Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзотоксина токсического шока Staphylococcus aureus на процессы перекисного окисления липидов в животном организме

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзотоксина токсического шока Staphylococcus aureus на процессы перекисного окисления липидов в животном организме"

( РГ8 00

\\ » ^ ' '«»мйнйстерство здравоохранения

российской федерации ростовский ордена дружбы народов

л^ медицинский институт

V

VI

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

АНТИПОВ Александр Юрьевич

ШМИШЕ ЭКЗОТОКСИНА ТОКСИЧЕСКОГО ШОК Л,

8(арЬ \/!ососсиз аигеив

Ш ПРОЦЕССЫ НЕРЕКМСН0ГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПМДОВ В ЖИВОТНОМ ОРГАНИЗМЕ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОМ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ростов-на- чоиу 1993

Работа выполнена в Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор & П. Шепелев '

Официальные оппоненты: лауреат Государственной премии,

доктор медицинских наук, профессор А. 11 Поверенный,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник 3. К. Мккашинович.

Ведущая организация: Московский государственный

медицинский университет - им. Н. И. Шрогова

Защита состоится " хддз г. в ¿Ёг часов Л

заседании специализированного совета Д. 084-53.01 .при Ростовскс ордена ДрумЗи народов медицинском институте (344718 г. Ростов-к? Лону, пер. Нахичеванский, 29). '

С. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовско! ордена Друггйы народов медицинского института.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Е Я. Корган

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . .

Актуальность проблемы. В последние годи синдром токсического кока (ОТ110 привлекает к себе всё возрастающее внимание иссло-доЕателсй как в нашей стране.'так и за рубежом. К числу основных факторов, обусловивших, значительный подъём интереса к настоящему заболеванию в США и западноевропейских странах, относятся крайне тяжэясе течение СТШ, Бысокая частота детальных исходов при нём в сочетании с отсутствием надёжных методов диагностики и патогенетической терапии CMS.Bergdoll, P. J.Chesney, 1991 j. Синдром токсического шока, этиологически связанный со штаммами Staphylococcus aureus, был выделен в самостоятельную нозологическую единицу С J. К. Todd et al., 1978). и в настоящее время рассматривается исключительно кал отдельное инфекционное заболевание, ведущим Синдромом которого является токсический шок.

Важнейшим патогенетическим фактором СТШ является экзотоксин токсического шока S. aureus ("ЭГЩ>. продуцируемый практически всеми штаммами золотистого стафилококка, выделенными от больных СТШ (M.S. Bergdoll et а!.. 1981; Р, № Schli evert et al. . 1981). Несмотря на то., что воздействием именно данного-токсического продукта S. aureus обусловлены практически все проявления СТШ (Р. М. Schli е-, vert, 1939), многие особенности патогенетических механизмов реализации его токсических проявлений не изучены. 3 полной мере это относится и к биохимическим аспектам патогенеза СТШ

Как известно, евоСоднорадикаяькым процессам принадлежит ведущая роль как в защите организма от повреждающего действия различных чужеродных агентов (в том числе бактерий и токсинав), так и в проявлении токсических свойств многих соединений (¡0. А. Владимиров, А. И. Арчаков. 1972). Показано активирующее влияние различных бактериальных токсинов (как знтеротокоинов, так н эндотоксинов). на перекисное окисление липиЬов (ГОЛ), а'.такта метаболическую активность фагоцитов (-Е. В. Рябиченко, 50t Б. Еэепчук, 153? • 30; S. Sonkare, Т.Pekkanen. 1932; K.3urigino et al. , 108?; A. Kappet al., 1987; S. Muto et al. , 1988).

Очевидно, что участие свободноридшсальных процессов ь нечто' генэзе токсичестого воздействия ЗТШ на организм также мо.ж т Сигь вполне вероятным- Б-доступной литературе .нам удалось найти только одну работу, поовяцениу» иеоледовигшю влиянии ЭТШ на клетки ••

фагоциты (E. M. Berger et al., 1988). Показанное авторами in vitro 'подавляющее влияние ЭТШ на реактивность полиморфнойдерных лейкоцитов свидетельствует о перспективности исследования биохимкчес--них особенностей патогенеза. QTKL -. ~

Целью настоя щ.е го" исследования явилось выявление н^ушейий в процессах перекисного окисления липидов в органах и тканях животных, а также состоянии бйоцидного компонента реактивности поли. морфноядерных лейкотдитов при экспериментальном воздействии экзотоксина токсического" шока S. aureus.

В соответствии с поставленной целью исследования были определены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить-содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и шффэвых оснований) в плазме крови, тканях печени и миокарда.в различные сроки посл^ введения ЭТИ подопытным животным.

2. Изучить активность ферментов систем обезвреживания реак-шюшюсцособных кислородных радикалов и метаболитов (супероксид-дисмутазн и каталазы) и перекисей липидов (глутатионпероксидазы, глутатиокредуктазы и глутатион-З-трансферазы) эритроцитов, печени и миокарда,- в различные сроки после введения ЭТШ.

3. Исследовать биохимические особенности реактивности поли-морфкоядерных лейкоцитов в условиях воздействия ЭТШ как in vivo,. так и in vitro.

4. Обосновать экспериментальным .путём возможность использования в терапии СТШ соединений, оказывающих влияние на свободно-радикальные процессы. .

Научная новизна..

В результате проведенных исследований получены новые' факты, имекяцие .существенное значение для понимания механизма реализации токсических эффектов экзотоксина токсического шока S. aureus.

Бг.ерЕые проведено систематическое исследование динамики образования продуктов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов в условиях воздействия ЗТШ на организм in vivo.

Обнаружено выраженное фазное изменение активности ферментов систем обезвреживания активных форм кислорода (супероксиддисму-тззы и каталазьО и перекисных метаболитов липидов (глутатионпе-•. роксвдазы, глутатион-о-трансферазы и глутатио'">едуктаэы), разно-, направленный характер которого в эритроцитах в инициальный период воздействия ЗТШ указыв&гт ка возникновение дисбаланса в есте-

ственно протекаю®« процессах генерирования и обезвреживания высокоактивных свсбоднорадикальных метаболитов, а также, лониленае эффективности антиоксидантной зашиты.

Показано повышенное накопление в различные фазы воздействия ЗТШ на организм продуктов перекисного окисления (диенових конгю-гатов и шиффовых оснований) в плазме крови, тканях печени и миокарда, что подтверждает развитие в организме комплекса патохими-чёских нарушений, связанных о активацией процессов своСсднсради-кального окисления.

Получены данные, свидетельствующие об ингиОироеакии функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов в условиях воздействия ЗТШ in vitro и in vivo и возможности коррекции возникающих нарушений путём применения прооксидантов, в частности, препаратов антибиотиков антрациклического ряда.

Установлено, что подавление активности метаболических реакций полиморфноядерных. лейкоцитов под действием ЗТШ сопровождается, наряду с выраженным снижением продукции активных форм кислорода, нарушением чувствительности активирующих механизмов к действию свободных ионов кальция.

По результатам проведенных исследований на защиту еыносятся следующие основные положения:

- экзотоксин токсического шока S. aureus вызывает выраженную активацию процессов" перекисного окисления в • органах и тканях тавотных, характер которой свидетельствует о дисбалансе.происходящих в организме сопряжённых процессов образования и обезвреживания реакционноепособных свободнорадикальных соединений и понижении эффективности механизмов антиоксидантной защиты; .

- наблюдающееся в условиях воздействия экзотоксина токсического шока S.aureus как in vitro, так и in vivo подавление био-цидного компонента реактивности полиморфноядерных лейкоцитов сопровождается выраженным уменьшением генерации активных форм кислорода и обусловлено снижением чувствительности механизмов регуляции активности клеток к действию свободных ионов кальция;

. , - применение прооксидантов и, в частности, антибиотиков аи-трацкклического" ряда, являющихся индукторами свободкорздикальных процессов, приводит к подавлению токсических эффектов экзотоксина токсического иска S. aureus.

■ Научно - теоретическая и практическая значимость работы за-

ключается в.экспериментальном подтверждении существующих в-литературе предположений о значительной роли процессов свободноради-кального окисления, в том числе ПОЛ, в реализации некоторых токсических эффектов бактериальных токсинов и, в частности, экзотоксина" токсического шока S. aureus. . .

* Представляют теоретический' интерес результаты изменил влияния Э'Ш на функциональную активность полиморфнсядерных лейкоцитов, свидетельствующие о подавляющем его действии на образование важнейших биоцидных продуктов фагоцитов - активных форм кислорода вследствие ингибируквдего воздействия на естественные механизмы регуляции функционального состояния клеток и позволяющие рассматривать с новых позиций возможные механизмы патогенетического действия бактериальных энтеротоксинов.

Получены данные, позволяющие рекомендовать применение некоторых лекарственных: средств, обладающих прооксидантным действием ( в частности, антрациклических антибиотиков), для коррекции воз- -никающих при синдроме токсического шока патологических изменений з функциональном состоянии органов и систем больного.

В ходе' работы продемонстрирована возможность применения хе-милюминесцентного метода исследования для оценки активности бактериальных экзотоксинов, проведено сравнительное изучение эффективности предлагаемого метода-и обычных методов определения, основанных на использовании биологических моделе'й.

Апробация работы. • ■ ' .'. '

Основные положения работы доложены на заседании Ростовского отделения Российского биохимического общества (Ростов"н/Д, 1992)' и научной конференции "День науки" студентов, молодых учёных и специалистов РОДНШ ( Ростов н/Д, ' 1992). . '-

. . Публикация материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 4 научных работы, ira них 1 в зарубежной печати. '

•Структура и объем работы. ! . .

• Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами,. 14 рисунками и 4 схемами. Работа состоит из введения, обзора литературы в трёх главах, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов, списка литературы, включающего 24 отечественных и 198 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Продуцентом токсина служил эталонный штамм Staphylococcus aureus FRI-H69. 'Выделение и очистку ЭТШ проводили методом С. И. Текутьева, Н. В. Каркицкой,- 1889.

Для изучения влияния экзотоксина токсического шока S. aureus на содержание продуктов ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов эритроцитов, тканей печени к миокарда в опыте in vivo препарат ЭТШ вводили подопытным животным внутрибрюшинно в дозе, соответствующей найденной ранее по способу Спирмена-Кербера величине LD(50). Животным контрольной группы тем же способом вводили соответствующий объем физиологического раствора. Животных забивали декапитацией. Производили забор-крови (е добавлением 3% раствора цитрата натрия), тканей печени и миокарда. Обработку биологического материала производили при температуре не выше + 5е С. С це-• лью дальнейшего пересчета показателей содержания продуктов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов в органах и тканях животных определяли со держание в биологическом материале белка (О, Н, Lowry et ai., 1951), общих липидов (D. D. Woodman, C.P.Price. 1972), гемоглобина (унифицированным гемоглобинцианидным методом).

Содержание в плазме крови шиффовых оснований (ШО) определяли флхюриметрически (B.Fletcher et al.. 1973), диеновых конъюга-тов (ДЮ в плазме -крови и гомогенатах тканей - спектрофотометри-чески (R.'O. Recknagel, А. К. Choshal, 1966).

Активность каталазы (FAT) лпределяли по скорости утилизации перекиси водорода (R. F. Beers, I. W, Stzer, 1952), супероксиддисму-' тазы (СОД) - по. ингибкрованию восстгновления тетразолия нитроси-. него супероксидным анион - радикалом (М.Nlshtkimi et al., 1972). Об активности глутатионпероксидазы (ГП) судили по скорости накопления окисленного глутатиона (Е. Berschneider, J.Ruben, пат. ГДР 210983), глутатионредуктвзы (ГР) - по скорости окисления восстановленного НАДФ (R. Е. Pinto , W. Bartley, 1969), глугаткон-Б-транс-фераэы (ГТ) --по скорости накопления конъюгата 1-С1-2,4-динитро-бензола с восстадовленным глутатиском (W. Н. Habtg ot al., 1974).

. Состояние реактивности полиморфно(ядерных лейкоцитов периферической крови изучали хемилюминесценткым (ХЛ) методом, в качестве объекта исследования брали цельную кровь. Регистрировали как спонтанную хемилюминесценцию, так и ХД-ответ клеток на опсонйзи-

роьанныП зимозан и кальциевый ио'нофэр А 23187.

Определение проводили'методом H.Faden, Ni Maciejewski.' 1981, К. Yan Dyke, С. Van-Dyke, 1986, используя разведение крови 1 : 50, обеспечивающее (R.O.Allen, 1988) нивелирование ингиби; >вания хе-милюминесцептного ответа плазмой крсви. Для постановка опытов in vivo взятие крови проводили 'как до внутрибрюшинного введения ЭТШ в дозе Lü(50), так и через 45 мин, 3 ч и 6 ч после введения токсина К полученной крови добавляли гепарин. (15 ед на 1 мл).

Опыты in vitro ставили на цельной крови ..чтактных животных. Проводили инкубацию крови в растворе Хеикса (pH 7,4) без фенолового красного (соотношение объёмов крови и раствора Хенкса 1:4), добавляя -ЭТШ до. конечной концентрации от 3 до 100 мкМ. Инкубацию проводили при 37° С в течение 120 мин, отбирая пробы для хемилк>-шнесцентного анализа через 5 um-, 15 мин и 45 мин с момента начала инкубации. ' .

. Влияние антиоксидантов (альфа-токоферола и каталазы) и про, оксидантов. (адриабластина) на токсические эффекты ЭТШ исследовали в опытен in vivo. Растворы указанных соединений вводили живот-' ним подопытной группы внутрибрюшинно сразу после введения аналогичным способом препарата ЭТШ в дозе LD(50) (токоферол - 1 мг/кг кассы тела, катадазу - 40000 ед/кг, адриабластии - 1 ыг/кг). Животным. контрольной группы вводили только препарат ЭТШ. Проводили взятие кроЁи в указанные выше сроки для хемилюминесцентного анализа. Летальность животных подопытной и контрольной групп регистрировали через 24 ч, 48 ч, 72 ч ji 7 суток после введения токсина и определяли наличие корреляционной связи между выживаемостью животных.после введения ЭТШ и использованием•анти- и прооксидак-тов. ' .

• Статистическую обработку экспериментальных данных проводили' общепринятыми методами (Г. Ф. Лага«, 1990).

О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и подопытной групп судили по величине 17«ритерия Отьюдента после проверки распределения-в группах на-нормальнрсть. Наличие корреляционной связи между признаками оценивали методом параме-тричес-. ¡ый и нэпяраметрической корреляции. '. .

Результаты и их обсуждение. Изучение биологической активности, а также степени чистоты полученного препарата ЭТШ показало,' •ко использованные методы выделения, й очистки позволили получить

вьюокоочищэнный препарат, обладающий полноценными биологическими свойствами.

Влияние ЭТШ на динамику процессов ПОЛ з организме до настоящего времени практически не изучено. В нашей работе было исследовано влияние ЭТШ на содержание продуктов ПОЛ - диеновых конъх>-гатов и шиффовых оснований - и активность ферментов, участвуют, в обезвреживании активных Форм кислорода и гидроперекисных метаболитов липидов в крови, печени и миокарде в различные сроки после внутрибрюшинного введения ЭТШ экспериментальным жквотнмм.

В плазме крови' отмечается повышение уровней диеновкх коггь»-гатов (153,6%) и шиффовых оснований (335,3% по отношению к контролю) "'-пез 45 мин о момента введения ЭТШ (рис. 1), однако через б ч оба'показателя практически .возвращаются к норме. В ткани .печени наблюдаемое через 45 мин после введения ЭТШ накопление диеновых конъюгатов сохраняется и через б ч (193,1% и 192,0% по отношению к контролю соответственно). В миокарде как через-45 мин,' так.и через б ч с момента введения ЭТШ уровень диеновых конъюгатов несколько ниже нормы (соответственно 68,8% и 70,3%).

• Данные. демонстрирующие динамику активности ан^иоксиднктных ферментов эритроцитов, представлены на рис, 2. Отмечается выраженное повышение активности супероксиддисмутаэы через 45 мин после введения ЭТШ (178,2% по отношению к контролю), сменяющееся к б ч достаточно показательным снижением, и прямо противоположная динамика активности глутатион-й-трансферазы, - статистически достоверное угнетение активности в инициальный период действия ЭТШ (73,3% по отношению к контролю) сменяется некоторой активацией.

Кроме того, наблюдается' некоторое снижение активности ката-лазы на протяжении всего времени эксперимента.

Результаты исследования динамики активности антиоксидантных ферментов тканей печени и миокарда представлены на рис. 3. Отмечается существенное изменение активности глутатион-3-транс5*?рв?ы тканей. Вуражен'ное статистически достоверное ингабироведие 'чего фермента в печени отмечается как через 45 мни, так и черел 6 ч с момента введения ЭТШ (50,7% и 47,5% по отношения к контроле).

Показательна инактивация глутатионредуктазы через б ч иг,еле введения ЭТШ. наблюдаемая как .в печени (45,9%), так и в миокарде (75,6%). .

. Представленные нами данные можно интерпретировать слеяухгцим

Рис. 1 Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови, • тканях печени и миокарда (в % по отношению к контролю) через 45 мин (1) и б ч (2) после введения .ЭТИ ' й - диеновые конъюгаты, Щ - виффовы основания. К - контроль, всех показателей, и - р < 0. ОЬ в сравнении с" контролем. '

Рис. ?. Активность антиоксидантных ферментов эритроцитов (в X по отношению к контролю) через 45 мин (1) и 6 ч (2) иоеле введения ЭТИ КАТ - каталаза, СОЛ - супероксиддисмутаза, ГР - глу-татконредуктаза, ГТ - глутатион-Б-трансфераза. К - контроль всех показателей. # - р < 0.05 в сравнении о контролем.

образов Отмеченные изменения активности антиоксидантных ферментов демонстрируют происходящие в организме под влиянием экзотоксина токсического шока S. aureus' нарушения эффективности защитных механизмов, в норме обеспечивающих равновесие между 'продукцией и обезвреживанием високореакционноспссобных радикальных продуктов, .что неизбежно приводит к повышенному накоплению в органах и тканях метаболитов перекис них процессов. Отмеченное в различные периоды воздействия ЭТИ! накопление продукта ПОЛ - шиффовьп: основа-, mtft - в плазме крови и ткани печени свидетельствует с» зовлечешж 35 процесс белков и липидов организма sa счёт их взаимодействия с активными свободнорадикальными продуктами.

Наблюдаемый дисбаланс активностей ферментов, основной задачей которых является обезвреживание кислородных радикалов, и ли-попероксид - метаболкзирухщих.ферментов (пример - СОД и ГТ эритроцитов в наших опытах) также свидетельствует о понижении эффективности ферментативной зашиты - выключение одного из этапов ан-тиоксидантной защиты•неизбежно приводит к нарушению функциональной полноценности системы в целом. Ингибирование глутатионредук-тагц в печени и миокарде к 6 ч после введения ЭТШ может-привести к быстрому расходованию запасов восстановленного глутатиона, необходимого для нормальной работы других глутатион-зависимых ферментов (С. F. Nathan et а]., 1981). Кроме того, разобщение функционирования СОД и каталазы (показанное нам: в эритроцитах) приводит к-накоплению перекиси водорода, способной при распаде продуцировать гидроксильный радикал. Последний, как известно, облада-. ет наивысшей в сравнении с другими кислородными радикалами реакционной способностью у, соответственно, таким же высоким повреждающим действием (В. S,'Van Asbeck, 19SÖJ.

Метаболическая перестройка стимулированного Нолиморфноядер-ного лейкоцита является одним из ведущих проявлений . его реактивности наряду с такими известными феноменами, как.миграция, адгезия, поглощение, формирование пищеварительных вакуолей и другими (А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский, 1989). Весьма показательным является изменение скорости кислородного'метаболизма, в частности, образования реакциокноспособных биоцидных продуктов. Полагают, что важнейшим биоцидным фактором лейкоцита является активный метаболит перекиси водорода, образуемый в присутствии галогенидов мие-лоперокоидазой - ион гийогалогенита, .в частности, гипохлорит.

200 ; 150 • 100 • 50 -

К

1

т

# р

D

да

1

1 Г*

№ / F w

Uí

КАТ

L¿

11

tf 2

JU ra

- # i # if 1 И

i RS-IÍM

ГР

ГТ

Рис. 3 Активность антиоксидантных ферментов печени и миокарда (в X-по отношению к контролю) через 45 мин (1) и 6 ч (2) после введения ЭТШ. КАТ - каталаза, ГП - глутатионпероксидаэа. РР - глутатионрэдуктаза, ГТ - глутатион-З-трансфераза. в - печень, В'-.миокард. К - коятроль всех показателей. # - р < 0.05 в сравнении с контролем.

Рис. 4 Спонтанная хемилюминесценция клеток цельной крови и ХЛ - ответ на опсснизиоованный эимозан и кальциевый ионофор (в 7. по отношению к контролю) через'45 мин (1), 180 мин (2) и 360 мин (3) после введения ЗТШ в опыте ir. vivo. К - контроль -всех показателей. # - р < 0.05 в сравнении с контролем..

Компоненты, ссставляюзде эффэкторнсе звено цитотоксичнооти, описаны S, J. Klebanoff, R. X. Clare, 1976. Наша работа демонстрирует влияние-ЭТШ in vivo и in vitro на базальный кислородный метаболизм- полиморфноядерных лейкоцитоз (показатели спонтанной хеш-люминесценции) и состояние реактивности клеток (хемилвмигесцент-. ные ответы клеток на опсонизированнь,й зимоган я кальциевый ионо-фор А 2318?, выступаиз!" в ютсстиз. сти^'латорзв).

' Полученные данные о влиянии ЭТШ па хешлхминесцокцип ¡слеток цельной крови in vivo представлены на рис. 4. '

Уже через 45 Mi после введения токсина подопытным животным практически все показатели хемилюминесценции (спонтанная ХЛ, ответы на споонизированный'зимозан и кальциевый ионофор) "иже, чем в контроле. В отличие от спонтанной хемилюминесценции, показатели которой несколько нормализуются к 6ч после введения'токсина, способность лейкоцитов к ответу па стимуляцию ещё более 'снижается, хотя и наблюдается незначительный всплеск активности к 3 ч с момента введения ЭТШ. Аналогичные данные об ингибирующем влиянии ЭТШ на хемилюминесценцию полиморфноядерных лейкоцитов получены н в опытах un vitro, причём выявлена лилейная зависимость величин XJI-ответа на стимуляторы от концентрации токсина в среде инкубации (величины коэффицентов линейной корреляции составляют -0,999 для опсонизирдванного Бимоэана и -0,992 для кальциевого ионофора А 23187). Также продемонстрирована линейная зависимость спонтанной- ХЛ от концентрации токсина.

Зависимость указанных показателей ХЛ от времени инкубации о ЭТШ носит нелинейный характер - наибольшая скорость подавления и спонтанной, и индуцированной хемилюминесценции наблюдается в течение первых 5 мин инкубации с токсином.

.Таким образом, нашими исследованиями продемонстрировано' непосредственное угнетающее действие экзотоксина токсического шока S.. aureus на биоцидный компонент реактивности лейкоцитов.

О учётом способности экзотоксина токсического шока S. aureus стимулировать синтез монокиноь (Т. Ikejima et al. , 1984, 1988), а также имеющихся в литературе данных о подавляющем воздействии их на пслшсрфноядерные лейкоциты (D. J. Fast et al. , 1989), допустимо предположить, что в условиях организма воздействие ЗГИ! приводит к глубокому-угнетению функциональной активности ф^уодатирую-2|jix йлеток пак вследствие непосредственного его воздействия, так

и опосредованного.

: Достаточно сложным вопросом является интерпретация полученных наш данных. Как известно, использованный нами в экспериментах кальциевый ионофор А 23187 является, элементарным, не образующим каналов в плазматической мембране клетки подвижным переносчиком, не изменяющим мембранного потенциала - на каждый вводимый нонофором в цитоплазму ион кальция им же выводится два протона и суммарный заряд как цитоплазматичес'кой, так и наружной поверхностей мембраны клетки не изменяется. С учетом выра;кенной гидрофо-бности ЭТШ можно было бы предполагать возможность изменения мембранной структуры лейкоцитов, приводящего к снижению проницаемости естественных кальциевых каналов. Данное' предположение, в сочетании с общепризнанной ролью свободных ионов кальция, как универсальных/вторичных посредников, или мессенджеров (А. Н. Маянский и ДЕ№йнский, 1983), могло бы объяснить наблюдаемые нами изменения реактивности фагоцитирующих клеток. Однако, наш зарегистрировано снижение ХЛ-ответов полиморфноядерных лейкоцитов как на 03 (связывание комплемент -.адсорбирующих частиц которого с мем-' бранными рецепторами клетки приводит, в конечном итоге, к открытию кальциевых каналов), так и на ионофор А 23187, следует отказаться от привлекательной на первый взгляд гипотезы об изменении плазматической мембраны под действием ЭТШ. Представляется крайне маловероятным, чтобы внедрение молекулы токсина в плазматическую мембрану настолько сильно изменило её свойства, чтобы функционирование естественных ионных каналов (не прекращающих работу даже при воздействии низких температур) стало навозможным. Транспорту ионов кальция в цитоплазму ЭТШ, вероятно, не препятствует. Вместе с тем-однозначно отрицать возможность мембранных эффектов ЭТШ не представляется возможным. Вполне-вероятно, к примеру, что иод действием токсина нарушается самосборка эффе-'орного каскада образования высокоактивных бяоциднЫх веществ, индуцируемая воздействием на клетку фагоцита какими -либо стимулами. . ■ : Как известно, начальным звеном образования биоцидных активных форм кислорода в фагоцитирующей (слетке является восстановление-молекулярного кислорода НАДФН - оксидазой с образованием су-перокекдного анион-радикала (А.Н.Маянский, Д.Н.Маянский, 1989) 1 последующей редукцией израсходованного НАДФК в реакциях гексозо-мснофоефагкого г?укта (ГШЩ, эффективность которого резко возра-

стаэт при индукшш респираторного взрыва вследствие стимулирования клетки. Активация НАДФН - оксидазы может, клк известно, осуществляться дзумя основными путями - с помошью протеинкинаэы С и комплекса гальция с кальмодулином. Свободные-ионы кальция необходимы в обоих случаях. Условно второй, кэльмодул/новый путь активации можно считать более быстрым. Реализация его практически происходит в одну стадию, не требует присутствия в каскаде ысти-вацил каких-либо дополнительных вэиеств (например, фоо^нтилилов-рина,- необходимого в первом 'пути на этапе активации протеинкина-зы С). Именно второй вариант активации НАДВД-оксидази задействован при стимуляции полиморфноядёрнмх лейкоцитов.опсонизированным зимозаном и кальциевым ионофором А 23187. Представляется вполне вероятной возможность подавления какого-либо этапа активации под действием ЭТШ либо непосредственно, либо же с использованием естественных деактивируюших механизмов регуляции.

Другим еозможным механизмом ингибирования хемилюминесценции лейкоцитов может являться активация аденилциклалы. Исследованиями Я II Шерстнееа, 1990, показано снижение хемилюминесцснтных ответов клеток цельной крови на опсонизировачныД сульфат бария при цоздействин бета-адреномиметиков. Отмечаются (ор. с1Ь) три возможных механизма подавления хемилюминесценции - вследствие ингибирования под действием цЛМФ системы транспорта кальция, ингибирования фосфолипазы С или (в качестве дополняющего механизма) стимуляции гликолиза (и тем самым выключением гексоэомонофосфатного шунта). .По нашему мнению, в том случае, если ЭТШ реально вызывает активацию аденилциклазы в клетке, наибольшее значение для реализации описанного влияния его на хемилюминесценцию имеют именно последние два механизма.. Участие первого (кальций - опосредованного) пути подавления ХЛ лейкоцитов представляется маловероятным в нашем случае (т.к. даже при очевидно избыточном поступлении кальция в клетку при использовании кальциевого ионофора развивающийся ХП-ответ лейкоцитов намного ниже контрольного). Веро-. ятно, второму механизму может принадлежать больная роль в реализации подавления хемилюминесценции. О возможном участии в процессе третьего, дополнительного механизма, говорят данные (цит. по _ А. Н. Ыаянскому, Д. Н. Мачнскому. 1989) о незначительной способности незрелых лейкоцитов костного моэга (в которых практически отсутствуют реакции ГШЩ к хемилюминесценции. Разумеется, необходимо

экспериментальное подтверждение предлагаемых механизмов.

Предполагая возможность уме:гыпения токсического влияния ЭТШ in vivo и коррекции патохимических нарушений при введении местным соединений, проявляющих анти- или прооксидантную активность, мы исходили из полученных ранее результатов об активирующем влиянии ЭТШ на процессы ПОЛ в масштабе целого организма и, вместе о тем, о подавляющем его влиянии на продукцию биоцидных соединений полиморфноядериыми лейкоцитами. .

В серии опьггов по изучению влияния анти- и прооксидантов на выживаемость подопытных животных при введении ЭТШ нами было проведено испытание альфа-токоферола к каталазы (как веществ антио-ксидантного действия), а также представителя группы антибиотиков антрациклического ряда - адриабластина (как прооксиданта).

Полученные наш данные о влиянии анти- и прооксидантных ве-CseoTB на выживаемость подопытных животных при введении ЭТШ представлены на рис. 5.

На протяжении всего эксперимента показатели летальности животных контрольной группы (получивших только дозу ЭТШ) были достоверно выше соответствующих по1сазателей в группе подопытных животных, получивших наряду с дозой ЭТШ адриабластин. В то же время летальность подопытных животных, получивших наряду с токсинов каталазу и токоферол, практически не .отличалась от летальности е контрольной группе. Таким образом, лишь для прооксидантного соединения - адриабластина - нами .было показано .протективное действие по отношению к выживаемости-подопытных животных.

С целью выявлений изменений функциональной активности поли-морфноядерных лейкоцитов под влиянием адриабластина осуществлял! взятие крови у животных контрольной группы и подопытных животны: (получивших антибиотик) через 45 мин, 180 мин и 360 мин С момен та ¿ведения ЭТШ и осуществляли регистрацию спонтанной и стимули рованной опсонизирозанным зимозаном хемилюминесценции.

На рис. 6 представлены полученные нами данные. Как видно, группе животных» получивших наряду с ЭТШ дозу адриабластина, от кечаегся весьма выраженное повышение уровня спонтанной хемилвми несценции, многократно превышающего даже аналогичный контрольнь показатель.

Особенно выражено.повышение спонтанной ХЛ через 45 мин пос ле введения адриабластина и ЗТШ. -в дальнейшем отмечается понижи

2 -

Рис. 5 Влияние анти- и прооксидантов на зыхиваемоеть подопытных животных в условиях воздействия ЭТШ in vivo. К - контроль (животным вводили только ЭТШ) , АДР - животные, полупившие наряад с ЭТШ адриабластин, КАТ - каталазу, ТОК - токоферол. I? - количество выживших особей через 24 ч (1), 48 ч (2), 72 ч (3) и 7 дней С 4) после введения ЭТШ.

%

200 200 100

''¡2 F

tt

Щ.Л 3 3

..• Г -1 - с » '!i»o

спонтанная ХЛ

ствет на эимозан

Рис. G Спонтанная хемилюминесценция клеток цельной крови и максимум ХЛ - ответа на опеонизированньй-зимозан в условиях воздействия ЭТШ in vivo (3) и при одновременном введении адриаблас-тина (.Е). - до введения ЗТШ (1), через 45 мин (2), 1Б0 мин (3) и 350 мин (4) после введения ЭТШ. # - р < 0.05 в сравнении с контролем. ;

иие данного показателя. Несколько иная закономерность наблюдается б изменении величины хемилюминесцентиого ответа лейкоцитов на опсонизированный зимовал. Наблюдаемое снижен ■ .ответа лейкоцитов 'крови подопытных животных (через 45 и 180 мин после введения ад-риабластина и ЭТШ) сменяется подъемом к шестому часу, в то время как величина соответствующего показателя контрольной группы снижается ещё более выракенно. Таким образом, наблюдается тенденция к нормализации обоих показателей к б ч после введения адриаблас-тина в сочетании с ЭТШ.

представленные данные свидетельствуют о том, что применение антрацшслйческих антибиотиков способствует понижению токсических эффектов ЭТШ, что позволяет рекомендовать использование препаратов данной группы в терапии СТЕ .

• ВЫВОДЫ

1. Ведущая роль в активации процессов перекисного окисления лиаидов в эритроцитах принадлежит возникающему под действием эк-. зотокеиьа токсического шока S. aureus дисбалансу в работе ферментов систем обезвреживания активных форм кислорода (СОД и катала-вы) и гидроперекисей липздов (глутатион-З-трансферазы). Разнонаправленное изменение активности СОД и каталазы, а также СОД и ГТ свидетельствует о значительном понижении эффективности антиокск-данткой защиты в эритроцитах.

2. Наблюдаемое в условиях воздействия ЭТШ in vitro и in vivo угнетение продукции активных фо$м кислорода нолиморфноядерны-ми лейкоцитами обусловлено снижением чувствительности регулятор-ных клеточных механизмов к действию свободных ионов кальция.

3. Препараты прооксидантного действия (антрациклические антибиотики) нивелируют■токсическое действие ЭТШ in vivo.в результате индукции свободнорадикальных процессов а организме, что позволяет рекомендовать использование лекарственных средств данной' группы в терапии СТШ.

4.. Результаты исследований свидетельствуют о развитии в организме пед влиянием экзотоксина токсического шока S. aureus комплекса биохимических нарушений, важнейшими проявлениями которого являются изменения в интенсивности процессов свободнорадикалыю-

го окисления.

5. Подавляющее действие экзотоксина токеичеощл о шна 5. aureus на продукцию свободкорадикальных соединений in "it-.ro послу• шло основой использования хемилюминесцентного метода исглодсла ния для определения активности ЭТЩ.

список. оь'Увлтоеднннх работ

1. Некоторые аспекты патогенетического действия экзотоксина токсического шока S. aureus -/Текутьев С. И., Шепелев А. П. / - Известия Северо-Кавказского научного центра высшей школы. Естественные науки. - 1991. - 3. - С. 124 - 130.

2. Влияние экзотоксина токсического шока S. aureus на процессы пе'рекисного окисления липидов в эксперименте. - Анн. докл. 46 - й итоговой научней конференции студентов, молодых уч^кых и-специалистов РОДНМИ. 1992г. - Ростов-на-Лону. 1992. - С. 32.

3. Экспресс-способ определения активности бактериальных токсинов (приоритетная справка N5063179/14. 1992г.) /Поляков R U. , Текутьев С. И... Андрусенко iL Т. , Шепелев A. IL /.

Л. The effect of Toxic Shock Syndrome Toxin - I on the wticle blood chemiluminescence in vitro and" in vivo /Shepe'ev A. P. , Po-lyakov V.M./. - /International conference on critical aspects of free radicals in chemistry, biochemistry and rosdicine. Fßbruavy 14th - 17th, 1903, Veinna - -Austria/. - Vienna. 1993. - P.

Почать офсе гяая

Формат uyMi,ru 00\8 4 Тираж 100. JAK'V3 7 8 1A.02, AO Лтомкотломаш,