Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение антиоксидантной активности биологических жидкостей хемилюминесцентным методом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Определение антиоксидантной активности биологических жидкостей хемилюминесцентным методом"

- _ На правах рукописи

од ->ао

/6

'г ОН"

ЛЮБИЦКИЙ Олег Борисович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕПТНЫМ

МЕТОДОМ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва -1999

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете (Москва).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Г. И. Клебанов. Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, профессор О. А. Азизова, доктор медицинских наук, профессор А. К. Журавлёв.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского МЗ РФ.

Защита состоится " . " . У^Рг^. . . . 1999 г. в 14 часов на заседании Диссертационнс совета К.084.14.04 в Российском государственном медицинском университете по адре 117869, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан " . .. ".......... 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук И.В. Буромскш

к

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ктуальность исследования. Известно, что в организме человека и животных юбоднорадикальное окисление (СРО) биомолекул является нормальным :таболическим процессом. Основными механизмами активации СРО при этом являются: гачительное увеличение выработки активных форм кислорода (АФК) и высвобождение политически активных ионов железа из вне- и внутриклеточных депо [Осипов А.Н. и )., 1990, Владимиров Ю.А. и др., 1991]. Однако, несмотря на то, что СРО непрерывно ютекаст во всех органах и тканях, оно не приводит к развитию их радикального )вреждения, поскольку для каждой ткани характерно поддержание указанного процесса I определённом стационарном уровне. Эта стационарность в определённой степени »стигается за счёт функционирования согласованной системы ингибирования СРО, стоящей из системы контроля за содержанием АФК и системы связывания ионов злеза. Однако, при многих патологических состояниях происходит нарушение этой ационарности за счёт усиления СРО биомолскул и/или ослабления системы его [гибирования, что приводит к усилению перекисного окисления липидов клеточных ;мбран и липопротеинов, денатурации белков и повреждению нуклеиновых кислот [alliwell В et al., 1986]. Это послужило патогенетическим обоснованием применения для чения многих заболеваний различных экзогенных природных и синтетических [гибиторов СРО. В настоящее время в клинике широко используются такие ингибиторы к аскорбиновая кислота, сс-токоферол, каротиноиды, различные флавоноиды, мезосвязывающие агенты, такие как дссферал, тиол-содержащие соединения [Rice-Evans A. et al., 1993]. Предлагается много других веществ для их клинического использования, (нако, в подавляющем большинстве случаев их применение и подбор доз препарата новывается на эмпирическом подходе, что связано с тем, что не используются или груднепы способы оценки активности и механизма действия данного препарата.

В настоящее время в качестве одного из таких способов используется определение тиоксидантной активности (АОА) веществ, которая показывает способность данного щества, называемого в этом случае антиоксидантом (АО), тормозить СРО в какой-либо »дельной системе [Ilalliwell В. et al, 1990]. Указанный подход применяется для оценки фективности антиоксидантного действия какого-либо вещества или для контроля за стоянием эндогенных АО, которое изучается посредством определения АОА ологических жидкостей.

Известны различные модельные системы для определения АОА веществ и ологических жидкостей, но в целом все они состоят по-крайней мере из двух

компонентов: инициатора окисления и субстрата окисления. Торможе аптиоксидантами СРО в модельных системах оценивается путём оиределе промежуточных или конечных продуктов окисления с помощью хроматографичеа спектрофотометрических, хемилюминссцснтных и других методов. Среди этих мето наибольшей информативностью обладают хемилюминссцентныс методы, кото используют хемилюминесценцию (XJI), сопровождающую окисление определен] субстратов, для непосредственного слежения за кинетикой окисления [Whitehead T.I al., 1992; Popov I.N. et al, 1994; Lissi E.A. et al., 1995]. Это позволяет исследовать времен параметры процесса окисления, что в некоторых случаях помогает определять механ антиоксидантного действия тестируемых веществ. Однако, при иснользова хемилюминесцснтных модельных систем возникает ряд трудностей, связанны) нестабильностью компонентов модельных систем, низкой интенсивностью свече! значительной продолжительностью процедуры определения во времени и трудное интерпретации полученных данных. Поэтому, дальнейшее развитие и совершеиствова хемилюминесцентных способов оценки антиокислительных свойств веществ биологических жидкостей будет, несомненно, содействовать более широкому внедрению в практику медицинских исследований и более полному понима] механизмов процесса СРО биомолскул. Цель н задачи исследования.

Цель работы: разработка хемилюминесцснтных способов изучения АОА и меха mi антиоксидантного действия веществ и биологических жидкостей.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1. Разработать хемилюминесцентныс способы определения АОЛ индивидуальных всщ| и биологических жидкостей.

2. С помощью разработанных способов изучить АОА и механизм антиоксиданти действия различных ингибиторов СРО.

3. С помощью разработанных способов изучить АОА и механизм антиоксиданп; действия плазмы крови и других биологических жидкостей.

4. Исследовать изменения АОА плазмы крови при некоторых патологических процсссг Научная новизна. Разработана хемишоминесцентпая модельная сисп свободнорадикального окисления шоминола (ЛМ), индуцированного сме гемоглобина (Нв) и пероксида водорода (Н2О2) (система HB-H2O2-J] Хемигаоминесценция в системе HB-H2O2-JIM отличается высокой интенсивное поэтому для измерения не требуется чувствительных хемилюминометров. Радикг

Vusiljcva О.V., Lyubitsky O.B., Klcbanov G.I., Vladimirov Yu.A. Effect of antioxidants on с kinctics of chain lipid peroxidation in liposomes. // Cell and membrane biology. 1998, Vol. !(2), pp. 223-231.

Klcbanov G.I., Kapitanov А.В., Teselkin Yu.O., Babenkova I.V., Zhambalova B.A., yubitsky O.B., Nesterova O.A., Vasiljeva O.V., Popov I.N., Lewin G., Vladimirov Yu.A. The itioxidant properties of lycopene. // Cell and membrane biology. 1998, Vol. 12(2), pp. 287-300. Любицкий О.Б., Васильева О.В., Клебанов Г.И., Капитанов А.Б., Тесёлкин Ю.О., ^беикопа И.В., Жамбалова Б.А., Владимиров Ю.А. Антиоксидантные свойства жопина. // Материалы X Международной конференции по химии органических и [емснтоорганических пероксидов. Москва. 1998, В37.

Любицкий О.Б., Давыдов Б.В., Елынанский И.В., Гришин А.В., Теселкин Ю.О., :t6ciiKOBa И.В., Клебанов Г.И., Иванов П.А., Голиков П.II., Владимиров Ю.А. Динамика жазатслей пероксидного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы ■шоротки крови при остром деструктивном панкреатите. // Вопросы медицинской химии. »98, Т. 44, №6, С. 565-570.

Клебанов Г.И., Теселтсин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Владимиров Ю.А. нтиоксидантная активность сыворотки крови. // Вестник Российской академии :дицинских наук. 1999, №2, С. 15-22.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Любицкий, Олег Борисович, Москва

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЛЮБИЦКИЙ Олег Борисович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ

МЕТОДОМ

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, . профессор Г.И. Клебанов

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Сокращения и условные обозначения----------------------------------------------------5

Общая характеристика работы----------------------------------............................6

Актуальность исследования.....................................-..........-................6

Цель и задачи исследования..................................................................................................................8

Научная новизна....................................................................— 8

Практическая значимость...............-.....................-..........................................9

Глава 1. Обзор литературы------------------------------—-----------------------------------------------10

1.1. Свободнорадикальное повреждение при заболеваниях человека и современное состояние антиоксидантной терапии------------------------------------------------------10

1.2. Антиоксиданты биологических жидкостей организма человека — 19

1.3. Модельные системы для определения антиоксидантной

активности биологических жидкостей...............-..........-.......................27

Глава 2. Материалы и методы исследования----------------------------------------34

2.1. Материалы......—.......................................——.........— 34

2.2. Препаративные методы-----------------------------------------------------------------------35

2.2.1. Получение плазмы крови..................-...................-...................35

2.2.2. Получение гемолизата эритроцитов..................................— 35

2.2.3. Приготовление образцов плазмы крови с различной степенью гемолиза........---------------------------------------------------------------------------------35

2.2.4. Получение биологических жидкостей-------------------------------------------36

2.3. Биохимические методы.......................-------------------------------------------------------------36

2.3.1. Фракционирование плазмы крови................................................................................36

2.3.2. Определение концентрации мочевой кислоты в плазме крови — 36

2.3.3. Получение общей фракции фосфолипидов из желтков куриных

яиц..........-.........-..........-........................-.............-.........................37

2.3.4. Приготовление многослойных фосфолипидных липосом.......— 38

2.4. Биофизические методы........................-........-.......................- 38

2.4.1. Измерение хемилюминесценции........................-....................................38

2.4.2. Модельная система гемоглобин-пероксид водорода-люминол — 39

2.4.3. Модельная система окисления суспензии фосфолипидных липосом, индуцированного ионами двухвалентного железа-------------- 39

2.4.4. Измерение спектров флуоресценции люминола..........-............ 39

2.5. Клиническая характеристика больных острым деструктивным панкреатитом...................-.........................------------------------------- 40

2.6. Статистическая обработка результатов —.......................-......... 40

Глава 3. Результаты и их обсуждение....................-....................... 41

3.1. Модельная система гемоглобин-пероксид водорода-люминол------ 41

3.1.1. Кинетики хемилюминесценции и предполагаемая схема химических реакций в системе гемоглобин-пероксид водорода-люминол........................-......................................................... 41

3.1.2. Подбор оптимального соотношения компонентов системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол------------------------------......- 49

3.2. Изучение антиоксидантных свойств веществ с помощью модельной системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол -.......... 55

3.2.1. Влияние ингибиторов свободнорадикального окисления на параметры хемилюминесценции системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол.................................................................... 55

3.2.2. Влияние ингибиторов свободнорадикального окисления на интенсивность флуоресценции люминола.....................................- 62

3.2.3. Определение антиоксидантной активности веществ с помощью системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол.......................... 69

3.3. Изучение антиоксидантных свойств биологических жидкостей с помощью модельной системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол .................................................................................. 72

3.3.1. Влияние плазмы крови на параметры хемилюминесценции системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол......................-— 72

3.3.2. Влияние гемолиза на антиоксидантные свойства плазмы крови в системе гемоглобин-пероксид водорода-люминол........................... 79

3.3.3. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы гемоглобин-пероксид водорода-люминол..........- 82

3.3.4. Исследование изменения антиоксидантной активности плазмы крови человека в системе гемоглобин-пероксид врдорода-люминол

при остром деструктивном панкреатите----------------------------------------- 85

3.3.5. Изучение вклада мочевой кислоты в антиоксидантную активность плазмы крови в системе гемоглобин-пероксид водорода-люминол...............................................................-........-......... 88

3.3.6. Исследование изменения антиоксидантной активности плазмы крови человека и кроликов в системе гемоглобин-пероксид водорода-люминол после однократного перорального приёма аскорбиновой кислоты...............................................................-------------------- 97

3.3.7. Определение антиоксидантной активности биологических жидкостей с помощью системы гемоглобин-пероксид водорода-

люминол........................................................-......................— 100

3.4. Преимущества и недостатки способа определения антиоксидантной активности веществ и биологических жидкостей с помощью модельной системы гемоглобин-пероксид водорода-

люминол...........................-...................................................... 106

Выводы.................................................................................... 116

Список использованной литературы.............................................. 118

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

АБАП - 2, 2л-азобис (2-амидинопропан) гидрохлорид

АБТС - 2,2"-азиноди(3-этилбензотиазолин)6-сульфоновая кислота

АК - аскорбиновая кислота

АО - антиоксидант

АОА - антиоксидантная активность

АФК - активные формы кислорода

КМБ - а-кето-у-метиобутировая кислота

ЛМ - люминол

ЛНП - липопротеины низкой плотности

МК - мочевая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота

ХЛ - хемилюминесценция

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

АР2- - 3-аминофталат дианион

С-525 - 2,3,5,6-1Н,4Н-тетрагидро-9-(2,-бензоимидазолил) хинолизино-(9,9а,1^11) кумарин

Нв - гемоглобин

Н2О2 - пероксид водорода

Юг - синглетный кислород

О2* - супероксидный анион-радикал

ОН* - гидроксильный радикал

TRAP - total peroxyl radical-trapping antioxidant potential

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Известно, что в организме человека и животных свободнорадикальное окисление (СРО) биомолекул является нормальным метаболическим процессом. Основными механизмами активации СРО при этом являются: значительное увеличение выработки активных форм кислорода (АФК) и высвобождение каталитически активных ионов железа из вне- и внутриклеточных депо [4, 16]. Однако, несмотря на то, что СРО непрерывно протекает во всех органах и тканях, оно не приводит к развитию их радикального повреждения, поскольку для каждой ткани характерно поддержание указанного процесса на определённом стационарном уровне. Эта стационарность в определённой степени достигается за счёт функционирования согласованной системы ингибирования СРО, состоящей из системы контроля за содержанием АФК и системы связывания ионов железа. Однако, при многих патологических состояниях происходит нарушение этой стационарности за счёт усиления СРО биомолекул и/или ослабления системы его ингибирования, что приводит к усилению перекисного окисления липидов клеточных мембран и липопротеинов, денатурации белков и повреждению нуклеиновых кислот [100]. Это послужило патогенетическим обоснованием применения для лечения многих заболеваний различных экзогенных природных и синтетических ингибиторов СРО. В настоящее время в клинике широко используются такие ингибиторы как аскорбиновая кислота, а-токоферол, каротиноиды, различные флавоноиды, железосвязывающие агенты, такие как десферал, тиол-содержащие соединения [144]. Предлагается много других веществ для их клинического использования, однако, в подавляющем большинстве случаев их применение и подбор доз препарата основывается на эмпирическом подходе, что связано с тем, что не используются или затруднены способы оценки активности и механизма действия данного препарата.

В настоящее время в качестве одного из таких способов используется определение антиоксидантной активности (АОА) веществ, которая показывает

способность данного вещества, называемого в этом случае антиоксидантом (АО), тормозить СРО в какой-либо модельной системе [101]. Указанный подход применяется для оценки эффективности антиоксидантного действия какого-либо вещества или для контроля за состоянием эндогенных АО, которое изучается посредством определения АОА биологических жидкостей.

Известны различные модельные системы для определения АОА веществ и биологических жидкостей, но в целом все они состоят по-крайней мере из двух компонентов: инициатора окисления и субстрата окисления. Торможение антиоксидантами СРО в модельных системах оценивается путём определения промежуточных или конечных продуктов окисления с помощью хроматографических, спектрофотометрических, хемилюминесцентных и других методов. Среди этих методов наибольшей информативностью обладают хемилюминесцентные методы, которые используют хемилюминесценцию (ХЛ), сопровождающую окисление определенных субстратов, для непосредственного слежения за кинетикой окисления [123, 138, 177]. Это позволяет исследовать временные параметры процесса окисления, что в некоторых случаях помогает определять механизм антиоксидантного действия тестируемых веществ. Однако, при использовании хемилюминесцентных модельных систем возникает ряд трудностей, связанных с нестабильностью компонентов модельных систем, низкой интенсивностью свечения, значительной продолжительностью процедуры определения во времени и трудностью интерпретации полученных данных. Поэтому, дальнейшее развитие и совершенствование хемилюминесцентных способов оценки антиокислительных свойств веществ и биологических жидкостей будет, несомненно, содействовать более широкому их внедрению в практику медицинских исследований и более полному пониманию механизмов процесса СРО биомолекул.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: разработка хемилюминесцентных способов изучения АОА и механизма антиоксидантного действия веществ и биологических жидкостей. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1. Разработать хемилюминесцентные способы определения АОА индивидуальных веществ и биологических жидкостей.

2. С помощью разработанных способов изучить АОА и механизм антиоксидантного действия различных ингибиторов СРО.

3. С помощью разработанных способов изучить АОА и механизм антиоксидантного действия плазмы крови и других биологических жидкостей.

4. Исследовать изменения АОА плазмы крови при некоторых патологических процессах.

Научная новизна. Разработана хемилюминесцентная модельная система свободнорадикального окисления люминола (JIM), индуцированного смесью гемоглобина (Нв) и пероксида водорода (Н2О2) (система НВ-Н2О2-ЛМ). Хемилюминесценция в системе Нв-НгОг-ЛМ отличается высокой интенсивностью, поэтому для измерения не требуется чувствительных хемилюминометров. Радикалы-инициаторы, образующиеся в данной модельной системе, в качестве которых рассматривают феррил-радикалы Нв и гидроксильные радикалы, составляют один из путей инициирования СРО in vivo.

На основе системы НВ-Н2О2-ЛМ разработаны способы определения АОА индивидуальных веществ и биологических жидкостей. Данные способы отличаются простотой и воспроизводимостью, для анализа необходимо малое количество биологической жидкости.

Измерена АОА плазмы крови, мочи, влаги передней камеры глаза, синовиальной и церебро-спинальной жидкости человека в системе НВ-Н2О2-ЛМ. Оценён вклад мочевой кислоты в АОА плазмы крови человека, определяемую в системе НВ-Н2О2-ЛМ.

Исследована динамика АОА плазмы крови человека в системе Нв-ШСЬ-ЛМ в процессе развития острого деструктивного панкреатита.

Исследовано изменение АОА плазмы крови человека (здоровые доноры) и кроликов (интактные животные) в системе нв-Н2О2-ЛМ после однократного перорального приёма аскорбиновой кислоты.

Практическая значимость. Предлагаемые способы оценки АОА веществ и биологических жидкостей могут быть использованы при проведении медико-биологических и клинических исследований для динамического наблюдения за состоянием антиокислительного потенциала биологических жидкостей при различных патологических процессах, оценки эффективности и механизма антиоксидантного действия различных фармакологических препаратов и адекватности проводимой ими антиоксидантной терапии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свободнорадикалъное повреждение при заболеваниях человека и современное состояние антиоксидантной терапии.

Многие заболевания человека связаны со свободнорадикальным повреждением [100, 144, 155]. Увеличение окислительного стресса может быть связано с тремя большими дефектами, возникающими при этом типе тканевого поражения: увеличением эндогенного образования супероксидного анион-радикала (Ог*), делокализацией гемовых белков и металлопротеинов и дефицитом антиоксидантной защиты. Ситуации, вовлекающие избыточную активацию фагоцитов, стимуляцию оксидаз, например, ксантин-оксидазы, или нарушение митохондриального электронного транспорта приводит к усилению продукции От. Изменение метаболизма арахидоновой кислоты через циклооксигеназный и монооксигеназный пути может индуцировать увеличение уровня гидропероксидов. Кроме того, высвобождение ионов металлов из мест хранения, гемовых белков, индуцированных оксидантами, металлопротеинов, индуцированных делокализованными протеазами, может распространять повреждение. От и пероксид водорода (Н2О2), образующийся из От в результате реакции дисмутации, не очень реактивные частицы, гидропероксиды также довольно стабильны при нормальных физиологических условиях. Их активность может быть усилена в результате присутствия гемовых белков и низкомолекулярных хелатов ионов переменной валентности в результате образования в их присутствии более активных частиц, таких как гидроксильные радикалы (ОН"), феррил-гем-протеин-радикалы, пероксильные и алкоксильные радикалы [121, 74]. Многие клеточные компоненты, такие как белки-ферменты, ионные каналы, структурные белки и мембранные липиды -потенциальные мишени для этих активных свободнорадикальных частиц [100].

Так, например, хронические воспалительные заболевания сопровождаются выделением избыточного количества От из-за активации большого количества фагоцитов в локализованном объёме [144]. Это приводит к повреждению тканей. Возрастной респираторный дистресс синдром

сопровождается избыточной активацией фагоцитов и инфильтрацией нейтрофилов в лёгкие [100]. Хроническое воспалительное заболевание суставов сопровождается образованием в суставе 500 нмоль Н2О2 в минуту [33]. Повреждение реперфузией при ишемическом инсульте происходит в результате адгезии нейтрофилов на поверхности эндотелия, их активации и образовании От [144]. Это, в комбинации с внутриклеточными источниками АФК и делокализацией гемовых белков, может учавствовать в тканевом повреждении при реперфузии, которая добавляет тканевое повреждение и вторична к ишемическому инсульту самому по себе.

При некоторых патологических состояниях железо- и гем-белки могут менять своё местоположение. Работы in vitro показали, что железо может высвобождаться из гемоглобина и миоглобина при избытке оксиданта [17, 84, 86, 141, 146]. Также продемонстрирована мобилизация железа из ферритина под действием восстанавливающих агентов, таких как От, аскорбат и других [31, 32]. Это имеет потенциальную причастность при воспалении коленного сустава или ишемии-реперфузии. Микрокровотечения в глазу приводят к повреждению сетчатки [51], кровотечения и делокализация железа в мозге приводит к заболеванию Паркинсона [136] и другим формам мозгового повреждения. Разрыв миоцитов при остром инфаркте миокарда приводит к появлению в крови миоглобина, который служит одним из ранних маркеров инфаркта миокарда [53] и подтверждает способность гемовых белков делокализовываться по кровеносной системе. Источник отложения железа в артериях при атеросклерозе может быть вследствии микрокровотечений через эндотелий.

Одним из патологических процессов, сопровождающимся свободнорадикальным повреждением, является повреждение реперфузией [144]. Повреждение реперфузией может быть определено как повреждение, которое появляется в органе в течении кровенаполнения, следующего вслед за ишемией. Это отдельная стадия и её действие отлично от действия, связанного с ишемией. Когда ткани лишаются кислорода - они повреж�