Исследование антирадикальной активности плазмы крови и секретов желудочно-кишечного тракта

Заева, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование антирадикальной активности плазмы крови и секретов желудочно-кишечного тракта
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование антирадикальной активности плазмы крови и секретов желудочно-кишечного тракта"

На правах рукописи

ЗАЕВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ И СЛИЗИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

03.00.13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск- 2007

003052758

Работа выполнена в отделе физиологии НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кривова Наталья Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Васильев Владимир Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Морозов Игорь Александрович

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН г. Санкт-Петербург

Защита состоится <л »¡.ЫС^рТ^2007г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 Томского государственного университета (634050 г. Томск, пр. Ленина,36)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского государственного университета

Автореферат разослан «___»_2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Ю. Просекина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и постановка проблемы. Актуальность исследования определяется все возрастающим пониманием роли многокомпонентной антирадикальной системы для защиты организма от токсического действия радикалов внешней и внутренней среды. Многочисленными исследованиями показаны физиологические функции и метаболизм активных форм кислорода в организме человека и животных (Величковский Б.Т., 2000; Воейков B.J1., 2003; Капелько В.И., 2003; Владимиров Ю.А., 2004; Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1992; De Lamirande Б. et al. 1993; Levin G., Popov J. 1994; Sawyer D.T. et al., 1996; Xia Y„ Zweier J.L., 1997; A M. Saran et al. 2000).

Установлено, что в основе канцерогенеза, атеросклероза, хронических воспалений, нервных дегенеративных заболеваний лежит токсичное действие вторичных радикалов, образовавшихся в результате метаболических процессов (Сучков В.П. и соавт., 1978; Владимиров Ю.А., 1998; Кольтовер В.К., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Manning А. et al., 1984; Pacifici R.E., Davies K.J.A., 1991; Pierpaoli W. et al., 1994; Tokumaru S. et al., 1996).

В то же время еще очень многие стороны антиоксидантной защиты организма остаются малоизученными. Так, радикалы из внешней среды поступают через открытые системы организма (дыхательную, пищеварительную, мочеполовую), однако механизмы антирадикальной защиты этих систем почти неизвестны. Отсутствуют сравнительные данные о состоянии антирадикальной активности плазмы крови и других систем организма у разных видов.

пищевых веществ и напитков (фрукты, овощи, зеленый чай, растительные масла и др.) (Клебанов Г.И. и соавт., 1988; Теселкин Ю.О., 1997; Frigg M. et al., 1983; Jenkins M.Y. et al., 1986; Yi O.S. et al., 1991; Meister A„ 1992; Lissi E. et al., 1992; Li-Chag Lu et al., 2003; Huang D.-J. et al., 2004).

Однако для некоторых тканей и систем пока не установлены конкретные носители антиоксидантной активности, т.е. не определены прямые корреляции между уровнем антиоксидантной активности той или иной системы и ее структурными компонентами.

Реакции образования и удаления активных форм кислорода и других радикалов (гидроксильный радикал, супероксид, липоксильный радикал, пероксинитрит и другие) обеспечиваются различными механизмами, объединенными в антиоксидантную систему организма (Владимиров Ю.А., 2004; Carrell R.W. et al, 1975; Levin G., Popov J.,. 1994).

Взаимодействия между отдельными звеньями антиоксидантной системы в настоящее время широко исследуются (Воейков ВЛ, 2003; Капелько В.И, 2003; Poovaiah В.Р. et al., 1986; Pacifici R.E., Davies K.J.A., 1991; Yi O.S. et al, 1991), однако ясности в этом вопросе пока нет, что определяется сложностью и неоднозначностью интерпретации результатов (Levin G., Popov J.,.1994).

Поэтому особое значение приобретают методы исследования антиоксидантной активности биологических субстратов. Все существующие методы оценки радикальных реакций делятся на косвенные и прямые (Владимиров Ю.А, 1998; Vladimirov Y.A, Putvinsky A.V., 1992).

скорости реакции в естественных условиях, без специальной подготовки исследуемого материала. Эти положительные стороны хемилюминесцентного метода объясняют его широкое применение в самых разных областях (Величковский Б.Т., 2000; Воейков B.JL, 2003; Владимиров Ю.А., 2004; Lissi Е. et al., 1992). В настоящее время существует огромное количество модификаций хемилюминесцентного метода, предназначенного для конкретных субстратов (Клебанов Г.И. и соавт., 1988; Теселкин Ю.О. и соавт., 1997; Lissi Е. et al., 1992; Parejo J. et al., 2000; Akiyama Y. et al., 2001).

Именно большое количество модификаций затрудняет сравнительный анализ уровней антиоксидантной активности в разных субстратах.

Цель работы: Исследовать антирадикальную и антиоксидантную активность плазмы крови и пищеварительных секретов у теплокровных животных.

Задачи исследования:

1. Подобрать состав стандартного раствора для хемилюминесцентного анализа, позволяющего проводить исследования в различных биологических субстратах;

2. Провести сравнительное исследование антиоксидантной и антирадикальной активности различных биологических субстратов и их комплексов;

3. Исследовать видовые особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови у млекопитающих (человек, собака, мышь) и птиц (бройлер);

4. Исследовать возрастные особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови бройлеров;

5. Исследовать корреляционные зависимости антирадикальной активности и биохимического состава компонентов пристеночного слизистого слоя различных отделов пищеварительного тракта у собак.

Научная новизна. Впервые установлено, что в биологических субстратах, таких, как плазма крови и слизь пищеварительного тракта, присутствует система защиты организма от действия радикалов внешней и внутренней среды, состоящая из двух частей: антиоксидантной активности (защита от действия активных форм кислорода) и антирадикальной активности (защита от действия радикалов различной природы). Причем уровень антирадикальной активности на два порядка выше уровня антиоксидантной активности. Впервые установлены видовые особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови у разных видов теплокровных животных (человек, собака, мышь, бройлер). Впервые установлены некоторые механизмы, обуславливающие антирадикальную активность пищеварительного тракта.

Практическая значимость. Предложен модифицированный метод ингибирования люминолзависимой хемилюминесценции, который может быть использован для широкого круга исследований антирадикальной и антиоксидантной активности различных биологических субстратов. Установленные закономерности взаимодействия напитков, содержащих алкоголь, со слизью желудка и плазмой крови, могут стать физиологическим обоснованием здорового образа жизни.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Использование двух источников (дифенилпикрилгидразил и фитонцидная фракция), генерирующих радикалы, позволило установить два вида защиты организма от действия радикалов: антиоксидантную активность и антирадикальную активность;

2. Основными носителями антирадикальной активности пристеночного слизистого слоя пищеварительного тракта у собак являются белок, Ы-ацетилнейраминовая кислота полимеризованных гликопротеинов и гексо-замины деградированных молекул гликопротеинов слизи;

3. Метод позволяет проводить сравнительные исследования антиоксидантной и антирадикальной активности в различных биологических субстратах.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на International Symposium on Science and Technology (Tomsk, 2001); IY Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); 7-th Korea-Russia International Symposium on Science and Technology (Ulsan, Korea, 2003); 1 Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); на Всероссийской научной конференции «Механизмы адаптации организма» (Томск, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ. Из них 5 статей в центральной печати.

Струюура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц и 16 рисунков.

Вклад автора. Работа выполнена в отделе физиологии НИИ биологии и биофизики ТГУ под научным руководством доктора биологических наук, профессора H.A. Кривовой, которой диссертант выражает глубокую благодарность и признательность. Автор выражает благодарность кандидату физико-математических наук, старшему научному сотруднику ОСП СФТИ ТГУ Светличному В.А. за содействие в выполнении работы. Все результаты получены автором самостоятельно. Забор плазмы крови и слизи желудка у человека проводился на базе ОКБ г. Томска.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. В острых опытах использовали собак, мышей, бройлеров. Были поставлены следующие серии экспериментов:

1) исследование антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови, гомогената слизи желудочно-кишечного тракта, спиртосодержащих напитков (бальзам, ликер, водка и коньяк) и их комплексов в условиях in vitro;

2) исследование видовых особенностей антиоксидантной активности и антирадикальной активности плазмы крови млекопитающих (человек, собака, мышь) и домашней птицы (бройлер);

3) исследование возрастных особенностей антиоксидантной активности и антирадикальной активности плазмы крови бройлеров породы кросс ИЗ А (1 группа - 20 однодневных цыплят, 2 группа - 60 бройлеров в возрасте 38 дней и 3 группа - 20 бройлеров в возрасте 260-ти дней);

4) исследование антирадикальной активности и биохимического состава полимеризованных и внеструктурных компонентов пристеночного слизистого слоя различных отделов желудочно-кишечного тракта у собак.

Исследования проводились в острых опытах на 12 собаках, 13 мышах и 100 бройлерах.

Методы исследования антирадикальной и антиоксидантной активности. Антирадикальную и антиоксидантную активность определяли по принципу метода ингибирования люминолзависимой хемилюминесценции, который в настоящее время получил широкое распространение. Имеется большое количество работ, где для исследования активности антиоксидантов, содержащихся в биологических жидкостях, в качестве субстрата, генерирующего активные формы кислорода, были использованы различные субстанции (Клебанов Г.И. и соавт., 1988; Владимиров Ю.А., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Lissi Е. et al„ 1992; Smith R. et al„ 1996; Cao G. et al., 1999; 2000;).

Наши исследования были направлены на определение интегральных

показателей антирадикальной и антиоксидантной активности различных биологических субстратов.

Для исследования активности антиоксидантов, как эндогенных, так и экзогенных, были важны следующие условия:

1) Возможность проведения сравнительных исследований активности как эндогенных антиоксидантов, содержащихся в биологических образцах (плазма крови, гомогенат слизи пищеварительного тракта), так и экзогенных, содержащихся в различных напитках и пищевых продуктах, биологически активных добавках, фармакологических препаратах;

2) Соотношение растворов (стандартный раствор: исследуемый материал) должно быть таким, чтобы высокомолекулярные соединения плазмы крови и слизи пищеварительного тракта (белки и гликопротсины) не преципитировали и не подвергались расщеплению, что могло бы привести к изменению их нативных свойств;

3) Составы стандартных (контрольных) растворов реагирующих смесей должны обеспечивать стабильный уровень хемилюминесценции, так называемое плато максимальной хемилюменесценции стандартных растворов должно оставаться стабильным в течение как минимум 90 секунд;

4) Метод должен позволять использовать различные источники радикалов активных форм кислорода и других атомов и молекул, что дало бы возможность сравнивать степень ингибирования радикалов, генерируемых этими источниками, эндогенными и экзогенными антиоксидантами;

5) Метод должен обладать высокой точностью и воспроизводимостью.

За основу предлагаемого нами метода было взято явление

хемилюминесценции (природная химическая реакция, сопровождающая процессы гниения). Развитие современной техники дает возможность воспроизвести этот процесс в лабораторных условиях.

В проведенных исследованиях для хемилюминесцентного метода были использованы следующие составы стандартных растворов: для определения антноксидантной активности - 16 мл дистиллированной воды (подогретой до 38°С), 1,25мМ раствор DPPH в этаноле, 0,01Н раствор люминола в фосфатном буфере и перекись водорода; для определения антирадикальной активности - 16 мл дистиллированной воды (подогретой до 38°С), фитонцидная фракция, 0,01Н раствор люминола в фосфатном буфере и перекись водорода.

Использование двух видов доноров радикалов (DPPH и фитонцидной фракции) дает возможность исследовать два вида защиты организма от действия радикалов различной природы: антиоксидантную активность, поскольку DPPH является донором только супероксид аниона, и антирадикальную активность, поскольку по своему составу фитонцидная фракция представляет собой смесь органических кислот, углеводов и фенольных соединений (Костеша Н.Я. и соавт., 2007) и поэтому может быть донором фенильных, метальных, этипьных, бензильных, алкильных и других радикалов.

Наши исследования проводились на хемилюминометре, работающем в режиме счета фотонов, ФЭУ и в программном обеспечении производства «Ангстрем». Камера для кювет, обеспечивающая термостатирование (t 37°С) и перемешивание разработана в отделе фотоники молекул Сибирского физико-технического института. Время экспозиции 0,1 секунды.

Благодаря высокой чувствительности прибора для определения антноксидантной и антирадикальной активности было достаточно 50 мкл исследуемой пробы.

Определение антноксидантной и антирадикальной активности проводили в следующей последовательности: 1) подготавливали четыре кюветы;

2) в первую кювету, которая служила контролем, добавляли 50 мкл дистиллированной Н20, а в три последующие по 50 мкл исследуемой пробы;

3) ex tempore готовили стандартный раствор (с DPPH или фитонцидной фракцией) и в каждую кювету добавляли по 4 мл приготовленного раствора;

4) кюветы помещали в камеру хемилюминометра и последовательно через каждые 10 секунд измеряли степень тушения реакции хемилюминесценции трех исследуемых проб против контрольной.

Измерения проводились трижды, на максимальном плато свечения контрольного образца, которое наблюдалось в течение 90 секунд.

Антиоксидантную и антирадикальную активность опытной пробы рассчитывали как среднюю величину из трех замеров.

Количественные величины антиоксидантной активности (АОА) и антирадикальной активности (АРА) выражали в (фотонах/мл)/сек и вычисляли по формуле:

АОА или (АРА) = (J - J)*n/t где: J0 - количество регистрируемых фотонов контрольной пробы; J - количество регистрируемых фотонов опытной пробы; п - разведение пробы; t - время экспозиции.

Методы исследования биохимического состава пристеночного слизистого слоя. Состав пристеночной слизи исследовали с помощью комплекса методов. Пробу нативной пристеночной слизи подвергали процедуре очистки и выделения полимеризованных гликопротеинов, при этом внеструктурные компоненты переходили в раствор в нативном виде, что важно для их последующего определения. Определение биохимического состава полимеризованных и деградированных гликопротеинов описано в монографии Кривовой H.A., Дамбаева Г.Ц.,

Хитрихеева В.Е. (2002). Результаты пересчитывали на мл того объема, который занимали структурные гликопротеины в пристеночном слизистом слое. Для характеристики состава структурных гликопротеинов рассчитывали суммарную концентрацию всех моносахаров, её отношение на мг белка, что позволяет оценить степень гликозилирования молекулы гликопротеина.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с применением распространенных методов вариационной статистики. Достоверность различий между выборками определяли при помощи критерия Манн-Уитни используя программу (^а^Нса 6,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки действия экзогенных антиоксидантов на защитные механизмы организма проводили сравнительное изучение антиокислительных свойств слизистого геля желудочно-кишечного тракта, плазмы крови и их комплексов с различными напитками.

Предлагаемый метод был апробирован при исследовании антиоксидаш-ной и антирадикальной активности в различных алкогольных напитках, плазме крови и гомогенате полостной слизи желудка здорового человека (табл. 1,2).

В качестве источников радикалов использовали дифенилпикрил-гидразил и фитонцидную фракцию.

Из алкогольных напитков были выбраны следующие:

1) Горно-Алтайский бальзам (45% алкоголя), Россия, Горно-Алтайск;

2) Черно-смородиновый ликер (16% алкоголя), Франция;

3) Коньяк «Белый аист» (45% алкоголя), Молдова;

4) Водка «Исток» (40% алкоголя), Россия, Томск.

Таблица I. Антиоксидантная [(фотонов/мл)/сек] и антирадикальная [(фотонов/мл)/сек] активность плазмы крови и гомогената слизи желудка здорового человека

Биологическая жидкость Антиоксидантная активность Антирадикальная активность

плазма крови (п=8) 56,6-10б± 4,8'106 4362-Ю6 ± 534-Ю6

слизь желудка (п=8) 10,0-Ю6 ± 2,4-10б 1521-106 ± 208-Ю6

Из приведенных в таблице данных видно, что уровень антиоксидантной активности плазмы крови человека в 5-6 раз выше, чем слизи желудка, а уровень антирадикальной активности (соответственно) - почти в 3 раза. Но, учитывая высокую скорость обновления слизи желудочно-кишечного тракта (4 раза в сутки), можно считать, что вклад антиоксидантов желудочной слизи в общую систему антиоксидантной защиты организма весьма значителен.

Стандартные растворы, содержащие БРРН или фитонцидную фракцию имеют исходную хемилюминесценцию, различающуюся на два порядка. В данных опытах полученные результаты показывают, что и в плазме крови, и в слизи желудка имеются механизмы, активно подавляющие хемилюминесценцию стандартного раствора, содержащего ЭРРН или фитонцидную фракцию.

Было принято, что тушение хемилюминесценции стандартного раствора, содержащего ПРРН, обусловлено механизмами антиоксидантной защиты. А тушение хемилюминесценции стандартного раствора, содержащего фитонцидную фракцию, обусловлено механизмами антирадикальной защиты.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что плазма крови и секреты пищеварительного тракта обладают способностью тушить люминолзависимую хемилюминесценцию, индуцированную супероксид анионом и/или комплексом других радикалов.

Результаты исследования антиоксидантной и антирадикальной активности алкогольных напитков представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что антиоксидантная активность составляет от 0,098-106 (фотонов/мл)/сек у водки до 0,368-106 (фотонов/мл)/сек у черносмородинового ликера, т.е. у водки антиоксидантная активность в 3,5 раза ниже. Коньяк антиоксидантной активностью не обладает.

Таблица 2. Антиоксидантная [(фотонов/мл)/сек] и антирадикальная

[(фотонов/мл)/сек] активность алкогольных напитков

Алкогольный напиток Антиоксидантная активность Антирадикальная активность

Горно-Алтайский бальзам 0,344-10" 96,5-10"

Черно-смородинов. ликер 0,368-10" 83,0-10"

Коньяк «Белый аист» не обладает не обладает

Водка «Исток» 0,098-106 не обладает

Среди этих же напитков антирадикальная активность была обнаружена только у Горно-Алтайского бальзама и черно-смородинового ликера. Следует отметить, что у Горно-Алтайского бальзама и черносмородинового ликера уровень антирадикальной активности превышает уровень антиоксидантной активности в 250-300 раз.

Таким образом, напитки, содержащие высокую концентрацию алкоголя (коньяк и водка) не обладают антиоксидантной или антирадикальной активностью. Только для водки был показан низкий уровень антиоксидантной активности.

Напитки, также содержащие высокую концентрацию алкоголя, но представляющие собой настойки из одного или нескольких сибирских растений, обнаруживают собственный высокий уровень антиоксидантной и антирадикапьной активности.

Помимо прямого определения антиоксидантной и антирадикальной активности биологических жидкостей и алкогольных напитков (табл. 1, 2) были проведены исследования антиоксидантной и антирадикальной активности комплексов этих напитков с гомогенатом слизи желудка или плазмой крови (табл. 3). Исследование этих взаимодействий прослеживает путь поступления веществ, содержащихся в напитках, через желудочно-кишечный тракт и дальнейшее их влияние на организм.

Было установлено (табл. 3), что антиоксидантная и антирадикальная активность плазмы крови и гомогената желудочной слизи изменяется после добавления различных напитков, причем эти изменения не полностью зависят от исходных показателей активности антиоксидантов самих напитков (табл. 2).

Из приведенных в таблице 3 данных видно, что антиоксидантная активность (источник радикалов дифенилпикрилгидразил) комплексов плазмы крови или гомогената слизи желудка с такими напитками, как Горно-Алтайский бальзам и черно-смородиновый ликер практически не изменяется по сравнению с контролем ( «плазма крови + д.НгО» и «слизь желудка + Д.Н2О»).

Незначительное снижение антиоксидантной активности прослеживается только в комплексе «плазма крови + водка», а комплексы «плазма крови + коньяк» и « слизь желудка + коньяк» показывают полное отсутствие антиоксидантной активности.

Таблица 3. Антиоксидантная и антирадикальная активность

[(фотонов/мл)/сек] комплексов «плазма крови + напиток» и «слизь желудка + напиток» смешанных в соотношении (1:1)

Исследуемый комплекс Антиоксидантная активность (п=8) Антирадикальная активность (п=8)

плазма крови + д.НгО 27,8-106 ± 2,4-106 2460-106± 201-106

плазма крови + ГАБ 28,9-106± 3,7-Ю6 4752-Ю6 ± 471-106*

плазма крови + ЧСЛ 28,3-Ю6 ± 5,МО6 4664-106 ± 174-Ю6*

плазма крови + К 0 0

плазма крови + В 23, МО6 ±2,0-106 2307-106 ±254-106

слизь желудка + д.НгО 5,0-106 ±0,4-106 725-106 ±96-106

слизь желудка + ГАБ 5,6-106± 0,8-106 1407-Ю6± 59-106*

слизь желудка + ЧСЛ 4,8-106 ±0,5-106 1482-Ю6± 31-106*

слизь желудка + К 0 105-106 ± 8,7-10ь*

слизь желудка + В 5,1-106±0,М06 730-Ю6 ±29-106

ГАБ - Горно-Алтайский бальзам; ЧСЛ - Черно-смородиновый ликер; К -коньяк «Белый аист»; В - водка «Исток»

* - отличия достоверны по отношению к контролю «плазма крови + Д.Н2О» или «слизь желудка + д.НгО» (р ¿),05)

В данном случае, разведение (1:1) плазмы крови и гомогената желудочной слизи д.Н20 и исследуемыми напитками снижает исходный уровень антиоксидантной активности биологических образцов (табл. 1) в два раза.

Результаты анализа антирадикальной активности (источник радикалов фитонцидная фракция) комплексов плазмы крови или гомогената слизи желудка с исследуемыми напитками представлены в таблице 3.

Антирадикальная активность исходного образца плазмы крови составляла 4362-106 ± 534-106 (фотонов/мл)/сек (табл. 1). Добавление д.Н20 и водки к плазме крови вызывало снижение уровня антирадикальной активности в 2 раза по сравнению с исходным образцом плазмы крови, но это снижение также объясняется разведением последнего в 2 раза.

Разведение исходного образца плазмы крови Горно-Алтайским бальзамом или черно-смородиновым ликером, наоборот, вызывало увеличение антирадикальной активности этих комплексов по сравнению с контролем (комплекс «плазма крови + д. Н2О») в 2 раза.

Коньяк при добавлении к плазме крови также генерирует собственные радикалы, т.е. антирадикальная активность в этом комплексе отсутствует.

Антирадикальная активность исходного образца гомогената слизи желудка составляла 152М06 ± 208-106 (фотонов/мл)/сек (табл. 1). Динамика изменений антирадикальной активности исследуемых комплексов, образованных после добавления алкогольных напитков к гомогенату желудочной слизи, аналогична изменениям при смешивании плазмы крови с данными напитками. Очевидно, что добавление апиквоты дистиллированной Н20 и водки к слизи желудка снизило этот показатель в 2 раза по сравнению с исходным образцом (табл. 1).

По результатам проведенных исследований можно сделать следующие заключения:

1) В условиях in vitro при добавлении к плазме крови или гомогенату слизи желудка алкогольных напитков происходит изменение уровня антиоксидантной и антирадикальной активности исходных образцов биологических жидкостей;

2) Антиоксидантная активность комплексов, образованных добавлением исследуемых напитков к плазме крови или гомогенату слизи желудка не изменяется по отношению к контролю;

3) Антирадикальная активность комплексов биологических жидкостей с Горно-Алтайским бальзамом или черно-смородиновым ликером увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем, т.е. уровень антирадикальной активности этих комплексов равен уровню исходных образцов плазмы крови и гомогената желудочной слизи;

4) Степень выраженности данных изменений не связана с процентным содержанием алкоголя в исследуемых напитках;

5) Чтобы получить наиболее достоверную информацию об активности антиоксидантов, содержащихся в каком-либо препарате или биологическом образце, методом ингибирования люминолзависимой хемилюминесценции, использование одного источника радикалов недостаточно.

Таблица 4. Видовые особенности антиоксидантной и антирадикальной

активности плазмы крови [(фотонов/мл)/сек]

Объекты исследования Антиоксидантная активность Антирадикальная активность

Человек (16-40 лет) 56,6-106±4,8-106 п=8 4362-10^534-106 п=8

Собаки (2-4 года) 89,М06±9,М06+ п=3 10523-106±110-Ю6* п=3

Мыши (90-95 суток) 105,8-106±13,7-106* п=13 7776,106±843'106* п=13

Бройлеры (260 дней) 40,8 106±2,2-106* п=20 3248-106±275-106 п=20

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с уровнем антиоксидантной и антирадикальной активности у человека (р ¿5,05)

Для сравнения видовых особенностей антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови здорового человека и животных были выбраны группы, достигшие половой зрелости (табл. 4).

Из приведенных в таблице 4 данных видно, что наиболее высокими уровнями антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови обладают собаки и мыши.

Наиболее высокий показатель антиоксидантной активности плазмы крови был установлен у мышей, а антирадикальной активности - у собак, по сравнению с другими исследуемыми видовыми группами. Наиболее низкими уровнями антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови обладают бройлеры.

Острые опыты по исследованию взаимосвязи антирадикальной активности пристеночного слизистого слоя с его структурными и внеструктурными компонентами были поставлены на 12 беспородных собаках-самцах в возрасте 2-4 лет и массой тела от 12 до 25 кг.

Состав структурных компонентов полимеризованных гликопротеинов и уровень их антирадикальной активности представлены в табл. 5. Из приведенных данных видно, что антирадикальная активность и состав полимеризованных гликопротеинов различаются в отделах пищеварительного тракта у собак. Так концентрация N-ацетилнейрамино-вой кислоты в отделах тонкой кишки достоверно выше, чем в отделах желудка и толстой кишки. Концентрация галактозы и степень гликозилирования молекулы гликопротеина во всех отделах кишечника ниже, чем в желудке. Сумма моносахаров в отделах тонкой кишки ниже, чем в желудке и толстой кишке. И в желудке отмечена самая низкая антирадикальная активность.

Более высокий уровень антирадикальной активности очищенной слизи тонкого кишечника, по сравнению с желудком, можно объяснить отличиями в строении молекул гликопротеинов в желудке и кишечнике: в желудке молекула гликопротеина состоит из 4 субъединиц, а в тонком кишечнике - из 6 - 7 субъединиц (Allen А. et al., 1982). Изменение

Таблица 5 . Антирадикапьная активность и состав полимеризованных гликопротеинов различных отделов желудочно-кишечного тракта у собак

показатель Желудок (п=12) Дуоденум (п=12) Тощая кишка(п=12) Толст.кишка(п=:12)

АРА (фотонов/мл)/сек 104,0-10"±11,3-10" 230,7-10"±29,1-10"* 233,0-10"±25,7-10"» 167,7-10"±19,5-10"*

Гексозамины (мкМ/мл) 9,27-10"±1,86-106 10,17-Ю"±1,31-10" 8,72-106±1,25-10" 12,35-10"±2,21-10"

Галактоза (мкМ/мл) 18,65-10"±3,81-10" 8,27-10"±1,21-10"* 6,12-10"±0,90-10"* 11,85-10"±1,46-10"*

Фукоза (мкМ/мл) 3,11-10"±0,60-10" 2,12-10"±0,30-10" 1,97-10"±0,27-10" ЗД4-10"±0,47-106

Ы-ацетилнейраминовая кислота (мкМ/мл) 0,46-10"±0,10-10" 0,74-10"±0,11-10"* 0,74-106±0,10-10"* 0,40-10"±0,06-10"

Сумма моносахаров (мкМ/мл) 31,48-10"±5,53-10" 21,29-106±2,14-10"* 17,56-10"±1,86-106* 27,83-10"±3,50-10"

Белок (мг/мл) 1,12-10"±0,19-Ю" 2,21 • 10Ь±0,34-106* 2.31-10"±0,35-10"* 1,72-10"±0,31-10"*

Степень гликозилирования (мкМ/мг белка) 28,10-10"±4,91-10" 9,61-10"±3,13-10"* 7,60-10"±0,52-10"* 16,18-10"±5,01-10"*

Примечание: * - статистически достоверные отличия показателей различных отделов кишечника по отношению к показателям желудка (р <0,05)

содержания белка в молекуле гликопротеина в различных отделах пищеварительного тракта (в направлении от желудка к толстому кишечнику) соответствует изменению антирадикальной активности очищенной слизи (коэффициент корреляции равен 0,85) в данных отделах.

Вторым фактором, обеспечивающим антирадикальную активность полимеризованных гликопротеинов, по-видимому, является наличие в их составе М-ацетилнейраминовой кислоты, которая благодаря отрицательному заряду на своих остатках, делает молекулу гликопротеина поливалентным анионом. Изменение уровня антирадикальной активности полимеризованных гликопротеинов слизи пищеварительного канала в направлении от желудка к толстому кишечнику совпадает с изменением содержания в молекуле гликопротеина 14-ацетилнейраминовой кислоты. Коэффициент корреляции между содержанием К-ацетилнейраминовой кислоты и уровнем антирадикальной активности равен 0,78.

Установлена также обратная взаимосвязь между уровнем антирадикальной активности полимеризованных гликопротеинов слизи различных отделов желудочно-кишечного тракта со степенью гликозилирования молекулы гликопротеина (коэффициент корреляции равен -0,81). Наиболее низкий уровень антирадикальной активности очищенных гликопротеинов желудка соответствует более высокой степени их гликозилирования в этом отделе пищеварительного канала. Низкая степень гликозилирования в тонком кишечнике (двенадцатиперстная кишка и тощая кишка) соответствует более высокому уровню антирадикальной активности полимеризованных гликопротеинов данных отделов (табл.5).

Взаимосвязи уровня антирадикальной активности очищенных гликопротеинов с содержанием в их составе гексозаминов, галактозы и фу козы не обнаружено.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что собственная антирадикальная активность гликопротеинов слизи зависит от структурных и пространственных особенностей их строения.

Помимо полимеризованных гликопротеинов в пристеночном слизистом слое находятся также частично или полностью деградированные гликопротеины, потерявшие свои гелеобразующие функции и состоящие из фрагментов гликопротеинов разного размера. Они представляют собой частицы из нескольких моносахаров, частично деградированных белков, частей молекул и их комплексов, которые находятся в растворенном состоянии. В слизистом слое определяются также все компоненты полости и подлежащего эпителия.

В табл. 6 представлены антирадикальная активность отмывок нативной слизи и состав внеструктурных компонентов пристеночного слизистого слоя соответствующих отделов желудочно-кишечного тракта. Было установлено, что во всех исследуемых отделах уровень антирадикальной активности отмывок слизи достоверно выше (р<0,05), чем антирадикальная активность очищенных гликопротеинов (табл.5). Но достоверных отличий антирадикальной активности отмывок слизи между исследуемыми отделами желудочно-кишечного тракта (в направлении от желудка к толстому кишечнику) не обнаружено (табл.6).

Содержание >1-ацетилнейраминовой кислоты и белка в отмывках слизи двенадцатиперстной кишки и тощей кишки достоверно выше (р<0,05), чем в отмывках слизи желудка и толстого кишечника (табл. 6), как и при исследовании структурных компонентов (табл. 5). Однако взаимосвязи антирадикальной активности отмывок слизи с содержанием в них Ы-ацетилнейраминовой кислоты и белка не обнаружено. Также не обнаружено этой взаимосвязи с содержанием галактозы, фукозы, суммы моносахаров и ферментов (табл. 6).

Таблица 6. Антирадикальная активность отмывок пристеночной слизи и состав ее внеструктурных компонентов

в различных отделах желудочно-кишечного тракта у собак

показатель Желудок (п=12) Дуоденум (п=12) Тощая кишка(п=12) Толст.кишка(п= 12)

АРА (фотонов/мл)/сек 364,2-10Ъ±47,4-Ю6 407,8-106±36,8-10" 423,2-10ь±23,4-106 371,1-10^20,5-Ю6

Гексозамины (мкМ/мл) 20,90-106±3,ЗМ06 22,11-106±3,62-106 20,78-10ь±2,86-10б 18,52-106±2,46-106

Галактоза (мкМ/мл) 48,33-10^7,90-Ю6 32,74-10ь±4,7610<>* 25,45• 10&±2,47-106* 23,42-106± 1,85-106*

Фукоза (мкМ/мл) 6,75-106±0,94-106 5,22-106±0,58-106 4,53-106±0,4Ы06 4,21-106±0,40-106

М-ацетилнейраминовая кислота (мкМ/мл) 0,50-106±0,09-106 1,25-106±0,16-106* 1,19-106±0,09-106* 0,71-10^0,06-Ю6

Сумма моносахаров (мкМ/мл) 76,47-106±8,32-106 61,31-10^6,69-Ю6 51,94-106±5,04-106* 46,86-106±3,05-106*

Белок (мг/мл) 11,18-106±2,52-106 18,96-106±2,68 ■ 106* 21,68-106±2,75-Ю6* 12,04-106±1,34-106

Нуклеиновые кислоты (мг/мл) 1,09-106±0,18-106 2,38-106±0,б4-106* 1,95-106±0,39-106* 1,62-106±0,21-106*

Пепсин (мЕд/мл) 634,5-10Ь± 102,6 • 106 754,2-106±105,3-106 751,6-106± 120,9 • 106 374,1 ■ 106±66,0-106*

Трипсин (мЕд/мл) 79,5-106±11,07-106 106,6-106±22,01-106 61,97-106± 15,44-106 69,4-106±15,23-106

Нашими исследованиями было показано, что уровень антирадикальной активности отмывок пристеночной слизи коррелирует (коэффициент корреляции равен 0,96) с содержанием в отмывках гексозаминов.

Более высокий уровень антирадикальной активности отмывок пристеночной слизи желудочно-кишечного тракта по сравнению с полимеризованными гликопротеинами можно объяснить присутствием в слизистом слое пищевых антиоксидантов и других компонентов, обладающих антиоксидантными свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны составы стандартных растворов и соотношение объемов проб для хемилюминесцентного метода сравнительных исследований антиоксидантной (источник радикалов дифенилпикрилгидразил) и антирадикальной (источник радикалов -фитонцидная фракция) активности в различных биологических субстратах.

2. Установлено, что плазма крови и секреты пищеварительного тракта обладают способностью тушить люминозависимую хемилюминесценцию, индуцированную супероксид анионом и/или комплексом других радикалов.

3. Сравнительное исследование антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови и слизи пищеварительного тракта показало, что антиоксидантная активность этих субстратов составляет от 1% до 2% их антирадикальной активности.

растительного сырья увеличивает исходную антиоксидантную и антирадикальную активность желудочной слизи или плазмы крови.

5. Установлены видовые различия уровня антиоксидантной и антирадикальной активности у человека, собак, мышей и цыплят-бройлеров. Наиболее высокие значения антиоксидантной активности установлены у мышей, антирадикальной активности - у собак.

6. Установлены возрастные изменения антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови у бройлеров: наибольшая антиоксидантная активность установлена у половозрелых бройлеров, наибольшая антирадикальная активность установлена у бройлеров в пубертатном периоде.

7. Антирадикальная активность пристеночного слизистого слоя определяется полимеризованными гликопротеинами и внеструктурными компонентами слизистого слоя. Антирадикальная активность прямо коррелирует с концентрацией белка (0,85) и с концентрацией М-ацетилнейраминовой кислоты (0,78) в полимеризованных гликопротеинах. Антирадикальная активность внеструктурных компонентов пристеночного слизистого слоя выше, чем антирадикальная активность полимеризованных гликопротеинов. Уровень антирадикальной активности отмывок, получаемых при выделении полимеризованных гликопротеинов, имеет коэффициент корреляции, равный 0,96, с содержанием в отмывках свободных гексозаминов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кривова H.A., Селиванова Т.И., Заева О.Б. Видовые особенности состава надэпителиального слизистого слоя пищеварительного тракта у крыс и мышей // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -1994. - Т.80, № 8. - С. 118-123.

2. Кривова H.A., Медведев М.А., Селиванова Т.И., Заева О.Б. Состав гликопротеинов надэпителиального слизистого слоя пищеварительного тракта при введении пентагастрина и карбахолина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - № 9. - С. 237-240.

3. Кривова H.A., Лаптева Т.А., Селиванова Т.И., Заева О.Б., Ткаченко Е.В. Возрастные особенности состава надэпителиального слизистого слоя пищеварительного тракта у мышей // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова,-1995.-Т. 81,№5.-С. 113-118.

4. Кривова H.A., Селиванова Т.И., Лаптева Т.А., Заева О.Б. Влияние внутрижелудочного введения простагландина Е2 на секрецию слизи у собак // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 1995. - Т. 81, №9.-С. 65-71.

5. Кривова H.A., Лаптева Т.А., Селиванова Т.И., Заева О.Б., Ткаченко Е.В. Функциональное состояние надэпителиального слизистого слоя кишечника у мышей в постнатапьный период после облучения // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1997. - Т. 37, вып. 5. - С. 765-771.

6. Кривова H.A., Заева О.Б. Антирадикальная неферментативная активность пристеночного слизистого слоя пищеварительного тракта // Механизмы функционирования висцеральных систем. Тезисы докладов международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева. - Санкт-Петербург, 2001. - С.196.

7. Krivova N.A., Kopylova T.N., Dambaev G.Z., Zaeva O.B., Svetlichnyi V.A., Hitriheev V.E,, Kuznezova R.T. New Mechanism of Protection of an organism from Free Radicals of an External Environmental //5 Korea-Russia International Symposium on Science and Technology. - Tomsk, 2001.-Vol. 2.-P. 106-108.

8. Кривова H.A., Заева О.Б., Копылова Т.Н., Светличный В.А. Антирадикапьная неферментативная защитная функция пристеночного слизистого слоя пищеварительного тракта // Тезисы докладов 18 Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. -Казань, 2001. - С. 364-365.

9. Кривова Н.А., Заева О.Б., Копылова Т.Н., Светличный В.А., Носенко К.А. Антирадикальная активность желудочной и бронхиальной слизи // Труды 4 Съезда физиологов Сибири. - Новосибирск, 2002. - С. 2223.

10.Krivova N.A., Kopylova T.N., Zaeva О.В., Svetlichnyi V.A., Kuznezova R.T., Lapteva T.A., Selivanova T.I. Modified method investigation antioxidant activity in food and biological liquids //Proceedings the 7-th Korea-Russia International Sumposium on Science and Technology. -Ulsan, Korea, 2003. -Vol. 5. - LB07. - P. 27-33.

11.Кривова H.A., Копылова Т.Н., Заева О.Б., Светличный В.А. Исследование антиоксидантной активности в напитках и биологических субстратах // Ноосферные знания и технологии: сборник статей. - Томск: Изд-во ТГУ, 2004. - С. 27-34.

12.Кривова Н.А., Заева О.Б., Копылова Т.Н., Светличный В.А. Антиоксидантная защитная функция пищеварительного тракта // Научные труды 1 Съезда физиологов СНГ. - Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005. - Москва: Изд-во «Медицина-Здоровье», 2005. - Т. 1. - С. 95-96.

Тираж 100. Заказ № 210. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Заева, Ольга Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Активные формы кислорода и антиоксидантная система организма.

1.1.1. Виды активных форм кислорода и других молекул.

1.1.2. Физиологические функции и метаболизм активных форм кислорода в организме человека и животных.

1.1.3. Влияние активных форм кислорода на процессы перекисного окисления липидов в организме.

1.1.4. Антиоксидантная система организма и ее физиологическое значение.

1.1.5. Возрастные особенности антиоксидантной защиты организма человека и животных.

1.1.6. Методы изучения радикальных реакций.

1.1.7. Методы исследования антиоксидантной активности биологических образцов и экзогенных антиоксидантов.

1.2. Структура и функции пристеночного слизистого слоя пищеварительного тракта.

1.2.1. Состав полимеризованных гликопротеинов и внеструктурные компоненты пристеночного слизистого слоя пищеварительного тракта.

1.2.2. Поступление экзогенных антиоксидантов через пищеварительный тракт.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Материалы исследования.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Исследование антиоксидантной активности организма.

2.3.2. Разделение и биохимический анализ структурных и внеструк-турных компонентов пристеночного слизистого слоя желудочно-кишечного тракта у собак.

2.3.3. Методологические задачи определения антиоксидантной активности организма.

2.3.3.1. Источники радикалов активных форм кислорода и других молекул.

2.3.3.2. Влияние соотношения компонентов стандартного раствора на процессы реакции хемилюминесценции и степень ее ингибирования.

2.3.3.3. Сохранение свойств нативных образцов исследуемого биологического материала.

2.3.3.4. Спектрофотометрическое определение концентрации белковых растворов и степени их прозрачности.

2.3.3.5. Исследование зависимости реакции хемилюминесценции от объема биологических образцов.

2.3.4. Ход определения антиоксидантной и антирадикальной активности.

2.3.5. Расчеты антиоксидантной и антирадикальной активности.

2.3.6. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови, гомогената слизи желудка, алкогольных напитков и их комплексов с плазмой крови или слизью желудка.

3.2. Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности хитозана.

3.3. Видовые особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови у теплокровных животных.

3.4. Возрастные особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови бройлеров породы кросс ИЗА.

3.5. Исследование взаимоотношений биохимического состава пристеночного слизистого слоя и антирадикальной активности в различных отделах пищеварительного тракта у собак.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование антирадикальной активности плазмы крови и секретов желудочно-кишечного тракта"

Актуальность и постановка проблемы. Актуальность исследования определяется все возрастающим пониманием роли многокомпонентной антирадикальной системы для защиты организма от токсического действия радикалов внешней и внутренней среды. Многочисленными исследованиями показаны физиологические функции и метаболизм активных форм кислорода в организме человека и животных (Величковский Б.Т., 2000; Воейков В.Л., 2003; Капелько В.И., 2003; Владимиров Ю.А., 2004; Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1992; De Lamirande Е. et al. 1993; Levin G., Popov J. 1994; Sawyer D.T. et al., 1996; Xia Y., Zweier J.L., 1997; A M. Saran et al. 2000).

Установлено, что в основе канцерогенеза, атеросклероза, хронических воспалений, нервных дегенеративных заболеваний лежит токсичное действие вторичных радикалов, образовавшихся в результате метаболических процессов (Сучков В.П. и соавт., 1978; Владимиров Ю.А., 1998; Кольтовер В.К., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Manning А. et al., 1984; Pacifici R.E., Davies К.J.A., 1991; Pierpaoli W. et al., 1994; Tokumaru S. et al., 1996).

В настоящее время установлена антиоксидантная активность многих ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидазы, глутатионредуктаза и др.), продуктов метаболизма (белки сыворотки крови, стероидные гормоны, женские половые гормоны, убихинон и др.), пищевых веществ и напитков (фрукты, овощи, зеленый чай, растительные масла и др.) (Клебанов Г.И. и соавт., 1988; Теселкин Ю.О., 1997; Frigg M. et al, 1983; Jenkins M.Y. et al, 1986; Yi O.S. et al„ 1991; Meister A„ 1992; Lissi E. et al, 1992; Li-Chag Lu et al, 2003; Huang D.-J. et al, 2004).

Реакции образования и удаления активных форм кислорода и других радикалов (гидроксильный радикал, супероксид, липоксильный радикал, пероксинитрит и другие) обеспечиваются различными механизмами, объединенными в антиоксидантную систему организма (Владимиров Ю.А, 2004; Carrell R.W. et al, 1975; Levin G, Popov J,. 1994).

Взаимодействия между отдельными звеньями антиоксидантной системы в настоящее время широко исследуются (Воейков B.J1, 2003; Капелько В.И, 2003; Poovaiah В.Р. et al, 1986; Pacifici R.E, Davies K.J.A, 1991; Yi O.S. et al, 1991), однако ясности в этом вопросе пока нет, что определяется сложностью и неоднозначностью интерпретации результатов (Levin G, Popov J,. 1994).

Наиболее информативными являются прямые методы исследования радикалов, к которым относятся метод электронного парамагнитного резонанса и метод хемилюминесценции. Хемилюминесцентный метод основан на механизме выделения фотонов в результате взаимодействия радикалов друг с другом. Интенсивность свечения пропорциональна скорости реакции в естественных условиях, без специальной подготовки исследуемого материала. Эти положительные стороны хемилюминесцентного метода объясняют его широкое применение в самых разных областях (Величковский Б.Т., 2000; Воейков B.JL, 2003; Владимиров Ю.А., 2004; Lissi Е. et al., 1992 Uotila J. et al., 1996; Smith R.et al., 1996; Cao G. et al., 2000). В настоящее время существует огромное количество модификаций хемилюминесцентного метода, предназначенного для конкретных субстратов (Клебанов Г.И. и соавт., 1988; Теселкин Ю.О. и соавт., 1997; Lissi Е. et al., 1992; Parejo J. et al., 2000; Akiyama Y. et al., 2001).

Цель работы: Исследовать антирадикальную и антиоксидантную активность плазмы крови и слизи желудочно-кишечного тракта у теплокровных животных.

Задачи исследования:

1. Подобрать состав стандартного раствора и объем исследуемой пробы для хемилюминесцентного анализа, позволяющего проводить исследования в различных биологических субстратах;

4. Исследовать возрастные особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови бройлеров;

Научная новизна. Впервые установлено, что в биологических субстратах, таких, как плазма крови и слизь пищеварительного тракта, присутствует система защиты организма от действия радикалов внешней и внутренней среды, состоящая из двух частей: антиоксидантной активности (защита от действия активных форм кислорода) и антирадикальной активности (защита от действия радикалов различной природы). Причем уровень антирадикальной активности на два порядка выше, уровня антиоксидантной активности. Впервые установлены видовые особенности антиоксидантной и антирадикальной активности плазмы крови у разных видов теплокровных животных (человек, собака, мышь, бройлер). Впервые установлены некоторые механизмы, обуславливающие антирадикальную активность пищеварительного тракта.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Использование двух источников (дифенилпикрилгидразил и фитонцидная фракция), генерирующих радикалы, позволило установить два вида защиты организма от действия радикалов: антиоксидантная активность и антирадикальная активность;

2. Основными носителями антирадикальной активности пристеночного слизистого слоя пищеварительного тракта у собак являются белок, N-ацетилнейраминовая кислота полимеризованных гликопротеинов и гексо-замины деградированных молекул гликопротеинов слизи;

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на International Symposium on Science and Technology (Tomsk, 2001); IY Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); 7-th Korea-Russia International Symposium on Science and Technology (Ulsan, Korea, 2003); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); на Всероссийской научной конференции «Механизмы адаптации организма» (Томск, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ. Из них 5 статей в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 116 источников, из них 35 отечественных и 81 зарубежных. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц и 16 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Заева, Ольга Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Подобран состав стандартных растворов и соотношение объемов проб для хемилюминесцентного метода сравнительных исследований антиоксидантной (источник радикалов дифенилпикрилгидразил) и антирадикальной (источник радикалов - фитонцидная фракция) активности в различных биологических субстратах.

2. Установлено, что плазма крови и слизь пищеварительного тракта обладают способностью тушить люминозависимую хемилюминесценцию, индуцированную супероксид анионом и/или комплексом других радикалов.

3. Сравнительное исследование антиоксидантной и антирадикальной активности слизи желудочно-кишечного тракта и плазмы крови показало, что антиоксидантная активность этих субстратов составляет от 1% до 2% их антирадикальной активности.

4. Добавление напитков, содержащих алкоголь, к пробам желудочной слизи или плазмы крови, изменяет исходную антиоксидантную и антирадикальную активность этих субстратов. Добавление коньяка снижает, а добавление алкогольных настоек растительного сырья увеличивает исходную антиоксидантную и антирадикальную активность желудочной слизи или плазмы крови.

5. Установлены видовые различия уровня антиоксидантной и антирадикальной активности у человека, собак, мышей и цыплят бройлеров. Наиболее высокие значения антиоксидантной активности установлены у мышей, антирадикальной активности -у собак.

7. Антирадикальная активность пристеночного слизистого слоя определяется полимеризованными гликопротеинами и внеструктурными компонентами слизистого слоя. Антирадикальная активность прямо коррелирует с концентрацией белка (0,85) и с концентрацией Ы-ацетилнейраминовой кислоты (0,78) в полимеризованных гликопротеинах. Антирадикальная активность внеструктурных компонентов пристеночного слизистого слоя выше, чем антирадикальная активность полимеризованных гликопротеинов. Уровень антирадикальной активности отмывок, получаемых при выделении полимеризованных гликопротеинов, имеет коэффициент корреляции, равный 0,96, с содержанием в отмывках свободных гексозаминов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что для сравнительного определения интегральных показателей антиоксидантной и антирадикальной активности биологических субстратов можно подобрать соответствующие составы стандартных растворов и соотношения объемов пробы. В наших исследованиях был использован принцип тушения пробой люминолзависимой хемилюминесценции (Хавинсон В.Х. и соавт, 2003; Lissi Е. et al, 1992; Popov J.N, Levin G, 1994 и мн. др.). Были заданы следующие условия:

1) Подобрать такой метод, который может быть использован для проведения сравнительных исследований активности как эндогенных антиоксидантов, содержащихся в биологических образцах (плазма крови, гомогенат слизи пищеварительного тракта), так и экзогенных, содержащихся в различных напитках и пищевых продуктах, биологически активных добавках, фармакологических препаратах;

2) Соотношение растворов (реагирующая смесь/исследуемый материал) должно быть таким, чтобы высокомолекулярные соединения плазмы крови и слизи пищеварительного тракта (белки и гликопротеины) не преципитировали и не подвергались расщеплению, что могло бы привести к значительному изменению их свойств;

3) Состав стандартного раствора реагирующей смеси должен обеспечивать стабильный уровень хемилюминесценции, так называемое плато максимальной хемилюменесценции стандартного раствора должно быть стабильным в течение как минимум 90 секунд;

4) Метод должен позволять использовать различные источники радикалов не только активных форм кислорода, но и других атомов и молекул что дало бы возможность сравнивать степень ингибирования радикалов, генерируемых этими источниками, эндогенными и экзогенными антиоксидантами;

5) Метод должен обладать высокой точностью и воспроизводимостью.

Проведенные многочисленные исследования показали, что подобраны варианты стандартных растворов для дефенилпикрилгидразила и фитонцидной фракции, удовлетворяющие вышеперечисленным условиям.

Достоверность наших результатов подтверждается тем, что:

- повторяемость максимального уровня хемилюминесценции для стандартных растворов, содержащих дифенилпикрилгидразил или фитонцидную фракцию, очень высока и колебания его для стандартных растворов, приготовленных в разное время, не превышают 10%;

- установлен диапазон соотношений объемов добавляемой пробы и концентрации компонентов стандартного раствора, в котором сохраняется прямая пропорциональность между концентрацией антиоксидантных или антирадикальных веществ в пробе и изменением уровня хемилюминесценции;

- при повторении измерения одной и той же пробы колебания показателей составляют менее 5%;

- доказано сохранение свойств нативных образцов исследуемого биологического материала путем минимальной обработки материала перед анализом и спектрофотометрически подтверждено отсутствие изменений оптических свойств исследуемой пробы в стандартном растворе.

Использование двух видов доноров радикалов в стандартном растворе (дифенилпикрилгидразила и фитонцидной фракции) позволило установить, что общая система защиты организма от действия радикалов внешней и внутренней среды состоит из двух частей (видов): антирадикальной активности, поскольку дифенилпикрилгидразил является источником единственной активной формы кислорода - супероксид аниона, и антирадикальной активности, поскольку фитонцидная фракция, по-видимому, является донором фенильных, метальных, этильных, бензильных, алкильных и других видов радикалов, и возможно, активных форм кислорода.

Антирадикальная активность слизи желудка в 150-160 раз выше ее антиоксидантной активности, а антирадикальная активность плазмы крови выше ее антиоксидантной активности в 75-80 раз. Вероятно, это объясняется тем, что слизь пищеварительного тракта является одним из первых барьеров на пути проникновения во внутреннюю среду организма токсических веществ (ксенобиотоков), метаболизм которых может сопровождаться образованием радикалов различной природы (активные формы кислорода, азота, водорода, хлора и др.).

В главе 3.5. показана возможность существования трех механизмов антирадикальной защиты слизи желудочно-кишечного тракта. Вероятно, эти механизмы и обеспечивают более высокий уровень соотношения антирадикальной/антиоксидантной активности слизи пищеварительного тракта по сравнению с плазмой крови.

На 93% кровь представлена плазмой - коллоидным раствором, в состав которого входят частицы от простейших ионов до сложно устроенных молекул, относящихся ко многим классам химических соединений. Многочисленными исследованиями (Кольтовер В.К., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Владимиров Ю.А., 2004; Yi O.S. et al., 1991; Meister A., 1992; Levin G., Popov J., 1994) установлено, что антиоксидантная активность плазмы крови обусловлена макромолекулярными неферментативными антиоксидантами (трансферин, церулоплазмин, гаптоглобины и другие белки сыворотки крови) и низкомолекулярными компонентами (тироксин, флавоноиды, стероидные гормоны, убихинон, билирубин, витамины, низкомолекулярные S-H соединения). Однако установлено, что при определенных условиях иммуноглобулины плазмы крови могут продуцировать активные формы кислорода (Wentworth A.D. et а1., 2001; Wentworth Р. е1 а1., 2002). Исследованиями Сао в. е1 а1. (1999; 2000) показано, что антиоксидантная активность лиофилизированной сыворотки крови ниже плазмы крови. Также следует учитывать то, что плазма крови не содержит клеточные антиоксиданты.

Нашими исследованиями установлено, что антиоксидантная активность плазмы крови в 5-6 раз выше антиоксидантной активности слизи желудка, а антирадикальная активность (соответственно) - в 3 раза. Эти данные подтверждают, что в исследуемых биологических субстратах существует два вида защиты от действия радикалов: антирадикальная и антиоксидантная активность. Соотношение антирадикальная/антиок-сидантная активность в исследуемых биологических образцах различается в два раза. Снижение этого соотношения в плазме крови объясняется увеличением ее антиоксидантной активности по сравнению с пристеночным слизистым слоем. Вероятно, это объясняется разнообразием механизмов как антирадикальной, так и антиоксидантной активности плазмы крови и слизи желудочно-кишечного тракта.

С физиологической точки зрения особенно важно то, что использованные биологические субстраты - плазма крови и слизь пищеварительного тракта обладают способностью тушения индуцированной хемилюминесценции стандартных растворов, содержащих дифенилпикрилгидразил или фитонцидную фракцию. Это также свидетельствует о том, что в исследованных биологических субстратах присутствуют два вида системы защиты от токсического действия радикалов.

Учитывая, что антиоксидантная активность организма, уже достаточно хорошо изученная, представлена самыми разнообразными механизмами (ферментативные антиоксиданты клетки, макромолекулярными и низкомолекулярными неферментативными компонентами и др.), можно предполагать, что антирадикальная активность организма еще более многообразна и имеет еще более сложные взаимодействия между отдельными компонентами.

По-видимому, если общую систему защиты организма от разрушающего действия радикалов внешней и внутренней среды назвать антирадикальной системой, то антиоксидантная активность различных органов и тканей организма является составной частью этой системы.

Проведение сравнительных исследований антиоксидантной и антирадикальной активности отдельных биологических субстратов, таких, как содержащие алкоголь напитки, хитозан, плазма крови и гомогенат слизи желудка показало, что предлагаемый метод может быть использован для подобных исследований. Например, изучение нативной антиоксидантной и антирадикальной активности напитков, содержащих алкоголь, и их комплексов с гомогенатом слизи желудка или плазмой крови, моделирует in vitro пути поступления напитков в пищеварительный тракт и их трансформацию в организме. Следует отметить, что именно через пищеварительный тракт поступает большинство экзогенных радикалов и антиоксидантов, что часто используется в лечебных и профилактических целях. Однако ожидаемый профилактический эффект не всегда наблюдается. Многие из общепринятых антиоксидантов (витамины Е, С, А и др.) при более детальном изучении не обнаружили профилактического эффекта (Marchioli R. et al., 2001; Ness A.R. et al., 1996), или даже способствовали повышению риска развития рака легких у курильщиков (каротиноиды) (Pryor W.A. et al., 2000). Поэтому исследование механизмов взаимодействия экзогенных антиоксидантов и субстратов, с которыми они взаимодействуют при попадании в организм необходимо для понимания процесса влияния экзогенных антиоксидантов.

Одним из возможных этапов трансформации экзогенных антиоксидантов является их взаимодействие с содержимым полости пищеварительного тракта и, особенно, с его пристеночным слизистым слоем. Этот слизистый слой является обязательным этапом транспорта пищевых веществ в кровеносное русло (Морозов И.А., 1988). Он обладает собственной антиоксидантной активностью, сравнимой с активностью антиоксидантов плазмы крови (Бочкарева Н.В. и соавт., 1999; Кривова H.A. и соавт., 2001).

Проведенные нами исследования показали, что:

- при добавлении исследуемых алкогольсодержащих напитков происходят изменения антиоксидантной и антирадикальной активности желудочной слизи и плазмы крови;

- степень выраженности данных изменений не связана с процентным содержанием алкоголя;

- на антиоксидантную и антирадикальную активность желудочной слизи и плазмы крови добавление коньяка оказывает подавляющее действие;

- добавление алкогольных настоек растительного сырья - черносмородинового ликера, Горно -Алтайского бальзама, настойки золотого корня, значительно увеличивает антиоксидантную и антирадикальную активность их комплексов с желудочной слизью и плазмой крови.

Эти результаты наглядно демонстрируют влияние алкогольсодержащих напитков на слизь пищеварительного тракта и плазму крови, что может иметь существенное значение для понимания их влияния на организм в целом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Заева, Ольга Борисовна, Томск

1. Азизова O.A., Осипов А.Н., Савов В.М. //Биофизика. 1984. - Т.29, №5.-С. 766-769.

2. Аршавский И.А. Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития /И.А. Аршавский. М.: Наука, 1986.

3. Богер М.М. Определение активности трипсина в сыворотке крови по Хэвербеку-Эрлантеру /М.М. Богер //Современные методы в биохимии. -1983.-С. 90-92.

4. Бочкарева Н.В. Антиоксидантная система при предопухолевых заболеваниях и раке желудка /Н. В. Бочкарева, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, A.B. Ситожевский, М.В. Вусик, И.В. Хавалкин, H.A. Кривова //Российский онкологический журнал. 1999. - №1. - С. 14-17.

5. Бузун Г.А. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного /Г.А. Бузун, K.M. Джемухадзе, Л.Ф. Милешко //Физиология растений. -1982. Т.29, вып. 1. - С. 198-204.

6. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. //Успехи химии. 1985. - Т.54, №9. - С. 1540-1558.

7. Величковский Б.Т. Молекулярные и клеточные основы экологической пульмонологии /Б.Т. Величковский //Пульмонология. -2000. -Т.10, №3. С. 6-19.

8. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты /Ю.А. Владимиров //Вестник РАМН. 1998. - №7. - С. 43-51.

9. Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции /Ю.А. Владимиров //Соровский Обозревательный журнал. 1999. - №6. - С. 25-32.

10. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях /Ю.А. Владимиров //Соровский Обозревательный журнал: Биология.-2001.-№12.-С. 11-17.

11. Владимиров Ю.А. Антиоксиданты природные и синтезированные -Электронный ресурс. Электронный журнал. - 2004. - Режим доступа к журналу: http: //cmjournal. ru/lec/rp326.htm.

12. Воейков В.JI. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах // Москва: МГУ им. М.В. Ломоносова. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. - 2003.

13. Гальперин Ю.М. Пищеварение и гомеостаз /Ю.М. Гальперин, П.И. Лазарев. М.: Наука, 1986. - 304 с.

14. Газарян К.Г. Биология индивидуального развития животных /К.Г. Газарян, Л.В. Белоусов. М., 1983. - 312 с.

15. Гамалея H.A. Перекись водорода как сигнальная молекула /И.А. Гамалея, И.В. Клыбин //Цитология. 1996. - Т.38, №12. - С. 1233-1247.

16. Капелько В.И. Активные формы кислорода, антиоксиданты и профилактика заболеваний сердца /В.И. Капелько //Русский медицинский журнал. 2003. - T.l 1, №21. - С. 3-18.

17. Клебанов Г.И. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных гликопротеинов /Г.И. Клебанов, И.В. Бабенкова, Ю.О. Теселкин, О.С. Комаров, Ю.А. Владимиров //Вопросы медицинской химии. 1988. - Т.34, №6. - С. 59-62.

18. Кольтовер В.К. Свободнорадикальная теория старения: современное состояние и перспективы /В.К. Кольтовер //Успехи геронтологии. 1998. -Т.2.-С. 37-42.

19. Костеша H .Я. Биологическая активность светлой фракции экстракта пихты сибирской /Н.Я. Костеша, Е.С. Гулик, Г.А. Борило, Л.Н. Зибарева //Вестник ТГУ. Биология. 2007 (в печати).

20. Кривова Н.А.Механизмы образования и деградации надэпителиаль-ного слизистого слоя пищеварительного тракта //Томск: ТГУ. -Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. -1994.

21. Кривова H.A. Развитие защитных функций пищеварительного тракта у свиней в онтогенезе /H.A. Кривова, Е.Г.Гвай, О.Б.Заева, Т.А. Лаптева //Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2007. -Т.93,№1 .-С. 68-75.

22. Критский Г.А. Диагностика радиационного поражения по анализу нуклеиновых кислот крови /Г.А. Критс-кий, C.B. Александров //Биохимические методы. М.: Наука. - 1980. - С. 118-121.

23. Кук Д. Методы анализа углеводов мембран //Биохимическое исследование мембран /под ред. Э. Мэдди. М.: Мир, 1979. С. 254-312.

24. Лившиц В.М. Биохимические анализы в клинике /В.М. Лившиц, В.И. Сидельникова. М.: МИА, 2001.-302 с.

25. Лысиков Ю.А. Надэпителиальный слизистый слой тонкой кишки и его роль в пищеварительном конвейере /Ю.А. Лысиков, И.А. Морозов,

26. B.Ю. Ишкова //Тезисы докл. XY Всес. съезда ВФО. Л.: Наука, 1987. -Т.1.-С. 216-217.

27. Морозов И.А. Всасывание и секреция в тонкой кишке: субмикроскопические аспекты /И.А. Морозов, Ю.А. Лысиков, Б.В. Питран,

28. C.И. Хвыля. М.: Медицина, 1988. - 226 с.

29. Нонхибел Д. Химия свободных радикалов /Д. Нонхибел, Д. Уолтон. М.: Мир, 1977.-320 с.

30. Осипов А.Н, Якутова Э.Ш, Владимиров Ю.А. //Биофизика. 1993. -Т.38, №3.-С. 390-396.

31. Питран Б.В. Сорбционные процессы на начальных этапах всасывания в тонкой кишке /Б.В. Питран, А.Б. Атлавин, М.Р. Апсите //Мембранное пищеварение и всасывание. Рига, 1986. - С. 107-109.

32. Питран Б.В. Структура и функции слизистого слоя тонкой кишки //Усвоение органических и неорганических соединений в организме животных. Рига, 1990. - С. 219-241.

33. Сучков В.П. Биохимическая роль селена в организме животных /В.П. Сучков, Ц.М. Штутман, А.Г. Халмурадов //Украинский биохимический журнал. 1978. - Т.50, №5. - С. 659-671.

34. Теселкин Ю.О. Ингибирование сывороточными антиоксидантами окисления люминола в присутствии гемоглобина и пероксида водорода /Ю.О. Теселкин, И.В. Бабенкова, О.Б. Любицкий, Г.И. Клебанов //Вопросы медицинской химии. 1997. - Т.43, №2. - С. 87-93.

35. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов /К.Т. Турпаев //Биохимия. 2002. - Т.67. - С. 281-292.

36. Уголев A.M. Исследование пищеварительного аппарата у человека /A.M. Уголев, Н.Н. Иезуитова, Ц.Г. Масевич, Н.М. Тимофеева, Т.Я. Надирова. Л.: Наука, 1969. - 250 с.

37. Хавинсон В.Х. Влияние эпиталамина на свободнорадикальные процессы у человека и животных /В.Х. Хавинсон, В.Г. Морозов, В.Н. Анисимов //Успехи геронтологии. 2003. - Т.4. - С. 128-133.

38. Akiyama Y. Screening of chemiluminescence constituents of cereal and DPPH radical scavenging activity of gamma-oryzanol /Y. Akiyama, K. Hori, K. Hata, M. Kawane, Y. Kawamura, Y. Yoshiki, K. Okubo //Luminescence. -2001. V.16, №3. - P. 237-241.

39. Allen A. Structure of gastrointestinal mucus glycoproteins and the viscosity and gel-formation properties of mucus /А. Allen //Brit. Med. Bull. -1978.-V.34.-P. 28-33.

40. Allen A. The structure and physiology of gastrointestinal mucus /A. Allen, A. Bell, M. Mantle, J.P. Pearson //Mucus Health and Disease. 1982. -P. 115-133.

41. Allen A. Studies of gastrointestinal mucus /A. Allen, W.J. Cunliffe, J.P. Pearson, L.A. Sellers, R. Ward //Scand. J. Gastroenterol. 1984. - V. 19. - P. 101-114.

42. Allen R.G. Oxidative stress and gene regulation /R.G. Allen, M. Tresini //Free Radic. Biol. Med. 2000. - V.28, №3. - P. 463-499.

43. Ames B.N. Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging / B.N. Ames, M.K. Shigenaga, T.M. Hagen //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993.-V.90.-P. 7915-7922.

44. Blix G. The determination of hexosamines according to Elson and Morgan /G. Blix //Acta Chemica Scand. 1948. - V.2, №5. - P. 467-473.

45. Bulatti E. Chemoprevention in Cancer Control /E. Bulatti, N. Munoz //Eds. Lyon. 1996. - №136. - P. 35-39.

46. Cao G. Hyperoxia-induced changes in antioxidant capacity and the effect of dietary antioxidants /G. Cao, B. Shukitt-Hale, P.C. Bickford, J.A. Joseph, J. McEwen, R.L. Prior //Journal of Applied Physiology. 1999. - V.86. — P. 18171822.

47. Cao G. Postprandial increases in serum antioxidant capacity in older women /G. Cao, R.L. Prior //Journal of Applied Physiology. 2000. - V.89. -P. 877-883.

48. Carrell R.W. Activated oxygen and hemolysis /R.W. Carrel), C.C. Winterbourn, E.A. Rachmilewitz //Br. J. Haemotol. 1975. - V.30. - P. 259264.

49. Chappie L.C., Mason G.J., Garner J., Mattews J.B., Thorpe G.H., Maxwell R.S.J., Whitehead T.P. //Amer. Clin. Biochem. 1997. - №34. - P. 412-421.

50. Clement M.V. Reactive oxygen intermediates regulate cellular response to apoptotic stimuli: a hypothesis of disorders of leukocyte oxidative metabolism: role of myeloperoxidase /M.V. Clement, S. Pervais //Clin. Chem. -1999.-V.29,№3.-P. 513-515.

51. Costagliola C. Vitamin E and red blood cell glutathione //C. Costagliola, T. Libondi, M. Menzione //Metabolism. 1985. - V.34. - P. 712-714.

52. Davies K.J.A. Intracellular proteolytic systems may function as secondary antioxidant defenses: an hypothesis /K.J.A. Davies //J. Free Rad. Biol. Med. 1986.-№2.-P. 155-173.

53. De Lamirande E. Human sperm huperactivation and capacitation as parts of an oxidative process /E. De Lamirande, C. Gagnon //Free Radic. Biol. Med. 1993. - V.14, №2. - P. 157-166.

54. De Waziers J. The effect of vitamin A. Nutri-tional status on glutathione, glutathione transferase activities in rat intestine /J. De Waziers, R. Albrecht //Experientia. 1987. - V.43. - P. 394-395.

55. Dische Z. A specific color reaction of methylpentoses and a spectrophotometric micromethod for their determination /Z. Dische, L.B. Shettles //J. of Biol. Chemistry. 1948. - V.175, №2. - P. 595-603.

56. Edwards P.A. Is mucus a selective barrier to macromolecules? /P.A. Edwards //Brit. Med. Bull. 1978. - V.34. - P. 55-57.

57. Forssell H. Gastric mucosal defence mechanisms: a brief review /H. Forssell //Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1988. - V.23, №155. - P. 23-28.

58. Frigg M. Relationships between vitamin A and vitamin E in the chik /M. Frigg, J. Broz //Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1983. - V.54. - P. 125-134.

59. Gad A. Pathophysiology of gastrointestinal mucins /A. Gad //Adv. Physiol.Sci. 1981. - V.29. - P. 161 -184.

60. Glavind J. //Acta chem. Scand. 1963. - V. 17. - P. 1635.

61. Goeptar A.R. Oxygen and xenobiotic reductase activities of cytochrome P450 /A.R. Goeptar, H. Scheerens, N.P. Vermeulen //Crit. Rev. Toxicol. 1995. -V.25.-P. 25-65.

62. Halliwell B. Biologically revelant ion-dependent hydroxyl radical generation. An update /B. Halli-well, J.M.C. Gutteridge //Febs Letters. 1992. -V.307.-P. 108-112.

63. Halliwell B. The gastrointestinal tract: a major site of antioxidant action? In Process Citation. /B. Halliwell, K. Zhao, M. Whiteman //Free Radic. Res. -2000. V.33, №6. - P. 819-830.

64. Hancock J.T. Role of reactive oxygen species in cell signaling pathways /J.T. Hancock, R. Desican, S.J. Neill //Biochem. Soc. Trans May. 2001. -V.29, Pt.2. - P. 345-350.

65. Handel D.U. Vergleichende untersuchug zur metodik der bestimmung des eiwei gedundenen zuckers /D.U. Handel, W. Kittlak //Z. Med. Labor. Techn. 1963. - №4. - S. 163-169.

66. Hills B.A. Gastric mucosal barrier: hydropho-bicity of stretched stomach lining /B.A. Hills, L.M. Lichtenberger //Amer. J. Physiol. 1985. - V.248, №6, Pt.l. -P.643-647.

67. Hiroyuki H. Antioxidative and Superoxide Scavenging Activities of Retrochalcones in Glycyrrhiza inflate /H. Hiroyuki, I. Harumi, M. Kenji,

68. T.Yukiyoshi, K. Takeshi //Bioorganic and Medicinal Chemistry. 1997. -№6. - P. 339-347.

69. Huang D.-J. Antioxidant and antiproliferative activities of sweet potato (Ipomoea batatas L. Lam 'Tainong 57') constituents /D.-J. Huang, C.-D. Lin, H.-J. Chen, Y.-H. Lin //Bot. Bull. Acad. Sin. 2004. - V.45. - P. 179-186.

70. Jenkins M.Y. Influence of excess vitamin E on vitamin A toxicity in rats /M.Y. Jenkins, G.V. Mitchell //J. Nutr. 1975. - V.105. - P. 1600-1606.

71. Jenkins M.Y. Effect of dietary protein on growth and on plasma and liver vitamin A and E levels in young rats /M.Y. Jenkins, G.V. Mitchell //Nutr. Res. -1986.-№6.-P. 1083-1094.

72. Jentiens T. Quantitative aspects of mucus glycoprotein biosynthesis in rat gastric mucosa /T. Jentiens, G.J. Strous //Biochem. J. 1985. - V.228, №1. - P. 227-232.

73. Jentiens T. Biosynthesis, processing and secretion of mucus glycoprotein of the rat stomach /T. Jentiens, A. Van de Kamp, R. Spee-Brand, G.J. Strous //Biochem. et Biophys. Acta: Mol. Cell Res. 1986. - V.887, №2. - P. 133-141.

74. Kaur C. Antioxidants in fruits and vegetables the millenium's health /C. Kaur, H.C. Kapoor //International and Journal of Food Science and Technology -2001.-V.36.-P. 703-725.

75. Kondakova I. Total reactive antioxidant potential in human saliva of smokers and non-smokers /1. Kondakova, E.A. Lissi, M. Pizarro //Biochem. Mol. Biol. Int. 1999. - V.47, №6. - P. 911 -920.

76. Krishnamurthy S. Effect of dietary coconut oil and caseine and megadoses of vitamin A or C on tissue lipid peroxidation and hemolysis in vitamin E deficiency /S. Krishnamurthy, T. George, N.J. Bai //Acta Vitaminol. Enzymol. 1983. - №5. - P. 165-170.

77. Levin G. The antioxidant system of the organism. Theoretical basis and practical consequences /G. Levin, J. Popov //Med. Hypotheses 1994. - V.42, №4. - P. 269-275.

78. Lissi E.A. Is spontaneous urinary visible chemiluminescence a reflection of in vivo oxidative stress? /E.A. Lissi, M. Salim-Hanna, T. Sir, L.A. Videla //Free Radic. Biol. Med. 1992. - V. 12, №4. - P. 317-322.

79. Lissi E. Luminol luminescence induced by 2,2'-Azo bis(2-amidinopropane) thermolysis /E. Lissi, C. Pascual, M.D. Del Castillo //Free Radic. Res. Commun - 1992. - V. 17, №5. - P. 299-311.

80. Lu L.-C. Antibacterial and DPPH Free Radical-scavenging Activities of the Ethanol Extract of Propolis Collected in Taiwan /L.-C. Lu, Y.-W. Chen, C.-C. Chou //Journal of Food and Drug Analysis. 2003. - V.l 1, №4. - P. 277282.

81. Manning A., Hearse D. //J. Molec. Cell. Cardiol. 1984. - V.l6, №6. -P. 497-518.

82. Marchioli R. Antioxidant vitamins and prevention of cardiovascular disease: epidemiological and clinical trial data /R. Marchioli, C. Schweiger, G. Levantesi, L. Tavazzi, F. Valagussa //Lipids. 2001. - №36. - P. 53-63.

83. Meister A. On the antioxidant effect of ascorbic acid and glytatione /A. Meister//Biochem. Pharmacol. 1992.-V.44,№ 10.-P. 1095-1105.

84. Mozsic G. Interrelationships between the gastric cytoprotective effect of vitamin A and (3-carotene and the gastric mucosal superoxide dismutase activity in rats /G. Mozsic, T. Javor, G. Toth //Acta Physiol. Hung. 1984. - V.64. - P. 315-318.

85. Napoli C. Multiple role of reactive oxygen species in the arterial wall /C. Napoli, F. De Nigris, W. Palinski //J. Cell Biochem. 2001. - V.82, №4. - P. 674-682.

86. Ness A.R. Vitamin C and cardiovascular disease: a systematic review /A.R.Ness, J.W. Powles, K.T. Khaw //J. Cardiovasc. Risk. 1996. - V.3, №6. -P. 513-521.

87. Oates G. The composition of human gastric mucin /G. Oates, A.C. Rossbottom, A.J. Schrager//Mod. Probl. Paediat. 1977. - V.l9. - P. 11-21.

88. Omaye S.T. Alteration of guinea pig erythrocyte superoxide dismutase activity by dietary antioxidants //S.T. Omaye, B.D. Fotter, H.P. Foovaian //Intern. J. Vit. Nutr. Res. 1986. - V.56. - P. 161-164.

89. Orr W.C. Extension of life-span by over expression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster /W.C. Orr, R.S. Sonal //Science 1994. - V.263. - P.l 128-1130.

90. Pacifici R.E. Protein lipid and DNA repair system in oxidative stress: free radical theory of aging revisited /R.E. Pacifici, K.J.A. Davies //Gerontology -1991.-V.37.-P. 166-180.

91. Patty A.K. Interaction of flavonoids with 1,1-diphenyl -2- picrylhydrazyl free radical, liposomal membranes and soybean lipoxygenase -1 / A.K. Patty, I. Sunamoto, N.P. Das II Biochem Pharmacol 1988. - V. 37, №6. - P. 989-995.

92. Peltola V. Induction of lipid peroxidation during steroidogenesis in the rat testis. /V. Peltola, J. Huhtaniemi, T. Metsa-Ketela, M. Ahotupa //Endocrino-logy 1996. - V.137, №1. -P. 105-112.

93. Pierpaoli W. Pineal control of aging: effect of melatonin and pineal grafting on aging vice /W. Pierpaoli, W. Regelson //Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1994.-V.91.-P. 787-791.

94. Poovaiah B.P. Response of plasma retinol to dietary changes of ascorbic acid and selenium in the guinea pig /B.P. Poovaiah, S.T. Omaye //Nutr. Res. -1986.-№6.-P. 583-588.

95. Popov I.N. Photochemiluminescent detection of antiradical activity: II. Testing of nonenzymic water soluble antioxidants / I.N. Popov, G. Levin // Free Radic. Biol. Med. - 1994. - V. 17, №3. - P. 267-271.

96. Pryor W.A. Beta carotene: from biochemistry to chinical trials /W.A. Pryor, W. Stahl, C.I.Rosk // Nutr.Rev. 2000. - V.58, pt. 1 .-P.39-53.

97. Rhead W.J. Risks of long-term ascorbic acid overdosage /W.J. Rhead, G.N. Schrauzer//Nutr. Rev. 1971. - №11. - P. 262-263.

98. Sanchez-Moreno C. Review: Methods Used to Eva-luate the Free Radical Scavenging Activity in Foods and Biological Sistems. // Food Sci. Tech.Int. -2002.-vol. 8, №3. P. 121-137.

99. Saran A.M. Arguments against the significance of Fenton reaction contributing to signal pathways under in vivo conditions /A.M. Saran, C. Michel, K. Stettmaier, W. Bors //Free Rad. Res. 2000. - V.33. - P. 567-579.

100. Sawyer D.T. Metal/hudroperoxideinduced activa-tion of dioxygen for the oxygenation of hydrocarbons: oxygenated Fenton chemistry /D.T. Sawyer, T. Sobkowiak, T. Matsushita //Accounts of Chemical Research 1996. - V.29. -P. 409-416.

101. Shachter H. Glycoprotein biosynthesis //The glycoconjugates, V.2, Mammalian glycoproteins, glycolipids and proteoglycans //Academic Press, New York- 1978.-P. 87-181.

102. Sevanian A. Phospholipase A2 dependent relase of fatty acids from peroxidized membranes /A. Sevanian, E. Kim //J. Free Rad. Biol. Med. 1985. -№ 1. - P. 263-271.

103. Smith R. Total antioxidant capacity of human seminal plasma / Vantman D., Ponce I., Escobar I., Lissi E.A. // Reproduction 1996. - vol. 11,-P. 1655-1660.

104. Sondergaard E. The influence of vitamin E on the expenditure of vitamin A from the liver /E. Sondergaard //Experientia 1972. - V.28. - P. 773774.

105. Stein H.B. Ascorbic acid-induced uricosuria. A consequence of megavitamin therapy /H.B. Stein, A. Hasan, J.H. Tor //Ann. Intern. Med. -1976.-V.84.-P. 385-388.

106. Stocks I. The inhibition of lipiol autoxidation by human serum and its relationship to serum proteins and a tocopherol / Gitteridge I.M., Sharp R.I., Dormandy T.L. //Clin. Sci. Molec. Med. - 1974. vol.47, №3. - P. 215-222.

107. Stump D.D. The effect of dietary vitamin E supple-mentation on y-tocopherol levels of human plasma and red blood cells /D.D. Stump, H.S. Gilbert //Ann. New York Acad. Sci. 1986. - V.418. - P. 497-498.

108. Tokumaru S. Change of the lipid hydroperoxide level on mouse organs on ageing /S. Tokumaru, H.Iquchi, S. Kojo //Mech. Ageing Dev. 1996. - V. 86. - P. 67-74.

109. Uotila I.T., Kirkkola A.L., Rorarius M., Tuimala R.I., Metsa-Ketela T. // Free Radic. Biol. Med. 1996. - №16. - P. 581-590.

110. Vladimirov Yu.A., Putvinsky A.V. // I. Plys.Biol. Med. 1992.- vol. 1. -P. 10-18.

111. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acid /L. Warren //J. of Biol. Chemistry 1959. - V.234, №8. - P. 1971-1975.

112. Wentworth A.D. Antibody catalysis of the oxidation of water /A.D. Wentworth, L.H. Jones, P. Wentworth, K.D. Janda, R.A. Lerner // Science -2001.-V.293 (5536).-P. 1806-181 1.

113. Wentworth P. Evidence for ozone-catalyzed ozone formation in bacterial killing and inflammation /P. Wentworth, J.E. McDunn, A.D. Wentworth, J. Nieva, J.M. Riedi, R.A. Lerner //Science 2002. - V. 14. - P. 930-935.

114. Xia Y. Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric oxide synthase in macrophages /Y. Xia, J.L. Zweier //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. - V.94 (13). - P. 6954-6958.

115. Yi O.S. Synergistic antioxidative effects of tocopherol and ascorbic acid in fish oil (lecitin)Avater system /O.S. Yi, D. Han, H.Q. Shin //J. Am. Oil. Chem. Soc. 1991.-V.5,№8.-P. 881-883.

116. Zalewsky C. Mechanisms of mucus release in exposed canine gastric mucosa / C. Zalewsky, F. Moody //Gastroenterology 1979. - V.77. - P. 719-729.

Информация о работе

Заева, Ольга Борисовна
кандидата биологических наук
Томск, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Исследование антирадикальной активности плазмы крови и секретов желудочно-кишечного тракта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы