Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние антиоксидантов на структурно-функциональное состояние эритроцитов крови собак при окислительном стрессе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние антиоксидантов на структурно-функциональное состояние эритроцитов крови собак при окислительном стрессе"

На правах рукописи

Иванова Ирина Павловна Г Г Г) од

ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА СТРУКТУРНО -ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ СОБАК ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

03.00.13 физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2000

Работа выполнена в Центральной научно - исследовательской лаборатории Нижегородской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Конторщикова К.Н. Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор

Богдарин Ю.А.

2. Кандидат биологических наук, доцент

Вдовина Н.В. Ведущая организация:

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Защита диссертации состоится апреля 2000 г

в I ^ часов на заседании Диссертационного Совета Д 120.40.02 в Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 603107, Н. Новгород, пр. Гагарина, 97

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан_марта 2000 года

Ученый секретарь

диссертационного совета к.б.н., доцент

ii.ii.

Ь О

/ 7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. Влияние физиологически активных соединений на структурно-функциональную целостность биологических мембран остается иауальной проблемой экспериментальной биологии и физиологии. С ней напрямую связаны особенности функционирования клеток крови и, в частности, эритроцитов в норме, а также при действии различных факторов. (Владимиров Ю.А., 1972; Каган В.Е., 1986; Бароненко В.А., 1988; Савич A.B., 1993). Несомненно, что в условиях экислительного стресса, развивающегося при ультрафиолетовом облучении, воздействии радиации, старении несомненное значение имеет активация или угнетение процессов свободнорадикального окисления (Harris M., 1992;Барабой В.И., 1993; Зенков И.К., 1993; Гамалей И.А., 1999).

В норме окислительные процессы строго контролируются, причем важную роль в регуляции перекисного окисления выполняют различные ферментативные и неферментативные системы, значительное место среди которых занимают антиоксиданты (Кения М.В., 1993; Паранич В. А., 1999)

Избыточное образование перекисей липидов, в условиях окислительного стресса, приводит к серьезным нарушениям в биомембранах: полному окислению ненасыщенных жирных кислот, нарушению структуры и функции белков, нуклеиновых кислот, мембраносвязанных ферментов и, в конечном счете, к гибели клеток (Деев А.И., 1989; Зенков И.К., 1993; Бышевский А.Ш., 1994). Важно, что повреждающей эффект имеет не столько усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ), сколько истощение и срыв собственной защитной антиоксидантной системы клетки. Поэтому, в последние годы широко изучаются природные и синтетические антиоксиданты, а также их вклад в защиту мембран клеток от повреждающего действия свободнорадикального окисления (Меныцикова Е.Б., 1993; Kramer К., 1994; Трубников Г.А., 1997; Орлова C.B., 1999).

Таким образом, исследование факторов, которые вызывают изменение скорости ПОЛ, а также изучение механизмов действия веществ, способных снимать эти изменения, является актуальным. Возникает необходимость поиска и скрининга физиологически активных соединений ангаокислительного действия, выявление их

специфических свойств, которые и позволяют регулировать свободнорадикальные реакции.

Цель и задачи исследования

Цель работы - оценить влияние природных и синтетических ангиоксидантных препаратов на структурно - функциональное состояние эритроцитов крови собак в условиях моделирования окислительного стресса озоном. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Изучить структурно - функциональные изменения в эритроцитах крови собак, вызванные окислительным стрессом. Создать в условиях in vitro модель окислительного стресса посредством воздействия озона на эритроциты.

2. Провести скрининг биологически активных соединений буфатина, гутимина, мочевины, роданитов (тиоционатов) по механизмам антиоксидантного действия

3. Оценить характер действия антиоксидантов на эритроциты в условиях экспериментального окислительного стресса, вызванного озоном.

Научная новизна. Показаны изменения структурно - функциональных . свойств эритроцитов in vitro при моделировании окислительного стресса путем воздействия озоном в концентрации 1500 мкг\л.

Разработан новый метод для изучения антирадикальной активности в системе с озонированным физиологическим раствором.

Впервые исследованы антирадикальные и антиоксидантные свойства таких препаратов как: буфатин, роданистый гуанидин, роданистый аммоний, роданистый натрий. Изучены механизмы антиоксидантаого действия выше перечисленных веществ на клеточном уровне. Показана эффективность использования этих препаратов для сохранения структурно-функциональной целостности эритроцитов в условиях экспериментального окислительного стресса.

Выяснено, что восстановление структурно - функциональных свойств эритроцитов, вызванных воздействием озона, присуще всем изученным веществам. Буфатин наиболее активно проявлял свои антиоксидантные свойства. Данный препарат был эффективен в более низкой концентрации, чем другие исследованные вещества. Из группы роданитов наибольшую антиоксидантную активность проявлял

юданистый гуанидин. Показано, что наиболее выраженными антирадикальными свойствами обладает синтетический препарат гутимин, который был намного »ффективнее природных роданитов в условиях модельных экспериментов.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные вносят существенный вклад в понимание механизма действия озона на эритроциты. Разработанный нами метод позволяет провести обоснованный скрининг и оценку штиоксидантных свойств препаратов, которые могут использоваться, как стабилизаторы свободнорадикальных процессов. Результаты исследования могут гайги свое применение в ветеринарии и медицине. Предлагаемый нами методический подход открывает перспективное направление поиска новых средств штиокислительного действия, эффективных при регуляции окислительных состояний, а также расширяет представления о механизмах их действия на щеточном уровне. Практическая ценность работы закреплена авторским свидетельством (Ы 2020945 от 23.11.89 г.) «Способ активации систем штиоксидантной защиты организма» и патентом на изобретение (И 2112982 от 10.06.98 г.) "Способ оценки антиокислительной активности химических и эиохимических соединений». Результаты исследования и разработанный метод «пользуются при выполнении научно-исследовательских работ в ЦНИЛ НГМА.

Положения, выносимые на защиту.

1 .Озон, в концентрации 1500 мкг/л озоно-кислородной смеси, воздействуя на этмытые от плазмы эритроциты собак, вызывает деструктивные изменения в мембране, нарушает структурно - функциональные свойства эритроцитов и ведет к разрушению 50 % клеток.

2.Препараты: буфатин (10"9М), гугамин, роданистый аммоний, роданистый гуанидин и роданистый натрий (10"7М) являются антиоксидантами. Данные зещества проявляют антирадикальные и антиоксидантные свойства. \нтирадикальные свойства наиболее выражены у гутимина, антиоксидантные - у эуфатина.

3. Использование буфатина, гутимина, мочевины, роданистого аммония, роданистого гуанидина и роданистого натрия непосредственно перед воздействием эзоном приводит к снижению внеклеточного гемоглобина, увеличению количества

неразрушенных эритроцитов, снижению конечных продуктов перекисного окисления липидов, уменьшению лизофосфатидилхолина, увеличению количества холестерина и восстановлению структурно-функциональных свойств эритроцитов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на: Республиканской научно-практической конференции "Актуальные проблемы физико-химической медицины". Конаково,1988 год; Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение". Рига,1989 год; 3-й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант". Москва, 1989 год; Interconference on "Regulation free radical reac". Varna, 1989 год; Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний. Горький, 1989 год; Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений принципы и подходы". Москва, 1989 год; Ppoceedings of 12 Osone World congress. Lille, 1995 год; 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Озон в биологии и медицине". Н. Новгород, 1995 год; 2 International Simposium on Ozone Applications, Havana 1997 год; 3 Всероссийской научно - практической конференции "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" Н. Новгород, 1998 год.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 180 источников (113 отечественных и 67 зарубежных). Работа содержит 16 рисунков и 19 таблиц.

Материалы и методы исследования.

Характеристика экспериментального материала.

Объектом исследования служили эритроциты и липосомы, экстрагированные из липидов эритроцитов. В экспериментах была использована кровь 90 животных (беспородных собак). У здорового животного забиралась кровь из бедренной вены (гемолитик гепарин). Эритроциты трижды отмывались физиологическим раствором, затем клетки разводились забуференным раствором Хенкса (по составу солей

раствор Хенкса близок к плазме крови). Количество клеток в суспензии - 7,5 - 7,0 х 1012 в литре, что соответствует физиологической норме эритроцитов.

Эксперименты проводились in vitro. Озон применяли в концентрации 1500 мкг\л озоно - кислородной смеси, данная концентрация широко применяется в озонотералии (Мирошин С.М., 1995; Сорокина С.Р., 1997).

Подвергшаяся воздействию озоном (экспозиция 1 минута) и антиоксидантами (инкубация 30 минут), а также контрольная (не подвергавшаяся воздействиям) взвесь эритроцитов находились в термостатируемой бане в течение суток при температуре 36,6 градусов, под слоем вазелина, чтобы исключить окисление кислородом воздуха. Для получения озона использовали озонатор «МЕДОЗОНС». Концентрацию озона контролировали в газовой фазе спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 254 нм, в жидкости -методом йодометрического титрования (Разумовский С.Д., 1974).

Характеристика исследуемых соединений.

В настоящей работе проводились исследования по выявлению и оценке антиоксидантных свойств буфатина (10"9М), гутимина (10 "7М), препаратов ряда тяоционатов: роданистого натрия (10'7М), роданистого аммония (10 ~7М), роданистого гуанидина (10'7 М) в условиях моделирования окислительного стресса озоном. Озон относится к сильным окислителям. В высоких концентрациях озон повреждает липиды и окисляет белки . (Carrol А., 1992).

Гутимин - гуанилтиомочевина, искусственный препарат, обладает антигипоксическими свойствами, уменьшает токсическое действие радиопротекторов, снижает уровень ПОЛ (Пастушенков JI.B., 1989; Бояринов Г. А.,1990).

Тиоционаты - малоизученные вещества, являются продуктами метаболизма человека. В экспериментальных исследованиях выявлены антигипоксические свойства таоционата аммония (Шаров Ю.Г., 1989).

Буфатин - фармакологический препарат, изготовленный из яда жаб Bufa viridis dans. Химико-технологический анализ показал, что в состав буфатина входят вещества, имеющие высокую биологическую активность. ( Орлов Б.Н., 1978, 1980, 1985; Крылов В.Н., 1987).

Исследование проводилось в три этапа:

1. На первом этапе исследовалась глубина структурно - функциональных нарушений эритроцитов в условиях окислительного стресса. Окислительный стресс моделировали посредством воздействия на эритроциты озоном, в концентрации 1500 мкг\ л озоно-кислородной смеси в течение 1 минуты. Суспензию эритроцитов делили на 2 серии. Первая серия - контрольная (отмытые разведенные забуференным раствором Хенкса эритроциты) (20 экспериментов). Вторая серия -эритроциты после воздействия озоном в концентрации 1500 мкг/л в течение 1 минуты (20 экспериментов). Структурно-функциональное состояние эритроцитов после воздействия озоном изучалось в динамике в течение суток. Пробы анализировались через 1 час после озонирования, через 2 часа, через 4 часа, через 6 часов и через 24 часа после озонирования.

2. На втором этапе исследовались антирадикальные и антиоксидантные свойства буфатина (10 -9 М), гутимина (10 -7 М), мочевины (10 -7 М), роданистого аммония (10-7 М), роданистого гуанидина (10 -7 М), роданистого натрия (10 -7 М). Эксперимент выполнялся на моноламилярных липосомах. Липиды для моноламилярных липосом экстрагировались из отмытых эритроцитов крови собак. Взвесь липосом делили на следующие серии - 1. контрольная серия (не подвергавшаяся воздействию) (40 экспериментов) , 2. серия, подвергавшаяся воздействию окислителей (20 экспериментов) и антиоксидантов (40 экспериментов). Суспензию липосом инкубировали с исследуемыми веществами в течение 30 минут, затем инициировали ПОЛ тремя способами: 1. системой Ее3+ + аскорбиновая кислота; 2. Бе3+ +Н2Ог; 3. барботированием липосомальной взвеси озоном, в течение 1 минуты в концентрации 1500 мкг\л озоно-кислородной смеси. Через 30 минут регистрировалась интенсивность свободнорадикального процесса.

3. На третьем этапе изучалось структурно - функциональное состояние эритроцитов после сочетанного воздействия антиоксидантов и озона. Суспензию эритроцитов делили на следующие серии: 1. контрольная серия (20 экспериментов), 2. серия, подвергшаяся воздействию озоном в концентрации 1500 мкг\л озоно-кислородной смеси в течение 1 минуты (20 экспериментов), 3. серия эритроцитов с предварительной инкубацией антиоксидантами и воздействием озоном (20

экспериментов). Клетки эритроцитов перед озонированием инкубировали 30 минут с изучаемыми веществами. Пробы анализировались через 4 часа после воздействия озоном, т. к. именно к этому времени (по результатам первого этапа исследования) происходили наибольшие структурно-функциональные изменения в эритроцитах.

Характеристика методов исследования

1. Оценку структурно - функционального состояния эритроцитов проводили с помощью гематологических методов, которые включали: определение внеклеточного гемоглобина, гематокрита, СОЭ. Подсчет количества эритроцитов и телец Эрлиха - Гейнце (Меньшикова А.И., 1987). Изучение кислотной (Гитгельзон А.И., 1961) и ультразвуковой (Кокшаров И.А., 1995) резистентности эритроцитов.

2. Антирадикальные свойства химических соединений оценивали по способности веществ реагировать со стабильным свободным радикалом дифенилпикрилгидразином (Glavind J., 1963, 1952), а также по тушению хемилюминесценции, индуцированной озоном, в физиологическом растворе (Иванова И.П., 1998).

3. Липосомы получали методом гидратации липидной пленки. Липиды экстрагировали из эритроцитов крови собак (Антонов В.Ф.,1985).

4. Оценку состояния перекисного окисления липидов изучали, определяя интенсивность индуцированной хемилюминесценции (Кузьмина Е.И., 1983, Владимиров Ю.В., 1996), и анализируя уровни молекулярных продуктов перекисного окисления липидов: диеновых коньюгатов (ДК), триеновых коньюгатов (ТК) (Shenstone F.S., 1971) , оснований Шиффа (ОШ) ( Fletcher D.L., 1973), малонового диальдегида (МДА) (Smith J.B., 1976).

5. Изучали активность ангиоксидангных ферментов: супероксиддисмутазы (Nishikimi М., 1972) и каталазы (Aebi Н., 1970).

6. Анализировали липидный спектр эритроцитов. Липиды эритроцитов выделяли по методу Folch (Folch J., 1959). Разделение липидов по классам осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии.

7. Математическую обработку результатов проводили, анализируя средние значения, с использованием критерия Стьюдента, для оценки достоверности различий двух выборок. Различие считалось достоверным при Р< = 0,05.

Статистическая обработка средних проводилась на компьютере IBM PC с использованием пакетов прикладных программ Statistika и Microsoft Exel.

Результаты исследований и их обсуждение.

Структурно-функциональные изменения эритроцитов после воздействия

озоном.

Результаты влияния озона на гематологические и биохимические показатели эршроцитов приведены в Табл.1 и Табл.2.

Установлено, что после воздействия озоном в концентрации 1500 мкг\л в эритроцитах происходят следующие изменения.

Количество эритроцитов после озонирования начинает изменяться к первому часу; через 4 часа, в озонированной серии остается 50% неразрушенных эритроцитов, в то время как в контроле количество эритроцитов уменьшается всего на 1,2 %.

Содержание внеклеточного гемоглобина увеличивается с 5,9 г \ л через 1 час после озонирования до 38,0 г \ л через 6 часов. Через 24 часа после воздействия озоном концентрация внеклеточного гемоглобина - 59,1 г \ л, а в контрольной пробе этот показатель увеличивается всего до 8,9 г \ л, что в 6,5 раза меньше.

Показатель гематокрита. изменялся следующим образом: через 2 часа после воздействия озоном гематокрит по сравнению с контрольной серией увеличивался в 1,4 раза, через 4 часа после озонирования в 1,7 раза и через сутки в 1,6 раза.

Количество телец Эрлиха-Гейнца через 4 часа после озонирования увеличивалось до 3 - 4 штук, через 6 часов до 6 - 8 , через 24 часа их количество составляло 11- 12 штук в одном эритроците.

Уровень СОЭ в течение 5 часов после воздействия озоном снижается до 2,9 мм, в то время как, в контрольной серии этот уровень- 5,7 мм.

Резистентность эритроцитов, изучаемая по времени 50% кислотного гемолиза^ через 2 часа после воздействия озоном, снижается до 2,7 минут, а в контрольной группе время 50% гемолиза равно 6,3 минут.

В липидном составе происходят следующие изменения: через 4 часа после озонирования увеличивается содержание лизофосфатидилхолина до 3,1 %,

Таблица 1

Изменение гематологических и липидных показателей эритроцитов

(М±т), п = 20.

Время после воздействия озоном (часы)

Серии эксп. 1 2 4 6 24

Количество эритроцитов (х 10 12)

Контроль 7,3 +0,38 7,3 ±0,45 7,2 ± 0,26 7,0 ± 0,33 6,7 ± 0,17

Возд.Оз , 6,0 ±0,26 5,5 ±0,31 3,2 ± 0,16* 3,0 ± 0,10* 2,8 ±0,11*

внеклеточный гемоглобин (г%)

Контроль 1,12 ± 0,05 2,1 ±0,11 4,1 ±0,68 8,9 ± 0,76

Возд.Оз 5,9 ± 0,45* 24,1 ±0,88* 38,1 ± 1,47* 59,1 ±4,7*

Количество телец Эрлиха-Гейнце (шт)

Контроль 1,1 ±0,10 1,20 ±0,13 1,40 ±0,11 1,50 ±0,12

Возд.Оз 1,40 ±0,16 4,30 ±,41* 8,20 ±0,52* 11,10 ±0,63*

Уровень гематокрита (мм)

Контроль 45±1,4 46±0,9 51±1,7 55±2,3

Возд.Оз 65±1,8 77+2,2* 79±2,8* 81±3,2*

Лизофосфатидилхолин (%)

Контроль 0 0,04 ±0,0064 0,07 ± 0,0005

Возд.Оз 0,07±0,003* 3,1 ±0,008* 5,6 ±0,019*

Холестерин (%)

Контроль 50 ± 3,61 49 ± 1,92 48 ±2,65

Возд.Оз 29 ±2,04 25 ±1,21* 24 ± 2,07*

Резистентность (мин) СОЭ (мм)

Контроль 6,3 ±0,24 5,70 ± 0,26

Возд.Оз 2,7 ± 0,14* 2,90 ±0,23*

* - Достоверность различий относительно контрольной серии р<= 0,005.

Таблица 2

Содержания продуктов ПОЛ и активность АО ферментов (М±т), п = 20.

Время после воздействия озоном (час)

Серии эксперим. 1 2 4 6 24

Диеновые коньюгаты (ед.опт.пл.)

Контроль 0,15±0,001 0,17+0,0012 0,18±0,0014 0,21+0,0013 0,26±0,001

Возд. Оз 0,01± 0,004* 0,0013± 0,0001* 0,0016± 0,0002* 0,0015± 0,0001* 0,0010+ 0,0001*

Триеновые коньюгаты (ед.опт.пл.)

Контроль 0,03±0,0002 0,035±0,001 0,047±0,007 0,048+0,003 0,053±0,002

Возд. Оз 0,01± 0,0003* 0,0057± 0,00008* 0,0013± 0,00006* 0,0007± 0,00002* 0,0004± 0,00001

Малоновый диальдегид (Мм\л)

Контроль 0,08±0,0005 0,10±0,0003 0,09±0,0001 0,12±0,0006 0,11±0,002

Возд. Оз 0,14±0,0008* 0,19±0,0004 0,28±0,001* 0,31±0,001* 0,39±0,0009*

Основания Шиффа (отн.ед. флюоресц.

Контроль 49 ±2,4 35 ±2,9 43 ± 1,9 26 ± 2,2 63 ±3,1

Возд.Оз 104 ±6,1* 78 ±4,3* 74 ±2,6 55 ±2,1* 58 ± 2,7

Активность каталазы (ед.акт.\мин)

Контроль 70 ±0,43 90 ±2,61 70 ±1,22 80 ±3,19 100 ±4,64

Возд.Оз 255 ±12,17* 167 ±5,15 117 ±3,43 154±5,42* 231±9,56*

Активность СОД (ед.акг\сек)

Контроль 6,1 ± 0,04 23,7 ± 0,38* 5,4 ±0,001 2,3 ±0,07* 21,6±0,29*

Возд.Оз 19,2 ±0,31* 3,1 ±0,001* 11,8 ± 0,11* 12,2 ±0,4* 49,1 ±0,51*

»-Достоверность различай относительно контрольной серии р<= 0,005.

снижается процентное содержание холестерина до 25 % сразу после озонирования, в отличие от контроля, где его 50 %.

После воздействия озоном содержание ДК в эритроцитах резко снижено, через час после озонирования содержание ДК в 10 раз меньше, чем в контрольной серии. В дальнейшем ДК- и ТК в опытных образцах регистрируются в следовых количествах. В клетке, в то же время, отмечалось накопление МДА -промежуточного и ОШ -конечного продукта ПОЛ. Ко второму часу, после воздействия озоном, концентрация МДА увеличивалась в 2 раза, через 4 и 6 часов уровень МДА возрастал, по сравнению с контролем в 3 раза. Содержание ОШ к первому часу после озонирования увеличивалось в 2 раза и сохранялось на таком уровне в течение 6 часов.

После озонирования наблюдалась активация антиокислительных ферментов -каталазы и супероксиддасмутазы. Активность катал азы через 1 час после озонирования в 3,6 раз выше, чем в контроле, затем ко второму часу активность фермента снижается в 1,4 раза. Через 4 часа после воздействия озоном активность продолжает снижаться и восстанавливается на 10 % через 6 часов после озонирования. После воздействия озоном активность СОД возрастала, затем ко 2 и 4 часу снижалась, и увеличивалась на следующие сутки в 2,5 раза по сравнению с первоначальным уровнем активности в этой серии. Активность СОД в контрольной серии возрастала ко второму часу и через 24 часа. Через сутки активность СОД в интактных эритроцитах была в 3,5 раз выше первоначальной.

Анализ полученных результатов

При воздействии озона на эритроциты инициируется перекисное окисление, происходит повреждение клеточных компонентов, вызывающих деструкцию эритроцитарных мембран. Увеличение СОЭ и количества макроцитов указывало на возрастание диаметра эритроцитов, а также вязкости, которая, в свою очередь, снижает скорость оседания. Изменение количества телец Эрлиха-Гейнце гвидетельствовало о денатурации мембранных белков. Увеличение концентрации внеклеточного гемоглобина указывает на потерю мембраной эритроцита барьерной функции. Эритроцит становится проницаем для внешней среды, внутреннее годержимое вместе с гемоглобином оказывается во внеклеточном пространстве.

Окисление холестерина и перевод его в гидрофильное состояние способств вымыванию холестерина и расположенных рядом с ним фосфолипидных класте! из мембраны. Холестерин принимает участие в связывании эритроцита гемоглобина. После отщепления некоторой части холестерина распадаеп гемоглобин - холестерин - мембранный комплекс. 50 % эритроцитов пос воздействия озоном в концентрации 1500 мкг\л - гемолизируют.

Таким образом, воздействие озоном ведет к нарушению целостное цитоскелета и изменению структурно - функционального состояния эритроцитов. Исследование антирадикальных и антиоксидантных свойств соединены Результаты исследований антирадикальных и антиоксидантных свойств, изучаем! веществ представлены в Табл. 3. Достаточно полная и объективная информация < АО свойствах может быть получена только с помощью комплексного исследован) с применением разнообразных методов и модельных систем.

Антирадикальную активность регистрировали по реакции со стабильны! свободным радикалом дафенилпикрилгидразином (ДФПГ). Наиболее выражен* реагировал гутимин, затем мочевина, буфатин, роданистый аммоний, роданисты гуанидин, и роданистый натрий по сравнению с известными антиоксидантам витамином Е и ионолом. Гутимин по своей аншрадикальной активност приближался к активности витамина Е и был всего в 1,1 раза ниже. Активност остальных исследуемых соединений оказалась сравнимой с активностью ионол; Активность мочевины была в 1,2 раза выше, чем активность ионола. Активност буфатина и роданистого натрия ниже активности ионола, всего в 1,5 раз; Роданистый аммоний оказался в 1,6 раз менее активным, чем ионол, а роданисты] гуанидин почти в 2 раза.

Способность рекомбинировать активные формы кислорода, образующиеся при озонировании физиологического раствора, изучали по тушению спонтанно! хемилюминесценции. Способность рекомбинировать активные формы кислорода образующиеся при озонировании физиологического раствора, была самой высокой з роданистого гуанидина. Показано, что роданистый гуанидин на 50 % тушит ХЛ гутимин и мочевина на 45 % , буфатин на 43 %, роданистый аммоний и роданистые натрий на 41%.

ПО тушению индуцированной хемилЮминесценции в липосомах (липосомы + РеАБК) показано: что, буфатин снижает интенсивность индуцируемой дадилкшинесценции в липосомах в 2,3 раза, гутимин в 1,8 раза, роданистый натрий а 2 раза. Роданистый аммоний в 1,9 раза, роданистый гуанидин в 2,2 раза.

Таблица 3

Антирадикальная активность с ДФПГ. Уровень МДА и хемшпоминесценции в липосомах при воздействии веществами и озоном (М±ш), п=40.

Серии экспериментов МДА'(Мм\л) Реакция с ДФПГ (мм\сек) Iraax (mV)

Озон.Липосомы 343 ± 2,3*'"

Озон. Физраствор 125 ± 5,2

Буфатин 145 ±1,7* 98±2,1 70 ± 1,2*

Гутимин 152 ± 1,5* 507±12,2* 55 ± 2,4*

Мочевина 169 ±2,2 * 200±5,6* 60 + 3,1*

Родан.Аммоний 149 ±1,3 * 105±3,1 79 ± 5,3

Родан.Гуанидин 173 ±1,7* 91±7,4 65 ± 2,2*

РоданЯатрий 181 ±1,7* 123±3,9 81 ±4,9

*- Достоверность различий относительно контрольной серии р<= 0,005.

По степени торможения ПОЛ в искусственных мембранах - липосомах, яоказано: после воздействия на суспензию липосом озоном, содержание МДА увеличивалось в 3,4 раза по сравнению с контрольной серией. Предварительная инкубация с роданистым аммонием или буфатином достоверно снижала »держание МДА в 2,4 раза, относительно уровня МДА в окисленных липосомах, а тосле инкубации с мочевиной, гутимином, роданистым гуанидином и роданистым татрием - в 2 раза.

Анализ полученных результатов

Антирадикальные свойства наиболее выражены у гугимина и мочевины, утимин эффективнее, скорее всего, за счет наличия трех аминных группировок и

серы в структурной формуле. Гутимин является химическим соединение синтезированным на основе гуанилтиомочевины. Естественно было предположит что между серой и аминогруппой возможна перегруппировка. За счет этого гутим] может являться донором экзогенных SH-групп. Ранее было обнаружено свойсп гутимина тормозить ПОЛ (Бояринов Г.А., 1990) и повышать резистентное мембран клеток и лизосом (Пастушенков Л.В., 1981), снижать токсическое действ! радиопротекторов (Виноградов В.М., 1981).

Антиокислительные свойства наиболее выражены у буфатина, в сост. которого входят биологически активные соединения. Металл переменно валентности - железо эффективно инактивирует роданистый гуанидин. Высок активность роданитов в связывании ионов железа связана с наличием в v структурной формуле группировки SCN". Известно, что эта группировка акгивн также в отношении ионов Со, Zn, Ni, Си (Хьюз М., 1990)., По тушенш индуцированной (Fe+ASC) ХЛ, в которой продуцируются R02- радикалы (Владимиров Ю.В., 1989), можно заключить, что наиболее эффективно защшцае липиды от окисления буфатин и роданистый гуанидин. Можно предположить, что основе действия жабьего яда лежит блокирование ненасыщенным лакгонны] кольцом свободных сульфгидрильных групп белков (Yang L.Y., 1992).. Роданистьи гуанидин имеет в своей структурной формуле атом серы, который также може блокировать доступ к собственным сульфгидрильным группам мембранных белков.

Изучение влияния антиоксидантов и озона на эритроциты крови собак Результаты сочетанного применения антиоксидантов и озона на эритроцит! представлены в Табл. 4 и Табл. 5. Эритроциты перед озонированием инкубировали антиоксидантами 30 минут. Пробы изучали через 4 часа после воздействия озоном т. к. максимальные деструктивные изменения после воздействия озоног наблюдались именно к этому времени.

Количество неразрушенных эритроцитов увеличивалось по сравнению i озонированной серией в 1,5 раза, а при инкубации с буфатином в 2 раза.

Уровень СОЭ после инкубации эритроцитов с антиоксидантами повышался в< всех группах до уровня контроля при инкубации с гугимином, буфатином роданистым гуанидином и роданистым натрием.

При изучении резистентности эритроцитов, по времени 50 % ультразвукового i кислотного гемолиза, показано увеличение времени гемолиза клеток. При икубации с антиоксид антами буфатин увеличивал ультразвуковую резистентность 2,5 раза, гутимин в 3 раза, мочевина

Таблица 4

Изменение гематологических показателей эритроцитов после воздействия антиоксидантами и озоном (М±ш), п = 20.

Серии HB Количество Резистентность

экспериментов (г\л) эритроцитов эритроцитов

(х1012л) (мин)

Контроль 6,2 ±0,62 65,9 ±3,1 6,3±0,01

Возд. Озон 14,1 ±0,93** 28,4±1,4** 2,7±0,002**

Возд. Буфатин 6,6±0,09* 43,1 ±2,4* 5,7 ±0,04*

Возд. Гутимин 7,1 ±0,55* 50,3 ±3,6* 6,9 ±0,06*

Возд.Род.аммоний 6,3 ±0,34* 43,1 ±2,1* 5,7 ±0,004*

Возд.Род.гуанидин 5,2 ±0,46* 45,5 ± 2,6* 4,3 ±0,01

Возд. Род.натрий 5,4±0,71* 40,3 ±1,9* 4,9 ±0,02

*- Достоверность различий относительно контрольной серии р<= 0,005.

фактически до уровня контроля в 4 раза, роданистый аммоний в 2,2 раза, юданистый гуанидин и роданистый натрий в 1,2 и 1,3 раза, соответственно. Время >0 % кислотного гемолиза увеличивалось в 2 раза при инкубации с роданистым •уанидином и роданистым натрием, в 3 раза практически до уровня контроля при инкубации с мочевиной, роданистым аммонием, буфатином.

Концентрация внеклеточного гемоглобина в пробах, инкубированных с итиоксидантами, снижается до уровня контроля, что в 2 раза ниже, чем после юз действия озоном.

Уровень продуктов ПОЛ ДК, после инкубации с антиоксидантами увеличивался в 10 раз. ТК увеличиваются недостоверно, уровень МДА, после

воздействия антиоксидантами, снижается в 2, 5 раза, а количество ОШ снижается 1,5-2 раза.

При инкубации эритроцитов с АО значительно уменьшается содержаш лизоформ: в 1,6 раза при инкубации с буфатином и гутимином; в 1,3 раза пр инкубации с роданистым гуанидином. Процентное содержание холестерина посд инкубации с антиоксидантами приближалось к контролю, по сравнению, озонированными эритроцитами, где процентное содержание холестерина было в раза ниже.

Таблица 5

Изменение биохимических показателей при воздействии антиоксидантов и озона (М± т), п = 20.

Серии ХЛС МДА ОШ

экспериментов (%) (Мм\л) (отн.ед.фл.)

Контроль 49 ± 1,92 0,05±0,001 3,7 ± 0,001

Возд.Озон 25 ±1,21 ** 0,19±0,001** 35 ±0,5**

Возд.Буфатин 40± 1,1* 0,1 ± 0,02 15±0,3*

Возд.Гутимин 35± 1,9* 0,11± 0,001 21 ± 1,7

Возд.Род.аммоний 33±2,1* 0,12 ±0,004 17 ±0,3*

ВоздРод.гуанидин 37± 3,4* 0,07 ±0,0003* 19 ±0,4*

Возд.Род.натрий 31± 2,8* 0,14± 0,007 25 ±0,9

*- Достоверность различий относительно контрольной серии р<= 0,005.

Анализ полученных результатов

Важнейшим центром, где происходят реакции при воздействии озона, являются эритроциты (Viebahn R., 1985; Bocci V., 1981), что объясняется следующим. Во-первых, из клеточных мишеней окислительного действия озона эритроциты составляют основную массу. Во-вторых, мембраны эритроцитов содержат большую долю фосфолипидов с ненасыщенными жирными кислотами, цепи которых разрываются озонолизом по механизму классических реакций озона с олефинами. В результате озонолиза образуются пероксиды (Rokitansky О., 1982).

При развитии патологических процессов и моделировании окислительных стояний собственные антиоксиданты клетки истощаются, что приводит к сбою в акционировании клетки(НаШуе1 В., 1990; Меньшикова Е.Б., 1993, Parthiban А., >95). Т.о., при усиленной инициации окисления озоном происходит повреждение [еточных компонентов, вызывающих структурные модификации эритроцитарных гмбран, обнаруживаемых по изменению их структурно - функциональных свойств, эзникает необходимость в дополнительном введении антиоксидантов (Klvanova J., '98). Буфатин благодаря наличию амидных группировок, стероидов и гологически активных веществ (Yang L.Y., 1992), проявляет свои ггирадикальные и антиоксидантные свойства, которые позволяют предохранить шестерин и белковые компоненты эритроцитарных мембран от окисления.

Гугимин и роданистый гуанидин увеличивают время 50 % гемолиза, по-щимому, стабилизируя мембрану эритроцита. Содержание ДК при инкубации с ¿следуемыми веществами увеличивается, по сравнению с серией после »действия озоном, в несколько раз. Концентрация МДА и ОШ снижается после 1кубации с авпгиоксидантами. Это позволяет предположить, что ПОЛ габилизируется на первых этапах, конечные продукты ПОЛ образуются в значительных количествах и не дестабилизируют мембрану. Белки в меньшей гепени подвергаются окислительной деструкции благодаря тому, что тгиоксиданты способны защищать S-S и S-H белковые группировки. В груктурной формуле гугамина и родаиитов имеются сульфидные группы, которые, э-видимому, принимают на себя окислительный «удар», позволяя сохраняться збственным сульфидным группировкам глутатиона и других эритроцитарных глков.

Т.о., изученные антиоксиданты препятствуют интенсификации свободно -здикальных реакций, вызванных озоном, а мембраны эритроцитов сохраняют свою груктурно-функциональную целостность.

ВЫВОДЫ

1. При моделировании окислительного стресса озоном в концентрации 500 мкг/л на мембранах эритроцитов in vitro происходит необратимая деструкция япидов и белков мембран, проявляющаяся: в потере барьерной функции

(увеличение концентрации внеклеточного гемоглобина); увеличении объем эритроцита (возрастание гематокрита); снижении резистентности клеток (снижена кислотного и ультразвукового гемолиза); снижении процентного содержали холестерина. Воздействие озоном ведет к нарушению целостности цитоскелета и разрушению 50 % клеток.

2. Общая антиоксидантная активность изучаемых веществ складывается и антирадикальной и антиокислительной активности: а), инакгивирования свободны: радикалов (наиболее выраженными антирадикальными свойствами обладае гутимин и роданистый гуанидин); в), связывания металла переменной валентноси Fc+ (буфатин, роданистый гуанидин и роданистый аммоний); с), стабилизацш мембран эритроцитов (самая высокая степень антиокислительной активности t способности стабилизировать мембраны эритроцитов была выявлена у буфатинз).

3. Воздействие изученными антиоксидантами на эритроциты in vitro, перед озонированием, проявляется: в сохранении объема эритроцита на уровне физиологической нормы; незначительном увеличении концентрации внеклеточного гемоглобина; повышении резистентности клеток (увеличивается время кислотного и ультразвукового гемолиза). Перекисное окисление липидов, при инкубации с изучаемыми антиоксидантами стабилизируется на уровне первичных молекулярных продуктов. Снижается содержание окисленного холестерина.

4. В условиях окислительного стресса, вызванного озоном, комплексное проявление антиокислительных и антирадикальных свойств буфатина, гутимина, роданистого гуанидина, роданистого аммония, роданистого натрия способствует сохранению структурно - функциональной целостности мембран эритроцитов.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1.KoKuiapoB И.А., Конторщикова К.Н., Перетягин С.П., Дезент JI.A., Яхно В.Г., Иванова И.П. Изучение изменений вязко-эластичных свойств мембран эритроцитов при активации перекисного окисления липидов. // " Республиканская научно-практическая конференция "Актуальные проблемы физико-химической медицины": Тез. докл.- Конаково, 1988 .- С. 28.

2. A.C. № 2020945. Способ активации систем антиоксидантной защиты организма. Перетягин С П., Конторщикова К.Н., Баландина М.В., Бояринов Г.А., Зеленов Д.А.,

лыкин В.А., Яковлева Е.И., Смирнов В.П., Иванова И.П. // Изобретения, {шциальный бюллетень росийского атенства по патентам и товарным знакам »94. -№ 19.-С.42.

Конторщикова К.Н., Перетяган С.П., Иванова И.П. Использование 1уоресцентных методов в определении антиокислительного действия химических 'единений. // "Всесоюзное совещание. "Люминесцентный анализ в медицине и юлогии и его аппаратурное обеспечение" .Тез. докл.- Рига, -1989 .- С. 102-103. Конггорщикова К.Н., Иванова И.П. Ангиоксидантные свойства буфатина и юционатов. // " 3-я Всесоюзная конференция "Биоантиоксидант" :Тез. докл.- М.,-)89.-т. 1.-С. 258.

Kontorschikova С., Ivanova I. Antioxidant aktivity of bufotin. // "Regulation of Inter inference on free radical reactions" : AbstTakt.- Varna, 1989.-P. 83-84. Иванова И.П. Методический подход к определению антиоксидантной активности гкоторых антигипоксических и фармакологических препаратов. / Моделирование, атогенез и терапия гипоксических состояний. Горький,-1989.-С.74-78. . Иванова И.П. Изучение антиоксидантных свойств тиоционатов. // "Всесоюзная аучная конференция "Оценка фармакологической активности химических эединений: принципы и подходы" :Тез. докл.- М., 1989 . -ч. 2.- С,- 136. . Kontorschikova С., Peretyagin S., Ivanova I., Physico-chemical properties of zonated saline. // " Ppoceedings of 12 osone vorld congress" : Abstrakt.- Lille, -1995,-v. .- P. 237-240.

. Иванова И.П., Конторщикова K.H. Физико-химические свойства озонированных астворов. // "2-я Всероссийская научно-практическая конференция с (еждународным участием "Озон в биологии и медицине" :Тез. докл.- Н. Новгород,-995 .-С. 10

0.П. № 2112982. Способ оценки антиоксидантной активности химических и ¡иохимических соединений. Иванова И.П., Конторщикова К.Н. // Изобретения. )фициальный бюллетень росийского агенства по патентам и товарным знакам 998. -№1 6.-С.384.

1. Иванова И.П. Ангиоксидантные свойства буфатина. М.,-1996,- 6с,- Деп. в ШНИТИ 25.04.96., N 1361-96.

12. Ivanova I.P. The ozone influence in dynamic oscillation of biochemical erythrocyi indexes. // "2 International Simposium on Ozone Applications" : Abstrakt.- Havana 1997.-P. 25-26.

13. Иванова И.П. Влияние озона на структуру и функции эритроцитов собак. // " всероссийская научно - практическая конференция озон и методы эфферентно терапии в медицине" :Тез. докл.- Н. Новгород, 1998 .- С. 13-14.

Подписано к печати 24.03.2000. Формат 60х90'/1б. Бумага писчая. Печать офсетная. Усл.печ.л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 49.

Полиграфический участок НГМА. 603005, Н.Новгород, ул. Алексеевская, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Ирина Павловна

Сокращения и условные обозначения

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика эритроцитов в норме и в условиях окислительного стресса.

1.1.1. Мембрана эритроцитов. Функционирование мембраносвязанных ферментов,

1.1.2. Биохимические процессы в зрелом эритроците

1.2. Воздействие озона на клетку. Физико-химические, биохимические и окислительные свойства озона.

1.3. Современные представления о свободно-радикальном окислении.

1.4. Антиоксидантные системы клетки. Синтетические и природные антиоксиданты.

1.4.1. Классификация антиоксидантов.

1.4.2. Основные группы препаратов, ингибирующих свободнорадикальное окисление.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1.Схема эксперимента.

2.2.Характеристика исследуемых соединений.

2.3. Оценка структурно - функционального состояния эритроцитов.

2.3.1.Гематологические исследования.

2.3.2.Определение кислотной резистентности.

2.4. Экстракция липидов из эритроцитов.

2.4.1. Получение моноламелярных липосом.

2.5. Методы, используемые для оценки антирадикальных свойств.

2.6. Оценка состояния перекисного окисления липидов.

2.6.1. Измерение интенсивности хемшпоминесценции.

2.6.2. УФ - спектроскопия первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

2.6.3. Анализ содержания малонового диальдегида.

2.6.4. Флюориметрический метод определения оснований Шиффа.

2.7. Анализ антиоксидантных ферментов.

2.7.1. Определение активности супероксиддисмутазы.

2.7.2. Определение активности катал азы.

2.8. Анализ спектра липидов.

2.9. Математическая обработка результатов исследования.

Глава 3. Влияние озона на структурно-функциональное состояние эритроцитов.

3.1. Влияние озона на эритроциты в динамике. после обработки озоном. 5 В

3.3. Перекисное окисление лилидов и активность антиоксидантиых ферментов эритроцитов после воздействия озоном.

Глава 4. Оценка антирадикальных и антиоксидантиых свойств используемых соединений.

Глава 5. Влияние антиоксидантов и озона на структурно-функциональное состояние эритроцитов.

5.1. Гематологические исследования.

5.2. Состояние перекисного окисления липидов.

5.3. Оценка липидного спектра эритроцитов после инкубации с ангиоксидантами.

5.4. Изменение активности антиоксидантиых ферментов

Глава 6. Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние антиоксидантов на структурно-функциональное состояние эритроцитов крови собак при окислительном стрессе"

Влияние физиологически активных соединений на структурно-функциональную целостность различных биологических систем остается актуальной проблемой экспериментальной биологии, физиологии и ветеринарии. С ней напрямую связаны особенности функционирования клеток крови и клеточных мембран в норме и при действии различных повреждающих факторов (Владимиров 1972, Каган 1986, Бароненко 1988, Савич 1993, Kramer 1994, Паранич 1999). Несомненно, что в условиях окислительного стресса важное значение имеют активация или угнетение процессов свободнорадикального, перекисного окисления (Harris 1992, Барабой 1993, Зенков 1993, Лапшина 1995, Гамалей 1999). Г

Перекисное окисления липидов (ПОЛ) - процесс, характерный для метабол изирующих клеток, т.е. ПОЛ протекает на определенном стационарном уровне (Фролова 1999).

В норме окислительные процессы в липидах строго контролируются, причем важную роль в регуляции ПОЛ выполняют различные ферментативные и неферментативные системы, значительное место, среди которых занимают антиоксиданты (Кения 1993, Паранич 1999)

4 Избыточное образование перекисей приводит к серьезным нарушениям биомембран: полному окислению ненасыщенных липидов, нарушениям структуры и функции белков, нуклеиновых кислот, мембраносвязанных ферментов, и, в конечном счете, к гибели клеток (Афанасьев 1988, Деев 1989, Зенков 1993, Бышевский 1994, Александрович 1999). Важно, что патогенетическое значение имеет не столько усиление ПОЛ, сколько истощение и срыв собственной антиоксидантной системы клетки. Поэтому в последние годы широко изучаются природные и синтетические антиоксиданты, главным образом, различные биосубстраты и препараты из * них, а также их вклад в защиту мембран клеток от повреждающего действия ф. свободнорадикального окисления ( Меньшикова 1993, Kramer 1994,

Трубников 1997, Орлова 1999).

Исследование систем, регулирующих интенсивность ПОЛ, факторов, которые вызывают изменение скорости этого процесса, и изучение механизмов действия веществ, способных снимать эти изменения, являются актуальными. Возникает необходимость поиска и скрининга физиологически активных веществ антиокислительного действия, выявление их специфических свойств, позволяющих влиять на ПОЛ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель работы заключалась в оценке влияния природных и синтетических антиоксидантных препаратов на структурно функциональное состояние эритроцитов крови собак в условиях моделирования окислительного стресса озоном. В соответствии с этим поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить структурно - функциональные изменения в эритроцитах крови собак вызванные окислительным стрессом. Создать в условиях in vitro модель окислительного стресса посредством воздействия на эритроциты озона. 4

2. Провести скрининг биологически активных соединений: буфатина, гутимина, мочевины, роданитов (тиоционатов) по механизмам аитиоксидантного действия

3. Оценить характер действия антиоксидантов на эритроциты в условиях экспериментального окислительного стресса, вызванного озоном.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Показаны изменения структурно - функциональных свойств ц эритроцитов in vitro при моделировании окислительного стресса путем воздействия озоном в концентрации 1500 мкг \ л озоно - кислородной смеси.

4* Разработан новый методический подход к изучению антирадикальной и антиоксидантной активности веществ на клеточном уровне.

Впервые исследованы антирадикальные и антиоксидантные свойства препаратов природного происхождения: буфатина, мочевины, роданитов и синтетического препарата гутимина. Изучены механизмы их антиоксидантного действия, показана эффективность использования этих препаратов для сохранения структурно-функциональной целостности эритроцитов в условиях экспериментального окислительного стресса.

Восстановление структурно-функциональных свойств эритроцитов после развития окислительного стресса, вызванного воздействием озона, Щ присуще всем изученным веществам. Буфатин и мочевина, препараты природного происхождения, наиболее активно проявляли свои анти оксид антные свойства. Роданистый гуанидин оказался самым эффективным, из группы роданитов

Показано, что наиболее активными антирадикальными свойствами обладает синтетический препарат гутимин, который был намного эффективнее природных роданитов в условиях модельных экспериментов.

По сравнению с другими изучаемыми в данной работе препаратами 4 антирадикальные и антиокислительные свойства наиболее выражены у препарата природного происхождения буфатина, который эффективен в более низкой концентрации, чем другие исследованные вещества.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Полученные в работе данные вносят существенный вклад в понимание механизма действия озона на эритроциты. Разработанный нами метод позволяет провести обоснованный скрининг и оценку антиоксидантных свойств препаратов, которые могут использоваться, как стабилизаторы ^ свободнорадикальных процессов. Результаты исследования могут найти свое применение в ветеринарии и медицине. Предлагаемый нами методический подход открывает перспективное направление поиска новых средств антиокислительного действия, эффективных при регуляции окислительных состояний, а также расширяет представления о механизмах их действия на клеточном уровне. Практическая ценность работы закреплена авторским свидетельством (Ы 2020945 от 23.11.89 г.) "Способ активации систем антиоксидантной защиты организма" и патентом на изобретение (К 2112982 от 10.06.98 г.) "Способ оценки антиокислительной активности химических и биохимических соединений" Результаты работы и разработанные способы используются при выполнении научно-исследовательских работ в ЦНИЛ НГМА.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Озон, в концентрации 1500 мкг/л озоно-кислородной смеси, воздействуя на отмытые от плазмы эритроциты собак, вызывает деструктивные изменения в мембране, нарушает структурно функциональные свойства эритроцитов и ведет к разрушению 50 % клеток.

2. Препараты: буфатин (концентрация 10"9 М), гутимин, мочевина, роданистый аммоний, роданистый гуанидин и роданистый натрий (концентрация 10~7 М) обладают антиоксидантными и антирадикальными свойствами.

3. Использование буфатина, гутимина, мочевины, роданистого 4 аммония, роданистого гуанидина и роданистого натрия непосредственно перед воздействием озоном приводит к снижению содержания внеклеточного гемоглобина, увеличению количества неразрушенных эритроцитов, снижению уровня конечных продуктов перекисного окисления липидов, уменьшению содержания лизофосфатидилхолина, увеличению количества холестерина и восстановлению структурно-функциональных свойств эритроцитов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные результаты диссертации докладывались на: Республиканской научно-практической конференции "Актуальные проблемы физико-химической медицины", Конаково, 1988 год; Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", Рига, 1989 год; 3-Й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант", Москва, 1989 год; International Conference on "Regulation free radical reac Varna, 1989 год; Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний, Горький, 1989 год; Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений принципы и подходы", Москва, 1989 год; Proceedings of 12 Osone World Congress, Lille, 1995 год; 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Озон в биологии и медицине", Н. Новгород, 1995 год; 2 International Simposium on Ozone Applications, Havana 4' 1997 год; 3 Всероссийской научно - практической конференции "Озон и методы эфферентной терапии в медицине", Н. Новгород 1998 год.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Иванова, Ирина Павловна

ВЫВОДЫ

1. При моделировании окислительного стресса озоном в концентрации 1500 мкг/л на мембранах эритроцитов in vitro происходит необратимая деструкция липидов и белков мембран, проявляющаяся: в потере барьерной функции (увеличение концентрации внеклеточного гемоглобина); увеличении объема эритроцита (возрастание гематокрита); снижении резистентности клеток (снижение кислотного и ультразвукового гемолиза); снижении процентного содержания холестерина. Воздействие озоном ведет к нарушению целостности цитоскелета и к разрушению 50 % клеток.

2. Общая антиоксидантная активность изучаемых веществ складывается из антирадикальной и антиокислительной активности: а), инактивироваяия свободных радикалов (наиболее выраженными антирадикальными свойствами обладает гутимин и роданистый гуанидин); в), связывания металла переменной валентности Fe+ (буфатин, роданистый гуанидин и роданистый аммоний); с), стабилизации мембран эритроцитов (самая высокая степень антиокислительной активности и способности стабилизировать мембраны эритроцитов была выявлена у буфатина).

3. Воздействие изученными антиоксидантами на эритроциты in vitro, перед озонированием, проявляется: в сохранении объема эритроцита на уровне физиологической нормы; незначительном увеличении концентрации внеклеточного гемоглобина; повышении резистентности клеток (увеличивается время кислотного и ультразвукового гемолиза). Перекисное окисление липидов, при инкубации с изучаемыми антиоксидантами стабилизируется на уровне первичных молекулярных продуктов. Снижается содержание окисленного холестерина.

В условиях окислительного стресса, вызванного озоном, комплексное проявление антиокислительных и антирадикальных свойств буфатина, гутимина, роданистого гуанидина, роданистого аммония, роданистого натрия способствует сохранению структурно - функциональной целостности мембран эритроцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение: при воздействии озона на эритроциты инициируется перекисное окисление, происходит повреждение клеточных компонентов, вызывающих деструкцию эритроцитарных мембран. Увеличение СОЭ и макроцитов указывает на возрастание диаметра эритроцитов, вязкости, которая, в свою очередь, снижает скорость оседания. Изменение количества телец Эрлиха Гейнце свидетельствует о денатурации мембранных белков. Увеличение концентрации внеклеточного гемоглобина указывает на потерю мембраной ^ эритроцита барьерной функции. Эритроцит становится проницаем для внешней среды, и в скором времени просто разрывается. Внутреннее содержимое вместе с гемоглобином оказывается во внеклеточном пространстве. Окисление холестерина и перевод его в гидрофильное состояние способствует вымыванию холестерина и расположенных рядом с ним фосфолипндных кластеров из мембраны. Холестерин принимает участие в связывании эритроцитами гемоглобина. После отщепления некоторой части холестерина распадается гемоглобин - холестерин- мембранный комплекс (1аго1нп 1990).

Происходит сбой в работе мембранных белков, т.к. нарушается липидное окружение. Внеклеточная жидкость заполняет эритроциты, 50 % из которых после воздействия озоном в концентрации 1500 мкг\л гемолизируют.

Антирадикальные свойства наиболее выражены у гутимина и мочевины, гутимин эффективнее, скорее всего, за счет наличия трех аминных группировок и серы в структурной формуле. Гутимин является химическим соединением, синтезированным на основе гуанилтиомочевины. Это соединение способно к внутримолекулярной перестройке. Действительно, валентность концевого атома углерода гутимина заняты алифатическим радикалом , двухвалентной свободной серой и аминогруппой. Естественно было предположить, что между серой и аминогруппой возможна перегруппировка. За счет этого гутимин может являться донором экзогенных SH-групп . Обнаружено свойство гутимина тормозить ПОЛ и повышать резистентность мембран клеток и лизосом (Виноградов 1978). Гутимин снижает токсическое действие радиопротекторов.

Антиокислительные свойства наиболее выражены у буфатина. Кроме того он эффективно защищает липосомы от окислительной деструкции при воздействии озоном. Металл переменной валентности - железо лучше всего связывается роданистым гуанидином (Хьюз 1990), менее выражено мочевиной. По тушению ХЛ в липопротеиновой системе можно заключить, что наиболее эффективно защищает белки и липиды от окисления ( продуцируется R02- радикал) буфатин и роданистый гуанидин. Предполагается, что в основе действия жабьего яда лежит блокирование ненасыщенным лактонным кольцом свободных сульфгидрильных групп белков. Роданистый гуанидин имеет в своей структурной формуле атом серы, который также может блокировать доступ к собственным сульфгидрильным группам мембранных белков.

Изучаемые вещества защищают мембрану от окисления, не позволяя ей разрываться. Озон окисляет белки и холестерин ,что нарушает структуру эритроцита. Буфатии благодаря наличию амидных группировок, стероидов и таких биологически активных веществ, как серотонин, холестерин и др., проявляет свои антирадикальные и антиоксидантные свойства, защищая холестерин и белковые компоненты эритроцитарных мембран от окисления. Гутимин и роданистый гуанидин увеличивают время 50 % гемолиза, по-видимому, разжижая мембрану. Содержание ДК и ТК при инкубации с исследуемыми веществами увеличиваются по сравнению с группой после воздействия озоном в несколько раз, МДА и ОШ снижаются после инкубации с антиоксидантам и. Это позволяет предположить что ПОЛ стабилизируется на первых этапах, конечные продукты ПОЛ не образуются и не дестабилизируют мембрану. Белки не подвергаются окислительной деструкции благодаря тому, что антиоксиданты способны защищать Б-Я и

Б-Н белковые группировки т.к., в структурной формуле гутимина и роданитов имеются сульфидные группы, которые, по-видимому, принимают на себя окислительный удар, позволяя сохраняться собственным сульфидным группировкам, как у глутатиона, так и в эритроцитарных белках. Окислительной деструкции ферментов не происходит и они продолжают функционировать.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Ирина Павловна, Нижний Новгород

1. Азизова O.A., Осипов АН., Савов В.М. Инициирование неферментативного перекисного окисления липидов в системе Fe 2+ аскорбат линолеат \\ Биофизика -1985 г., т. 30.-в. 1 .-с.5.

2. Альберте Б., Брей Д., Рэфф М. Молекулярная биология клетки.-М.: Мир, 1994. Т. 3. - С. 445-481.

3. Антонов В.Ф. Липосомы. Применение в биологии и медицине.-М.-Наука.-1985.-89 с.

4. Атауллаханов Ф.И., Кляткина А.Б., Витвицкий В.М., Пичугин A.B. Регуляция объема эритроцитов человека. Роль калиевых каналов, активируемых кальцием. \\ Биол. мембраны.-1993.-Т. 10.-№5.-С.519-526.

5. Афанасьев И.Б. Свободнорадикальные ингибиторы и промоторы в биологических процессах. \\ Кислородные радикалы в химии биологии и медицине. Рига : РМИ. - 1988.- с. 9 - 23.

6. Барабой В Н. Перекисное окисление, биоэнергетика в механизме стресса. \\ Нарушение биоэнергетики в патологии и пути их восстановления. М., 1993. - с 27 - 32.

7. Бароненко В.А- Эритроцит-мишень для стресса. \\ Наука в СССР." 1988.Т.30.-№1.-С.5-18.

8. Ю.Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М,- Медицина.- 1989.-370 с.

9. Н.Бойтлер Э. Нарушение метаболизма эритроцитов и гемолитическая анемия \\ М.- Медицина.-1981 с. 13 33.

10. Боярииов Г.А,, Перетягин С,П. и др. Влияние гутимина на углеводный и энергетический обмен миокарда при кровопотере. \\ Кровообращение,-1983.- p. XVI.- № 6,-14 -17.

11. Бояринов Г.А., Конторщикова К.Н., Мухина ИВ. Перекисное окисление липидов и сократительная функция миокарда в постишемическом периоде в зависимости от уровня гипотермической защиты сердца. \\ Бюл. Экспер. биол. -1991.- № 10. с. 374 - 376.

12. Бышевский А.Ш., Терсенов O.A. Биохимия для врача. \\ -Екатеринбург: Уральский рабочий.- 1994. 384 с.

13. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и природные антиоксиданты \\ Успехи химии. 1985. - Т.54. - № 9.-С. 1540-1558.

14. Бурлакова Е.Б., Хохлов А. П. Изменение струюуры и состава липидов после воздействия природных и синтетических антиоксидантов. Влияние на передачу информационных сигналов на клеточном уровне. \\ Биол. мембраны, 1985 Т2 №6 С. 557-565.

15. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Керимов Р.Ф. Взаимосвязь между количеством природных антиоксидантов и вязкостью липидов в мембранах органелл в норме. \\ Бюл.Эксп.биол.и мед. 1986.-N 4.- с. 431 -433.

16. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. \\ М Наука 1972.

17. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных. \\ М.: ВИНИТИ, 1989,- 170с.

18. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Н.В. Грудина и др. Хемшпоминесцентный метод при обследовании животных, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения. \\ Бюл. Эксп. Биол. и мед. -1996. № 1.- С. 39-41.

19. Гаврилов O.K., Козинец Г.И., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. Москва: Медицина, 1985, 288с.

20. Гаврилюк Л .А., Шрайман М.Л. Состояние ферментной редокс-системы глутатиона в крови больных лимфопо-лиферативными заболеваниями. \\Воп. онк.- 1992. -№11. -С. 1304-1308.

21. Гамалей И.А. О регуляторной роли активных форм кислорода в клетке. \\ Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты. \\ Интернациональная конференция, С-Петербург.-1999.-с.767.

22. Гиттельзон А.И., ТерсковВ.Н. Факторы влияющие на стойкость эритроцитов в кровяном русле. \\ Вопросы биохимии, биофизики и патологии эритроцитов. \\ Новосибирск.- 1962/- с. 342.

23. Гогвадзе ВТ., Бруетовецкий H.H., Жулова A.A. Участие фосфолипазы Аз в индуцированном продуктами перекисного окисления липидовразобщении митохондрий печени крыс. \\ Биохимия.-1990.-Т.55. -Вып. 12.-с. 2195-2199.

24. Гончарова Е.И., Пинаев Г.Л. Белки цитоскелета эритроцитов. \\ Цитология,- 1988.-T30.-N 1.-е. 5-18.

25. Граевский Э Л. Сульфгидрильные группы и радиочувствительность. \\ М Атомиздат, 1969.

26. Гуськов Е.П. , Лукаш А.И. Системная реакция многоклеточных организмов на окислительный стресс. \\ Биоантиоксидант. 1989.- т.2.-с.ЗЗ.

27. Даманский В.Ю. Функциональное состояние и фосфолипидный состав эритроцитов у больных раком молочной железы. \\ Вопр. онк. 1992. -№11. - с. 1155 - 1163.

28. Деев А.И., Добрецов Г.Е., Аркхольд И.И., Владимиров Ю.А. Уменьшение площади поверхности фосфолипидных мембран при перекисном окислении липидов. \\ Биол. мембраны, 1989 Т. 6 - №11-с.1227-1231.

29. Иванов И Т. Исследование роли белков эритроцитарной мембраны в термоиндуцированных нарушениях барьера проницаемости. \\ Биол. мембраны.-1997.-Т.14.-№1.-с.41-49.

30. Иванова И.П. Влияние озона на структуру и функции эритроцитов собак . \\ Тез. докл. 3 всероссийская научно практическая конференция "озон и методы эфферентной терапии в медицине", Н. Новгород 1998 г.- с. 13-14.

31. Иванова И.П. Методический подход к изучению антиоксидантных свойств антигипоксантов. Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний. Горький.-! 989.-с.-74-78.

32. Иванова И.П., Конторщикова К.Н. Способ оценки антиоксидантной активности химических и биохимических препаратов. // Изобретения. Официальный бюллетень российского агентства по патентам и товарным знакам 1998.-№1 6.-С.384.

33. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. -М. :Наука. -224с.

34. Каган В.Е., Орлов О Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. \\ Итоги науки и техники. ВИНИТИ АН СССР. Биофизика. М. -1986.-T.18.-c. 136.

35. Казеннов А.М. Маслова М.Н. Влияние мембран безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФ // Цитология." 1991. -Т.31. -№11.-С.32-40.

36. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Роль белков мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов. // Докл. АНСССР.-1990.-Т312.-№1.-с.223-226.

37. Кашперский Ю.П., Адамян A.A. Изучение факторов воздействия озонсодержащего потока на кровь в эксперименте in vitro.W Таз. докл. 3-я Всероссийская конференция "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" Н. Новгород.- 1998,- с. 18.

38. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе. \\ Успехи современной биологии. 1993. - Т.113.- в.4 - с. 456-460.

39. Кирпатовский В. И., Никифорова Н.В„ Кудряшов Ю.В. Надточий О.Н. Использование эмульсии а-токоферола для антиоксидантной защиты ишемизированных и консервированных почек. \\ Бюл. эксперим. биол. и мед.-1996.-№5.-с. 499-502.

40. Климов А.Н., Васильева Л.Е., Маковейчук Е.Г, Лозовский В.Т.,Марачева Е.Я., Хейфец Г.М„ Алексеева Э.М. Зависит ли содержание холестерина в клетках крови от его уровня в плазме? \\ Биохимия.-1994.-№1.-с. 9-77.

41. Козлов Ю.П. Свободные радикалы и их роль в нормальных и патологических процессах \\ М.: МГУ, 1973,- 175 с.

42. Козлов М.М., Маркин B.C. Втягивание мембраны эритроцита в микропипетку: перераспределение мембранного скелета. \\ Биол мембраны.-1989,- Т. 6,- с. 754-764.

43. Козлов М.М., Маркин B.C. Мембранный скелет эритроцита теоретическая модель. \\ Биол. мембраны.- 1986.- Т.З.- с. 404-422

44. Кокшаров И.А. Черняков И.А., Яхно В.Г. Структурно-функциональное состояние мембраны эритроцитов. Н.Новгород: ИПФ АН 1995.-32с.

45. Коновалова Г.Г., Ланкин В.З., Богословская О.А, Влияние высокодисперсного порошка меди на активность супер-оксиддисмутазы при экспериментальном инфаркте миокарда. \\ Бюл.эксп.биол, и мед.- 1989. -№2. -с.154-157.

46. Конторщикова К.Н Биохимические основы эффективности озонотерапии \\ Озон в биологии и медицине: Тез. докл. Н.Новгород, 1995,-с. 8.

47. Конторщикова К.Н Влияние озона на метаболические показатели крови в эксперименте in vitro \\ Гипоксия и окислительные процессы : Сб. научн, трудов Нижегородский мед. ин-т.- Н.Новгород, 1992. -с. 50-54.

48. Конторщикова К.Н. Свободнорадикальное окисление в миокарде в норме и при экстремальных условиях. \\ Сб. научн. тр. "Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний Горький.- 1989.-е, 10-15.

49. Крылов В Н. Разработка технологии фармакологического препарата " буфатина" и обоснование его применения в медицинской практике. \\ В сборнике "Механизмы действия аутотоксинов". \\ Горький. - 1987.

50. Кузьмина Е. И., Нелюбин Л. С., Щепникова М. К. \\ Биохимия и биофизика микроорганизмов. Горький. - 1983. - с. 41 - 48.

51. Кузьмин A.A. Перспективы применения препаратов супероксиддисмутазы для лечения сочетай ной травмы .\\ Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты// Интернациональная конференция, С-Петербург.-1999.-с.770.

52. Кулинский В.И., Колисниченко JI. С. Структура, свойства, биологическая роль глутатиона и регуляция глутатион-пероксндазы. \\ Успехи биол.химии. -1993.-Т. 113.-С. 107-122.

53. Ланкии В.З. Антиоксидантиые ферменты. \\ Тез. докл. 3 Всеросийской конференции "Биоантиоксидант" , Москва.- 1989-т. 1, с. 33.

54. Лапшина Е.А., Заводник И.Б. Структурные изменения эритроцитарных мембран в присутствии СЖК и их производных. \\ Биол. мембраны.-1995.-Т12.-№2.-С, 157-163.

55. Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Каган Э.М. Холестериноз. \\ М,- 1983.- 352 с.

56. Лунин В.В. Попович М.П. Ткаченко С.М. Физическая химия озона. М.-МГУ.- 1998.-c.-305.

57. Лю Б.И. Шайхутдинов Е.М. Физико-химические и биокибернитические аспекты онкогенеза. \\ Алма-Ата: Гылым, 1991.- 270 с.

58. Машковскнй И.А Лекарственные средства. М., Медицина.-1992 в 2 т.

59. Марголис Л. Б. Искусственные липидные мембраны как инструмент для изучения клеточной мембраны. \\ ВИНИТИ, Биофизика мембран. -1984,-в.З.-с. 175-217.

60. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных и окислительных процессов. \\ Успехи совр. Биол,- 1993.-т.ПЗ.-в. 4.-с.442-454.

61. Меньшиков А.И. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования в клинике. М. Медицина. -1987.- с.106-122.

62. Мельникова A.M., Матус Н.Л. Механизмы стимуляции физиологической активности дрожжевых клеток и клеточные мишени действия озона\\Тез. докл. 2 Всероссийской научно-пректической конференции с международным участием\\ Н. Новгород -1995.- с. 6.

63. Орлов Б. Н. ,Бояринов Г. А., Крылов Н. В. \\ АН Арм ССР. Кровообращение . - XYIII. - в. 2. - 1985. - с. 63.

64. Орлов Б.Н. Крылов В.Н. Жабий яд.\\ в сб.: Механизмы действия зоотоксиновА Горький, Горьк. ун-т. 1978.-с.-22.79,Орлов Б.Н., Крылов В Н. Кардиотропное действие яда зеленой жабы. \\-Биол. науки, N 9, 1980.-е. 62-67.

65. Павлова O.E. Влияние озона на реологические свойства крови. Автореф. канд.биол.наук.-М.-с. 3-16.

66. Паранич A.B. Антиокислительный гомеостаз и его изменение с возрастом у крыс. \\ Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты. \\ Интернациональная конференция. С-Петербург.-1999.-с.788.

67. Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постгеморагического периода. \\ Автореф. докт. мед. наук,- Казань.-1991.- 30 с.

68. Перетягин С.П., Бояринов Г.А.Донторщикова К.Н., Зеленое Д.М. Возможность коррекции постреанимационных нарушений организма озоном \\ Тез. докл. IV Всесоюзн. съезда патофизиологов.- Кишинев.-1989,- с. 279.

69. Перетягин С.П.,Бояринов Г.А., Зеленое Д.М., Конторщикова К.Н. Техника озонотерапии. Методические рекомендации. \\ Н.Новгород.-1991,-15 с.

70. Поливода Б.И., Конев В,В., Попов Г.А. Биофизические аспекты радиационного поражения биомембран, М.; Энергоатомиздат, 1990.-154с.

71. Разумовский С.Д. Кислород элементарные формы и свойства.- М.: Химия,- 1979.-304с.

72. Разумовский С.Д., Заиков Г.Е. Озон и его реакции с органическими соединениями. М.: Наука, 1974. 322 с.

73. Ремсден Э.Н. Начала современной химии: Справ. Изд. Л. : Химия.-1989.-784 с.

74. Савич А.В. Роль супероксидного радикала в норме и при патологических состояниях. \\ Нарушения биоэнергетики в патологии и пути их восстановления. М. 1993. - С.33-43.

75. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии.- М.,: МГУ, -1989. 509 с.

76. Си Доренко Свободнорадикальное окисление липидов в патогенезе опухолевой болезни. \\ Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты. \\ Интернациональная конференция, С-Петербург.-1999.-с.777.

77. Сим Э. Биохимия мембран. М.: Мир, 1985.- 110 с.

78. Сторожок С.А., Соловьев СВ. Структурные и функциональные особенности цитоскелета мембран эритроцита. \\ Вопросы медицинской химии.- 1992.- т.38.- № 2.- с. 14 17.

79. Сорокина С.Р., Иванова И.П. Оценка эффективновта озонотерапии хронического генерализованного пародонтоза. \\ Нижегородский медицинский журнал, 1997. -N 2,- с. 56.

80. Трубников Г,А., Левина Т.А., Журавлев Ю.И. Место антиоксидантной терапии в системе паллиативной помощи больным раком легкого. \\ Паллиативная медицина и реабилитация 1997.- №2,- с. 43.

81. Уайт А., Хендлер Ф. Основы биохимии в 3 т.- М Мир 1981.- т. 1.- 534 с.

82. Ужанский Я.Г. Стресс и гемолиз. \\ Пробл. гематол.-1973.-№11.-е. 13-15.

83. Фролова H.A. Свободнорадикальные процессы и регуляция антиоксидантного гомеостаза в организме. W Свободнорадикальные процессы; экологические, фармакологические и клинические аспекты. \\ Интернациональная конференция, С-Петербург.-1999.-с.767.

84. Федорук А.А, Конторщикова К.Н. Андреева H.H. Индекс ненасыщкееости плазмы крови под действием озонированного физиологического раствора. \\ 2 Всероссийская конференция с международным участием.-1995.-с.8.

85. Хашиктуев Б.С., Хашиктуева H.A., Иванов В.Н. Изменение перекисного окисления липидов и фосфолипидного спектра крови у больных раком легкого. \\ Вопр. онк.-1993.-Т. 39.-№7.-с.288-291.

86. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов.М.: Мир.- 1983.-414 с.

87. Храпова Н.Г. О взаимозаменяемости природных и синтетических антиоксидантов, \\ В кн.: Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М. Наука, 1982 г., с. 59-73.

88. Черницкий Е.А. ,Воробей A.B. Структура и функции эритроцитарных мембран., Минск: Наука и техника, 1981.-216 с.

89. Черницкий Е.А., Сенькович O.A. Гемолиз эритроцитов детергентами.\\ Биол. мембраны.-1997.-Т.14.-№4.-С.З 85-393.

90. Черняк Н.Б. Биохимия эритроцитов \\ в кн. : Нрмальное кроветворение е его регуляция. -Под ред. H.A. Федорова \ М.-Медицина 1976,- с. 159 190.

91. Чижевский A.JI. Биохимические механизмы реакции оседании эритроцитов." Новосибирск: Наука, 1980.-178с.

92. Шаров Ю.Г. Внутрикостное введение лекарственных препаратов в амбулаторной практике при угрожающих жизни состояниях \\ Актуальные вопросы постреанимационного периода. Саранск.- 1982с. 91 -93.

93. Шаров Ю.Г. Экспериментальное и клиническое обоснование применения внутрикостного метода вливания лекарственных растворов на догоспитальном этапе. \\ Автореф. канд. мед. наук.- Горький 1986 .-16 с.

94. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Шевченок Т.С., Орлов С.Н . Транспорт Са2 в нейтрофилах и эритроцитах человека в гипотонической и гипертонической средах. \\ Биол.мембраны.-1995.-в. 12.-№3.-С.254-259.

95. Шуваева В. Н., Кузнецова Н.П., Левтов В.А. Реологические свойства крови при частичном замещении ее у крыс раствором модифицированного гемоглобина. \\ Физиол.журн.СССР,-1990.-Т.76.-1Ч 2.-с.192-199,

96. Эккерт Р,, Рендел Д., Огастин Д. Физиология животных. М.-Мир.-1991,- т. 2,- с.85-95.

97. Aebi Н. Methoden der erymatiechen analyses. 1970.- V. 2. - P.636-647.

98. Ames B.N., Sbigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sein. USA. 1993 - P. 7951-7922.

99. Apostolski S, Marinkovic Z, Nikolic A, Blagojevic D, Spasic MB, Michelson AM. Glutathione peroxidase in amyotrophic lateral sclerosis: theeffects of selenium supplementation. \\ J. Environ Pathol Toxicol Oncol.-1998,-N 17,-p.325-329

100. Barclay L.R.C ., Ingold K.U. Autoxidation of biological molecules. \\ J.Am. Chem. Soc. 1981.-v.103,- N 20,- p.6478 6485.

101. Bendicb A. Vitamin E and human immune Junctions. \\ Nutrition and immunology. Plenun Press, New York. 1993.- V. 8. - P.217-228.

102. Bocci V. Ozone: a mixed blessing. New mechanism of the action of ozone on blood cells make ozonated major autohaemotherapy (MAH) a rational approach. \\ Karger. -1996.- v. 3 p. 25 33.

103. Bocci V. Tumor therapy with biological response modifiers. Why is progress slow? \\ EOS-J Immunol Immunopharmacol. 1990. V.10. - P.79-82.

104. Bocci V., Luzzi E., Corradeschi F., Paulesu L. Studies on the biiological effects of ozone: evaluation of immunological parameters and tolerability in normal volunteers receiving ambulatory autohaemotherapy. \\ Biotherapy. -1994.- V.7.- P.83-90.

105. Bosch F. H, Werre J.M, Shipper L, Willektns F.L.,Halie MR. Determinants of red blood cell deformability in relation to cell aqe. \\ Eur-J-Haematol, 1994, v.52, p. 35-41.

106. Cerutti P., Larsson R., Krupitza G. et. ol. Pathophysiological mechanisms of active oxygen. WMutat. Res. 1989 v. 214.- p. 81 - 88.

107. Cochrane C.G. Mechanism of oxidant injury of cells. \\ Molecular Aspects of Medicine.-1991.- v,12.-p. 137 147.

108. Codorean E., Filipescu G., Ciotaru L., Tañase C. Ctllular and subcellular antioxidants involved in liver susceptibility to xenobiotics. Rom J Morphol Embryol. 1997,- N 43.- v. 4.- p.103-111.

109. Cross C., Reznick A., Packer L., Davis P. Oxidative damage to human plasma proteins by ozone. W Free Rad. Res. Comms.- 1992.- v. 15-N15,- p. 347-352.

110. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxyden radikals. General aspekts. \\ Biologikal Chemistri.- 1987,- v. 262.- p. 9895-9901.

111. Desilva T.M., Harper S.L., Kotula L., Curtis P.J.,Otvos L. J.,Speicher D. W. Physical properties of a single-motiv eiythrocyte spectrin peptide: ahighly stable independently folding unit. \\ Biochemistry 1997,- v. 36.- p. 39913997

112. Disher D., Parra M., Conboy J.G.,Mohandas N. Mechanochemistry of the alternatively spliced spectrin-actin binding domain in membrane skeletal protein4.1. \\Biol-Chem.- 1993,-v. 268.-p. 7186-7195.

113. Divisek J. Electrochemical generation and reactuvity of the superoxide ion in agueous solutions. // J. Electroanal. Chem. 1975, v.65, N 2, p. 603-621.

114. Dolhhin D., Poulson R., Avromovic O. Glutathione: chemical, biochemical and medical aspects. \\ Coenzymes and cofactors. N-Y.- V.3. -1989. -P.930.

115. Eguchi K., Sawai T.,Mizutany Y. Erythrocyte deformability of nonpregnant, pregnant, and fetal blood. \\ J-Perinat-Med. 1995.- v.23 p. 301-306.

116. Esterbauer H. Cytotoxicity and genotoxicity of lipid-oxidation products. \\ Proc. Ozone Application in Medicine.- Zurich,-1994,- p. 62.

117. Etlik O., Tomur A.s Dundar K. The effekt of antioxidant vitamins E and C on lipoperoxidation of erythrocyte membranes during hyperbaric oxygenation. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 1997.- N 8.- v.4 p.269.

118. Fischer T. M. Role of spectrin in cross bonding of the red cell membrane. \\ Blood Cells., 1988.-v. 13.-p.377-394

119. Fischer T. M.,Haest C. W., Stohr M., et al. Selective alteration of eiythrocyte deformability by SH- reagents. Evidence for an involvement of spectrin in membrane shear elastisity. \\ Biochim. Biophys. Acta. ,1978.- v. 510,-p. 270

120. Fletcher D. L.,Dillared C. J., Tappel A. Y.\ Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues. \\ Analyt. Biochem.-1973.-V.52. P.497-499.

121. Flohe L. Glutathione: chemical, biochemical and medical aspects. \\ Coenzymes and cofactors. N-Y - 1989,- V.3. - P.643.

122. Folch J., Less M., Stanley A. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. \\ Biol. Chem. -1957.-V.226.-№2.-P,497-509.

123. Gascard P. Sauvage M., Sulpice I.C., Giraud F. et al. Characterization of structural and functionalphosphoinositide domains in human erythrocyte membranes. \\ Biochemistrv.-1993.-V.23.-P.5941-5948.

124. Glavind J., Hartman S. \\ Pathol et Mikrobiol. Scand. 1952.- v. 30 -p. 1-9.

125. Glavind J. Acta chem. scand. 1963.- v. 17,- p. 1635.

126. Guyton K.Z., Kensler T.W. Oxidative mechanisms in carcinogenesis. \\ Br. Med. Bui.- 1993,- v. 49,- p. 523- 544.

127. Halliwel B., Cbirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. \\ Am. J. Clin. Natr.- 1993. V. 57.- p. 715-725.

128. Halliwel B., Gutteridge J. The antioxidants of human exstracellular fluids. \\ Archives of Biochemictry and biophysics 1990 - v.280.- p.1-8.

129. Harris M.L., Scbiller H.J., Reilly P.M. et al. Free padicals and other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease: cause, consequence or epiphenomenon? \\ Pharmac. Ther 1992.- v. 53 .- p. 375-408.

130. Heath R.L. Decline in energy reserves of Clorella sorociniana upon exposure to ozon.W Plant Physiol., 1984, vol.76, p.700-704.

131. Hughes C A., Bennett V. Adducin: a physical model with implications for function in assembly of spectrin-actin complexes. \\ J-Biol-Chem-1995,-v. 270, p. 18990-18996.

132. Jarolim P., Lahav M., Liu Shin-Chun, Palek J. Effect of hemoglobin oxidation prodact on the stability of red cell membrane skeletons and the associations of skeletal proteins: correlation with a release of hemin. \\ Blood. 1990.-v. 76,-p. 2125-2131.

133. Jjzanov- Stankov O, Demajo M, Djujic I, Mandic M. Selenium intake as a modulator of responsiveness to oxidative stress. \\ J Environ Pathol Toxicol Oncol 1998,- N 7,- p.251

134. Kleszcynska H., Oswiecimska M., Witek S., Inhibition of lipid peroxidation in the erythrocyte membrane by quaternary morpholinium salts with antioxidant function. \\ Z Naturforsch .1998.-N5.-v. 53 .-p.425.

135. Klvanova J., Beno I., Ondreicka R. Relation between fatty acid composition, vitamin e and malondialdehyde levels, and activity of antioxidant enzymes in the blood. \\ Bratisl Lek Listy 1998 N 5.-v. 9.-p.245.

136. Koga T., Moro K., Terao J. Protective effect of a vitamin E analog, phosphatidylchromanol, against oxidative hemolysis of human erythrocytes. \\ Lipids.- 1998 .-N6.-v.33.- p.589

137. Kramer K. Antioxidanzien in der Onkologie // Onkologie. -1994.- N 3.-P. 76-83.

138. Labrake C.C.; Wang L.; Keiderling T.A.; Fung L.W. Fourier transform infrared spectroscopic studies of the secondary structure of spectrin under different ionic strengths. \\ Biochemistry.- 1993.- v. 32.- p. 10296-10302

139. MacDonald R. J. Temperature and ionic effects on the interaction of erythroid spectrin with phosphotidylserine membranes \\ Biochem 1993,- v. 32.-№27,-p. 6957-6964.

140. Manno S.; Takakuwa Y.; Nagao K; Mohandas N. Modulation of erythrocyte membrane mechanical function by beta-spectrin phosphorylation and dephosphorylation. \\ J-Biol-Chem., 1995.- v. 270,- p. 5659-5665.

141. Mosior M., Mikotazak A,, Gomutkiewicz J. The effect ofATP on the order and the mobility of lipids in bovine erythrocyte membrane. \\ Biochem. etbiophys. acta biomembranes.-1990,-V.1022.-Xo3.-P.361-364.

142. Nouchi J., Toyama S., Effects of ozone and peroxyacetyl nitrate on polar lipids and fatty acids in leaves of monrning glory and kidney bean // Ibid . 1988., vol. 87, p. 638-646.

143. Nishicimi M., Roo A., Xagi K. The occurrence of superoxide anion in reactions of red used phenaxi-nemetasulfate and molecular oxygen \\ Biochem. Biophys. res.commun.-1972.-V.146.- №2,- P.849-854.

144. Nobel P.S., Wang C.-T. Ozone increases the permeability of isolated pea chloroplasts. \\ Arch. Biochem. and Biopchys., 1973.- vol. 157.-p. 1141-1145.

145. Ondreicka R, Beno I, Cerna O, Grancicova E, Staruchova M, Volkovova K, Bobek P, Tatara M. Relation between levels of vitamins C, E, A and beta-carotene and activity of antioxidant enzymes in the blood. \\ Bratisl Lek Listy.- 1998.- N 5,- p.250-254

146. Parthiban A, Vijayalingam S, Shanmugasundaram KR, Mohan R Oxidative stress and the development of diabetic complications— antioxidants and lipid peroxidation in erythrocytes and cell membrane. \\ Cell Biol Int.- 1995.- N12.- p.987

147. Rice-Evans C., Burdon R. Free radical lipid interactions and their pathological consequenses. \\ Prog. Lipid Res. - 1993 .- v. 39,- p. 71 -110.

148. Rodgers W., Glaser M. Distributions of proteins and lipids in the erythrocyte membrane \\ Biochem.- 1993.- v.32.- № 47,- p. 12591 12598.

149. Rokitansky O. Klinik und biochemie der ozontherapie. \\ Ozontherapie.- 1982.- N 52,-p. 643 711.

150. Sies H., Ketterer B. Glutathione conjugation: mechanisms andbiological significance. \\ Acad. Press. 1988.- P.480.

151. Smith J. B., Ingerman C M. Labraryt Clinik Medicine. 1976. - v. 88.-1-p. 167- 172.

152. Sunnen G.V. Ozone in Medicine: overview and future direction \\ Proc. 9th Ozone World Congress.-New York, 1989. V.3 - P. 1-16.

153. Takeshita K,, Macdonald R.I.; Macdonald R.C. Band 4.1 enchances binding to phospatidylserine vesicles. \\ Biochem-Biophys-Res-Commun,1993.- v. 191.-p. 165-171

154. Ursitti J.A. Fowler V. M. Immunolocalization of tropomodulin, tropomyosin and actin in spread human erythrocyte skeletons. \\ J-Cell-Sci.,1994.-v.107.-p. 1633-1639.

155. Viebahn R. Ozontherapie therapeutische Grundidee und Wirksamkeitsmodelee. \\ Erfahrungsheilkunde.- 1991 .-N4 p. 296 315.

156. Viebahn R. The biochemical process underlying ozone therapy. \\ Ozonachrichter. 1985,- N 4,- p. 18 - 30.

157. Vitasseri G.T. Vitamin E concentrtions in the brains and some selected peripheral tissues of selenium-deficient and vitamin E -deficient mice. // J. Neurochem, 1984, v. 42, 2, p.554-558.

158. Weser E. Reaktivity of chelated copper with superoxide. // Bull . europ. Physiopeth, resp., 1981,17, ( supll.), p. 69-82.

159. Wojcicki W.E. Beth A H. Structural and binding properties of the stilbenedisulfonate sites on erythrocyte bands 3: an electron paramagnetic resonance study using spin labeled stilbenedisulfonates \\ Biochem - 1993.-v. 32.-№32.-p. 9454-9464.