Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система антиоксидантной защиты и иммунобиологический статус у животных при распространенном перитоните

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Система антиоксидантной защиты и иммунобиологический статус у животных при распространенном перитоните"

На правах рукописи

ЧМЫХОВА Анастасия Николаевна

СИСТЕМА АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У ЖИВОТНЫХ ПРИ РАСПРОСТРАНЕННОМ ПЕРИТОНИТЕ

03.01.04 - биохимия

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Курск - 2014

2 г МАП 2014

005548461

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

Научные руководители: Доктор биологических наук

Лртюшкова Елена Борисовна

Заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор биологических наук, профессор Сеин Олег Борисович

Официальные оппоненты: Фурман Юрий Васильевич, доктор

биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО КИСО (филиал) РГСУ, заведующий кафедрой истории, теории и технологии социальной работы

Лебедева Марина Георгиевна, кандидат ветеринарных наук, ОБУ «Станция по борьбе с болезнями животных (СББЖ) Курского района», руководитель

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт патологии,

фармакологии и терапии» РАСХН

Защита диссертации состоится «27» июня 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» (305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70. Тел. (4712) 53-13-30, факс (4712) 58-50-49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» и на сайте www.kgsha.ru.

Автореферат разослан <хк£у> ОмЛг£е££2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Рыжкова Галина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Согласно современным исследованиям тяжелый распространенный перитонит сопровождается развитием системной воспалительной реакции, а также активацией целого ряда факторов, влияющих на характер течения и исход заболевания, важное значение среди которых имеют активация процессов свободнорадикального окисления, нарушение синтеза оксида азота, выброс значительного количества медиаторов воспаления, повреждение сосудистого эндотелия, нарушения микроциркуляции (Савельев B.C., Петухов В.А., 2012; Ермола Ю.А., Кубышкин A.B., 2012; Ашрафов P.A., Лычкова А.Э., 2012; Блинков Ю.Ю., 2012; Суковатых Б.С. и др., 2011; Фролова О.Г, 2011). Возникающий дисбаланс усиливает деструктивные процессы в паренхиматозных органах и, как следствие, приводит к прогрессированию полиорганной недостаточности.

Выполненные на сегодняшний день клинические исследования не позволяют сделать однозначные выводы о целесообразности применения в комплексной терапии распространенного перитонита только лекарственных средств с антиоксидантным действием. Последние десятилетия ведутся поиски природных веществ, связывающих активные формы кислорода. Перспективным представителем данного направления является дигидрокверцетин (3,5,7,3',4'-пента-гидроксифлаванон), антиоксидант из лиственницы, антиоксидантная активность которого превосходит антиоксидантный эффект кверцетина, рутина и бета-каротина (Потапович А.И., Костюк В.А., 2003; Кравченко Л.В. и др., 2005; Бабкин В.Н., 2011). Прямая антирадикальная активность ДГК осуществляется преимущественно за счет взаимодействия с липидными радикалами или супероксидными анионами. В результате многоплановых исследований с использованием различных модельных систем установлено, что ДГК ингибирует свободнорадикальное окисление как водорастворимых (люминол), так и жирорастворимых субстратов (липиды липосомальных и микросомальных мембран). При этом, ДГК может действовать как ловушка активных форм кислорода, хелатор металлов с переменной валентностью или обрывающий цепь агент (Щукина О.Г. и др., 2008; Бабкин В.А., 2011; Deng W., Fang X., Wu J., 1997).

В настоящее время опубликованы работы, свидетельствующие о том, что на всех стадиях перитонит протекает на фоне иммунодефицита, а в терминальной стадии (полиорганной недостаточности) этот дефицит наиболее выражен, возможность выведения из которого в значительной степени определяет успех их лечения (Станулис А. И., Гришина Т.И. и др. 2002; Сухоруков А.Л., 2005; Алешин Д.А., 2009). Учитывая это, одной из важных задач экспериментальных исследований является изучение комбинированного применения дигидрокверцетина и отечественного синтетического иммуномодулятора Галавита®. Галавит® является 5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевой солью, которая известна в качестве противовоспалительного и иммуномодулирующего препарата (Добрица В.П., Ботерашвили Н.М. и др., 2001; Донцов В.И., Подколзин A.A., 2001; Коробкова Л.И., Вельшер Л.З. и др., 2004).

Таким образом, наиболее актуальным в настоящее время является внедрение эффективных и патогенетически обоснованных методов антиоксидантной терапии и иммунокоррекции при распространенном перитоните. В этой связи определенный интерес может представлять изучение возможности коррекции системной воспалительной реакции при перитоните путем применения антиоксиданта из лиственницы — дигидрокверцетина и иммуномодулятора Галавита® в качестве дополнения к стандартной терапии при распространенном перитоните.

Цель исследования. Изучение антиоксидантного и иммунобиологического статуса у животных при распространенном перитоните на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина.

Задачи исследования.

1. Оценить изменение параметров оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и конечных стабильных метаболитов оксида азота на фоне введения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® при моделировании распространенного перитонита.

2. Дать оценку иммунобиологического статуса при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом®.

3. Изучить эффективность применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® при микроциркуляторных нарушениях в стенке тонкой кишки крыс, вызванных моделированием распространенного перитонита.

4. Изучить органопротективную активность природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® по результатам морфологических исследований при моделировании распространенного перитонита.

5. Оценить влияние природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® на показатель общей летальности крыс при моделировании распространенного перитонита.

Научная новизна. На основании комплексных исследований впервые изучен антиоксидантный и иммунобиологический статус при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом®. 4

Впервые экспериментально обосновано применение природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в качестве дополнения к стандартной терапии распространенного перитонита. Монотерапия дигидрокверцетином способствовала эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки крыс, нормализации биохимических маркеров свободнорадикального окисления, снижению провоспалительных цитокинов, повышению антиоксидантной системы защиты и иммунобиологического статуса, а также восстановлению ЫО-продуцирующей функции эндотелия. В ходе проведенного исследования выявлена органопротективная активность дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в сторону регресса гистоморфологических изменений изучаемых внутренних органов и признаки стимуляции лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке.

В работе впервые предложен эффективный способ комбинированного лечения экспериментального распространенного перитонита с использованием природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг с иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг и антиоксидантного препарата Мексикор® 60 мг/кг с иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг. Изучение оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, ЫО-продуцирующей функции эндотелия, а также уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки и морфологических изменений внутренних органов крыс обнаружили выраженный сопоставимый фармакологический эффект исследуемых комбинаций. Применение комбинаций способствовало более раннему восстановлению нарушенных биохимических показателей и микроциркуляции до уровня интактных животных по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином 7,7 мг/кг.

Эффективность проводимой терапии была подтверждена результатом оценки уровня общей летальности экспериментальных животных. Впервые отмечено снижение общей летальности с 62% в группе с распространенным перитонитом до 26% на фоне введения комбинации дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг; до 32 % на фоне введения дигидрокверцетина 7,7 мг/кг и до 34% на фоне введения комбинации Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг.

Теоретическая и практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции распространенного перитонита природным антиоксидантом дигидрокверцетином, антиоксидантным препаратом Мексикор®, а также комбинациями дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит® и препарата Мексикор® с иммуномодулятором Галавит®. При этом преимущество дигидрокверцетина перед препаратом Мексикор® выявлялось как при монотерапии, так и в комбинации с иммуномодулятором Галавит®.

По результатам исследования нами получено, что наибольшему снижению процента общей летальности крыс сопутствовала более эффективная коррекция оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, КЮ-продуцирующей функции эндотелия, восстановление микроциркуляторных нарушений в стенке тонкой кишки и

морфологических изменений, развившихся на фоне моделирования распространенного перитонита.

С практической точки зрения результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что из числа испытанных препаратов предпочтение следует отдавать тем препаратам и комбинациям, которые оказали существенное влияние на снижение общей летальности крыс в ходе выполненного эксперимента.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания природного антиоксиданта дигидрокверцетина, а также комбинаций дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит® и антиоксидантного препарата Мексикор® с иммуномодулятором Галавит® в качестве дополнительной терапии к общепринятым хирургическим и фармакологическим методам лечения распространенного перитонита.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся обоснования эффективности фармакологической коррекции природным антиоксидантом

дигидрокверцетином оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и ЫО-продуцирующей функции эндотелия включены в состав документов, поданных на регистрацию в ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора. Получено свидетельство о государственной регистрации на биологически активную добавку к пище, содержащую 257,0±25,0 мг/мл дигидрокверцетина в глицерине №1Ш.77.99.11.003.Е.003227.04.13 от 24.04.2013 г.

Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры терапии и акушерства ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова», в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии и при выполнении экспериментальных исследований в НИИ экологической медицины ГБОУ ВПО КГМУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут, препараты Мексикор® 60 мг/кг/сут и Галавит® 8,6 мг/кг/сут оказывают корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и N0-продуцирующую функцию эндотелия на фоне моделирования распространенного перитонита, наиболее выраженный протективный эффект получен при комбинированном введении дигидрокверцетина с Галавитом® и препарата Мексикор® с Галавитом®.

2. Применение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, а также монотерапия препаратом Галавит® и монотерапия дигидрокверцетином оказывает стимулирующее влияние на гуморальное звено иммунной системы крыс при моделировании распространенного перитонита.

3. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут, препараты Мексикор® 60 мг/кг/сут и Галавит® 8,6 мг/кг/сут оказывают протективное действие на коррекцию 6

морфологических изменений, а также повышают уровень регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы животных с моделированием распространенного перитонита, при этом, дигидрокверцетин проявлял более выраженный эффект, сопоставимый с комбинированным введением дигидрокверцетина с Галавитом® и препарата Мексикор® с Галавитом®.

4. Оценка общей летальности экспериментальных животных при моделировании распространенного перитонита представляет эффективность фармакологического действия исследуемых антиоксидантов и иммуномодулятора, а также их комбинаций в следующей последовательности: ДГК+Галавит® > ДГК > Мексикор®+Галавит® > Мексикор® > Галавит®.

5. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут проявляет более выраженную эффективность при лечении распространенного перитонита по сравнению с препаратом Мексикор® 60 мг/кг/сут при оценке оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, ЫО-продуцирующей функции эндотелия, микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, морфологических изменений и общей летальности экспериментальных животных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 3 научных конференциях:

- Международной научно-производственной конференции «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства» (15-16 мая 2013 г.) -Белгород, 2013;

- Международной научно-практической конференции «Научният потенциал на света» (17-25 сентября 2013 г.) - София, 2013;

- Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства» (29-31 января 2014 г.) - Курск, 2014.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 215 источников, из них 184 отечественных и 31 зарубежного автора. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 46 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование выполнено на половозрелых крысах-самцах линии массой тела 200-250 г. Эксперимент проведен в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей ред. чл.-корр. РАМН, профессора Р.У. Хабриева (2005).

Нами была использована модель распространенного гнойного перитонита (РГП) (Лазаренко В.А. и др., 2008) с синдромом интраабдоминальной гипертензии (ИАГ) на крысах (рацпредложение №190410 от 11.01.10; рацпредложение №1877-09 от 28.04.09 ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России), с помощью которой изучалась эффективность применения природного антиоксиданта флавоноида дигидрокверцетина (ДГК), антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит®, а также комбинаций: ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит®, в коррекции нарушений оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NO-продуцирующей функции эндотелия, а также уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки и морфологических изменений внутренних органов у лабораторных животных.

В качестве средства для наркоза использовали хлоралгидрат, который вводили внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг массы животного. Под наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики крысам выполнялась срединная лапаротомия, распространенный перитонит вызывался путем внутрибрюшного введения 10 % каловой взвеси крысы, которая вводилась в разных направлениях в объеме 0,5 мл на 100 г массы животного (Лазаренко В.А. и др., 2008). Далее создавалась дубликатура в 1 см апоневроза передней брюшной стенки, которая фиксировалась П-образными швами с последующей фиксацией узловыми швами. Животные всех исследуемых групп (контрольная и опытные) получали внутримышечно антибактериальную терапию путем введения цефотаксима в дозе 0,085 г на 1 кг массы тела, ежедневно в течение 5 дней. Через 48 часов от начала эксперимента в контрольной и исследуемых группах выполнялась повторная операция - релапаротомия, санация брюшной полости антисептическим раствором (0,02% раствор фурациллина), устранение дубликатуры передней брюшной стенки путем закрытия лапаротомной раны «край в край» (ФроловаО.Г. дисс.... к-тамед. наук, 2011).

Обоснование доз исследуемых препаратов. Дозы исследуемых препаратов в опытных группах рассчитывались исходя из средней терапевтической дозы для человека с учетом коэффициента пересчета доз с человека на животных согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).

Согласно Требованиям безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов «Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза, а также Техническому регламенту Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (TP ТС 021/2011) уровень суточного потребления природного антиоксиданта дигидрокверцетина для взрослых составляет 25-100 мг. В настоящем экспериментальном исследовании фармакологические эффекты дигидрокверцетина (3,5,7,3',4'-пента-гидроксифлаванон) (антиоксиданты из лиственницы «Дигидрокверцетин (Таксифолин)» СГР № RU.77.99.11.003.Е.018404.05.11) производства ООО «Таксифолия», Россия изучались исходя из суточной дозы потребления 90 мг для человека массой

70 кг, которая в результате переноса доз на крысу составила 7,7 мг/кг/сут. Так как растворимость дигидрокверцетина в воде и водосодержащих продуктах недостаточна для осуществления точного дозирования препарата с целью достижения необходимой биодоступности, то введение дигидрокверцетина лабораторным животным осуществлялось внутрижелудочно в виде 20% раствора на основе разрешенного к применению в пищевой промышленности растворителе - глицерине (ТУ 9197-012-66975341-2010 "Сырье для производства БАД к пище и пищевой промышленности "Флавомикс-G").

Эффективность антиоксидантного препарата Мексикор® (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат) ООО «ЭкоФармИнвест», производства Государственный завод медицинских препаратов ФГУП, Россия исследовалась при внутримышечном введении лабораторным животным в дозе 60 мг/кг/сут, исходя из максимальной суточной дозы 800 мг для человека массой 70 кг. Доза вводимого препарата была рассчитана с учетом коэффициента пересчета на площадь поверхности тела человека, равному 39,0, и коэффициента пересчета на площадь поверхности тела крысы массой 250 г, равному 7,0.

При изучении эффективности иммуномодулятора Галавит® (5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевая соль) производства ЗАО «Центр современной медицины «МЕДИКОР», Россия препарат вводился животным внутримышечно в дозе 8,6 мг/кг/сут, исходя из средней терапевтической суточной дозы 100 мг для человека массой 70 кг. Доза вводимого препарата была рассчитана с учетом коэффициента пересчета на площадь поверхности тела человека, равному 39,0, и коэффициента пересчета на площадь поверхности тела крысы массой 250 г, равному 7,0.

В случае комбинированного лечения препараты вводились в тех же дозах, что и при монотерапии.

В хронических экспериментах при моделировании распространенного перитонита исследуемые препараты вводились в соответствующих дозах один раз в сутки в течение 10 дней. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований, выполненных на крысах, на данной модели патологии (Фролова О.Г. дисс. ... к-та мед. наук, 2011; Блинков Ю.Ю. дисс. ... д-ра мед. наук, 2012).

Измерение лшкроциркуляторных показателей. Измерение микроциркуляции в стенке тонкой кишки производилось с помощью лазерного доплеровского флуометра (ЛДФ) фирмы «Biopac Systems, Inc.» МР-100 с датчиком TSD-144 и программы Acqknowledge 3.8.1. Измерения производились в 6 точках на расстоянии 1 см, 2 см, 3 см, 4 см, 5 см и 7 см от илеоцекального угла в стенке тонкой кишки. Показатели микроциркуляции имели вид ЛДФ-грамм и выражались в перфузионных единицах (перф. ед.). Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 сек. в каждой точке, затем из полученных значений выводили средние, которые вносили в Протокол исследования.

Определение биохимических и иммунологических показателей. Выраженность перекисного окисления липидов в крови животных оценивали

по содержанию малонового диальдегида (Бенисевич В.И., Идельсон Л.И., 1973; Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983). Кроме того, определяли активность каталазы (Королюк М.А. и др. 1988), супероксиддисмутазы (Макаренко Е.В., 1988) и общую антиокислительную активность сыворотки крови крыс (Клебанов Г.И. и др., 1988). Уровень метаболитов оксида азота (суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса (Метельская В.А., 2004).

Количественное содержание ИЛ-6, ФНО-а определяли с помощью ИФА наборов для крыс «Rat TNF-a Platinum ELISA» и «Rat IL-6 Platinum ELISA» фирмы «eBioscience», Австрия. Метод определения основан на «сэндвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа с применением биотин-конъюгированных поликлональных антител против крысиных ФНО-а и биотин-конъюгированных моноклональных антител против крысиных ИЛ-6.

Концентрацию иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA в сыворотке крови определяли иммунотурбидиметрическим методом на автоматическом анализаторе для биохимического и иммунотурбидиметрического анализа Vitalit 1000 (Италия) в соответствии с программами, разработанными фирмой-производителем, с использованием наборов «Иммуноглобулин G-Витал», «Иммуноглобулин М-Витал» и «Иммуноглобулин А-Витал».

Морфологические исследования. При вскрытии животных обращали внимание на общий вид внутренних органов, наличие и отсутствие жидкостей в серозных полостях. Для морфологического подтверждения развития моделируемой патологии и в комплексной оценке эффективности препаратов проводили гистологическое исследование тонкого и толстого кишечника, печени, почек, легкого и селезенки интактных, контрольных крыс и крыс, получавших исследуемые препараты. С этой целью кусочки данных органов фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина и заливали в парафин по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969). Парафиновые срезы толщиной 8-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили морфометрию.

Статистическая обработка результатов исследований. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±т) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием t-test для групп с разными дисперсиями, достоверными считались различия сравниваемых параметров при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение влияния дигидрокверцетина в сравнении с препаратом Мексикор®, а также их комбинаций с иммуномодулятором Галавит® на оксидантно-антиоксидантный, иммунобиологический статус, уровень 10

провоспалительных цитокинов и NO-пpoдyциpyющyю функцию эндотелия при моделировании распространенного перитонита у крыс.

Моделирование экспериментального распространенного перитонита вызывает активацию процессов свободнорадикального окисления, угнетение системы антиоксидантной защиты, повышение уровней провоспалительных цитокинов, нарушение синтеза оксида азота.

Так, в сыворотке крови нелеченных животных отмечается достоверное повышение концентрации малонового диальдегида. Сравнительное изучение влияния исследуемых препаратов и их комбинаций выявило значительное снижение концентрации МДА на фоне введения дигидрокверцетина, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин+Галавит® и Мексикор® + Гапавит®, начиная со 2-х суток эксперимента, в сравнении с контрольной группой без достижения уровня интактных животных. В то время как наиболее выраженный эффект снижения продуктов перекисного окисления липидов до уровня интактных животных, на примере МДА, получен на фоне лечения комбинацией дигидрокверцетина с препаратом Галавит®, начиная с 5-х суток и до конца эксперимента (рис. 1-а).

Определение антиокислительного потенциала включало исследование активности ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы, каталазы и общей антиокислительной активности. Об угнетении антиоксидантной системы защиты при моделировании распространенного перитонита свидетельствовало снижение активности СОД, каталазы и ОАА (рис. 1-6, 1-в, 1-г) относительно интактной группы животных. При введении ДГК и препарата Мексикор® отмечалось с третьих суток эксперимента достоверное повышение СОД относительно контрольной группы, а к 10-м суткам имело место превышение значений интактной группы (рис. 1-6). Использование комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит® приводило к более раннему повышению уровня СОД, начиная со вторых суток (рис. 1-6) и на всем протяжении эксперимента, относительно контрольной группы и достоверному повышению показателя на 5-е, 7-е и 10-е сутки — от интактных крыс.

На фоне введения ДГК, препарата Мексикор®, а также комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит®, начиная с 3-х суток, активировалась антиоксидантная система защиты, что подтверждалось статистически достоверным повышением активности каталазы в сыворотке крови крыс от уровня, определяемого не только в контрольной группе животных, но и повышением относительно интактных крыс (рис. 1-в).

Изучение состояния ОАА выявило, что в условиях патологии чрезмерная активация процессов свободнорадикального окисления приводит к стойкому снижению показателя в 2 раза на протяжении всего эксперимента. На фоне введения дигидрокверцетина и препарата Мексикор®, а также комбинаций ДГК+ Галавит® и Мексикор®+Галавит® получено статистически достоверное повышение показателя ОАА относительно контрольной группы, начиная со 2-х суток эксперимента, а начиная с 5-х суток ОАА практически не отличался от значений интактной группы. Следует отметить, что использование комбинации ДГК+Галавит® приводит к более раннему повышению значений ОАА к уровню интактных животных, начиная уже с 3-х суток исследования (рис. 1-г).

лкмоль/л

0 I г,34| 5.К| з.м! <.«! з.Щ з.41| ЙГ .-.те «.» ■•■>•. I

2 сут 1

Рис. 1-а Малоновый диальдегид (МДА. мкмоль/л)

Рис. 1-6 Супероксиддисмутаза _(СОД, усл.ед/мл)

Зсут 10 суг

Рис. 1-г Общая антиокислительная _активность (ОАА, %)

Рис. Х-в Каталаза (мкат/л)

140

пг/мл

-* X ХУ-И

0 ' [ 1?.1| 51.1 [ >М> <Н,1( ГЗ.К 13.'.

2 сут Юсут

Рис. 1-е Фактор некроза опухоли-а _(ФНО-а, пт/ыл)_

0 ~ ЗД.З! 39.41 39.ll ЭВ.41 зе.7 ' |4.15|Ы>.6* 5.Ц| 5.47| 3.72| 4,5114,«Г

2 суг Юсут

Рис.1-д Интерлейкин-6 (ИЛ-6, пг/мл)

□ Интактные 0 Модель - перитонит 0ДГК

^ Мексикор® ЕЗ Галавит®

0 '! 3.19|10.ВЗ| 7.361 е,41[Д0.2^ 6431 8.В01 ¡3.131 7,041 3.57|Э.Я|<.»7|3.42| 3,501' 1 сут 10 сут

Рис. 1-ж Конечные стабильные метаболиты _N0 (ЫОх, мкмоль/л)_

БДГК+Галавит® 0 Мексикор®+Галавит®

Рис. 1. Влияние дигидрокверцетина 7,7 мг/кг, препарата Мексикор® 60 мг/кг, Галавит® 8,6 мг/кг, а также комбинаций препаратов дигидрокверцегин 7,7 мг/кг+Гагтавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг на биохимические показатели сыворотки крови крыс при моделировании распространенного перитонита.

Примечание: х - при р<0,05 в сравнении с интактной группой;

у - при р<0,05 в сравнении с контрольной группой

После моделирования перитонита на 3-й сутки исследования наблюдалось повышение активности гуморального звена иммунитета, характеризующееся достоверным увеличением концентрации иммуноглобулинов 1§0 и ^М, которые играют важную роль в процессах противоинфекционной защиты. При этом концентрация иммуноглобулина 1§А достоверно уменьшалась по сравнению с интактной группой животных, что может свидетельствовать о снижении местной защиты слизистых оболочек от инфекции. У крыс контрольной группы на 5-е и 10-е сутки имело место снижение уровня всех классов иммуноглобулинов: 1§М и ^А относительно интактных животных (р<0,05), что подчеркивает степень тяжести развивающейся патологии (табл. 1).

Таблица 1

Влияние дигидрокверцетина, препарата Мексикор®, Галавит®, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин +Галавит® и Мексикор®+Галавит® на иммунологические показатели гуморального иммунитета крыс при

Иммунологические показатели Исследуемые группы Сутки исследования

3-й сутки (до релапаро-томии) 5-е сутки 10-е сутки

ДО, г/л интактные 1,78±0,08у 1,82±0,06у 1,75±0,05у

контроль 2,18±0,08х 1,06±0,11х 1,05±0,15х

ДГК 1,60±0,07у 1,53±0,09ху 1,93±0,10у

Мексикор® 2,09±0,06х 1,15±0,09х 0,94±0,12х

Галавит® 3,03±0,14ху 3,23±0,07ху 3,42±0,12'[у

ДГК + Галавит® 3,31±0,14ху 3,58±0,10ху 3,87±0,13ху

Мексикор®+Галавит® 3,14±0,11ху 3,25±0,08ху 3,56±0,06ху

1§М, г/л интактные 0,260±0,025у 0,244±0,013у 0,253±0,020у

контроль 0,462±0,046х 0,142±0,038х 0,124±0,033х

ДГК 0,309±0,036у 0,264±0,022у 0Д89±0,041У

Мексикор® 0,489±0,029х 0,123±0,044х 0,108±0,032х

Галавит® 0,607±0,040ху 0,557±0,039ху 0,526±0,045ху

ДГК + Галавит® 0,626±,041ху 0,563±0,035ху 0,572±0,029ху

Мексикор®+Галавит® 0,577±0,023ху 0,516±0,019ху-

^А, г/л интактные 0,069±0,018у 0,071±0,022у 0,074±0,01бу

контроль 0,029±0,005х 0,028±0,009х 0,031±0,012х

ДГК 0,061±0,028 0,066±0,014у 0,082±0,007у

Мексикор® 0,036±0,007х 0,023±0,010х 0,042±0,012х

Галавит® 0,102±0,011у 0,134±0,007ху 0,140±0,006ху

ДГК + Галавит® 0,128±0,020ху 0,147±0,025ху 0,164±0,020ху

Мексикор®+Галавит® 0,094±0,013у 0,116±0,012у 0,135±0,008ху

Примечание: х - при р<0,05 у - при р<0,05

в сравнении с интактнои группой; в сравнении с контрольной группой.

На фоне применения дигидрокверцетина на 3-й сутки после моделирования перитонита концентрация и ^М соответствовала значениям интактных

животных (р>0,05), однако, была достоверно ниже значений в контрольной группе (р<0,05). На 5-е и 10-е сутки в контрольной группе уровень 1§С одинаково снижался в 1,7 раза, а ^М - в 1,7 и 2 раза, соответственно, по сравнению с показателями интакпюй группы. Введение дигидрокверцетина приводило к восстановлению концентрации иммуноглобулинов ^М и ^А на 5-е и 10-е сутки исследования до нормальных значений интактных животных (табл. 1).

При изучении динамики изменений иммунологических показателей получено, что введение препарата Мексикор® не вызывает заметных изменений в показателях, характеризующих гуморальное звено иммунитета: концентрации 1цМ и 1§А в сыворотке крови крыс не восстанавливались до нормальных значений интактных животных на всех сроках исследования (табл. 1).

На фоне применения препарата Галавит® на 3-й сутки эксперимента наблюдалось более выраженное иммуностимулирующее действие по сравнению с контрольной группой, характеризующееся увеличением 1§0 и 1дМ (р<0,05). Напротив, концентрация ^А в контрольной группе на 3-й сутки снижалась более чем в 2 раза, в то время как введение препарата Галавит® способствовало достоверному повышению значений 1§А относительно контрольной группы до уровня интактных животных. Введение животным иммуномодулятора Галавит® после моделирования перитонита приводило к достоверному повышению концентрации ^М и ^А не только

относительно контрольной группы, но и превышало уровень интактных крыс в 1,5 раза, в 2,3 раза и в 1,9 раза, соответственно, на 5-е сутки и в 1,9 раза, 2 раза и в 1,9 раза, соответственно, на 10-е сутки исследования (р<0,05) (табл. 1).

На фоне применения комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+ Галавит® на 3-й сутки наблюдалось более выраженное иммуностимулирующее действие по сравнению с контрольной группой, характеризующееся увеличением ¡цС}, 1$>М и (р<0,05). Следует отметить, что введение комбинации ДГК+Галавит® оказывало более заметное влияние на показатели иммунного ответа по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином, увеличивая на 3-й сутки концентрацию

и ^А в 2 раза. Введение комбинации Мексикор®+ Галавит® также оказывало влияние на показатели гуморального иммунитета по сравнению с монотерапией препаратом Мексикор®, увеличивая концентрацию ^(З в 1,5 раза, IgM - в 1,2 раза, ^А - в 2,6 раза (табл. 1).

Введение комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит® приводило к достоверному повышению концентрации IgM и ^А не только относительно контрольной группы, но и превышало уровень интактных крыс на 5-е и 10-е сутки исследования (р<0,05). В то же время следует подчеркнуть, что добавление к дигидрокверцетину иммуномодулятора Галавит® способствовало повышению концентрации 1§С, 1§М и 1§А в 2,3 раза, в 2,1 раза и в 2,2 раза на 5-е сутки, соответственно, по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином. На 10-е сутки сохранялось преимущество комбинированного применения ДГК+Галавит®, что выражалось в повышении ^М и ^А в 2 раза по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином (табл. 1). Добавление к препарату Мексикор® иммуномодулятора Галавит® способствовало повышению концентрации иммуноглобулинов ^М и ^А в 2,8 раза, в 4,3 раза и в 5,0 раза на 5-е сутки, соответственно, по сравнению с монотерапией препаратом Мексикор®. На 10-е сутки также сохранялось преимущество комбинированного применения Мексикор®+Галавит®, что выражалось в повышении 1§М и 1§А в 3,8 раза, в 4,8 раза и в 3,2 раза, соответственно, по сравнению с монотерапией препаратом Мексикор® (табл. 1).

При изучении влияния монотерапии препаратом Галавит® и препаратом Мексикор® на уровень провоспалительных цитокинов нами было получено снижение ИЛ-6 (начиная с 4-х и 5-х суток, соответственно) и ФНО-а (начиная с 3-х и 4-х суток, соответственно) относительно контрольной группы животных, сопоставимое для исследуемых групп. При комбинированном применении дигидрокверцетина и препарата Мексикор® с препаратом Галавит® отмечалось более эффективное снижение цитокинов относительно контрольных животных, начиная со 2-х суток исследования (рис. 1-д, 1-е) и, что особо важно, достижение значений интактных животных в отношении ИЛ-6 и ФНО-а в исследуемых комбинациях достигалось одновременно на 7-е и 10-е сутки. При этом считаем примечательным наблюдаемый на фоне монотерапии дигидрокверцетином эффект аналогичный комбинациям, выражающийся в снижении ИЛ-6 в 6 раз, а ФНО-а - в 3,7 раза от уровня контрольной группы на 10-е сутки (рис. 1-д, 1-е).

Изучив динамику концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота, в контрольной группе мы подтвердили нарушение N0-продуцирующей функции эндотелия, выражающееся в повышении концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота №Эх с 1-х по 10-е сутки эксперимента по сравнению с интактной группой животных. Заслуживает внимания тот факт, что исследуемые препараты: ДГК, Мексикор® и их комбинации в разной степени достоверно снижали концентрацию ИОх относительно контрольной группы уже с 1-х суток исследования (рис. 1-ж), что может свидетельствовать об их эндотелиопротективных свойствах. При этом наиболее выраженный эффект демонстрировали ДГК, комбинации препаратов ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит®, восстанавливая концентрацию >Юх до уровня интактной группы, начиная с 5-х по 10-е сутки исследования. В то время как под действием монотерапии препаратом Мексикор® уровень интактных крыс достигался лишь на 10-е сутки, а на фоне введения препарата Галавит® целевые значения интактной группы в ходе эксперимента достигнуты не были (рис. 1-ж).

Таким образом, комбинации дигидрокверцетина+Галавит® и Мексикор®+Галавит® при моделировании распространенного перитонита в эксперименте оказывают более выраженное корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и ТМО-продуцирующую функцию эндотелия по сравнению с монотерапией, где наиболее сопоставимую положительную динамику на показатели МДА, СОД, ИЛ-6, ФНО-а и ИОх продемонстрировала монотерапия дигидрокверцетином.

2. Изучение влияния дигидрокверцетина в сравнении с препаратом Мексикор®, а также их комбинаций с иммуномодулятором Галавит® на микроциркуляторные и морфологические изменения при моделировании распространенного перитонита у крыс.

При исследовании микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс выявлены значительные нарушения кровотока, сопровождающиеся достоверным снижением показателей микроциркуляции на протяжении всего исследования по сравнению с интактной группой животных (р<0,05). К 10-м суткам не происходило полного восстановления микроциркуляции, значения которой оставались достоверно ниже на 42,3 % относительно группы интактных животных (рис. 2).

Рис. 2. Динамика микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, получавших дигидрокверцетин 7,7 мг/кг, Галавит® 8,6 мг/кг и комбинацию дигидрокверцетин 7,7 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг при экспериментальном перитоните, в абсолютных значениях.

Примечание: х - при р<0,05 в сравнении с интактной группой;

у - при р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

Рис. 3. Динамика микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, получавших Мексикор® (60 мг/кг), Галавит® (8,6 мг/кг) и комбинацию Мексикор® (60 мг/кг)+Галавит® (8,6 мг/кг) при экспериментальном перитоните, в абсолютных значениях.

Примечание: х - при р<0,05 в сравнении с интактной группой;

¥ - при р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

Дигидрокверцетин в качестве монотерапии, комбинация препаратов ДГК+Галавит® при моделировании распространенного перитонита у крыс способствовали эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы животных. Введение экспериментальным животным комбинации способствовало более раннему (начиная с 5-х суток) восстановлению микроциркуляции в стенке тонкой кишки до уровня интактных животных (р>0,05) по сравнению с монотерапией ДГК, в которой уровень интактных животных достигался на 10-е сутки (рис. 2).

Комбинация препаратов Мексикор®+Галавит®, а также монотерапия препаратом Мексикор® и в меньшей степени монотерапия препаратом Галавит® при моделировании распространенного перитонита у крыс приводит к эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки по сравнению с контрольной группой. Введение экспериментальным животным комбинации способствовало (начиная с 7-х суток) восстановлению микроциркуляции до уровня интактных животных (р>0,05) в отличие от монотерапии препаратом Мексикор® и препаратом Галавит®, на фоне введения которых уровень интактных животных достигнут не был (рис. 3).

В наших экспериментах показано, что нарушения микроциркуляции возникали уже на реактивной стадии перитонита и сопровождались дистрофическими изменениями тонкой кишки и других органов-мишеней, достигшими в токсической фазе максимальной выраженности.

Морфологические изменения у крыс с нелеченным перитонитом заключались в развитии распространенных нарушений кровообращения, дистрофических и воспалительных изменений в кишечнике, печени, почках и легких. Описанный морфологический симптомокомплекс свидетельствует о развитии при перитоните у крыс полиорганной недостаточности.

Морфологические исследования подтвердили высокую

органопротективную активность монотерапии дигидрокверцетином в дозе 7,7 мг/кг/сут и препаратом Мексикор® в дозе 60 мг/кг/сут в сторону регресса гистоморфологических изменений в париетальной брюшине, в тонком и толстом кишечнике, печени, почках и легких, вызванных моделированием распространенного перитонита (рис. 4-5). К концу эксперимента обнаруживаемые в контрольной группе нарушения кровообращения, дистрофические и воспалительные изменения не определяются.

Кроме этого на фоне применения дигвдрокверцетина 7,7 мг/кг/сут выявляются признаки стимуляции лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке (рис. 6), что может быть обусловлено иммуномодулирующим действием дигидрокверцитина.

При введении препарата Галавит® в дозе 8,6 мг/кг/сут в тонком и толстом кишечнике (рис. 7), легких и селезенке (рис. 8) отмечается выраженная гиперплазия лимфоидной ткани, что может быть обусловлено иммуномодулирующим действием препарата Галавит®.

Также морфологические исследования подтвердили высокую органопротективную активность комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит® на фоне моделирования распространенного перитонита.

Рис. 4. Перитонит на фоне введения ДГК, 4 сут. Воспалительная инфильтрация ворсин тонкого кишечника с их заметным утолщением, язв нет. Окраска гематоксилином и эозином, х 56

тмт.....^

1

Ш9.

4 С * Й|

Ж

I II

■ш

■ г

ю

Рис.6. Перитонит на фоне введения ДГК 7,7 мг/кг, 10 сут. Гиперплазия лимфоидных фолликулов селезенки. Окраска гематоксилином и эозином. х56.

МмШЩ

шшш

Рис. 8. Перитонит на фоне введения препарата Галавит®, 10 сут. Лимфоид-ные фолликулы селезенки крупные, имеются реактивные центры. Окраска гематоксилином и эозином, х 70.

Рис. 5. Перитонит на фоне введения препарата Мексикор®, 2 сут. Мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. х400.

Рис. 7. Перитонит на фоне введения препарата Галавит®, 7 сут. Выраженная гиперплазия лимфоидного аппарата тонкой кишки. Окраска гематоксилином и эозином, х 56.

§р|&

Г »

мае

ЩЩг?

аШ&аЗя

ЙШша

ннМНННш

Рис. 9. Перитонит на фоне введения комбинации ДГК+Галавит®, 10 сут. Тонкий кишечник, гиперплазия лимфоидной ткани. Окраска гематоксилином и эозином, х 56.

При этом на фоне применения комбинации ДГК+Галавит® морфологические изменения в париетальной брюшине, кишечнике, печени, почках, легких и селезенке были в целом аналогичны таковым у крыс, получавших монотерапию дигидрокверцетином. В то же время на фоне введения комбинации Мексикор®+Галавит® патологические изменения в структуре изученных органов были выражены в меньшей степени, чем в группе монотерапии препаратом Мексикор®.

Следует отметить значительную гиперплазию лимфоидной ткани тонкого кишечника в результате применения комбинации ДГК+Галавит® (рис. 9). Можно предположить, что полученный результат связан с иммуномодулирующим действием испытуемых препаратов.

В отличие от группы животных, получавших лечение препаратом Мексикор®, при комбинированной терапии Мексикор®+Галавит® отмечается выраженная гиперплазия лимфоидной ткани тонкого кишечника, что, вероятно, связано с иммуномодулирующим действием препарата Галавит®.

3. Изучение влияния дигидрокверцетина в сравнении с препаратом Мексикор®, а также их комбинаций с иммуномодулятором Галавит® на летальность при моделировании распространенного перитонита у крыс.

Одним из основных и наиболее информативных критериев, характеризующих эффективность лечения, является оценка уровня летальности в ходе эксперимента. В результате проведенного исследования видно, что фармакологическая коррекция распространенного перитонита препаратом Галавит® привела к снижению показателя общей летальности на 16% относительно контрольной группы животных, в то время как эффективность монотерапии препаратом Мексикор® была несколько выше, что подтверждалось снижением данного показателя на 22%.

Модель- Гадават* Мексике]**) Мекспкорг:+ ДПС ДГК+

пернтонпт Галявнг Галавптф

Рис. 10. Влияние дигидрокверцетина 7,7 мг/кг, препарата Мексикор® 60 мг/кг, Галавит® 8,6 мг/кг, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин 7,7 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг+ Галавит® 8,6 мг/кг на показатель общей летальности крыс при моделировании распространенного перитонита.

Комбинированное использование препаратов Мексикор®+Галавит® значительно сократило количество павших животных и, тем самым, снизило летальность на 28%, в то время как монотерапия ДГК привела к аналогичному результату, снизив общую летальность на 30%. Преимущество комбинации ДГК+Галавит® подтвердилось максимальным снижением общей летальности на 36% относительно контрольной группы животных. Таким образом, представляется возможным расположить исследуемые препараты и их комбинации по степени снижения общей летальности в следующем порядке: ДГК+Галавит® < ДГК < Мексикор®+Галавит® < Мексикор® < Галавит® (рис. 10).

В заключение необходимо отметить, что перспективным направлением в послеоперационной интенсивной терапии распространенного перитонита, наряду с общепринятыми хирургическими и фармакологическими методами, является дополнительное применение природного флавоноида дигидрокверцетина, который приводит к нормализации показателей свободнорадикального окисления, активирует антиоксидантную систему защиты, нормализует иммунологические показатели гуморального звена иммунитета, снижает уровень провоспалительных цитокинов, способствует снижению избыточного синтеза оксида азота, восстанавливает уровень регионарного кровотока в стенке тонкой кишки. Приведенные в данной работе результаты патоморфологических исследований и оценки общей летальности также свидетельствуют об эффективности дигидрокверцетина и целесообразности проведения дальнейших целенаправленных доклинических и клинических испытаний при лечении распространенного перитонита.

ВЫВОДЫ

1. Введение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг при моделировании распространенного перитонита в эксперименте оказывает более выраженное корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и МО-продуцирующую функцию эндотелия по сравнению с монотерапией, где наиболее сопоставимую положительную динамику на показатели МДА, СОД, ИЛ-6, ФНО-а и >Юх продемонстрировала монотерапия дигидрокверцетином 7,7 мг/кг.

2. Применение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, а также монотерапии препаратом Галавит® оказывает выраженное стимулирующее влияние на гуморальное звено иммунной системы крыс, что проявлялось в достоверном повышении концентраций иммуноглобулинов ^М, ^А по сравнению с контрольной группой животных, а также превышало значения интакгных крыс. Монотерапия дигидрокверцетином оказывает иммуномодулирующее действие и сохраняет относительную стабильность 1§М, ^А на уровне интактных животных, проявляя тенденцию к повышению концентраций иммуноглобулинов всех фракций.

3. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг, Мексикор® 60 мг/кг и Галавит® 8,6 мг/кг в качестве монотерапии, комбинации дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг при моделировании распространенного перитонита у крыс способствовали повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы. Введение экспериментальным животным комбинаций: дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг приводило к более раннему (начиная с 5-х и 7-х суток, соответственно) восстановлению микроциркуляции в стенке тонкой кишки до уровня интактных животных (р>0,05) по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином 7,7 мг/кг, в которой уровень интактных животных достигался на 10-е сутки.

4. Морфологические исследования подтвердили высокую органопротективную активность комбинаций: дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, а также монотерапии дигидрокверцетином 7,7 мг/кг и препаратом Мексикор® 60 мг/кг при моделировании распространенного перитонита. Введение дигидрокверцетина 7,7 мг/кг и комбинаций: дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг приводило к выраженной гиперплазии лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке, характерной для монотерапии иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг.

5. Комбинированное лечение дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и монотерапия дигидрокверцетином 7,7 мг/кг привело к максимальному снижению общей летальности с 62% в контрольной группе до 26%, 34% и 32%, соответственно. Монотерапия препаратами Мексикор® 60 мг/кг и Галавит® 8,6 мг/кг способствовала снижению общей летальности на 22% и 16%, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для коррекции нарушений в системе антиоксидантной защиты и иммунобиологического статуса при распространенном перитоните у животных рекомендовано в качестве дополнения к стандартной терапии применение природного антиоксиданта из лиственницы - дигидрокверцетина в дозе 7,7 мг/кг/сут 1 раз в день внутрижелудочно в течение 10 суток.

2. Материал диссертационной работы может быть рекомендован для использования:

- в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на биологических, ветеринарных, медицинских факультетах высших учебных заведений;

- при написании соответствующих разделов учебников, монографий, справочных руководств и пособий по биохимии, ветеринарной микробиологии, вирусологии, эпизотологии, микологии с микотоксикологией и иммунологии;

- при проведении научно-исследовательских работ аспирантами, научными сотрудниками биологического и ветеринарного профиля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

¡.Экспериментальное обоснование применения дигидрокверцетина при распространенном ^перитоните / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, Е.В. Артюшкова // Вестн. Курск. ГСХА. - 2013. - № 6. - С. 71-75.

2. Влияние флавоноида природного происхождения дигидрокверцетина на биохимические показатели крови при экспериментальном перитоните. Т. 15. Лекарство / А.Н. Чмыхова, Е.В. Артюшкова, О.Б. Сеин, И.Ю. Уханова // Научният потенциал на света : материалы 9 Междунар. науч. практ. конф. (София, 17-25 сент. 2013 г.). - София, 2013. - С. 59-61.

3. Исследование влияния дигидрокверцетина на уровень микроциркуляции и морфологические показатели при перитоните (экспериментальное исследование). Т. 15. Лекарство / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, В.С. Барсуков // Научният потенциал на света : материалы 9 Междунар. науч. практ. конф. (София, 17-25 сент. 2013 г.). - София, 2013. - С. 62-66.

4. Оценка эффективности применения антиоксидантов дигидрокверцетина и Мексикора® в комплексном лечении распространенного перитонита в эксперименте [Электронный ресурс] / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, Е.В. Артюшкова // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 6. - Режим доступа: Шрг/Лтлу^аепсе-education.ru/113-11043, свободный (дата обращения: 09.12.2013).

5. Чмыхова, А.Н. Перспектива применения природного флавоноида дигидрокверцетина и его комбинации с иммуномодулятором Галавит® в комплексном лечении распространенного перитонита в эксперименте / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, Е.В. Артюшкова // Вестн. Курск. ГСХА. -2014.-№1.-С. 62-65.

6. Чмыхова, А.Н. Экспериментальное обоснование комбинированного применения дигидрокверцетина и Галавита® при распространенном перитоните / А.Н. Чмыхова // Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства : материалы Междунар. науч.-произв. конф. (15-16 мая 2013 г.). - Белгород, 2013. - С. 72.

7. Фармакологическая коррекция биохимических изменений при распространенном перитоните в эксперименте / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин // Интегративные тенденции в медицине и образовании: материалы Междунар. науч.-практ.. конф. - Москва, 2013. - С. 97-99.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДГК - дигидрокверцетин ИЛ-6 - интерлейкин 6 КАТ -каталаза МДА — малоновый диальдегид ОАА - общая антиоксидантная

активность N0 - оксид азота

РГП - распространенный гнойный

перитонит СОД - супероксиддисмутаза ФНО-а - фактор некроза опухоли- а 1§А — иммуноглобулин А ^М - иммуноглобулин М - иммуноглобулин в

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.

Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 115.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чмыхова, Анастасия Николаевна, Курск

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

04201459519 Чмыхова Анастасия Николаевна

СИСТЕМА АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У ЖИВОТНЫХ ПРИ РАСПРОСТРАНЕННОМ ПЕРИТОНИТЕ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Артюшкова Е.Б.

заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор биологических наук, профессор Сеин О.Б.

На правах рукописи

03.01.04 - биохимия

Курск-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................13

1.1 Патогенетические механизмы развития распространенного перитонита............................................................................................................................................................................................13

1.2 Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита....................................................................................................................................................................17

1.3 Теоретические предпосылки использования антиоксидантов при экспериментальном гнойном перитоните....................................................................................20

1.3.1 Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита препаратом Мексикор®....................................................................................................21

1.3.2 Принципы фармакологической коррекции распространенного перитонита дигидрокверцетином........................................................................................................24

1.4 Теоретические предпосылки использования иммуномодуляторов при

экспериментальном гнойном перитоните....................................................................................29

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................34

2.1 Объект исследований................................................................................................................................34

2.2 Обоснование доз исследуемых препаратов........................................................................35

2.3 Измерение микроциркуляторных показателей..................................................................39

2.4 Определение биохимических и иммунологических показателей в сыворотке крови крыс......................................................................................................................................39

2.5 Морфологические исследования....................................................................................................40

2.6 Статистическая обработка результатов исследований............................................41

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............................42

3.1 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного

перитонита у крыс..............................................................................................................................................42

3.2 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного

перитонита у крыс, получавших дигидрокверцетин.............................. 56

3.3 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших препарат Мексикор®........................ 68

3.4 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших препарат Галавит®............................. 79

3.5 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших комбинацию дигидрокверцетина и препарата Галавит®...................................................................... 90

3.6 Исследование флоуметрических, биохимических, иммунологических и морфологических изменений при моделировании распространенного перитонита у крыс, получавших комбинацию препаратов Мексикор® и

Галавит®.................................................................................... 103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................... 118

ВЫВОДЫ................................................................................. 133

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................ 135

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................. 136

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ДГК - дигидрокверцетин

N0 - оксид азота

МДА - малоновый диальдегид

ИЛ-1 - интерлейкин 1

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФНО-а - фактор некроза опухоли-альфа

РГП - распространенный гнойный перитонит

ИАГ - интраабдоминальная гипертензия

БАД - биологически активная добавка

ЛДФ - лазерный доплеровский флуометр

ИФА - иммуноферментный анализ

ИЛ-6 - интерлейкин 6

КАТ - каталаза

СОД - супероксиддисмутаза

ОАА - общая антиоксидантная активность

- иммуноглобулин А ^М - иммуноглобулин М

— иммуноглобулин О

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на существующие достижения в области хирургии, лечение распространенного гнойного перитонита на современном этапе остается открытой проблемой. Разработка и внедрение в практику новых методов хирургической санации брюшной полости, использование различного рода методов детоксикации, применение антибактериальных препаратов последних поколений оказали значительное позитивное влияние на исходы заболевания, но так и не смогли существенно снизить летальность больных [34, 53, 163]. Смертность при перитоните варьирует от 15 до 60%, при послеоперационном перитоните увеличивается до 80-90% и выше [4, 8, 35, 162, 163, 173].

Сохраняющийся высокий процент летальности при распространенном перитоните во многом сопряжен с тяжелым течением заболевания, обусловленным сложной цепью морфологических и функциональных изменений со стороны отдельных органов, систем и организма в целом. По современным представлениям микробный фактор является лишь пусковым механизмом, вызывающим ряд патоморфологических изменений. В результате попадания микроорганизмов в брюшную полость происходит высвобождение большого числа микробных эндо- и экзотоксинов, лейкоцитов, недоокисленных продуктов обмена, продуктов распада погибших клеток брюшины и пр. Далее, вследствие попадания токсических и вазоактивных субстанций в кровоток, прогрессирует генерализованный процесс эндогенной интоксикации. Вся эта сумма токсических факторов приводит в первую очередь к функциональным, а потом и к морфологическим нарушениям центральной и системной гемодинамики, органов естественной детоксикации и центральной нервной системы, и в результате к развитию полиорганной недостаточности и летальному исходу [92].

Важной частью развития и прогрессирования распространенного перитонита является снижение резервов антиоксидантной системы и избыточное

образование перекисных соединений [16, 73]. Развитие патологического процесса нарушает баланс образования и расходования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). При гиперактивации ПОЛ происходят нарушения практически на всех уровнях клеточного метаболизма: изменение физико-химических свойств мембранных белков и липидов, активности мембранно-связанных ферментов, нарушение проницаемости мембран, ионного транспорта, уменьшение электрической стабильности липидного бислоя мембран [60, 72, 82, 95, 204].

Локальное воспаление, синдром системной воспалительной реакции, сепсис, тяжелый сепсис, оксидантные нарушения, полиорганная недостаточность - это звенья одной цепи в реакции организма на воспаление в результате микробной инфекции [49, 148, 149]. Вследствие этого диагностика и коррекция иммунных и оксидантных расстройств имеет большое значение в клинической практике, так как отражает степень нарушений в начале заболевания, а также динамику, наблюдаемую в процессе лечения пациента [152].

В настоящее время, с целью фармакологической коррекции перитонита пристальное внимание уделяется использованию антиоксидантов, направленных на снижение степени свободнорадикального окисления и повышение мощности антиоксидантных систем организма, а также способствующих уменьшению уровня гипоксического воздействия и, тем самым, коррекцию микроциркуляторных нарушений [4, 170].

При перитоните состояние иммунной системы можно охарактеризовать как злокачественную форму внутрисосудистого воспаления. Формируется мощная противовоспалительная реакция, на фоне массивного повреждения эндотелия, возрастает число активированных юных форм нейтрофилов [77]. Повышение проницаемости сосудистого эндотелия приводит к увеличению миграции лейкоцитов из сосудистого русла и повреждению ими тканевого интерстиция (особенно в легких), что приводит к полиорганной дисфункции. При этом диагностика иммунных и оксидантных расстройств имеет большое значение в клинической практике, поскольку отражает степень иммунодефицита в начале заболевания, а также динамику, наблюдаемую в процессе лечения пациента [160].

В настоящее время получены убедительные данные о необходимости включения антиоксидантной и иммунотерапии в состав интенсивной терапии перитонита и сепсиса [100]. В российской практике существует большое количество исследований, рекомендаций и публикаций, посвященных иммунотерапии и иммуномодуляции [43, 44]. Область применения большинства иммуномодуляторов лежит ближе к амбулаторной практике или улучшает реабилитационные процессы. Пациенты с распространенным перитонитом в составе интенсивной терапии и без того получают большое количество препаратов для поддержания жизненно важных функций организма [151]. В этих условиях назначение каждого дополнительного препарата без доказанной эффективности может принести больше вреда, чем пользы.

Поэтому наиболее актуальным является внедрение в клиническую практику эффективных и патогенетически обоснованных методов антиоксидантной терапии и иммунокоррекции у больных с распространенным острым перитонитом после тщательной апробации в экспериментальных исследованиях [152]. Наиболее перспективным в этом отношении может оказаться дигидрокверцетин (ДГК), который обладает антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами, о которых имеются многочисленные публикации [26, 70, 123, 136, 172, 209].

Цель исследования: изучение антиоксидантного и иммунобиологического статуса у животных при распространенном перитоните на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1. Оценить изменение параметров оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и конечных стабильных метаболитов оксида азота на фоне введения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® при моделировании распространенного перитонита.

2. Дать оценку иммунобиологического статуса при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом®.

3. Изучить эффективность применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® при микроциркуляторных нарушениях в стенке тонкой кишки крыс, вызванных моделированием распространенного перитонита.

4. Изучить органопротективную активность природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® по результатам морфологических исследований при моделировании распространенного перитонита.

5. Оценить влияние природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® на показатель общей летальности крыс при моделировании распространенного перитонита.

Научная новизна исследования. На основании комплексных исследований впервые изучен антиоксидантный и иммунобиологический статус при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения

природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата

♦

Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом®.

По результатам настоящего исследования продемонстрировано, что экспериментальный распространенный перитонит вызывает у лабораторных животных комплекс функциональных, биохимических, иммунологических и морфологических изменений. При исследовании микроциркуляции в стенке

тонкой кишки выявлены значительные нарушения кровотока, сопровождающиеся достоверным снижением показателей микроциркуляции по сравнению с интактной группой животных. Биохимический анализ сыворотки крови нелеченных животных показал достоверное повышение концентрации малонового диальдегида, снижение супероксиддисмутазы, общей антиокислительной активности, каталазы, иммуноглобулинов 1§М, 1§А и нарушение 1\Ю-продуцирующей функции эндотелия, выражающееся в увеличении концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота. Также установлено, что модель перитонита приводила к прогрессирующему повышению провоспалительных цитокинов - интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли-альфа по сравнению с интактной группой. Имели место морфологические изменения, заключающиеся в развитии распространенных нарушений кровообращения, дистрофических и воспалительных изменений в кишечнике, печени, почках и легких. Основной причиной летальных исходов явилось прогрессирование инфекционного токсического шока, общая летальность при этом составила 62 %.

Впервые экспериментально обосновано применение природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в качестве дополнения к стандартной терапии распространенного перитонита. Монотерапия дигидрокверцетином способствовала эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки крыс, нормализации биохимических маркеров свободно-радикального окисления, снижению провоспалительных цитокинов, повышению антиоксидантной системы защиты и иммунобиологического статуса, а также восстановлению МЭ-продуцирующей функции эндотелия. В ходе проведенного исследования выявлена органопротективная активность дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в сторону регресса гистоморфологических изменений изучаемых внутренних органов и признаки стимуляции лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке.

В работе впервые предложен эффективный способ комбинированного лечения экспериментального распространенного перитонита с использованием

природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг с иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг и антиоксидантного препарата Мексикор® 60 мг/кг с иммуномодулятором Галавит 8,6 мг/кг. Изучение оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, ТЧО-продуцирующей функции эндотелия, а также уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки и морфологических изменений внутренних органов крыс обнаружили выраженный сопоставимый фармакологический эффект исследуемых комбинаций. Применение комбинаций способствовало более раннему восстановлению нарушенных биохимических показателей и микроциркуляции до уровня интактных животных по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином 7,7 мг/кг.

Эффективность проводимой терапии была подтверждена результатом оценки уровня общей летальности экспериментальных животных. Впервые отмечено снижение общей летальности с 62% в группе с распространенным перитонитом до 26% на фоне введения комбинации дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг; до 32 % на фоне введения дигидрокверцетина 7,7 мг/кг и до 34% на фоне введения комбинации Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг.

Теоретическая и практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции распространенного перитонита природным антиоксидантом дигидрокверцетином, антиоксидантным препаратом Мексикор®, а также комбинациями дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит® и препарата Мексикор® с иммуномодулятором Галавит®. При этом преимущество дигидрокверцетина перед препаратом Мексикор® выявлялось как при монотерапии, так и в комбинации с иммуномодулятором Галавит®.

По результатам исследования нами получено, что наибольшему снижению процента общей летальности крыс сопутствовала более эффективная коррекция оксидантно-антиоксида�