ и ослабляют, таким образом, повреждающее действие последних на другие жизненно-важные компоненты клетки (белки, нуклеиновые кислоты и т.п.). С другой стороны, повышение резистентности животных к токсическому влиянию афлатоксина 81 макет быть связано с образованием в клетке пула свободных жирных кислот, способных встраиваться на место поврежденных молекул и быстро восстанавливать целостность мембранных структур.

При рассмотрении показателей микровязкости микросомальных мембран печени крыс, в течение года находившихся в условиях качественно различного питания, установлено, что через 6 и 12 месяцев от начала эксперимента контрольные животные всех диетических групп имели примерно одинаковые уровни изучаемого показателя. Однократная затравка

ксенобиотиком также практически не изменяла на указанных этапах исследования величину микроЕйзкости микросомальных мембран во всех диетических группах животных. В то же время, анализ динамики изменения миг.ровязкости у затравленных афлатоксином В1 крыс, получавших качественно различное питание, выявил некоторые интересные особенности, имеющие, по-видимому, определенное значение для развития в печени животных канцерогенного процесса. Так, крысы группы ПР, которые в тех де экспериментальных условиях (однократная затравка афлатоксином В1 в дозе 1,3 мг/кг массы тела) проявили самую высокую чувствительность к канцерогенному действию ксенобиотика и продемонстрировали в острую 4>1зу отравления (между 24 и 48 часами после затравки) резкий подьем относительно контроля микровявкости мембран, сменившийся в дальнейшем прогрессирующим снижением. В тоже время затравленные афлатоксином В1 тавотные наиболее резистентной к канцерогенному действию агента группу И ь течение всего эксперимента не обнаружили существенных изменений со стороны микровязкости микросомальных мембран. Примечательно тел«*, что для крыс группы ГШ. получивших однократную дозу ксенобиотика, было характерно отсутствие изменения изучаемого показателя от-носител!но соответствукщйх контрольных значений на первом этапе наблюдения. • 24-48 часов) и резкое падение жестк.стности лшшдного бислоя ¡.•.«кроссм на последующ?* стадиях исследования (41* часов - 12 месяцев). Такте изменение микровязкости соответствовало проявлению в этой группе промежуточных значения силы канцерогенного действия афлатоксина В1.

!:ыло обнаружено также, что через С и ¡2 месяцев от начала эксперимента контрольные и затравленные афлатоксином В1 животные всех экспериментальных групп имели примерно одинаковую концентрацию в печени продуктов ПО,'. - диеновых коныогатов и шиповых оснований. Наряду с этим в динамике наблюдения необходимо отметить наличие прогрессирующего снижения примерно до уровня контрольных значений резко возросшеР Б первые сутки после затравки концентрации диеновых коньюгатов в мик-рооомальных мембранах печени, наблюдавшееся вне зависимости от чувствительности животных к канцерогенному действие анатоксина В1. Ь тоже время при рассмотрении динамики кгшнетл относительно ко|!т;о.и показателей концентрации шиффовых оснований г гомогенате печени крьк опытных диетических групп, обращает на себя внимание резкое возраста ние в отдаленные сроки после гатравкк (через Б месяцев) уровня шк^фо

вых оснований у тавотных, получавших рацион с повышенным содержанием жиров (группы КЖ и ПМ),

Установлено также, что активность СОД в цитоэоле печени крыс через 5 и месяцев от начала эксперимента существенным образом не зависела от вида алиментарного воздействия ни у контрольных, ни у затравленных афлатоксином И животных. В то же время при анализе динамики изменен«! активности СОД, обращает на себя внимание наличие на 6-месячном этапе эксперимента резкого преобладания активности фермента над соответствующими контрольными значениями у затравленных животных диетических групп КЯ и ГШ (21л84+3,02 против 31,55+2,81; 23,24 3,11 против 41,32+6,25 ед. активностй/нг белка, соответственно).

Примечательно, что между значениями активностей каталазы э цкто-золе печени контрольных и затравленных афлатоксинои В1 крыс через б и 12 месяцев от качала эксперимента суоественных различий изучаемого параметра обнаружено не было. В то же время .тавотные, содержавшиеся на базовом рационе ПР (высокочувствительном к канцерогенному действию ксенобиотика), через 6 месяцев после затравки афлатоксинои В1 проде-ккшстрировали резкое увеличение активности каталазы относительно контрольной группы (57.43+19,27 против 75,37+20.36 ед. активности/мг белка).

Из выиеизложенного следует, что конечные биологические эффекты афлатоксина В1 могут в значительной степени зависеть от влияния ксенобиотика на процессы ПОЛ, а интенсивность последних, в свою очередь, существенным образом определяется метаболическим фоном организма, который формируется в непосредственной зависимости от особенностей питания.

Исходя из собственных результатов и-на основании данных литературы, складывается впечатление о существовании следующего механизма раз вития ПОЛ в результате воздействия афлатоксина В1: запуск процессов ПОЛ осуществляется, по-видимому, в результате усиленной работы, ферментов монооксигеназной системы, метаболизируших ксенобиотик. При этом образуется большие количества активных форм кислорода (0|, ВЦ"), способные иницировать цепные реакции окисления липидного компонента мембран обуславливая, тем самым, мембранотокснческое действие указанного агента

Таким образом, интенсивность процессов ПОЛ в значительной мере может определяться скоростью биотрансформации афлатоксина В1 в эндоп-

-И"

лазматическом ретккулуме печени. С другой стороны, в ходе метаболиза-щш ксенобиотика образуются его многочисленные производные, причем некоторые из них приобретает большую химическую активность по сравнению с исходным соединением (например, 2,3-эпоксид афлатоксина В1) и способны реализовывать свои токсические свойства через непосредственное взаимодействие с макромолекулами клетки - белками и нуклеиновыми кислотами (Тутельян Е А., Кравченко Л. В. , 19S5). Степень выраженности токсических или канцерогенных эффектов афлатоксина В1 зависит, таким образом, от многих факторов, имеющих отношение к ыетаболиэации ксенобиотика и интенсивности процесов ПОЛ - в частности, от активности ферментов биотрансформации афлатоксина В1, скорости его метаболиза-ции, соотношения образующихся токсичных, нетоксичых производных и количества активных форм кислорода, а также способов утилизации последних (развитие ПОЛ, гашение антиоксидантами, дисмутация). Практически все представленные выше процессы могут зависеть от качественного и количественного состава пищевого рациона способного, в конечном итоге, существенно изменить резистентность организма к побеждающим эффектам афлатоксина В1.

В условиях скармливания базового рациона (группа ПР) животные оказались высокочувствительными и к токсическому, и канцерогенному действию афлатоксина И. При этом после затравки ксенобиотиком крысы данной группы продемонстрировали резкое повышение микровязкости мембран гепатоцитов (до 176Z к контрольному уровню), накопление в мембранах продуктов ПОЛ (диеновые коньюгаты - до 4207., основания Шиффа - до 257Х), повышение активности СОД в цитозоле печени (до 164Х) и отсутствие изменений со стороны каталазной активности, что в совокупности может указывать на высокую степень развития в данных условиях разру-вапцих последствий липопероксидации, а также, по-видимому, на накопление в клетке перекиси водорода из-за диссоциироьянности взаимодействия СОД и каталазы.

Содержание животных на рационе ECU. г/.юг-ш-нном такими ангиокеи дантами, как витамин Е, селенит натрия и метианин, привело к развитию у животных чрезвычайно высокой чувствительности к токсическому и умеренной - к канцерогенному действию ксенобиотика. При этом у крис данной группы было обнаружено заметное возрастание микроья,-к<>-ти м-мгран (до 133Z) и активности СОД (до 1472), сочетавшихся с самими низкими показателями концентрации изученных п^дуктов ПОЛ ( диеновые коньюга-

ты - до С',42+0,03 нМ/ мг белка, основания Шиффа - до 4,87+0,79 ед. флюоресценции), и отсутствием изменений в активности каталазы. Эти даншй позволяют предположить, что в условиях скармливания рациона ЕСМ вследствие стабилизирующего действия антиоксидантов на липиднум Фаау мембран и торможения в ней процессов ПОЛ сохраняется высокая ак -тивность липид-зависимых мембраносвязанных ферментов метаболизании ксенобиотиков . Указанное обуславливает б свою очередь, высокую скорость биотрансформации анатоксина В1, которая в данном случае происходит, по-видимому, с преимущественным образованием высокореакционных метаболитов, обуславливавших выраженное токсическое действие ксенобиотика. В то же время нельзя полностью исключить высокой значимости повышенной активности СОЛ и отсутствия при этом индукции каталазы з совокупности способствующих, по-видимому, накоплению в тканях перегаси водорода, хотя в данных экспериментальных условиях, а именно, при повышенном поступлении в организм метиснина (донатора -БН -групп) может происходить частичная элиминация последней с покопаю глутати-сн-зависимой антиоксидантной загыты.

Высокая резистентность животных групп Ш и КЯ к токсическому, а также к канцерогенному (группа КЯ) действию афлатоксина В1 сопровождалась в острую стадию отравления ксенобиотиком наименее выраженным повышением у них микроряэкости микросомальных мембран относительно соотв^тстнукеих контрольных значений, а такл? уыеренниым повышением концентрации изученных проду!сгов ПОЛ (диеновых коныогатов и виффовых оснований) и отсутствием резких изменений со стороны СОД и каталазы. Указанное свидетельствует, что ослабление токсических свойств ксенобиотика в д;шных условиях связано, по-видимому, с ограничением развития в ответ на воздействие анатоксина В1 процессов липопероксидации. М_'х.'1низмы т;»кого влияния увеличенного поступления пищевых жиров нуя-даятся в дгиьнейием изучении, однако обнаружение залетных свойств у жиром« компонентов пипи открывает принципиальную возможность целенаправленного повышения с пометь» алиментаршя факторов резистентности организма к действию афлатоксина и других токсических агентов, сходных с ним по механизму реализации токсического и 1 канцерогенного влияния..

Полученные в настоящем эксперименте данные, касаюздеся изменения ряда параметров ПОЛ, не вдавили какой-либо устойчивой зависимости, объясняющей различия в степени чувствительности тавотных к юнцеро-

- (О -

генному процессу в печени. В частности, обнаруженные через б и 12' месяцев от начала эксперимента изменения со стороны ферментов антиокси-дантной завиты (СОД и каталазы) были однотипными у животных как чувствительных, так и резистентных к канцерогенному действию афлаток-сина В1 диетических групп. Этот пример, также как и изменения других параметров ГОЛ, выявленнные в данном исследовании, св&етельствуггг ■ наличии, по-видимому, более ^сложной взаимосвязи м»жд>« скоростью липо-пероксидационных процессов и развитием опухолей, для выявления кото рой необходимо дальнейшее, более комплексное изучение.

ВЫВОДЫ

1. Использованные в настоящем эксперименте рационы питания (ПР -базовый рацион; КЖ - диета с повышенным содержанием кулинарного жира; Ш - с повышенным содержанием подсолнечного масла; ЕСМ - обогащенная витамином Е, селенитом натрия и метионином) без воздействия анатоксина В1 не оказывают существенного влияния на интенсивность процессов липопероксидации (микровязкость микросомальных мембран, концентрацию диеновых коныогатов и оснований Шиффа), а также на активность ферментов антиоксидантной задеты (СОД и каталазы). •

2. Воздействие афлатоксина В1 (однократно в дозе 1,3 мг/кг массы тела) в первые двое суток после затравки приводит к стимулированию ГШ, степень возрастания которого обнаруживает отчетливую зависимость от качественных особенностей питания.

3. В острую фазу интоксикации у животных всех диетических групп (ПР, К*. ПЫ и ЕСМ) происходит увеличение относительно контроля микровязкости микросомальных мембран, степень которой в целом соответствует чувствительности животных к токсическому действию афлатоксина Ь1.

4. В трех диетических группах - ПР, КЖ и ПМ в результате ост[ой затравки афлатоксином В1 имеет место возрастание в печени концентрации диеновых коньюгатов и оснований Шиффа. :.<том степень воз;>астз-ния содержания указанных продуктов ПОЛ имеет тенд^нциг. к ПрОйВЛеНИГ обратной вависимости со степенью резистентности животных к токсич>-е кому действию ксенобиотика.

5. В условиях поступления в организм антиоксидантных ком::он- итгл - витамина В, селенита натрия и метионина - воздействие ксенобиотика приводит к наименее выраженному накоплению в печени продуктов !ЬЛ

6. У высокочувствительных к токсическому действию ксенобиотика i животных диетических групп - ПР и ЕСМ, в результате воздействия афла-

токсина В1 происходит резкая индукция СОД ^ печени, приводящая, пови-I димому, к накоплению в этом органе эндогенной перекиси водорода.

7. Менбранотоксическое действие афдатоксина В1, реализуемое посредством индукции ПОЛ, является, по- видимому, одним из важнейших элементов патогенеза летального действия афлатоксина В1. В условиях

1 повышенного поступления антиоксидантных компонентов чувствительность животных к действию афлатоксина В1 определяется особенностями биотрансформации ксенобиотика и утилизации активных форм кислорода

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Меербекова Н. Т., ЕГай И. С., Колесникова Л. Г., Амиреева Н. Т., Баимбетсва А. М. , Ишмуратова А. Ж. , Божко Д. М. Модифицирующее влияние питания на токсичность афлатоксина В1 //Межреспубл. научно-прак-тич. кснф. "Питание здорового и больного человека ". - Ашхабад. 1989.- С. 83-85.

2. Меербекова Б. Т. , Амиреева Н. Т. , Баимбетовз A. И. , !СГай И. С. , Колесникова Л. Г. . Ишмуратова А. Ж. , Божко Д. М. Некоторые биохимические показатели в условиях качественно различного пнтмния и воздействия афлатоксином ш //Респуб. научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы охраны и укрепления здоровья населения Казахстана". - Алма-Ата. - 1990. - С. 69-72.

3. Bcv'.hko D. М. ,Meerbekova В. Т. . Yugai l.S. , Kolesnikova L. й . h-hmuratova A. Zh. Effect of different r.utnon on aflatoxin B1 'induce>' hepatig carcinogenesis in rat //Конф. молодых ученых с между-нарол участием "Актуальные вопр. нутрициологии". - 1990. - С. 8-9.

4. RcM.o D.M., Tazhibaev Sh. S. , HikovP. S. , bteerbekova В. T., Yu-ai 1.5. , Koles.rukova L G. Dietary rrtxhfication of toxic and с.\rcmögenic effects of aflatoxic B1 //Soviet-American Symposium '(.tost important issues of rodern nutrition science". - Aira-Ata -1990. - P. 14-15.

5. Божко Д. M. , Тажибаев Ш. С. , Белозеров Е. С. , Меербекова Б. Т. , ХЗгай И. С. , Колесникова Л Г. , КямурзтоЕа А. Ж. , Еаямбетова A. Ü Алиментарная модификация токсического эффекта афлатоксина В1 //¡ручная конференция с между народные участием "Питание: здоровье и болезнь".

- г /-

Москва. - 1990.

6. Болко Д. 11, Ников П. С., Белозеров Е. С., Меербекова Б. Т., Кгай И. С., Колесникова Л. Г., Ваимбетова А. Ы., Амиреева Н. Т. Алиментарная модификация канцерогенного действия афлатоксина В1 //Научная конференция с международным участием "Питание: здоровье и болезнь". Москва. - 1990.

- гг.-