Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях экспериментального перитонита

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях экспериментального перитонита"

На правах рукописи

ПОПОВ Сергей Владимирович

Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях э кс л ер и м ентал ь но го пер итонита

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 0 ДПР ¿013

Челябинск - 2013

005057498

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководи!ель: доктор биологических наук, профессор

Цейликман Вадим Эдуардович Официальные оппоненты: заслуженный работник высшей школы РФ,

доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России

Высокогорский Валерий Евгеньевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры» Минспорттуризма России Львовская £лена Ивановна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (г.Москва)

Защита состоится « » ¿ЪлЛ&^Л 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "¿^ " ¿¿слу^т-ч 2013

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Согласно современным представлениям при септическом перитоните часто происходит делокализация воспалительного очага, что сопровождается интоксикацией, развитием SIRS - синдрома и генерализацией воспалительного процесса (Weinert С., Meiler W., 2007; Boer R. et al., 2008; Шальков Ю.Л., 2010). Проявления системного воспаления могут быть в значительной степени модифицированы хроническим стрессом (Handa et al., 2008).

Ранее было показано, что предварительные ежедневные эпизоды одночасового иммобплизационного стресса влияют на процессы свободно-радикального окисления, как в воспалительном очаге, так и во внутренних органах при септическом перитоните (Нусратов М.И., 2011). Однако использованная в этом исследовании экспериментальная модель стресса не воспроизводит состояние длительного ограничения двигательной активности. Можно предположить, что длительная гипокинезия оказывает значительное влияние на динамику системного воспаления. Поэтому клинические проявления системного воспаления у больных, длительное время находящихся на строгом постельном режиме (тяжелые травмы, патология центральной и периферической нервной системы, кома различной этиологии), зачастую модифицированы, что значительно затрудняет их своевременное выявление и лечение (Hunter J.D., Doddi М., 2010). Кроме того, развитие сепсиса, как осложнения перитонита, приводит к ограничению двигательной активности, что отражено в термине «гиподинамическая фаза сепсиса» (Yang S.L. et al., 1997).

Вместе с тем, изменение динамики системного воспалительного процесса в условиях хронического стресса во многом реализуется за счет влияния на процессы свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и во внутренних органах (Zhu Н., Li Y.R., 2012). Имеются данные о причастности процессов свободно-радикального окисления к развитию осложнений при воспалительной патологии (Zhang R. et al., 2002). Известно, что с усилением свободно-радикального окисления во внутренних органах связано развитие гюлиорганной недостаточности (Лейдерман И.Н., 1999).

К сожалению, остаётся не исследованным влияние предварительной гипокинезии на особенности свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и во внутренних органах при экспериментальном септическом перитоните.

Цель работы:

Установить особенности модифицирующего влияния 30 - суточной гипокинезии на уровень липопероксидации и карбонилирования белков в очаге воспаления, органах системы крови, печени и головном мозге при экспериментальном перитоните.

Задачи исследования:

1. Определить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии и ложной операции.

2. Определить особенности свободно-радикального окисления в органах системы крови, печени и головном мозге животных, подвергнутых 30 -суточной гипокинезии и ложной операции.

3. Исследовать особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при экспериментальном септическом перитоните.

4. Изучить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при септическом перитоните, воспроизводимом на фоне 30 - суточной гипокинезии.

5. Изучить состояние свободно-радикального окисления в головном мозге и печени в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.

6. Изучить состояние свободно-радикального окисления в органах системы крови в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.

Научная новизна

Впервые установлено, что 30 - суточная гипокинезия сопровождается увеличением содержания гептанофильных продуктов ПОЛ при неизменном уровне окислительной модификации белков в перитонеальных смывах. Установлено, что хирургический стресс, осуществляемый на фоне 30 -суточной гипокинезии, приводит к приросту содержания продуктов ПОЛ не только в перитонеальных смывах, но и в тимусе, селезенке и печени.

4

Установлено, что при септическом перитоните угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов ассоциируется со снижением липопероксидации и усилением карбонилирования белков в перитонеальных смывах. Установлено, что предварительное воздействие 30 - суточной гипокинезии усугубляет окислительную деструкцию белков в перитонеальных смывах, вызванную септическим перитонитом. Обнаружено, что при септическом перитоните соотношение между линопероксндацией и окислением белков имеет органоспецнфический характер: в тимусе усилилось ПОЛ при снижении ОМБ, в селезенке наоборот снижение ПОЛ и усиление ОМБ. В костном мозге усиление ПОЛ. Увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге сопряжено с увеличением активности церебральной МАО-Б. Септический перитонит на фоне гипокинезии сопровождается приростом содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в головном мозге.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты уточняют свободно-радикальные механизмы развития воспалительных осложнений в условиях длительного ограничения двигательной активности. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых путей фармакологической коррекции септического перитонита, предусматривающих использование антиоксидантов. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России.

Положения, выносимые на защиту:

1. Длительное ограничение двигательной активности приводит к усилению свободно-радикального окисления в брюшине и вызывает органо-специфичные изменения свободно-радикального окисления во внутренних органах.

2. Предварительная гипокинезия усугубляет снижение липопероксидации и повышение карбонилирования белков в брюшине, вызванные септическим перитонитом, усиливая при этом нейтрофильную инфильтрацию воспалительного очага.

3. Предварительная гипокинезия модифицирует соотношение между линопероксндацией и карбонилированием белков во внутренних органах при септическом перитоните.

Апробация работы

Основные положения работы изложены и представлены на 2nd European congress of Immunology «Immunity for life Immunology for health» (Berlin, 2009); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009); на XXXVI International Congress of Physiological Sciences (IUPS2009) Function of Life: Elements and Integration (Kyoto, Japan, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 - в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Уральской медицинской академической науки).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 220 источников: 102 - на русском языке и 118 - иностранных. Работа содержит 32 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Моделирование изучаемых состояний

Исследование выполнено на 210 беспородных лабораторных крысах обоего пола. Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре на стандартной диете.

Гипокинетический стресс моделировали путём помещения крыс в специальные клетки-пеналы, ограничивающие подвижность животных, при свободном доступе к пище и воде. Применялась 30-суточная модель гипокинетического стресса (Коваленко Е.А., Гуровский H.H., 1980; Фёдоров И.В., 1984; Тигранян P.A., 1990; Миллер Е., Рутковский М., Mrowicka М., Матушевский Т., 2007).

Для создания экспериментального перитонита нами использована модель лигирования и последующего однократного пунктирования слепой кишки - cecal ligation and perforation (CLP) (Wichterman K.A., 1980).

Биохимические методы

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). Содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов, определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ производили спектрофотометрическим методом по Львовской Е.И. с соавт. (1998). Окислительную модификацию белков оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов по методу Е.Е. Дубининой (1995). Активность моноаминоксидазы - Б в гомогенатах органов определяли спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстрата солянокислый бензиламин (Волчегорский И.А., 1991).

Гематологические и иммунологические методы

Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992). Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза. Кариоциты костного мозга и лимфоидных органов (также как и лейкоциты крови) подсчитывали в камере Горяева после ресуспендироваиия в 0,1% растворе метилеиового синего в 3% уксусной кислоте. Изучение способности нейтрофилов к захвату частиц проводили на модели поглощения частиц латекса (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990) и контрольных штаммов микроорганизмов. Исследование внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов осуществлялось при помощи НСТ-теста. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (Карпищенко А.И., 1998). Раздел работы по изучению внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов выполнен совместно со старшим преподавателем кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития, к.м.н. Е.В. Плехановой.

Статистический анализ результатов

Для обработки результатов исследований использовали пакет прикладных программ "Statistica 6.0 for Windows". Статистически значимые различия между несколькими группами определялись с помощью критерия Краскелла-Уолиса (Kruskal-Wallis). Для определения статистически значимых различий между двумя сравниваемыми группами использовали критерии Манна-Уитни (U). Различия считали значимыми при р<0,05.

7

Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (И,) и Кенделлу (гк).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах при 30 - суточной гипокинезии

После завершения 30 - суточной гипокинезии (ГК30) наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов, Шиффовых оснований, а также вторичных изопропанол-растворимых продуктов перекисного окисления липидов в перитонеальных смывах животных (таблица 1).

Таблица 1

Влияние 30 - суточной гипокинезии на свободно - радикальное окисление в перитонеальных смывах_

Показатель Контроль (п=8) гкзо (п=12)

Диеновые коиъюгаты гептановая фаза, е. о. и. 0,685±0,14 0,735±0,19

Кетоднены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. 0,1И±0,01 0Д27±0,02 р=о,опи

Шнффовы основания гептановая фаза, е.о.н. 0,013±0,02 0,026±0,002 Р=0,014и

Диеновые конъюгаты юопропанольная фаза, е.о.н. 0,798±0,015 0,822±0,04

Кетоднены и сопряжённые триены изопропанольная фаза, е.о.н. 0,146±0,03 0,189±0,03 Р=0.014Ц

Шиффовы основания изопропанольная фаза, е.о.и. 0,039±0,02 0,082±0,022

Окислительная модификация белка мкмоль/г белка 0,805±0,023 0,668±0,034

вторичные продукты, Е^Ецо - конечные продукты, извлекаемые гептановой и нзопропанольной фазамилигшдпого экстракта). V - критерий Манна-Уипти.

После завершения ГК30 в вилочковой железе наблюдалось увеличение содержания гептан - растворимых диеновых конъюгатов (таблица 2). Для головного мозга характерно снижение содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. В селезёнке наблюдалось увеличение уровня Ре-/Н202 - индуцированного карбонилирования белков.

Таблица 2

Влияние 30 - суточной гипокинезии на свободно - радикальное окисление во внутренних органах

Показатель Контроль (п=8) гкзо (п=12)

Диеновые коныогаты гептаноеая фаза, е.о.и. Тимус 0,908±0,07 0,979±0,068 Р=0,01511

Диеновые коныогаты изопропанольная фаза, е.о.и. Головной мозг 0,896±0,08 0,882±0,1 Р--(),022и

Окислительная модификация белка (индукция Ре2*/Н2О2), мкмоль /г белка Селезёнка 70,91±3,48 81,93±1,13 /'=0,02/1/

Окислительная модификация белка (индукция Ре2*/Н2О2), мкмоль /г белка Печень 66,31 ±4,32 48,08±2,11 Р=0,017 и

Окислительная модификация белка мкмол>>/г белка Костный мозг 4,41 ±0,51 2,58±0,35 Р=0,017 и

Примечание: е.о.ч. - единицы окислительного индекса (Е2з2/Ег2гпсрвичные, Е27^Е22(г вторичные продукты, Ет / £дм - конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта), и - критерий Манна-Уитни.

Для печени, напротив, характерно снижение Ре"2/Н202 индуцированного карбонилировация белков. В костном мозге обнаружено снижение базального уровня карбоншшрования белков. Таким образом, для ГК30 изменения уровня свободно-радикального окисления имеют органо-специфичный характер.

Установлено, что 30-суточная гипокинезия (ГК30) сопровождалась появлением нейтрофилов в перитонеальных смывах (количество нейтрофилов составило 3,4±0,01 х109/л, Р=0,033и). В цитологических препаратах контрольных животных не обнаружена эта разновидность лейкоцитарных клеток. При этом отмечено увеличение спонтанного (с 37,85±2,78 до 68,3±3,44%, Р=0,01713) и индуцированного (с 39,42±1,37 до 55,2±2,97%, Р=0,017Ц) НСТ - теста при одновременном снижении активности фагоцитоза (с 44,57±3,33 до 21,1±1,97%, Р=0,017и).

Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах ложнооперированных животных

У ложнооперированных животных, как и при гипокинезии, в перитонеальных смывах зарегистрировано статистически значимое увеличение содержания гептан-растворимых диеновых коныогатов,

кетодиенов и сопряжённых триенов, а также Шиффовых оснований. При этом содержание изопропанол - растворимых продуктов ПОЛ не претерпело статистически значимых изменений (таблица 3).

В перитонеальных смывах ложнооперированных животных наблюдалось снижение базального уровня окислительной модификации белка при увеличении уровня окислительной модификации белка в ответ на индукцию Ре2" / Н2О2.

Таким образом, ложная операция характеризовалась реципрокными отношениями между перекисным окислением липидов и карбонилированием белков в перитонеальных смывах.

Таблица 3

Влияние процедуры ложной операции на свободно-радикальное

Показатель Контроль (п=8) Ложная операция (п=!2)

Диеновые конъюгаты гептаиокая фаза, е.о.и. 0,685±0,09 0,765±0,02 Р=0.П27Ь<

Кетоднены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. 0,313±, 0,004 0,154«, 01 Р=0.02711

Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и. 0,013±0,006 0,0843±0,02 Р=0,027и

Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и. 0,798±0,059 0,777±0,015

Кетоднены и сопряжённые трнены изопропанольная фаза, е.о.и. 0,148±0,03 0,141±0,03

Шиффовы основания изопропанолъная фаза, е.о.и. 0,039±0,005 0,035±0,002

Окислительная модификация белка мкмоль /г белка 0,551±0,62 0,191±0,391 Р=0,0341/

Окислительная модификация белка (индукция Ре2*/НМ. мкмоль /г белка 2,55±10,23 3,22±0,618 Р=0,034Ч

Примечание: е.о.и. — с^.м........----------------- ------------------------..... - -----

вторичные продукты. Ет / Е;ю - конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольноы фазами липидного экстракта). V - критерий Манна-Уитнч.

В большинстве исследованных органов ложнооперированных животных наблюдалось изменение значений различных показателей свободно-радикального окисления (таблица 4). В селезёнке отмечено снижение содержания карбонилированных белков. В тимусе и в костном мозге наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также карбонилированных белков. Таким образом, в этих

органах развитие операционного стресса сопровождалось усилением свободно-радикального окисления.

Таблица 4

Влияние процедуры ложной операции на свободно-радикальное окисление во внутренних органах животных

Показатель Контроль (п=8) Ложная операция (п=12)

Диеновые коныогаты гептановая фаза, е.о.и., Тимус 0,900±0,08 1,005±0,08 Р=0,01би

Диеновые коныогаты гептановая фаза, е.о.и., Костный мозг 0,692±0,03 0,724±0,04 Р=0,023и

Диеновые коныогаты изопропанольпая фаза (индукция Ре~* / аскороат), е. о. и..Костный мозг 2,355±0,074 2,12±0,08 Р=0,0231/

Диеновые коныогаты гептановая фаза, е.о.и., Печень 0,542±0,04 0,515±0,048 Р=0,01би

Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и.. Печень 0,29±0,009 0,515±0,048 Р=0.0161Г

Шнффовы основания изопропанольпая фаза, е.о.и,Печень 0,079±0,005 0,033±0,002 Р=0,0161Г

Диеновые коныогаты изопронанольная фаза (индукция Ре1*/аскорбат), е.о.и., Печень 1,119±0,101 0,716±0,096 Р=0,015и

Окислительна« модификация белка мкМ/г белка. Тимус 1,25±0,102 2,48±0,98 Р=0.01би

Окислительная модификация белка мкМ'г белка. Костный мозг 3,96±3,47 11,35±0,976 Р=0,00би

Окислительная модификация белка мкМ/г белка. Селезенка 3,81 ±0,533 2,34±0,352 Р=0,01би

Окислительная модификация белка мкМ/г белка. Печень 5,92±0,43 2,25±0,38 Р=0,01би

Окислительная модификация белка (индукция Ре?* /Н2О2), мкМ/г белка. Печень 18,81 ±2,95 9,41 ±3,03 Р=0,01би

Окислительная модификация белка мкМ'г бака, Головной мозг 0,572±0,063 0,382±0,028 Р=0,037С/

Примечания: е.о.и. - единицы окислительного индекса (Е!3;/Е32о-первичные, Е:7в/Е:;Гвторичные продукты, Е4(ю / Ег:о - конечные продукты, извлекаемые гептановой ч изопропанояыюй фазами липидного экстракта), и - критерий Манна-Уитни.

Для печени характерно снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов, при одновременном снижении уровня изопропанол-растворимых Шиффовых оснований. Кроме того, в органе наблюдалось снижение содержания уровня Ре+2 / Н2О2 - индуцированного карбонилирования белков.

В головном мозге ложнооперированных животных наблюдалось статистически значимое ограничение ОМБ по сравнению с контролем (таблица 4).

Полученные результаты свидетельствуют об органо-специфичных изменениях свободно-радикального окисления при ложной операции, что отражает особенности хирургического стресса. Поэтому активация ПОЛ в брюшине, а также в тимусе, костном мозге может быть связана со стрессорными гормонами. Усиление карбонилирования белков в тимусе и в костном мозге может быть связано с глюкокортикоид - зависимой активацией протеолиза.

У ложнооперированных животных, как и при гипокинезии, в перитонеальных смывах зарегистрировано появление нентрофильных гранулоцитов (до 9,3±4,19 % от общего количества лейкоцитов, Р=0,014и). Уместно обратить внимание на положительную корреляционную зависимость между количеством нейтрофилов, инфильтрировавших брюшину, и уровнем гептан - растворимых Шиффовых оснований (^=0,576; Р=0,034). Отмечено увеличение показателей спонтанного (с 37,85±2,78 до 63,75±3,29, Р=0,014Ц) и индуцированного (с 39,42±1,37 до 63,75±4,28, Р=0,014и) НСТ-теста при одновременном снижении активности фагоцитоза (с 44,57±3,33 до 29,12±3,16, Р=0,014и).

Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и во внутренних органах при ложной операции на фоне длительного ограничения двигательной активности

Установлено, что ложная операция на фоне 30 - суточной гипокинезии характеризовалась увеличением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в перитонеальных смывах. Одновременно повышалась устойчивость к Ре+2/Н202 - индуцированному карбонилированию белков (таблица 5).

Операционный стресс после ГКЗО привёл к усилению липопероксидации при одновременном снижении карбонилирования белков в вилочковой железе (таблица 5).

Усиление ПОЛ в тимусе проявлялось в повышении содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ. Активация свободно-радикального окисления в селезёнке проявлялась в увеличении содержания всех категории гептан-растворимых продуктов ПОЛ, а также повышения содержания карбонилированных белков. В костном мозге, в отличие от селезёнки, наблюдалось снижение карбонилирования белков.

Таблица 5

Влиянне предварительной гипокинезии на липопероксидацию и карбоннлирование белков в перитонеальных смывах и внутренних органах при ложной операции

Показатель Ложная операция (п=8) ГК30 + Ложная операция

Диеновые конъюгаты изопропапольная фаза, е.о.и., Перитонеалыше смывы 0,777±0,072 0,826±0,084 Р=0,028Ъ'

Окислительная модификация белка (индукция Ре* / Н2О2), мкМ/г белка, Перитонеалыше смывы 2,25±0,201 1,66±0,12 Р=0,03217

Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Тимус 1,005±0,07 1,019±0,068 Р=0,Ш7и

Диеновые конъюгаты изопропапольная фаза (индукиия /аскорбат), е.о.и.. Костный мозг 2,12±0,007 2,34±0,004 Р=0,015и

Днеповые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и.. Селезенка 0,588±0,058 0,657±0,058 Р=0,04213

Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. Селезенка 0,012±0,009 0,015±0,005 Р=0,02513

Шпффовы основания гептановая фаза, е.о.и.. Селезенка 0,008±0,002 0,018±0,005 Р=0,01би

Днеповые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Печень 0,515±0,022 0,536±0,01 Р=0,017(3

Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и.. Печень 0,174±0,0041 0,22±0,03 Р=0,02413

Окислительная модификация белка мкМ/г белка. Тимус 0,249+0,008 0,141±0,006 Р=0,018и

Окислительная модификация белка мкМ/г белка. Костный мозг 1,13±0,11 2,3±0,05 Р=0,027и

Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка 1,922±0,321 2,268±0,98 Р=0,04213

Окислительная модификация белка (индукция /ч!** /Н2О1), мкМ/г белка, Селезенка 6,602±1,245 7,477±2,123 Р=0,04513

Окислительная модификация белка мкМ/г бака. Головной мозг 0,215±0,04 0,208±0,05 Р=0,00913

Примечания: е.о.и. - единицы окислительного индекса (Еиу'Е'я-первичные, Ег^'Еу^вторичные продукты, Е40о / Е220 — конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами лииидного экстракта). V - критерий Манна-Уитни.

В печени животных, подвергнутых ложной операции после ГКЗО наблюдалось увеличение содержания неполярных продуктов ПОЛ. В головном мозге (таблица 5), отмечено снижение содержания карбонилированных белков на базальном уровне.

Таким образом, осуществляемый после завершения ГКЗО операционный стресс характеризовался увеличением содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ во внутренних органах и органо - специфичным изменением уровня карбонилирования белков.

Ложная операция на фоне 30 - суточной гипокинезии характеризовалась уменьшением количества нейтрофилов в перитонеальных смывах (с 9,3±1,19% в группе «ложная операция» до 3,6±0,31% в группе «ГКЗО + ложная операция», P=0,044U), при неизменной функциональной активности. Отмечено наличие положительной корреляционной зависимости между уровнем изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов и количеством нейтрофилов в перитонеальных смывах (1^=0,745; Р=0,018).

Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах при CLP -перитоните

В перитонеальном экссудате животных с CLP - перитонитом наблюдалось снижение содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ при одновременном увеличении содержания изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов, а также базального уровня окислительно модифицированных белков и уровня Fe^/HjOi индуцированного карбонилирования (таблица 6).

Таблица 6

Содержание продуктов липопероксидации и карбонилирования

белков в перитонеальных смывах при CLP - перитоните

Показатель Ложная операция (п=8) Перитонит (п=12)

Диеновые коиъюгаты гептановая фаза, е.о.и. 0,765±0,04 0,691 ±0,09 P=0.014U

Кетодиены и сопряжённые триепы гептановая фаза, е.о.и. 0,154±0,01 0,113±0,02 P=0,027U

Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и. 0,084±0,02 0,0L6±0,002 P=0.014U

Диеновые коиъюгаты юопропанольная фаза, е.о.и. 0,778±0,015 0,812±0,04 P=0,027U

Окислительная модификация белка .мкМ/г белка 0,584±0,023 0,999±0,054 P=0,044U

Окислительная модификация белка (индукция Ее2* / Н;02), мкМ'г бака 7,17±0,201 7,37±0Д01 P=0.022U

Примечания: е.о.и. — единицы окислительного индекса (Ец^Епо-псрвичные, Ег^Егзг вторичные продукты, Еш / Е220 — конечные продукты, извлекаемые гептановой и топропанолъной фазами липидного экстракта). V - критерий Манна-Уитни.

В исследованных внутренних органах специфично менялось соотношение между липопероксидацией и окислением белков (таблица 7).

Так, в вилочковой железе наблюдалось снижение содержания гептан -растворимых диеновых конъюгатов при одновременном увеличении содержания диеновых конъюгатов в изопропанольной фазе. В тимусе также снижался уровень карбонилированных белков.

Для селезёнки характерно увеличение содержания карбонилированных белков и гептан-растворимых Шиффовых оснований. Для костного мозга характерно снижение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований на фоне увеличения уровня Ре+2/аскорбат индуцированного ПОЛ. Таким образом, среди иммунных органов наиболее эффективной антиоксидантной защитой при CLP - перитоните обладает костный мозг. В печени по сравнению с ложнооперированными животными было обнаружено увеличение уровня Fei2/acKOp6aT - индуцированного ПОЛ. Кроме того, в органе снижалось содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов и увеличилось содержание гептан-растворимых диеновых конъюгатов (таблица 7).

Одновременно снижалась активность печёночной МАО-Б с 3,92±0,48 нМ / мг белка / мин (п=9) до 1,42 ±0,21нМ / мг белка / мин (п=9;Р=0,02Ш). В связи с этим интересно отметить положительную корреляционную связь между активностью МАО-Б и содержанием изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов (Rs=0,714; Р=0,023).

При экспериментальном перитоните по сравнению с ложнооперированными животными наблюдалось увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге в ответ на индукцию в системе Фэнтона. Кроме того, по сравнению с ложнооперированными животными снижалось содержание общего белка в органе. Это даёт основание предполагать, что усиленное карбонилирование белков является механизмом активации протеолитических процессов в органе. Усилению карбонилирования белков в органе сопутствовало увеличение активности церебральной МАО-Б. В связи с этим заслуживают внимания положительные корреляционные зависимости между содержанием карбонилированных белков и уровнем активности церебральной МАО-Б (Rs=0,639; Р=0,025).

В перитоиеальном экссудате животных с CLP - перитонитом наблюдалось увеличение содержания нейтрофилов до 38,6±9,31 %, P=0,014U (в сравнении с группой «ложная операция»). Прирост содержания нейтрофилов сопровождался снижением их фагоцитарного числа (с 0,96±0,15 до 0,651 ±0,04, Р=0,038 U).

Таблица 7

Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков

во внутренних органах при СЬР - перитоните

Показатель Ложная операция (ч=9) Перитонит 0'=9)

Диеновые копыогаты гептаиовая фаза, е.о.и.. Тимус 0,900±0,07 0,975+0,101 Р=0,027и

Диеновые копыогаты изопропанольная фаза, е.о.и.. Тимус 0,851±0,072 1,07±0,085 Р=0,028и

Шиффовы основания гептаиовая фаза, е.о.и., Селезенка 0,08±0,004 0,025±0,007 Р=0,026 и

Шиффовы основания гептаиовая фаза, е.о.и.. Костный мозг 0,031 ±0,009 0,019±0,002 р-о.опи

Дкеиовые конъюгагы изопропанольная фаза (индукция Ее2*7аскорбат), е.о.и.. Костный мозг 0,956+0,087 1,98+0,11 Р=0,017и

Диеновые копыогаты изопропанольная фаза. е,о.и., Гплавной мозг 0,730±0,061 2,94+0,191 Р=0,02ШУ

Диеновые копыогаты изопропанольная фаза (индукция Ре" /аскорбат).е.о.и.. Головной мозг 1,037±0,92 0,906±0,102 Р=0,027ЮГ

Кетодиены и сопряжённые трнеиы изопропанольная фаза (индукция Ре2* / аскорбат),е.о.и.. Головной мозг 1,243±0,154 0,875±0,081 Р=0,0171!

Диеновые конъюгагы изопропанольная фаза, е.о.и., Печень 0,612±0,043 0,56±0,024 Р=0,026 и

Диеновые копыогаты изопропанольная фаза (индукция Ре'*/аскорбат),е.о.и.. Печень 1,588±0,12 1,96±0,098 Р=0,026 и

Кетодиены и сопряжённые трнены изопропанольная фаза (индукция Ре2*/аскорбат), е.о.и.. Печень 6,15+0,36 8,64±0,42 Р=0,026 и

Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус 0,2496±0,098 0,1981=0,012 Р=0.027 Ц'1У

Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка 1,9±3,321 2,47+1,12 Р-!).01711

Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг 0,157+0,014 0,345+0,029 Р=0,044и

Окислительная модификация белка (индукция Ре' / Н;0;), мкМ/г белка, Головной мозг 3,294+2,28 6,69±3,123 Р=0,04417

Примечания: е.о.и. - единицы окислительного индекса (Е2з^Е2;о-первичные, Е^Е^го-вторичные продукты, Ет / Е220 — конечные продукты, изрекаемые гептановой и изопропанолыюй фазами липидного экстракта). и - критерий Манна-Уипши.

Влияние предварительной гипокинезии на свободно-радикальное окисление в перитонеальных смывах и во внутренних органах при септическом перитоните

CLP - перитонит, воспроизводимый после завершения ГКЗО, характеризовался относительным снижением содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований и увеличением окислительной модификации белка в перитонеальных смывах (таблица 8).

Таблица 8

Свободнорадикальное окисление в перитонеальных смывах

при CLP - перитоните, воспроизводимом на фоне гипокинезии

Показатель 1 Ложная перацпя 2 Перитонит (п=12) 3 ГКЗО +Пернтонит (п=12)

Шнффоиы основания гептановая фаза, е.о.н. 0,084±0,02 0,016±0,002 Р, ¡=0,014U 0,008±0,0003 Р, ,=0.024U

Окислительная модификация белка, мкМ/г белка 0,147-0,023 0,491 ±0,034 PU=*0,044U 1,22±0,072 P2;=0.044U

Примечания: е.о.н. - единицы окислительного индекса (ЕиуЕкогпервичные, Езя/Еяогвяюричные продукты, Ет / Е:.ю - конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). V - критерий Манна-Учтни.

При этом снижается уровень липопероксидации в печени, что проявляется в более низком уровне гептан-растворимых диеновых конъюгатов. В костном мозге снижено содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Одновременно наблюдалось увеличение эффективности антиоксидаитной защиты костного мозга. Так, в группе «ГКЗО+перитонит» отмечен более высокий уровень Ре+2/аскорбат индуцированного ПОЛ, что свидетельствует об увеличении окисляемостн ацильных радикалов в полярных липидных фракциях (таблица 9).

В головном мозге, напротив, в группе «ГКЗО+перитонит» повышено содержание вторичных гептан-растворимых продуктов ПОЛ. В тимусе повышено содержание как гептан-растворимых диеновых конъюгатов, так и изопропанол - растворимых кетодненов и сопряжённых триенов. В селезёнке также повышено содержание гептан-растворимых диеновых конъюгатов (таблица 9).

Таблица 9

Показатели свободнорадикального окисления во внутренних органах

при моделировании перитонита у стрессированных животных (М±т)

Показатель 1 Ложная операция (п=Л) 2 ГК30 + Ложная операция (п=32) 3 Перитонит (,,=23) 4 ГК30+ Перитони т (4=11)

Головной мозг

Кетодиеиы и сопряжённые триены гептановая фаза, e.o.u. 0,012±0,04 0,010±0,01 0,012*0,02 0,018*0,05 Рз,4=0,00би

Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe~*/аскорбат),e.o.u.. 1,23*0,15 1,15*0,33 1,15*0,05 1.39*0.07 P3,4=0.006U

Печень

Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о. и. 0,515*0,084 0,536*0,09 0,547*0,03 0,523*0,04 P3.4=0,028U

Кетодиеиы и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о. и. 0,174 ±0,02 0,22*0,01 0,19*0,01 0,13*0.02 P3.4=0,006U

Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe~*/аскорбат),е.о.и.. !,59±0,08 1,97*0,04 1,96*0,06 2,36*0,19 P3,4=0,017U

Костный мозг

Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза е.о.и. 0,48*0,06 0,47±0,1 0,51*0,03 0,45*0,09 Р3.4=0,0035 и

Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ /аскорбат),е.о.и., 2,12*0,34 2,34*0,56 2,38*0,09 1,98*0,04 fj.rC.0IU

Селезёнка

Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. 0,588*0,15 0.657*0,2 0,567*0,07 0,670*0,03 Р, 4=0,01 и

Тимус

Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. 1,005*0,024 1,01*0,018 Р12=0,0Ш 0,975±0,071 0,988*0,08 P,.4=0,01U

Примечания: с.о. и. — единицы окислительного индекса (Е2п'Е22г первичные. Е 27*Е220-вторичные продукты. Е,т / Ецо — конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанолыюй фазами липидного экстракта). II - критерий Манпа-Уитни.

Предварительная гипокинезия существенно повлияла на клеточный состав воспалительного экссудата при CLP - перитоните (таблица 10).

Это проявлялось в увеличешш количества нейтрофильных гранулоцитов при одновременном снижении количества лимфоцитов. Кроме того, гипокинетический стресс ограничивает снижение фагоцитарного числа, вызванное септическим перитонитом (таблица 10).

Таблица 10

Клеточный состав перитонеалъных смывов при CLP - перитоните у стрессированных животных (М±т)_

Показатель 1 Ложная операция 2 Перитоиит (п=7) 3 Г|ІІ10КІШЄЗИЯ+ Перитонит (¡1=10)

Лейкоциты (*10°/л) 69,17±3,96 74,50±4,16 89,46±3,81 Р2.з=0,0161)

Нсйтрофилы (%) 9,3±4,19 38,6+9,31 P=0,014U 62,7±2,87 P2,J=0,027U

Лимфоциты (%) 83,25±6,25 47,2±5,01 P=0,014U 36,8±4,431 P2,3=0,019U

Фагоцитарное число 0,96+0,15 0,651 ±0,04 Р=0,038 U 0,894±0,005 Р;.з=0,044 U

Примечание к таблице: U - Критерий Манна - Уитни

Основным итогом выполненного исследования является обнаруженный факт усугубления воспалительного процесса в брюшной полости на фоне 30 -суточной гипокинезии. Таким образом, экспериментально показана возможность развития осложнений при перитоните в результате длительного ограничения двигательной активности, что необходимо учитывать в хирургической практике.

Прежде всего, это связано с провоспалительными эффектами ГКЗО в брюшине. Их наличие может быть связано с гилерцитокинемией, характерной для гипокинезии (Сысаков Д.А., 2009). Вероятно, последствием гиперцитокинемни является формирование градиентов хемоагграктантов.

При ГКЗО, также как и при экспериментальном перитоните, продукты свободнорадикального окисления обладают бактерицидным действием и вносят свой вклад в элиминацию инфекционных агентов при септическом перитоните (Бкаи Т й а1.,1986). Кроме того, они выступают в роли хемоагграктантов для лейкоцитарных клеток (Маянский Д.Н.,1991). Гипокинезия оказывает аддитивное действие на перитонит-зависимое усиление окислительной модификации белков в воспалительном очаге. Вполне возможно, что это способствует реализации провоспалительных эффектов стресса применительно к экспериментальному перитониту.

выводы

1. У животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии, как и у ложнооперированных животных, наблюдается увеличение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований в перитонеальных смывах, что ассоциируется с появлением в них иейтрофильных гранулощггов.

2. Осуществляемый после завершения ГК30, операционный стресс характеризуется увеличением содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ во внутренних органах и органо - специфичным изменением уровня карбонилирования белков.

3. В перитонеальных смывах при септическом перитоните наблюдается усиление окислительной модификации белка, снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов и увеличение количества нейтрофилов со сниженным фагоцитарным числом.

4. Моделирование перитонита на фоне предварительной 30 - суточной привело к снижению уровня гептан-растворимых Шиффовых оснований, показателей НСТ - теста и уровня фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне увеличения их количества в перитонеальных смывах.

5. В печени и в головном мозге 30 - суточная гипокинезия с септическим перитонитом приводит к усилению Рет2/аскорбат-индуцированного ПОЛ. При этом в печени снижается, а в головном мозге увеличивается содержание гептан-растворимых продуктов ПОЛ.

6. Сочетание 30 - суточной гипокинезии с септическим перитонитом приводит к повышению содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в тимусе и селезёнке и в снижении содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов в костном мозге.

Список опубликованных работ:

1. Tseilikman, V.E. Stress-induced hepatitis and sensitivity to pro-inflammatory cytokines and glucocortikoids / V.E.Tseilikman, O.B. Tseilikman, M.I. Nusratov, S.V.Popov, D.A.Kozochkin // European journal of Immunology Supplement 1/09. Immunity for life Immunology for health Abstracts 2nd European congress of Immunology September 1316, 2009 Berlin, Germany.

2. Tseylikman, V.E. Endocrine-immune interaction under stress conditions on hypertensive and normotensive rats / V.E. Tseylikman, О. B. Tseyliman, D.A. Kozochkin, A.I. Sinitsky, S.V.Popov, E.S. Katashinsky, A.M. Mironov // The journal of Physiological Sciences Proceedings of the XXXVI International Congress of Physiological Sciences Function of Life: Elements and Integration July 27-August 1, 2009, Kyoto, Japan.

3. Лаптева, И.А. Состояние свободаюраднкального окисления в эритроцитах и во внутренних органах при гипокинетическом и иммобнлизациопном стрессе / И.А. Лаптева, А.Б. Горностаева, Д.А. Козочкнн, Д.А. Романов, С.В. Попов // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лнфшица. Челябинск. - 2009. - С. 57.

4. Цейликмаи, В.Э. Модифицирующее влияние хронического сгресса на реакцию лейкоцитарного звена системы крови и процессы свободнорадикалыюго окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните / В.Э. Цейликмаи, М.И. Нусратов, С.В. Попов, Е.В. Плеханова, Р.В. Деев // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск но аллергологии и иммунологии. -2010- № 2/1 (29). - С.226-227.

5. Плеханова, Е.В. Изменение функционального статуса нейтрофилов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек у крыс при стрессе и его сом (паи ни с экспериментальным перитонитом / Е.В. Плеханова, В.Э. Цейликмаи, Д.А. Козочкин, С.В. Попов, А.И. Синицкий // Вестник Уральской медицинской академической науки Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии, биотехнологии.- 2011.-№4/1 (38) С.145-146

6. Плеханова, Е.В. Изменение функционального статуса нейтрофнлов, количества нейтрофильных внеклеточных ловушек и уровня свободно-радикального окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните J Е.В. Плеханова, В.Э. Цейлнкмап, М.И. Нусратов, Т.В. Соломатова, С.В.Попов // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2011.-№2/1.-С. 61-62.

7. Плеханова, Е.В. Изменения функционального статуса нейтрофилов при экспериментальном стрессе микробной и немикробной этиологии у животных / Е.В. Плеханова, Е.Л.Мезепцева, И.Ю.Орнер, В.Л.Маркова, А.И.Синицкин,

С.В.Попов // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2012.-№2 (39).- С.112-113.

8. Стрельников, И.В. Влияние предварительной пшокниезии на глюкокортнкоид-зависимые изменения поведенческой активности и свободно-радикального окисления в различных отделах головного мозга / И.В.Стрелышков, В.Э. Цейликман, Д.А. Козочкнн С.В.Попов, АЛ. Цытович, Л.Ф. Чарная // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2012.- №2.- С.113 -114.

Список использованных сокращений:

ГК - гипокинезия

ГКЗО - тридцати суточная гипокинезия ДК — диеновые конъюгаты

КДиСТ - кетодиеновые сопряженные с триеновыми

МАО-Б - моноаминоксидаза-Б

ОМБ - окислительная модификация белка

ПОЛ - перекисное окисление лигшдов

ШО - Шиффовы основания

и - критерий Манна-Уитни

- критерий Вальда-Вольфовица

Работа проведена в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы. Соглашение №8275 от 23.10.2012 (НОЦ " Проблемы фундаментальной и клинической медицины ").

На правах рукописи

ПОПОВ Сергеи Владимирович

Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях экспериментального перитонита

03.01.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2013

Подписано в печать 21.03,2013 г. Отпечатано в типографии ООО фпрма "Нрессш" 22.03.2013 г. Формат 60*84 1/16. Гарнитура Times New Roman Суг. Бумага офсетная. Лазерная печать. Объем 1,4 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Попов, Cергей Владимирович, Челябинск

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБР АЗОВ АНИЯ «ЧЕЛЯБИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ»

042 01 3 5 7869 ^а Правахрукописи

Попов Сергей Владимирович

СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ПРИ ГИПОКИНЕЗИИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПЕРИТОНИТА

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович

Челябинск - 2013

Содержание

Список использованных сокращений....................................................................................................3

Введение..................................................................................................................................................................................4

Актуальность темы....................................................................................................................................................4

Цель исследования..........................................................................................................................................................5

Задачи исследования....................................................................................................................................................5

Научная новизна..............................................................................................................................................................6

Теоретическое значение и практическое значение......................................................................................7

Положения, выносимые на защиту..............................................................................................................7

Апробация работы........................................................................................................................................................7

Публикации..............................................................................................................................................................................8

Структура и объем диссертации..................................................................................................................8

Глава 1. Роль стресса и процесса свободнорадикального окисления в

патогенезе перитонита..................................................................................................................................................9

Глава 2. Материалы и методы исследования................................................................................31

2.2. Общая характеристика экспериментальных моделей....................................................31

2.3.Методы анализа изучаемых явлений..............................................................................................................32

Определение биохимических параметров......................................................................................................................32

Гематологические методы..................................................................................................................................................................35

Статистический анализ результатов..............................................................................................................................38

Глава 3. Результаты исследования..............................................................................................................39

3.1. Реакция системы крови при ложной операции....................................................................................40

3.2. Соотношение между ПОЛ и карбонизированием белков во внутренних органах у ложноперированных животных..............................................................................................................43

3.3. Реакция системы крови при CLP - перитоните................................................................................50

3.4 Состояние свободнорадикального окисления внутренних органов при

CLP - перитоните..............................................................................................................................................................................................53

3.5 Особенности реакции системы крови при гипокинезии..........................................................59

3.6 Влияние процедуры ложной операции на реакцию системы крови у стрессированных животных............................................................................................................................................................61

3.7 Влияние процедуры ложной операции на свободнорадикальное окисление внутренних органов у стрессированных животных................................................63

3.8 Влияние дополнительной процедуры ложной операции на вызванные 30 - суточной гипокинезией изменения свободнорадикального окисления в брюшине, крови и во внутренних органов у стрессированных животных..........64

3.9 Влияние предварительных стрессорных воздействий на реакцию лейкоцитарного звена системы крови при септическом перитоните......................69

3.10 Влияние предварительных стрессорных воздействий на состояние

свободно-радикального окисления в условиях CLP — перитонита......................................73

Обсуждение........................................................................................................................................................................76

Заключение.....................................................................................

Выводы......................................................................................................................................................................................101

Список литературы....................................................................................................................................................102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидантная защита

ГГАС - гипотоламо-гипофизарно-адреналовая система ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ГК-гипокинезия

ДБФ - дибензилфлюоресцеиндебензилазная активность

ОМБ-окислительно-модифицированные белки

IL-1 - интерлейкин 1

IL-6 - интерлейкин 6

TNF - туморнекротический фактор

U - критерий Манна-Уитни

X - критерий Колмогорова-Смирнова

ТКФ - точный критерий Фишера

ФНО - фактор некроза опухолей

WW - критерий Вальда-Вольфовица

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Патогенез перитонита включает в себя развитие воспалительного процесса в результате абдоминальной инфекции с возможной делокализацией воспалительного очага, что сопровождается интоксикацией, синдромом системного воспалительного ответа (SIRS) и полиорганной недостаточностью, развитие которой приводит к летальному исходу. По мере прогрессирования перитонита больной в течение продолжительного времени вынужден находиться в условиях ограничения двигательной активности (гипокинезии).

Дезадаптивные последствия гипокинезии как состояния с низкой двигательной активностью очевидны. Накоплен значительный фактический материал, свидетельствующий о нарушении процесса окисления и фосфорилирования в митохондриях, снижении активности ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, нарушении белкового, углеводного и липидного обмена, активацией свободно-радикального окисления. Гипокинезия может выступать в качестве кондиционального фактора, способствующего развитию как самого перитонита, так и формированию его осложнений. Это связано с нарушениями моторики желудочно-кишечного тракта, а также барьерной функции слизистой оболочки кишечной стенки, вызванными ограничением двигательной активности. Кроме того, в результате сопутствующего стресса, гипокинезия может способствовать развитию глюкокортикоид-зависимой бактериемии интестинального происхождения (Зурочка А.В.,1984).

Не исключено, что в результате гипокинетического стресса модифицируется функциональная активность фагоцитирующих клеток в воспалительном очаге, что может само по себе снижать антимикробную резистентность и способствовать прогрессированию перитонита. Известно, что функциональная активность полиморфноядерных лейкоцитов непосредственно зависит от свободно-радикального окисления. Вместе с тем, имеются данные о причастности процессов свободно-радикального

окисления к развитию осложнений при воспалительной патологии (Zhang R. et al., 2002). Известно, что с усилением свободно-радикального окисления внутренних органов связано развитие полиорганной недостаточности (Лейдерман И.Н., 1999). Известно, что у крыс 30 суточная гипокинезия способствует усилению липопероксидации и карбонилирования белков во внутренних органах (Тимофеева Т.Г., 2012).

Однако остаётся неизвестным как длительное ограничение двигательной активности отражается на характере свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и внутренних органах при экспериментальном перитоните. Между тем решение этого вопроса помогло бы понять механизмы прогрессии перитонита в условиях гипокинезии.

Цель исследования: Установить особенности модифицирующего влияния 30 - суточной гипокинезии на уровень липопероксидации и карбонилирования белков в очаге воспаления, органах системы крови, печени и головном мозге при экспериментальном перитоните.

Задачи исследования:

1. Определить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии и ложной операции.

2. Определить особенности свободно-радикального окисления в органах системы крови, печени и головном мозге животных, подвергнутых 30 -суточной гипокинезии и ложной операции.

3. Исследовать особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при экспериментальном септическом перитоните.

4. Изучить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при септическом перитоните, воспроизводимом на фоне 30 - суточной гипокинезии.

5. Изучить состояние свободно-радикального окисления в головном мозге и печени в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.

6. Изучить состояние свободно-радикального окисления в органах системы крови в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.

Научная новизна. Впервые установлено, что 30 - суточная гипокинезия сопровождается увеличением содержания гептанофильных продуктов ПОЛ при неизменном уровне окислительной модификации белков в перитонеальных смывах. Установлено, что хирургический стресс, осуществляемый на фоне 30 - суточной гипокинезии, приводит к приросту содержания продуктов ПОЛ не только в перитонеальных смывах, но и в тимусе, селезенке и печени. Установлено, что при септическом перитоните угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов ассоциируется со снижением липопероксидации и усилением карбонилирования белков в перитонеальных смывах. Установлено, что предварительное воздействие 30 -суточной гипокинезии усугубляет окислительную деструкцию белков в перитонеальных смывах, вызванную септическим перитонитом. Обнаружено, что при септическом перитоните соотношение между липопероксидацией и окислением белков имеет органоспецифический характер: в тимусе усилилось ПОЛ при снижении ОМБ, в селезенке наоборот снижение ПОЛ и усиление ОМБ. В костном мозге усиление ПОЛ. Увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге сопряжено с увеличением активности церебральной МАО-Б. Септический перитонит на фоне

гипокинезии сопровождается приростом содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в головном мозге.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты уточняют свободно-радикальные механизмы развития воспалительных осложнений в условиях длительного ограничения двигательной активности. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых путей фармакологической коррекции септического перитонита, предусматривающих использование антиоксидантов. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России.

Положения, выносимые на защиту

1. Длительное ограничение двигательной активности приводит к усилению свободно-радикального окисления в брюшине и вызывает органо-специфичные изменения свободно-радикального окисления во внутренних органах.

2. Предварительная гипокинезия усугубляет снижение липопероксидации и повышение карбонилирования белков в брюшине, вызванные септическим перитонитом, усиливая при этом нейтрофильную инфильтрацию воспалительного очага.

3. Предварительная гипокинезия модифицирует соотношение между липопероксидацией и карбонилированием белков во внутренних органах при септическом перитоните.

Апробация работы

Основные положения работы изложены и представлены на 2nd European congress of Immunology «Immunity for life Immunology for health» (Berlin, 2009); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня

рождения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009); на XXXVI International Congress of Physiological Sciences (IUPS2009) Function of Life: Elements and Integration (Kyoto, Japan, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 - в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Уральской медицинской академической науки).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 220 источников: 102 - на русском языке и 118 - иностранных. Работа содержит 32 таблицы.

9

Глава 1

РОЛЬ СТРЕССА И ПРОЦЕССА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ПАТОГЕНЕЗЕ ПЕРИТОНИТА

1.2 Роль нейтрофилов и окислительного стресса в иатохимии перитонита

Современная концепция воспаления представляет его как местную защитно-приспособительную сосудисто-тканевую реакцию живых систем на повреждающее действие флогогена, эволюционно сформировавшуюся как способ сохранения целого организма ценою повреждения его части и направленную на восстановление гомеостаза (Адо А.Д., 2000). Перитониты, независимо от причины, в подавляющем большинстве случаев представляют собой типичное бактериальное воспаление. Наиболее частыми возбудителями гнойных перитонитов являются кишечная палочка (65%) и патогенные кокки (30%). В современных условиях отмечается также значительная активация условно-патогенной флоры, участвующей в нагноите льном процессе в брюшной полости: необлигатных анаэробов, бактероидов и пр. Поэтому, первичным звеном защиты от патогенна являются фагоцитирующие клетки.

Результативность фагоцитов в целях защиты от флогогена обеспечивается согласованным действием различных механизмов: продукцией активных форм кислорода, высвобождением лизосомальных ферментов, катионных белков и других бактерицидных агентов. Однако высокая токсичность механизмов защиты приводит к вторичному повреждению окружающих тканей, микрососудов и самых близких мишеней - клеточных структур самих фагоцитарных клеток, ограничивая эффективность и срок жизнедеятельности последних (Simon H.U. et al., 1997; Dibbert В. et al., 1999; Маянский A.H., Маянский Д.Н., 1989; Зенков Н.К. и соавт., 1996).

В очаге воспаления (OB) основным источником АФК являются активированные нейтрофилы, выступающие эффекторами и модуляторами

воспалительного процесса (Маянский Д.Н., 1991; Rosen G.M. et al., 1995; Маянский Д.Н., 1998; Bergendi L. et al., 1999; Rutkowski R. et al., 2007). Накопление АФК происходит за счет явления, называемого «дыхательным» или «респираторным взрывом». Взаимодействие чужеродных частиц (опсонизированные бактерии, их экзо- и эндотоксины, антигенные структуры, латекс) с поверхностью нейтрофилов вызывает активацию клеток, выражающуюся в перестройке метаболизма - увеличении ионной проницаемости клеточной мембраны, резком возрастании (в десятки раз) потребления кислорода и глюкозы. Стимуляция окисления глюкозы в пентозофосфатном пути потенцирует образование НАДФН, восстановительная способность которого используется НАДФН-оксидазой нейтрофилов для частичного восстановления молекулы О2 путем присоединения электрона (Маянский А.Н., 2007). Продукт этой реакции супероксидный анион-радикал (О2' ) является первичной свободно-радикальной АФК и быстро преобразуется в другие более токсичные формы, применяемые нейтрофилом в микробицидных целях (Rosen G.M. et al., 1995; Владимиров Ю.А., 2000; Рябов ГА. и соавт., 2001; Бурлакова Е.Б., 2006; Дубинина Е.Е., 2006; МеньщиковаЕ.Б. и соавт., 2006; Sun J. et al., 2010).

Важную роль АФК в защите организма от патогенной микрофлоры доказывает факт развития хронического септического гранулематоза при инактивирующей мутации мембранного НАДФН-оксидазного комплекса, когда поглощаемые при фагоцитозе бактерии не погибают, а их персистенция приводит к повторным хроническим инфекциям вплоть до развития сепсиса (Меныцикова Е.Б. и соавт., 2004; Nathan С., 2006). Эффективный фагоцитоз патогена с дальнейшим апоптозом нейтрофилов является фундаментальным биологическим процессом, необходимым для удаления флогогена и успешного разрешения OB (Vignola А.М., 2000; Nathan С., 2006).

Нейтрофильные лейкоциты обладают значительно большим окислительным потенциалом, чем другие фагоциты, поскольку в ответ на стимуляцию генерируют очень высокий (выше, чем у моноцитов и

макрофагов) уровень АФК. Например, при стимуляции форболовым эфиром миристатацетата нейтрофилы продуцируют Н202 в концентрации 17,0±3,10 нмоль/(106клеток-ч), а моноциты - 13,0±2,81 нмоль/(106клеток-ч) (Geertsma M.F. et al., 1993).

Лавинообразный синтез АФК важен для борьбы организма с патогеном, но именно «дыхательный взрыв» становится основной причиной формирования ОС не только в очаге OB, но и в самих нейтрофильных гранулоцитах (Klebanoff S.J., 1992; Шепелев А.П. и соавт., 2000; Рябов Г.А. и соавт., 2001; Peake J., Suzuki К, 2004). Возникновению состояния ОС способствует недостаточность системы антиоксидантной защиты (АОЗ), когда неконтролируемое производство АФК п