Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика антирадикальной активности различных классов антиоксидантных средств в условиях окислительного стресса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика антирадикальной активности различных классов антиоксидантных средств в условиях окислительного стресса"

на правах рукописи

Басов Александр Александрович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ АНТИОКСИДАНТНЫХ СРЕДСТВ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003160129 Ростов-на-Дону - 2007

003160129

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель доктор медицинских наук, доцент

Павлюченко Иван Иванович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Терентьев Владимир Петрович доктор биологических наук, профессор Артемьева Надежда Константиновна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Волгоградский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 4 » в ^ час ^ * мин

на заседании диссертационного совета Д 208 082 01 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер , д 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «_/_» ^¿^-ГО^-^иА 2007

Ученый секретарь диссертационного совета профессор

Корганов Н.Я.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Окислительный стресс (ОС) - один из наиболее распространенных видов стресса, является реакцией на многие экстремальные факторы, возникает в ответ на воздействие активных форм кислорода (АФК) и свободных радикалов на молекулярные структуры клеток, характеризуется срывом функционирования системы антиоксидантной защиты (АОЗ), интенсификацией процессов свободнорадикального окисления (СРО) и сопровождается накоплением в органах и тканях токсичных продуктов окислительной модификации биомолекул (ОМБ) [Владимиров ЮА, Арчаков А И, 1972, Агаджанова ЛМ, 1998, Бапаболкин МИ, Клебанова ЕМ, 2000, Микашинович 3И идр, 2004, ЛакомкинВЛ идр, 2005, Меньщикова ЕЕ и др, 2006, Мискевич ДА и др, 2007, Ашзова О А идр, 2007, Halliwell В, Gutteridge JMC, 1999] Сахарный диабет (СД) является одной из проблем современного здравоохранения и практически на всех этапах сопровождается в той или иной мере выраженным ОС [Бапаболкин МИ и др, 2005, Клебанова ЕМ, 2006, Плетюшкина ОЮ идр, 2006, Догадин С А идр, 2007, Amos A et al, 1997] При этом неконтролируемые реакции свободнорадикального окисления (СРО) с развитием состояния ОС наряду с дислипидемией, дефицитом инсулина или инсулинорезистентностью, и, как следствие, гипергликемией при СД, являются одним из обязательных компонентов патогенеза сосудистых осложнений. |Дубинина ЕЕ, 1998, Картчцежо А И 2001, Бапаболкин МИ и др, 2005, Шестакова С А и др, 2006, Клебанова ЕМ, 2007, Шестакова МВ, и др, 2007, Страхова и др, 2007, Taskinen MR., 1997]

Особое значение в лечении заболеваний, патофизиологической и патобиохимической основой которых является ОС, имеет своевременное и дозированное применение эффективных антиоксидантных средств (препараты содержащие витамины Е, С, липоевую кислоту и другие тиолсодержащие вещества, а также комбинированные антиоксидантные комплексы), которые необходимы для коррекции прооксидантно-антиоксидантной системы и окислительного метаболизма в целом [Бапаболкин МИ и др, 2005, Перевозкина МГ и др, 2007, Базарнова ЮГ, 2007]. Необходимо отметить, что если фармакологическая значимость и механизмы антиоксидантного действия витаминов Е и С хорошо изучены и препараты на их основе достаточно широко применяют в клинической практике, то значимость и дозировки препаратов липоевой кислоты, глутатиона и других тиолсодержащих веществ, рекомендуемых к применению в практической медицине, до последнего времени недооценены и детально не исследованы с биохимической точки зрения [Бапаболкин МИ и др, 2005, Макеева А В и др, 2007, Кулинский В И и др, 2007, Cross J V, Templeton D J, 2004, Forman HJ et al, 2004, Poole LB et al, 2004], хотя и находит все большее применение в медицинской практике в форме фармпрепаратов (тиоктацид, берлитион, эспа-липон) и различных парафармацевтических средств (глутатион, глютатион формула) При этом необходимо учитывать, что применение любого антиоксидантного средства должно быть строго дозированным и

обоснованным, так как в зависимости от используемой дозы лекарственные средства могут проявлять как аятиоксидантный, так и прооксидантный эффект Щорожко А И и др„ 1988, Дубинина ЕЕ, 2001, Микашинович ЗИ u др, 2005, КвиннПДж, 2004, Halltwell В, Gutteridge J М С, 1990, James AM et al, 2004]

Кровь больных с ОС, уровень которого установлен комплексно с учетом различных показателей прооксидантяо-антиоксидантной системы [Павлюченко ИИ, 2005], является эффективной естественной биосистемой для изучения антиоксидантной активности (АОА) различных фармацевтических и парафармацевтяческих средств как m vitro, так и ex vivo Такие исследования необходимы прежде всего потому, что одни антиоксидантные средства проявляют свой эффект только in vivo, другие как m vivo так и in vitro, в связи с чем их делят на антиоксиданты (АО) прямого и косвенного действия [Зайцев ВГ, Островский О В, Закревский В И, 2003] Перспективным представляется изучение антиоксидантного потенциала различных объектов с помощью биофизических методов (амперометрического и хемилюминесцентного), позволяющих определять суммарное количество легко окисляемых групп, активных доноров протона в восстановительных реакциях, что важно для установления принципиального наличия потенциальной АОА у исследуемых веществ или наличие прооксидантных качеств Другим из подходов к изучению АОА фармпрепаратов и парафармацевтиков является их апробация in vitro в специально создаваемых тест-системах с искусственной индукцией СРО В настоящее время отечественными и зарубежными компаниями предлагаются к использованию хемилюминесцентные, амперометрические, кондуктометрические анализаторы для определения АОА фармацевтических средств, биологических жидкостей и пищевых продуктов Нередко оборудование разработано и внедряется в широкое использование работниками немедицинского профиля и/или не имеющими прямого отношения к практическому здравоохранению, поэтому актуальна их апробация и сравнительная оценка в лабораторных и клинических условиях

Учитывая все вышеизложенное, целью настоящего исследования явилось проведение сравнительной оценки АОА и антиоксидантной емкости различных классов антиоксидантных средств m vitro и ex vivo с использованием биохимических и физико-химических методов тестирования.

Задачи исследования

1 Установить динамику процессов перекисного окисления белково-липидных компонентов эритроцитов и плазмы крови у больных СД 1 и 2 типа на фоне проводимой антиоксидантной терапии тиолсодержащими средствами

2 Изучить ex vivo влияние тестируемых антиоксидантных средств в различных дозировках на интенсивность процессов перекисного окисления биомолекул и состояние системы антиоксидантной защиты (АОЗ) эритроцитов и плазмы крови больных СД 1 и 2 типа

3 Изучить сравнительную характеристику антиоксидантной и антирадикальной активности тиолсодержащих фармпрепаратов и биологически активных добавок (производных липоевой кислоты и глутатиона) в авторских модельных тест-системах in vitro и ex vivo

4 Провести сравнительное комплексное амперометрическое и хемилюминесцентное определение антиоксидантной и антирадикальной активности индивидуальных и комбинированных антиоксидантных средств m vitro и ex vivo

Научная новизна работы

• На основании комплексного подхода диагностики показана динамика ОС у больных с СД 1 и 2 типа на фоне проводимой антиоксидантной терапии тестируемыми препаратами (берлитион, тиоктацид)

• Впервые на большом клинико-экспериментальном материале проведено сравнительное изучение АОА тиолсодержащих и ряда иных индивидуальных и комбинированных антиоксидантных средств на доклиническом этапе с применением модернизированных хемилюминесцентных и амперометрических методов

• Предложен новый способ сравнительной характеристики антиоксидантной емкости и АОА, дозозависимых антиоксидантных эффектов исследуемых препаратов различных фармацевтических и парафармацевтических препаратов с помощью амперометрического метода («аскорбиновый эквивалент») и в модельных тест-системах (патент № 2182706,2001)

• Впервые для выявления пролонгированного антиоксидантного эффекта фармацевтических и парафармацевтических средств m vitro и ex vivo апробирован программный комплекс (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006611562, 2006) регистрации показателя степени ингибирования площади индуцированной вспышки хемилюминесценции (ВХЛ) для оценки уровня свободнорадикальных процессов (СРП)

Практическая значимость исследования

Выявлены особенности динамики показателей ОС у больных СД 1 и 2 типа в зависимости от тяжести болезни и уровня гипергликемии, и предложены алгоритмы диагностики уровня ОС в зависимости от характера его развития и течения

Установлен ex vivo и m vitro факт индивидуальной чувствительности прооксидантно-антиоксидантной системы крови больных СД 1 и 2 типа к различным антиоксидантным средствам (фармпрепаратам или парафармацевтикам) Показаны наиболее эффективные средства антиоксидантной коррекции ОС у больных СД, что позволяет оптимизировать процесс патогенетической антиоксидантной терапии при сахарном диабете, сократить затраты на лечение и реабилитацию больных с СД, снизить число неблагоприятных исходов заболевания

На основании полученных результатов дана сравнительная характеристика АОА и антиоксидантной емкости тиолсодержащих (берлитион, глютатион формула) и комплексных (кардиотоник, ультраантиоксидантная формула) препаратов, проведена стандартизация их АОА Разработан алгоритм оценки АО А лекарственных средств, что позволяет сократить сроки внедрения новых антиоксидантных препаратов в практическую медицину

Внедрение

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре фундаментальной и клинической биохимии лечебного, педиатрического, медико-профилактического. фармацевтического и стоматологического факультетов Кубанского государственного медицинского университета и кафедре клинической нутрициологии ФПКМР Российского государственного университета Дружбы народов Разработанные методы диагностики ОС и мониторинга антиоксидантной терапии нашли применение в клинике внутренних болезней и используются в МУЗ Городской больнице № 2 и МУЗ Городская клиническая больница № 1 г Краснодара в отделениях эндокринологии

Апробация работы

Основные положения диссертации были изложены на 63-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов (Краснодар, 2002), Международной научно-практической конференции Современные технологии фитонутрициологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Москва, 2003 год). Международной конференции «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health» (Смоленск, 2003 год), IV конференции молодых ученых Кубани «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической гастроэнтерологии» (Краснодар, 2003), III Всемирном конгрессе по клинической патологии и реабилитации в медицине (Паттайя, Таиланд, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии иммунореабилитояогии (Москва, Россия, 2005), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), XIV Международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2006), XXXIV научной конференции студентов и молодых ученых вузов Южного федерального округа России (Краснодар, 2007)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных научных работ, из них 9 в журналах, рекомендованных ВАК, получены 3 авторских свидетельства на изобретение, полезную модель и программное обеспечение для ЭВМ

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, трех глав обсуждения полученных результатов собственных

исследований, заключения, выводов и списка литературы Текст диссертации изложен на 177 страницах компьютерного текста, иллюстрирован 34 рисунками и графическими диаграммами, включает 8 таблиц Список литературы содержит 156 источников отечественной литературы и 69 - иностранных авторов

Основные положения, выносимые на защиту

1 У больных СД в период декомпенсации заболевания наблюдается значительный дисбаланс в прооксидантно-антиоксидантной системе, что проявляется ОС, осложнения которого наиболее эффективно купируются при рациональном применении тиолсодержагцих фармпрепаратов и антиоксидантных комплексов

2 Тиолсодеражащие антиоксидантные средства (берлитион, тиоктацид, глютатион формула) проявляют наибольшую антиоксидантную активность ш vitro и ex vivo, проявляя выраженный дозозависимый эффект, что необходимо учитывать при их назначении пациентам с ОС

3 Комплексная достоверная оценка АОА лечебных и профилактических антиоксидантных средств возможна при параллельном определении их антиоксидантной емкости с помощью амперометрического метода и АОА в модельных тест-системах

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе были изучены различные показатели системы прооксиданты-антиокеиданты в крови больных СД 1 и 2 типов с использованием новых биохимических методов Критериями отбора больных были 1) трудоспособный возраст (менее 60 лет), 2) стаж заболевания не менее 5 лет, 3) тяжелое течение СД, приведшее к формированию поздних осложнений СД, 4) необходимость на момент обследования в получении базис-болюсной инсулинотерапии, 5) декомпенсация СД при поступлении (гипергликемия, кетоз) Больные СД 1 типа и СД 2 типа (п=88) были разделены на 4 группы (табл № 1) группа 1 (СД 1, п=22) и группа II (СД 2 типа, п=22) с традиционным лечением (инсулин, инфузионная, метаболическая терапия), группа III (СД 1, п=22) и группа IV (СД 2 типа, п=22), получавшие дополнительно в комплексной терапии тиолсодержащие препараты липоевой кислоты (тиоктацид 600 Т, берлитион) в курсовой дозе не менее 1500 мг тиоктовой кислоты Контрольную группу составили 30 здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (18-59 лет, средний возраст - 40,6 ± 1,24 года ) Объектом исследования являлась венозная кровь, стабилизированная гепарином Определение необходимых параметров в эритроцитах и плазме осуществляли в первые сутки нахождения больных в стационаре и на 10-й день после проведенного лечения

Материалом для анализа также послужили данные, полученные при изучении в тест-системах in vitro и ex vivo, АОА и антиоксидантной емкости следующих фармпрепаратов, витаминов и парафармацевтиков 1) витамин С (vit С) -

аскорбиновая кислота относится к классу 1.4 (альфа, бета - диеяолы) АО прямого действия, 2) витамин Е (vit Е) - относится к классу 1 1 (фенолы) АО прямого действия, 3) кверцетин - относится к классу 1 1 (фенолы) АО прямого действия, 4) провитамин А - бета-каротин относится к классу 2 (полиены) АО прямого действия,

5) парафармацевтик кофермент Q10 (Coenzime QI0, убихинон - 1 капсула содержит 30 мг кофермента Qi0) препарат - по своей химической природе жирорастворимый хинон с боковой изопреноидной цепочкой За счет своей химической структуры это соединение может выступать в роли как донора, так и акцептора электронов, обеспечивая протекания окислительно-восстановительных реакций на физиологическом уровне, поэтому in vivo он может проявлять как прямую, так и опосредованную АОА Исходя из его химической природы, его можно отнести к нескольким классам АО прямого действия (класс 1.1 (фенолы) и класс 2 (полиены)),

6) парафармацевтик «Глютатион Формула» относится к представителям комплексных антиоксидантных средств, ключевыми компонентами которой являются серосодержащие АО трипептид L-глутатион (50 мг в 1 капсуле), витаминоподобное вещество альфа-липоевая кислота (10 мг в капсуле) аминокислоты селенметионин (500 мкг в 1 капсуле) и L-цистеин (100 мг в одной капсуле) Кроме того в состав глютатион-формулы входят витамин С, лецитин Составные компоненты глютатион формулы относятся к различным классам АО прямого действия (серосодеражащие компоненты глютатион формулы представляют класс 1 3 (тиолы) АО прямого действия), 7) парафармацевтик «СеленЦинк» (Se-Zn) - комплексный АО, 8) парафармацевтик «КардиоТоник» относится к классу комплексных АО, в котором ведущими компонентами с АОА являются витамины С (2000 мг), Е (400 МЕ) и провитамин бета-каротин, 9) парафармацевтик «Ультра Антиоксидантная Формула» (УАФ) - относится к комплексным антиоксидантным средствам, ключевыми представителями которой являются провитамин бета-каротин (15000 МЕ в 1 таблетке), витамин С (500 мг в 1 таблетке), витамин Е (d-альфа-токофекрол 200 МЕ в 1 таблетке), селен (100 мкг в 1 таблетке), которые относятся к различным классам АО прямого действия класс 1 4 (альфа, бета - диенолы), класс 1 1 (фенолы) и класс 2 (полиены) соответственно, 10) «Берлитион» (Berlithion, Berlin-Chemie AG, Germany) -содержит тиоктовую кислоту (альфа-липоевая кислота 25 мг/мл — в 1 ампуле 12 мл раствора этилендиаминовой соли (388 мг) альфа-липоевой кислоты, в 1 таблетке - 300 мг альфа-липоевой кислоты), которая регулирует обмен веществ, является эндогенным АО и обладает способностью связывать свободные радикалы. Тиоктовая кислота близка по фармакологическим свойствам к витаминам группы В и относится к классу 1 3 (тиолы) АО прямого действия, 11) «Эспа-липон» (Espa-Lipon, Esparma GmbH, Germany) - содержит тиоктовую кислоту (альфа-липоевая кислота 25 мг/мл - в 1 ампуле 12 или 24 мл раствора этилендиаминовой соли (32,3 мг/мл) альфа-липоевой кислоты, в 1 таблетке - 200 или 600 мг альфа-липоевой кислоты), которая относится к классу 1 3 (тиолы) АО прямого действия, 12) «Тиоктацид 600 Т» (Thioctacid 600 Т, ASTA Medica AG, Germany) - инъекционный раствор на основе тиоктовой (альфа-

липоевой) кислоты (альфа-липоевая кислота 25 мг/мл - в 1 ампуле 24 мл раствора трометамоловой соли (952,3 мг/амп) альфа-липоевой кислоты)

Таблица № 1 Количество и средний возраст обследованных больных _по нозологическим формам_

Категории больных Количество больных, человек, (%) Средний возраст, лет

Больные СД 1 типа (традиционное лечение) 22 (25,0 %, муж - 9 чел, жен -13 чел) 35,5 ± 2,7

Больные СД 1 типа (традиционное лечение + липоевая кислота) 22 (25,0 %, муж - 10 чел, жен -12 чел) 39,5 ± 2,6

Больные СД 2 типа (традиционное лечение) 22 (25,0 %, муж - 10 чел, жен -12 чел) 52,0 ± 1,5

Больные СД 2 типа (традиционное лечение + липоевая кислота) 22 (25,0 %, муж - 11 чел, жен -11 чел) 52,8 ± 0,9

Оценку АОА исследуемых препаратов проводили с использованием отечественного анализатора АОА Яуза-ААА-01, принцип работы которого основан на регистрации окислительного потенциала возникающего на рабочем электроде при окислении тестируемых веществ Полученный сигнал необходимо сравнивать с калибровочным стандартом (аскорбиновой кислотой, рис 1) и выражать АОА в унифицированных «аскорбиновых эквивалентах» [Басов А А и др, 2006\ Также измеряли АОА плазмы до инкубации и после инкубации крови с препаратами, определяя их способность изменять антиоксидантный потенциал биологических жидкостей Одновременно оценку АОА лекарственных средств проводили по ингибированию вспышки Н202-индуцированной люминол-зависимой XJ1 в тест-системе с плазмой Принцип оценки основан на способности тестируемого компонента тормозить реакции СРО в тест-системах, снижая в той или иной мере ВХЛ Использованный способ определения АОА был разработан на кафедре фундаментальной и клинической биохимии КубГМУ [Басов АА, идр 2003, Федосов CP, Басов А А, Виноградов MB и dp, 2006] на основе методики НИИБИ (г Ростов-на-Дону) В кювету вносили раствор люминола в буфере и сыворотку крови, затем добавляли раствор тестируемого вещества, реакции радикального окисления люминола инициировали впрыскиванием перекиси водорода АОА фармпрепаратов и парафармацевтиков оценивали m vitro по степени ингибирования перекисного окисления биосубстратов в авторских тест-системах после однократной и пролонгированной индукции перекисных процессов В тест-системах, содержащих

водно-спиртово-масляную смесь, где в качестве субстратов окисления выступали мицеллоподобные структуры, сформированные на основе кукурузного масла, изучалась антиокислительная емкость фармпрепаратов и парафармацевтиков по способности ингибировать СРО, инициированное химическими (Те2 и перекись водорода) или комбинированными (Fe2+ и ультрафиолетового облучения) индукторами СРП [Павлюченко И. И., Басов A.A., Федосов СР., 2001]. АОА выражали в универсальных убихиноновых единицах (Q-ЕД =13*10° мг/мл vit Q).

9

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Сила тока (I), нА*с vitC ----- - Линейный (vit С)

Рис. 1. Калибровочный график антиоксидантной активности по витамину С

Состояние антиоксидантной системы (АОС) организма оценивали по активности основных ферментов АРЗ: каталазы (КАТ) гемолизированных эритроцитов и супероксидлисмутазы (СОД) плазмы, а также по основному неферментному компоненту АОС - уровню восстановленных тиоловых групп. Активность КАТ исследовали в плазме по методу [Луговая U.A., Быков М.И., Моргоев А.Э., Гайворонская Т.В., Басов A.A., Федосов СР., Павлюченко И.И.. 2006], где количество перекиси водорода, разложившейся под действием фермента за 1 мин при оптимальных условиях выражали в ммоль Н202. Для определения активности СОД использовали методику [Луговая H.A., Быков М.И., Моргоев А.Э., Гайворонская Т.В.. Басов A.A., Федосов С.Р., Павлюченко И.И., 2006]. Метод основан на способности СОД ингибировать индуцированную реакцию аутоокисления кверцетина, так как одним из промежуточных продуктов этой реакции является супероксидный анион-радикал. Количество тиоловых групп определяли с помощью реактива Эллмана [Орехович В Н., 1977] в собственной модификации.

Состояние прооксидантной системы оценивали в плазме крови по исходному базальному количеству продуктов окислительной модификации биомолекул (ОМБ),

реагирующих при 100 °С с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Стальная ИД, Гаришвили ТГ, 1977], в эритроцитах определяли базальный и индуцированный уровень ТБК-активных продуктов Тиобарбитуровое число плазмы (ТБЧпл.), эритроцитов базальное (ТБЧэр) и индуцированное (ТБЧэр-Ind), тиобарбитуровое число общее (ТБЧобщ) выражали в оптических единицах [Ушкалова В Н и др, 1993] Уровень процессов СРО в плазме крови оценивали по интенсивности индуцированной ВХЛ с помощью люминотестера LT-01 ("Horos", Joint Venture Soviet-Swedish Company), на основе методики НИИБИ г Ростова-на-Дону, в собственной модификации [Федосов С Р, Басов А А, Канус И С и др, 2007] Количество эритроцитов для расчета активности ферментов и количества ТБК-активных продуктов в цельной крови определяли фотоколориметрически по методу Ресселя [Рессель Л К, Тодоров И, 1961] Статистическую обработку проводили с использованием компьютерных программ Excel и Statistica

Результаты собственных исследований

СД является одним из хронических заболеваний, при котором постоянно создаются предпосылки для активации реакций СРО и формирования ОС В ходе проведенных исследований по изучению состояния прооксидантно-антиоксидантного статуса больных СД 1 и 2 типа установлено, что у всех больных на момент поступления наблюдался значительный дисбаланс прооксидантно-антиоксидантной системы, характеризующийся прежде всего значительным снижением количества SH-групп (р<0,05, по сравнению с показателями контрольной группы) в группе I - на 32,6 %, группе II -26,6 % на , группе III - на 38,1 %, группе IV - на 33,5 % Также было выявлено повышение показателей ТБЧ у этих же групп больных в группе I - на 26,1 % (р<0,05), группе II - на 12,2% (р>0,05), группе III - 32,2% (р<0,05), группе IV -на 24,4 % (р>0,05), что указывает на увеличение продуктов ОМБ в первую очередь белковой и липидной природы в плазме крови и клеточных структурах После курса проведенного стационарного лечения в разной степени выраженности наблюдалось частичное восстановление емкости АОС и некоторое уменьшение показателей интенсивности процессов СРО у больных всех групп Количество SH-rpynn увеличилось у всех категорий больных (по сравнению с показателями при поступлении) в группе I - на 12,9 % (р>0,05), группе II - на 13,8 % (р>0,05), группе III - на 28,9 % (р<0,05), группе IV - на 37,0 % (р<0,05) Показатели ТБЧ снизились по сравнению с исходными значениями у всех категорий обследованных больных в группе I - на 6,6 % (р>0,05), группе II - на 1,6 % (р>0,05), группе III - на 16,0 % (р<0,05), группе IV - на 10,9 % (р<0,05) Более выраженный и статистически значимый прирост количества SH-групп эритроцитов и снижение уровня продуктов ОМБ у больных СД 1 и 2 типа на фоне комплексной терапии с препаратами липоевой кислоты показывает необходимость применения тиолсодержащих препаратов для коррекции дисбаланса в системе прооксиданты-антиоксидантьг и, прежде всего, показателей антиоксидантного звена, которое подвергается наибольшим негативным

воздействиям при ОС как у больных СД 1 типа, так и СД 2 типа (рис. 2.). При этом наиболее рациональным у больных СД является восстановления уровня ЭН-групп препаратами липоевой кислоты после коррекции показателей углеводного обмена для предотвращения их повторной окислительной модификации на фоне гипергликемии.

0.6-

ш О

е-

0.5 0.4 0,3 0,20.1-

ьс с;

и

«=с о

о

о

ч о

Е£ О

ч: о

ч

и

■ р<0,05 в сравнении с контролем.

группы обследованных

Рис. 2. Динамика тиоловыхгрупп до и после лечения больных сахарным диабетом 1 и 2 типа. (ЛК-липоевая кислота)

В ходе проведенных исследований установлено, что у всех больных на момент поступления наблюдался значительный дисбаланс прооксидан тно-антиоксидантной системы, характеризующийся прежде всего снижением активности СОД в группе I - на 36,7% (р<0,05), II - 41,2% (р<0,05), III - 45,7% (р<0,05), IV -42,8%, (р<0,05) при сохранной активности КАТ (р>0,05), что может сопровождаться у больных недостаточной дисмутацией супероксидного анион-радикала (*00-), участвующего в образовании других АФК и инициации реакций СРО. приводящих в дальнейшем к выраженному ОС.

После курса проведенного стационарного лечения наблюдалось частичное восстановление активности СОД (рис. 3) в группе I - на 21.8% (р<0,05). 11 - 33.7% (р<0,05), III - 39,9% (р<0,05), IV - 48,7% (р<0,05), при этом в группах I и II

активность КАТ статически значимо не изменялась (р<0,05), а в группах 111 и IV — повышалась (р<0,05) на 24,1% и 30,4% соответственно, что указывает активацию АОС организма больных и более эффективную нейтрализации *00-, повышение уровня инактивации пероксида водорода (Н202) у больных СД, получавших в комплексной терапии препараты липоевой кислоты.

0,18-1 0.16-

t=t О и

о

ё &

1 *

0,1440,12 0,1

0,08 -Н 0.06 0.040,020

и

«

о

f=t о

t=t о

о

н

сч «

О

о

ч

о

- р<0,05 в сравнении с контролем.

группы обследованных

Рис. 3. Динамика активности СОД до и после лечения больных сахарным диабетом 1 и 2 типа. (ЛК-липоевая кислота)

Таким образом, применение препаратов липоевой кислоты повышает активность ферментов 1-й (СОД) и 2-й (КАТ) линий АРЗ, что способствует нормализации показателей прооксидантно-антиоксидантной системы, исключает дисбаланс в работе АОС и предупреждает формирование у больных поздних осложнений СД. связанных с явлениями ОС.

Широкая реклама современных антиоксидантных средств выдвигает задачи по совершенствованию имеющихся и разработке новых эффективных и относительно простых способов определения АОА фармпрепаратов и парафармацевтиков. Это важно и для тех медикаментозных средств, у которых антиоксидантный эффект является основным, и для тех, у которых он является сопутствующим другим лечебным свойствам (противовоспалительным, иммуномодулирующим,

цитостатическим, гепатопротекторным и т.д) [Насыров ХМ, 1987] Актуальной проблемой является сравнительное изучение АОА фармпрепаратов и парафармацевтиков в соответствующих тест-системах с применением различных методов регистрации АОА на преклиническом этапе внедрения Проведенными нами исследованиями установлено, что наибольший антиоксидантный потенциал наблюдается у тиолсодержащих препаратов липоевой кислоты (берлитион, тиоктацид, эспа-липон), который превосходит или сопоставим с антиоксидантным потенциалом комплексных антиоксидантных средств кардиотоник, УАФ (тест-система 1, рис 4).

,, I , , _I......I,_и

к И

s

н «

0

ы

1

s

&

в

л &

& в

<L>

л

в

I

■е-

* тиоюацид * эспа-липон

* берлитион

* УАФ * Кардиотоник

* Se-Zn * глутатион формула

бета-каротин убихинон

* кверцетин

vit Е * vitC контроль

Т

□

1

10

15

20

25 30 35 АОА, vit С, мг/л

О 5 И Антиоксидантный потенциал

* - р<0,05 в сравнении с контролем Рис 4 Антиоксидантная активность фармпрепаратов и парафармацевтиков в амперометрическом детекторе

При изучении способности фармпрепаратов и парафармацевтиков влиять на СРП в системе люминол—Н202 зависимой ХЛ, содержащей плазму крови и исследуемый препарат, индукция СРО в которой осуществляется с помощью перекиси водорода (тест-система 2), установлено, что максимальным антирадикальным эффектом в этой тест-системе обладают так же препараты липоевой кислоты (рис 5) В работе исследована АОА фармпрепаратов и парафармацевтиков, которые используются в комплексном лечении СД, с помощью

авторских тест-системах [патент № 2182706, 2001, Павлюченко ИИ, Басов А А, Федосов С Р]

потенциал АОА, %-ингибирования ВХЛ

* - р<0,05 в сравнении с контролем Рис 5. Ингибирование ВХЛ фармпрепаратами и парафармацевтиками.

В ходе исследования АОА фармпрепаратов в тест-системе [Павлюченко ИИ и др, 2001], содержащей комплекс ненасыщенных жирных кислот в мицеллярном состоянии, перекисное окисление которых инициировалось физическими (УФО) и химическими (Ре804) индукторами СРП (тест-система 3) установлено, что наибольший антиоксидантный эффект выявлен при добавлении в тест-систему препаратов эспа-липон> берлитион> тиоктацид> кардиотоник> витамин С>УАФ (рис 6) Другие тестируемые препараты проявили менее выраженный антиоксидантный эффект, что отражено на рис 6

В ходе исследования АОА фармпрепаратов в тест-системе с применением химических (перекись водорода и сульфат железа (II) - система Фентона (Н202 / Ре2+)) индукторов СРП (тест-система 4) установлено, что максимальный ингибирующий эффект в отношении СРП наблюдался также при использовании препаратов липоевой кислоты (берлитион, эспа-липон, тиоктапид) и комплексных

антиоксидантов (кардиотоник и УАФ) (рис 7) Проведенные комплексные исследования фармпрепаратов и парафармацевтиков, относящих к разным классам АО (согласно представленной классификации), показали значительный разброс их АОА, как между отдельными классами, так и внутри одного класса АО

Л_1_

* тиокгацид

* эспа-липон

* берлитион

* УАФ : Кардиотоник

* Se-Zn

S 8-

g * глутатион формула s

I I

s &

■е-

! бета-каротин

* убихинон

* кверцетин

* vit Е

* vit С контроль

_

о

1

I Антиоксидантная активность

6 7

АОА, Q-ЕД

* - р<0,05 в сравнении с контролем Рис 6 Антиоксидантная активность фармпрепаратов и парафармацевтиков в модельных тест-систем ах с комбинированной индукцией СРО

На основании проведенных исследований можно говорить о наличии дозозависимого антиоксидантного эффекта у следующих фармпрепаратов и парафармацевтиков липоевая кислота (тиокгацид и берлитион), Р-каротина, водного раствора селена Данный эффект изучали по способности рабочих растворов исследуемых препаратов снижать вспышку люминол-зависимой ХЛ, индуцированную перекисью водорода, при добавлении тестируемых веществ к исследуемой системе, включающей также плазму крови обследуемого пациента для определения чувствительности последней к антиоксидантным средствам. В экспериментах установлено, что препараты липоевой кислоты ингибируют ВХЛ наиболее эффективно в дозе 0,16 мг/мл (исследовались дозировки в 0,08 мг/мл, 0,16 мг/мл, 0,25 мг/мл), процент ингибирования составил 75,4 %-т£ (рис 8) Цельную

кровь больных также подвергали инкубации с инъекционными формами липоевой кислоты (тиоктацид, берлитион) и физиологическим раствором с последующим определением АОА плазмы в тест-системе с индуцированной люминол-зависимой ХЛ. При исследовании антиоксидантных свойств [^-каротина (в дозах 0,33 мг/мл, 1,67 мг/мл, 3,33 мг/мл) наиболее эффективной при гашении ВХЛ следует считать дозировку в 1,67 мг/л, для которой процент ингибирования составил 18.1 (рис. 9), так как в концентрации 0,33 мг/мл он практически не проявлял

АОА, а увеличение дозировки в 2 раза (с 1,67 до 3,33 мг/мл), практически не изменяло выраженность антиоксидантного эффекта.

г тиоктацид

' эспа-липон

* берлитион

* УАФ

* Кардиогоник

* Se-Zn " глутатион формула

* бета-каротин

* убихинон

* кверцетин

* vitE

□ Антиоксидантная vlt ( активность контроль

?»

Н f-

5 œ

CL 1>

tS Я

с «

й s

Cl о.

С СО

s -е-

О- се

Св CL

•е- |

1 1 1 1

rtramrntlSBtt аг . . ta 1

□

——i

-1

4 5

АОА, О-ЕД

0 12 3

* - р 0,05 в сравнении с контролем.

Рис. 7. Антиоксидантная активность фармпрепаратов и парафармацевтиков в модельных тест-системах с химической индукцией СРО.

В ходе исследования проявилась способность препаратов липоевой кислоты (в экспериментальной максимальной разовой дозировке - 2,5 мг/мл) вызывать гемолиз эритроцитов при длительной инкубации (г = 24 часа, температура около 0 С) и при инкубации более 60 минут в термостате (I = 37 С). В тоже время контрольные пробы изучаемой крови сохраняли свои свойства в таких же условиях в отсутствии препаратов липоевой кислоты и при добавлении к ним раствора тироксина совместно с липоевой кислотой в дозировке, вызывающей гемолиз. При использовании

минимальных терапевтических дозировок препаратов липоевой кислоты выявлено нарастание антиоксидантных свойств в интервале дозировок 0,5 - 1,25 мг/мл (инкубация с кровью > 60 минут) (рис. 10).

о а. к

0 я

и

1 я

контроль 5%-ингибирования ВХЛ

* 0,08 ЛК *0,16ЛК * 0,25 ЛК

липоеви кислотои

концентрация липоевой кислоты (ЛК), мг/мл * - р<0,05 в сравнении с контролем. Рис. 8. Ингибирование ВХЛ как показатель дозозависимого эффекта липоевой кислоты

ю

20-1 У

15' У

10- у

5- У

0- /

контроль 1%-игибирования ВХЛ бета-каротином

0,33 БК * 1.67 БК * 3,33 БК

концентрация бета-каротина (БК), мг/мл р<0,05 в сравнении с контролем.

Рис. 9. Ингибирование ВХЛ как показатель дозозависимого эффекта бета-каротина

ю X Я Ю

контроль

ЕЗ %-ингибирования ВХЛ

* 0,5 ЛК

1,25 ЛК

2,5 ЛК

концентрация липоевой кислоты (ЛК), мг/мл

* - р<0,05 в сравнении с контролем.

препаратом липоевои кислоты рис ¡о Ингибирование ВХЛ как показатель дозозависимого эффекта

тиоктацида после инкубации с кровью

Исходя из полученных результатов, при разработке и внедрении в клинику препаратов для подтверждения их антиоксидантных свойств требуется более направленная их апробация, с предварительной оценкой антиоксидантного потенциала с помощью амперометрического способа и хемилюминесцентного метода, а также в различных модельных тест-системах с использованием как физических, так и химических инициаторов СРП Для стандартизации антиоксидантов прямого действия целесообразно использовать их унифицированную классификацию, исходя из механизма действия АО с последующей цифровой маркировкой и указанием АОА в универсальных единицах (убихиноновые единицы, аскорбиновый эквивалент, %-ингибирования BXJI)

Учитывая, что высокий лечебный эффект, получаемый в клинике от применения препаратов липоевой кислоты, обладающих антиоксидантными свойствами, необходимо сохранять на протяжении всего амбулаторного этапа ведения больных СД, у которых установлен выраженный ОС, можно рекомендовать в качестве поддерживающей и профилактической терапии тиолсодержащие препараты производные глутатиона Так как трипептид глутатион, являясь кофактором ферментов АОЗ, в частности глутатионпероксидазы, способен активно обезвреживать перекиси различной природы, снижать уровень прооксидантых факторов и одновременно, являясь донатором протонов, восстанавливать или регенерировать неферментые низкомолекулярные АО, такие как аскорбиновая кислота и токоферолы, повышая антиоксидантный потенциал организма человека Кроме того, глутатион активно участвует в транспорте аминокислот через клеточные мембраны, что очень важно учитывать у больных СД с нарушенным азотистым обменом

ВЫВОДЫ

1 У больных СД в период декомпенсации заболевания наблюдается развитие ОС, что лабораторно подтверждается при СД 1 типа снижением АОА плазмы на 37,1% и SH-групп на 38,1%, повышением ВХЛ на 497,3% и ТБЧобщ на 32,2%, у больных СД 2 типа снижением АОА плазмы на 29,6% и SH-групп на 33,5%, повышением ВХЛ на 248,1% и ТБЧобщ на 24,4%, что свидетельствует о глубоком дисбалансе в системе прооксиданты-антиоксиданты

2 Наибольшей антирадикальной активностью и антиоксидантной емкостью обладают тиолсодержащие лекарственные вещества (берлитион, тиоктацид, эспа-липон), производные липоевой кислоты, которые оказывают наиболее выраженный модулирующий дозозависимый антиоксидантный эффект на плазму крови больных СД ex vivo

3 Антиоксидантные показатели комбинированных парафармацевтических средств антиоксидантной коррекции наибольшие у кардиотоника (АОА = 24,3 мг/л vit С, АОА = 5,2 Q-ЕД) и ультраантиоксидантной формулы (АОА = 12,6 мг/л vit С, АОА = 4,7 Q-ЕД), что позволяет разработать алгоритм и определить оптимальные

дозировки их использования для профилактики осложнений ОС у больных СД в амбулаторных условиях.

4 Коррекция метаболических нарушений прооксидантно-антиоксидантной системы на 25-40% более эффективна при использовании в комплексной терапии больных СД 1 и 2 типа препаратов липоевой кислоты (берлитиона, тиоктацида), которые способны повышать АОА плазмы и эритроцитов на 23,4-28,9% и снижать уровень СРО в крови на 16,0-66,9%, что определяет важную роль этих препаратов для лечения больных с ОС.

5 Комплексная оценка АОА фармацевтических препаратов и парафармацевтиков наиболее достоверна при параллельном изучении их антиоксидантной емкости с помощью амперометрического метода и АОА с помощью хемилюминесцентного метода и модельных тест-систем, что позволит повысит эффективность их применениея при заболеваниях, сопровождающихся развитием ОС

Практические рекомендации

1 В клинических условиях показано, что использование амперометрического анализатора «Яуза-ААА-01» позволяет проводить эффективный скрининг-контроль АОА фармацевтических и парафармацевтических средств и осуществлять мониторинг проводимой терапии при различных заболеваниях по изменению антиоксидантных показателей биологических жидкостей организма человека

2 Для эффективной коррекции нарушений прооксидантно-антиоксидантной системы у больных СД 1 и 2 типа в стадии декомпенсации следует рекомендовать инъекционные формы липоевой кислоты (берлитион) в стандартной суточной и курсовой дозировке, с последующим назначением в качестве поддерживающей антиоксидантной терапии (для стабилизации прооксидантно-антиоксидантного равновесия) пероральных форм липоевой кислоты (берлитион) или глютатион формулы в течение 2-х месяцев.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Басов А А Клинико-генеалогический анализ больных сахарным диабетом // Материалы 63-й студенческой науч.-практ конф - Краснодар, 2002 - С 91

2 Basov А А , Pavluchenko 11, Fedosov S R Inhibition of peroxide oxidation m authors test-systems by the different medicines // Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health mtern confer Russia - Smolensk, 2003 - P. 8-9

3. Басов A.A., Павлючеико И.И., Плаксин A.M., Федосов C.P. Использование аналогово-цифрового преобразователя в составе системы сбора и обработки информации с хемилюминитестером LT-1 // Вести, новых мед. технологий. -2003. - Т. 10, № 4 - С. 67-68.

4 Басов А А, Федосов С Р Сравнительное исследование антиокислительной активности ß-каротина и других известных антиоксидантных веществ // Материалы

IV конф молодых ученых Кубани «Актуальные проблемы

экспериментальной и клинической гастроэнтерологии» - Краснодар, 2003 -С 9-11

5. Павлюченко И.И., Басов A.A., Орлова C.B., Быков И.М. Изменение активности ферментов антирадикальной защиты как прогностический критерий развития и прогрессирования сахарного диабета // Intern J. immunorehabihtation. - 2004. - V. 6, N 1. - С. 14-19.

6. Павлюченко И.И., Дынько Ю.В., Басов A.A. Показатели эндогенной интоксикации и окислительного стресса у больных с сахарным диабетом на фоне декомпенсированного кетоацидоза // Вестн. интенсив, терапии,- 2004. - № 5 - С. 116-120.

7. Павлюченко И.И., Басов A.A., Быков И.М., Орлова C.B., Интегральные методы оценки уровня эндогенной интоксикации и перекисного окисления биомолекул при острых и хронических заболеваниях // Аллергология и иммунология. - 2004. - Т. 5, № 4. - С. 551-554.

8. Pavluchenko I.I., Basov A.A., Bykov I.M., Orlova S.V. Change of the level of thiol groups in the patients with diabetes mellitus and possibility of its correction by tbe SH-containing biologically-active additives (glutathione formula) // Intern. J. immunorehabihtation. - 2005. - V. 7, N 1. - P.51.

9. Павлюченко И.И., Басов A.A., Есауленко E.E., Быков И.М., Орлова C.B. Хемилюминесцентный анализ как способ мониторинга окислительного стресса у больных с сахарным диабетом и гипотиреозом // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6, № 2. - С. 290.

10 Павлюченко И И, Быков И M, Басов А А Современные подходы к изучению антиоксидантной активности фармпрепаратов и биологически активных добавок in vitro // Материалы межрегиональной науч -практ конф «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» - Самара, 2005 - С 282-285

11 Павлюченко И И , Быков И M , Басов А А Сравнительная характеристика чувствительности плазмы крови больных с эндокринной патологией к некоторым антиоксидантам // Сб тр 4-й национальной науч -практ конф с междунар участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» -Смоленск, Россия, 2005 -Сс 218-221

12. Быков И.М., Павлюченко И.И., Басов A.A., Луговая И.А., Орлова C.B. Экспресс-диагностика окислительного стресса у больных с сахарным диабетом 1 типа и влияние Тиоктацида 600 Т на показатели свободнорадикального окисления // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6, № 3. - С.367.

13 Павлюченко И.И., Луговая И.А., Басов A.A., Орлова C.B., Быков И.М. Особенности изменения активности ферментов антиоксидантной системы у больных сахарным диабетом // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6, № 4. - С.480-485.

14 Басов А А . Федосов С Р, Канус И С, Еремина Т В , Пшидаток Д В , Малышко В В Современные способы стандартизации антиоксидантных лекарственных средств и биологически активных добавок // Современные проблемы науки и образования - 2006 - № 4 - Приложение № 1 - С 149

15 Луговая ИА, Быков МИ, Моргоев А.Э, Гайворонская ТВ, Басов А А, Федосов С Р , Павлюченко И.И Активность ферментов антирадикальной защиты в

эритроцитах и раневом отделяемом у больных с осложненным течением сахарного диабета // Материалы XIV Междунар. конф и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» - Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. - 2006 - С 425-427 16. Быков М.И., Павлюченко И.И., Басов А.А., Белоножкина Е.С., Канус И С. Динамика активности ферментов антирадикальной защиты у больных сахарным диабетом при фармакотерапии препаратами липоевой кислоты // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т. 8, № 1. - С.85-86.

17 Басов А А, Федосов С Р , Канус И.С, Губарева Е А , Власов Р В , Малышко В В, Макаренко Н В Динамика показателей прооксидантно-антиоксидантной системы у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа после комплексной терапии с препаратами липоевой кислоты // Тезисы докладов XXXIV науч конф студентов и молодых ученых Вузов ЮФО - Краснодар - 2007 - С 33-34

Список патентов на изобретения, полезные модели и программное обеспечение

1 Павлюченко И И, Басов А А., Федосов С Р Способ диагностики антиокислительной активности лечебных и профилактических антиоксидантных средств патент на изобретение № 2182706 -Заявл 15 01 2001, опубл 20 05 2002 -Б.14

2 Павлюченко И И, Басов А А., Федосов С Р Система лабораторной диагностики окислительного стресса Патент на полезную модель № 54787 - Заявл 19 01 2006, опубл 27.07 2006-Б.21

3 Павлюченко И И., Федосов С Р , Басов А А. Программа регистрации сигналов хемилюминотестера ЛТ-1 Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006611562 -Заявл № 2006610783 от 16 03 2006

Список сокращений

АО — антиоксидант, антиоксиданты АОА — антиокислительная активность, антиоксидантная активность

АОЗ - антиоксидантная защита АОС - антиоксидантная система АРЗ — антирадикальная защита АФК - активные формы кислорода ВХЛ - вспышка хемилюминесценции КАТ - каталаза

ОМБ - окислительная модификация биомолекул

ОС - окислительный стресс ПОЛ - перекисное окисление липидов

СД - сахарный диабет СОД - супероксиддисмутаза СРО — свободнорадикальное окисление

СРП — свободнорадикальные процессы

ТБК - тиобарбитуровая кислота ТБЧ - тиобарбитуровое число УФО - ультрафиолетовое облучение ХЛ - хемилюминесценция

Типография ООО «редакция газеты «Всякая Всячина» г Краснодар, ул Рашпилевская, 181, т. (861) 259-41-59 Объем 1 5 п л Тираж 100 экз. Заказ № 107.