Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка ферментных и клеточных кондуктометрических биосенсоров для определения концентраций некоторых субстратов и ингибиторов ферментов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка ферментных и клеточных кондуктометрических биосенсоров для определения концентраций некоторых субстратов и ингибиторов ферментов"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРАИНИ ШСТИТУТ BIOXIMIÏ ím. 0.В.ПАЛЛАД1НА

V и На правах рукопису

ДЗЯДЕВИЧ Ceprift Викторович

РОЗРОБКА ФЕРМЕНТНИХ ТА КЛГГИННИХ КОНДУКТОМЕТРИЧНИХ БЮСЕНСОР1В ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЩЙ ДЕЯК11Х СУВСТРАТШ ТА 1НПБГГОР1В ФЕРМЕНТ1В

03. 00. 23 - бютехнолопя

АВТОРЕФЕРАТ дисертацК на здобуггя паукового ступени кандидата б!олопчних наук

KHÏB - 1995

/

Дисертац1ею е рукопис.

Робота виконана у сектор! б!оелектрошки рад1оф!знчного факультету Кшвського университету ¡м.Тараса Шевченка та вщдш мехяшзм!В трансляци генетично! ¡нформацп 1нституту молекулярно? бюлоги та генетики HAH Украши (м.Кшв).

HayxoBi кср1вники:

доктор фЬ.-мат. наук, професор СТР1ХА В!талш 1ллар|оиович канд. бюлопчних наук, ст. н. сшвр. СОЛДАТК1Н Олексш Петрович

ОфшШш опонентн:

доктор х1м!чних наук, ст. н. cniep. ШАПОВАЛ Галина Cepriletta доктор бюлопчних наук, професор ПХАКАДЗЕ Георгш Олексаидрович

Провщна оргажзашя:

1нституг Здоров'я 1М.Л.1.Медведя МОЗ Украши (M.Kiiin)

Захист дисертаци вщбудеться ,ХО Л+сиЛЖл? 1995 р. о 14 год. на засщанш спешальзовано! вчено! ради Д 016.07.01 в Iiicnnyri öioxiMii ¡м.О.В.Палладша HAH Укра1'ь'и за адресою: 252601, м.Кшв, вулЛеонтовота, 9.

3 дисертащею можна ознайомитись в 6!бл1отещ 1нституту öioxiMii 1м.О.В.Г1алладша HAH Украши

Автореферат роз1сланий 1995 р.

Вчеиий секретар спещал130вшш7 вченоТ ради

кандидат бшлолчних наук /JUi^ü^^—^ Кирсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальшсть проблеми. Проблеми охорони навколишнього середовища, контролю б1отехнолопчних процесса, збиьшення юлькосп кл!шчних теспв в медичтй Д1агностищ потребуе все быьш широкого використання в практищ та наукових дослшженнях селективних, високочутливих, швидких та економ1Чних метод1в анал1зу. Разом з полтшенням р1зних фЬика-х1м[чних ¡нструментальних методов (хроматогрзф1чш, paflioxiMi4Hi, люмшсснснтш та innii) широке застосування знаходять анал(тичн) пристро! з використанням в рол! чугливих елемеяпв бголопчного материалу (ферменпв, юптин та шших) для пошуку та KbibuicHoro визначення р^зномаипннх органгпшх та неорганкних сполую метаболтв, мутагешв, онкогешв, ioHiB важких метал1В ¡.т.д. Серед таких пристроТв особливу увагу придшяють приладам нового поколшня - б|'осенсорам.

Великий ¡нтерес, який проявляеться до 6iocencopia протягом осташш дваддяти роюв, зумовлений 'ix певними перевагами у nopiewmm з традищйними методами та приладами 6ioxiMi4Horo анал!зу: вщноснш дешевизн! та простои використання при високш чутливост! та специф\чносп i можливосп робота з забарвленими зразками.

Але серед велико!" к1лькост! роб!т по бюсенсорам зовс1м незначна увага придшяеться кондуктометричним б!оеенсорам - приладам, що рееструють змшу пров!дност) розчииу в мембран! пщ час 6i0xiMi4H0i реакцй. На сьогодшшшй день розробкою кондуктометричних мнпатгорних 6iocencopiB займаються лише галька науковнх груп: Bilitewski (Брауишвейг, Шмеччина), Lowe (Кембрщж, Англия) та наша група. Така невелика увага, мабуть, частково базуеться на недостатньо вивченнх принципах, яю лежать в ocHoei ix роботи, тому що кондуктометричш бюсенсори мають ряд значних переваг у поршняшп з ¡ншими типами датчиков. Це: вщсутшсть технолопчно складного електроду пор!вняння; використання при poGoii змшно! напруги мало! амплитуд и, що дозволяе уникиути фарадешських процесш на електродах; вщсутшсть свтаочутлнвост!; здатшстъ до мпнатюризаци та до великого ступеню ¡нтеграци при використанш недорого! тонкоилгвчато! стандартно! технологи.

У зв'язку з цим видалось актуальним вивчитн можлив1СТь використання кондуктометричного методу вимфктань для реестрапи перебегу ферментативннх npoueciB i дослщити можливютъ створення високоселективних ферментних га юитинних кондуктометричних бтсенсорш.

Мета та залач"! поелКтженпя. Головною метою роботи була розробка кондуктометричних 6iocencopin на основ! вивчення взаемоди ферменмв та юитин з субстратами та шпбггорами в pi3imx умовах. Як бюлопчш об'екги було вибрано ферменти уреаза, глюкозооксидаза, ацетилхолшестераза, бутирилхолшестераза та дикий штам метилотрофшгх др1ждж!в Candida boidinii 706.

Виходячи з мети роботи, були сформульоваш слшуюч1 задач):

1. Вивчити електрох1м1Чш процеси в KOMipui з тонкогинвчатими кондуктометричними перетворювачами з метою ix найбшыц ефективного використання в бюсенсорах.

2. Розробити лабораторний макет уреазного кондуктометричного бюсенсора для визначення р1вню сечовшш в сироватц! кров) на ochobI вивчення властивостей в1льно1 та 1ММобШзовано'1 уреази.

3. Роэробити лабораторний прототип ферментного кондуктометричного бюсенсора для визначення pinino глюкози в сироватщ Kposi та провести пошук цишх1в полшшення його анаштичних характеристик.

5. Розробити макет ферментного кондуктометричного бюсенсора для визначення фосфороргашчних пестищшв в водних розчинах на ochobí вивчення взаемодЛ ¡ммобшзованих ацетил- та бутирилхолшестераз з шпбггорами.

6. Вивчити , можлив!сть використання штактних * клшш метилотрофних дрикдаав Candida boidinii 706 для створення лабораторного макету клтшного кондуктометричного бюсенсора по визначенню концентращй етанолу в алкогольних напоях,

Наукова_шшиаиа41й5о1и.в робот! вперше проведено дослщження електрох1М1чних npoueciB в KOMipui з кондуктометричними перетворювачами з метою вибору оптимальних умов роботи з ферментними кондуктометричними бюсенсорами. Показано, що робота на високих частотах змшного струму дае можлившть знехтувати поверхневими ефектами на електродах та 1х деградащею при 36epiraHHi та дозволяе використовувати кондуктометр ичш тонкогшвчат! перетворювач! для створення 6ioceHcop¡b.

Дослщжено можлив1сть використання кондуктометричного перетворювача для вивчення взаемода в1льно1 та ¡ммобшзовано! уреази з сечовиною та розроблено лабораторний прототип уреазного кондуктометричного 6ioceHcopa. Приведено результата використання кондуктометричного бюсенсора для визначення концентрацп сечовини в Kponi ¡ pÍ3H06¡4H0 дослщжено його електрох1м1чш характеристики (залежшсть вщ рН, буферно! cmhoctí розчину та концентрацп сол1 в розчиш).

Вперше розроблено лабораторний прототип ферментного кондуктометричного б!осенсора для визначення концентрацп глюкози в крови Дослщжено вплив на вщгук бюсенсору параметр1в середовища, таких як буферна емшсть розчину та концентрац1я coni в буферному розчин1. Приведено ряд цшгав розширення лшШного д1апазону роботи глюкозного бюсенсору та зменшення впливу на величину вШтуку параметр1в середовища. Показано, що використання додаткових заряджених мембран дозволяе розширити динам1чиий д1апазон роботи датчика до 10 мМ глюкози без постршення його чутливост! та значно зменшити вплив на величину вщгуку Cioceucopa буферно'{ cmhoctí розчину.

Вперше за допомогою кондуктометричного перетворювача проведено вивчення взаемодц хслшестераз з шпбпорами та на шй ochobí розроблено макет ферментного кондуктометричного б!осенсора для визначення фосфороргашчних пестицшйв у водних розчинах. Дослщжено чутливють такого сенсору до ряду пестицншв (дизопропШфторфосфат, параоксон-етил, параоксон-метил, трихлофон), показано можлишсть вщновлення активност! 1ммобЫзованого ферменту теля дн на нього ÍHri6iTopiB.

Вперше розроблено лабораторну модель кондуктометричного юптинного 6iocencopa для визначення концентраца етанолу в деяких алкогольних напоях на основ) штактних клггин метилотрофних дршджт Candida boidinii 706 э хорошим р!внем кореляци даних, отриманих за його допомогою, з результатами, визначеними методом газо-рцшнно! хроматографа.

Прзктнчналшшсть-робоик Створено aíiomí лабораторну модел! ферментних кондуктометричних 6¡ocencopÍB для експресного визначення концентрашй

сечовпни та глюкози в сироватш кров!. Навелеш характеристики вказують на перспектившсть таких 6iocencopiB. Вони можуть бути основою при розробш та налагоджеш промислового випуску вим1рювалышх прилил in для Gioxi м i ч noï AianiocTiiKii.

Створено дмочу лабораторну модель ферментного кондуктометричного 6ioeeHCopa для визначення концентрашй фосфороргашчних псстлцидш в водних розчинах, яка може бути основою при розробш прилад1в контролю забруднення при проведенш мошторингу навколншнього середовиша.

Створено дпочу лабораторну модель юнтинного кондуктометричного бюсенсора для визначення коннентрашй етанолу в алкогольних напоях. Датчик може з ycnixoM впкорнстовуватнсь и харчов^й промнсловоси при виробшщтв) алкогольних nanoÏB, а також на станшях швидко!" допомоги та в судмедекспертиз! для експресного визначення ршшо етанолу 8 кров1.

Апробашя.роботи. Результати досл1джень доповщались на Республ1кансьюй науково-техшчнШ конферении "Новые возможности современного биомедицинского приборостроения" (Ворзель, Украша, 1991), на Другому сттовому Kourpeci "Biosensors' 92" (Женева, Швейцария, 1992), на МЬкнароднш конференцн "Journées d'Electrochimie" (Гренобль, Франшя, 1993), на М1жнароджй конференцн "Eleclrodes modifiées electrocatalyse et capteurs electrochimiques" (Париж, Франшя, 1993), на М1жнаролтй конферении "Evrosensors VII" (Будапешт, Угоршина, 1993), на М|жнародшй конферении по xiMi'miiM сенсорам (Рим, 1талш, 1994) ), па М|Жнародшй конферении "Evrosensors VIII" (Тулуза, Франшя, 1994).

Пуб.'пкаци. За MaTepiiuiriMn днеершцн опублжовано 12 журналышх статей.

Структура та об'см роботи. Дисерташ'я складаеться з вступу, огляду лператури, опнеу матери'иив та метод1в дослщження, експерименталыкм частики, яка включас виклад результате роботи та ïx обговярення (у 5 главах), висновкш, а також списку лператури, який включас 119 публшашй.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОД И

У робоп використопупяли слщукт реактиви: уреаза марки Б з 6o6ïb coï (КФ 3.5.1.5, ниробннцтво Олайпського заводу х1мрелктивш, Литва) з актившетю 12 од.акг./мг.; р-глюкозооксидаза (ГОД) з Pénicillium vilalc (КФ 1.1.3.4, виробництво Косарського спиртзаводу Черкаського виробничого об'еднання спиртовoï промисловост!) з aKTiiBHicTio 168 од.акт./мг.; бутирилхолшестераза (БуХЕ) з сировагки KpoBi копя (КФ 3.1.1.8, виробництво ф1рми "Sigma", Франшя) з актитпетю 266 ол.акг./мг.; ацетилхолшеоераза (AXE) з електрнчного органу вугря (КФ 3.1.1.7, ппребнишво ффми "Sigma", Франшя) з актившетю 225 од.акт./мг.; каталаза з цсчшкн бика (КФ 1.11.1.6, виробництво ф!рми "Sigma", Франшя) з актившетю i9.9 од.акт./мг.; спроиаткопий альбумш бика (БСА) ф1рмн "Boehringer Mamiheim" (Франшя); 25 % розчин глугарового нльдегщу (ГА) ф]рмн "Serva" (Германш). Субстрати глюкоза, сечовина, ацетнлхолш хлорид та бутирилхолш хлорид булн впробннцтва (¡¡¡рми "Sigma" (Францш). Фосфороргашчш пестишщи д1 ¡зопроп ¡лфторфосфат ДФФ), дютил-р-штрофенол фосфат (етнл-параоксоп), трихлорфоп та реактиватор хол1нестераз шрщш-2-!1пьдоксим метйодид (ПАМ) були ф!рми "Sigma" (Франция), метил-параоксон - ф)'рми "Riedel-de-Haen" (Швейцар1я). MaTepianii для додаткових мембран: полтвпшбутирол (ПВБ) був

отриманий лшшною сопол1меризашею В1н!лбутиролу, вш1лалкоголю та вш1л ацетату у пропорциях 75:22:3, "NAFlON-perfluorinated" (5 % в cyMiiui низько-ал1фатичних спирпв та 10 % води, продукт № 27.470-4) був поставлений ф1рмою "Aldrich Chem.Co.". ДрЬкджовий екстракт був поставлений ф1рмою "Difco Laboratories" (США), альпнат натр1ю - ф1рмою "Chemical Co. Ltd." (Англш). Як буферш розчини використовували калш-фосфатний буфер (KH2P04-Na0H) ф1рми "Merck", tpic ффми "Reanal" (Угорщина), HEPES ффми "Calbiochem" (США). iHUji реактиви, що використовувались в po6crri, були вггчизняного та закордоного виробництва та мали ква1нф1кащю "ос. ч." та "х. ч.".

Клггини штаму вирощували в середовиии, яке складалося з таких компонентов: 1.0 г/л КН2Р04, 3.5 г/л (NH4)2S04, 0.3 г/л MgS04-7H20, 0.1 г/л СаС12 та 0.5 г/л дрЬкджового екстракту "Difco". В якосп джерела вуглероду використовували 1 % етанол. ДрЬкджов1 клггини вирощували до експоненщальноТ фази росту при постшному перекншуванш (240 об/хв) за температурою 30 °С. Концентрацпо юптин визначали оптичним методом (Гончар и др., 1990]. Перед експериментом дрЬкдж! осаджували центрифугуванням при 5 тис об/хв та деюлька pa3iB промивали дистильованою водою.

Досл!дження проводили на перетворювачах власного виробництва. Вони представляли з себе непровщну пщкладку, на яйй методом вакуумного напилення було отримано дв1 пари гребшчатих тонкошпвчатих металевих електрод^в.

Для створення ферментно! бюматриш готовили розчини ферменту та БСА в 20 мМ калш-фосфатному буфер!, рН 7.4 з шнцевими концентрашями 50 мг/мл та змшували в стввщношерД 1:1 вШповЩно. В cyMim фермент-БСА добавляли глщерин до кшцево! концентрацп 10 % для стабшзащ! ферменту при ¡ммобипзаци та щоб запоб1гти передчасному пщсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. Краплю cyMiuii фермент-БСА наносили на поверхню одше! пари електрод!в. На поверхню друго! пари наносили розчин одного БСА (ця пара була ' датчиком пор1вняння). Для пол1меризацц мембран датчики пом1щали в атмосферу насичених napie ГА на 30 хв i пот1М пщсушували на noeiTpi [Shul'ga et al, 1993]. Bci додатков1 мембрани формувалися поверх як ферментно!, так I референтно! мембран крапельним засобом. Для бшково! матриш брали 10 % розчин БСА, наносили суцшьним шаром поверх мембран i noTiM полшеризували в атмосфер! насиченнх napiB ГА на протяз! 30 хвил. ПВБ-матриця формувалася нанесеням крапл! 5 % розчину шннмеру в етанол1 з подалыпим пщсушуванням и на noBiTpi. Для NAFION-матрищ брали 5 мкл NAFION-розчину, наносили поверх мембран та центрифугували на протяз1 1-2 хвилин. ГОсля цього мембрани пщсушували на noeiTpi [Soldatkin et al, 1994].

Клтшт бюмембрани формували нанесениям на поверхню одше! пари електродт 1 мкл cyMimi 2 % розчину альгшату натрпо з 5-20 мкг дрЪкджових кл1тин. На поверхню друго! пари електрод1в наносилося 1 мкл 2 % розчину альпнату натрио i цей електрод був елементом пор1вняння. Поим датчик помшшш в 0.1 М СаС12 на 2 хвил до угворення гелю [Korpan et al, 1994].

Вим1рювання проводились в pi3Hi« буферних розчинах при юмнатнШ температур! в вщкрйтому об'ем1 з ¡нтенсивним перемпыуванням. Перед роботою перетворювач1 вимочували деякий час в буферному розчин! до отримання стабильного сигналу. Концентраци субстрапв змшювали шляхом добавления певних ал1квот конце1прованих розчишв.

РЕЗУЛЬТАТЫ ТА КХ ОБГОВОРЕННЯ

ВИВЧЕИНЯ ЕЛЕКТРОХ1М1ЧНИХ ПРОЦЕС1В В КОМ1РЦ1 3 ТОНКОПЛ1ВЧАТИМИ КОНДУКТОМЕТРИЧНИМИ ПЕРЕТВОРЮВАЧАМИ

Тонкогшвчатий кондуктометричний перетворювач - це мМатюрний двохелектродннй пристрШ для виМ1рювань проводи ост! тонкого шару розчину, якнй знаходнться безпосередньо бшя поверхш електрод1в. В комплекс! з бюлопчно активною мембраною в!н перетворюеться в б1оеенсор. Схематично вш представлений на рис. 1а.

Ключем до вивчення системи тонкошпвчатий перетворювач в розчиш е уявяетт ф1зцко-х1м(чнтпс процссш, як} в н!й проходить, у вигляд! еквхвалентного елеюричного ланцюга, в якому ш процеси замшюються вщповцшими елекгронними елементами, а саме конденсаторами та резисторами. Ф1зико-х»м1чш процеси, що протгкають в електрох1М1Чн!й кокорщ, запропоновано змоделювати слщуючою екв!валентною схемою (рис.16), де Сщц, Яп, Сокисд, Яроэч - емшсть подвШного шару, отр перетину, емвдсть окислу та ошр розчину вщпов1дно.

Рис. 1. Кондуктометрична ко\н'рха та П екв1'валентяа схема

Для анашу властивостей тако'! системи використовувався досить новий метод доапяжения електрох1М1чних процесса - ¡мпедансна спектроскошя, при якому аналЬуються залежносп реактивноГ складово! повного оп!ру системи (шпедансу) вщ активно! для р1зних частот зм!нного струму. Було проведено теоретичннй розрахунок еквталентно! схеми, побудован1 вщповщто теоретичш ¡мпедансш крив! (рис.2.а). Для пштвердження правильносп запропоновано! та розраховано! модел1 електрохМчного импедансу кондуктометрично'! ком!рки, заметь тонкогшвчатих перетворювач ¡в в вим1рювальну схему було подключено екв1валентний ланцюг з електронними елементами. Експериментальн! ¡мпедансш крив)', ям були отримаж для егаивалентного ланцюга, добре корелюють з теоретичними (рис.2.а) та в'щповщають ¡мпедансним кривим, отриманим для реальних перетворювач»в (рис.2.6), що пщтверджуе правшьшсть вибору екв1валентно! схеми.

Принцип роботи ферментного кондукгометричного б!осенсора базуеться на тому, що пщ час ферментативно! реакцй проходить змша провщносй (отру) розчину в приелектродшй областт мембрани, що пропорщйна концентрацц певно? речовини в розчинь Таким чином основним ¡нформативним параметром системи е

л.

' субстрат

мембрана ■ фермент -окисл

метал пщложка

змша КрОЗЧ. Було дослцркено зм1ну експериментальних. ¡мпедансних кривих при зм!ш р!зних компонент екв1валентного ланцюга, пщключеного до схеми вимфювань. На рис. 2.а показано, що змша величини Кр03Ч значно бшьше впливас на реальну складову ¡мпедансу, чим шип елементи екв1валентного ланцюга, особливо на високих частотах, що дуже важливо при робот1 з ферментним кондуктометричним бюсенсором.

50 100 150

Яг, кОт

(6)

гоо

Рис. 2. Теоретичн! (суцшьн¡) та експериментальш (крапчаст¡) ¡мпедансш крив! екв!валент-ного ланцюга з елекгронними компонентами (а) та експериментальш шпедансш крив! реальних перетворювачш (б). Частота змшювалась з! 100 Гц до 200 кГц.

(а): Параметри ланцюга:

1. Кп = 10 кОм, Ярозч " I к°м> спш " 4

2. Яп- 10 кОм, Кр03ч = 3 кОм, Спш = 4 нФ,

3. Нп = 5 к Ом, Ярозч = 3 кОм, Сщц = 4 нФ,

(б): Параметри резчику: 3 мМ калШ-фосфатний буфер, рН 7.4, юмнатна температура.

Змша провщносп розчину при дослщженнях модулювалась змшою концентрацц КС1 в розчиш та температурою. Показано, що змша фоново! пров1дност1 розчину головним чином впливае на внсокочастотну частину ¡мпедансу. Таким чином, працюючи на висоюй частот!, ми маемо кращу чутлив!сть датчика. До того ж, при таких умовах експерименту, основний вклад до сигналу дае реальна компонента, тобто провщшсть, що й потребно для кондуктометричних бioceнcopiв.

При робот! з кондуктометричними датчиками було вщммено, що при довгостроков1Й експозшш в розчиш, !х характеристики супево змшювались. Для дослщження природи цього феномену було проведено спещальну сер1ю дослщжень, коли структури, яка тестувались, заиурювались в розчин та перюдично аналиувались 1х ¡мпедансш залежнос-п.

3 рис.3 видно, що при робст на високих частотах, величина реально! складово! ¡мпедансу з часом збер1гання майже не змшюеться 1 ми втирюемо лише Ирозч» в той час як на иизьких частотах реальна складова ¡мпедансу зменшуеться в 3-10 раз'ш в залежносп вщ матер!алу електродав.

На основ! вим!рювань э реальними електродами та експерименив з екв1валентнок» схемою слшуе, що елекгрох»м!чний ¡мпеданс, пом'фяний на висоюй частот!, не чутливий до зм)ни поверхневого ¡мпедансу електрод!в, а визначаеться

(Г Od

головним чином об'емкнми

властивостями контактуючих фаз, а саме розчином мЬк електродами. Тобто при вим1рюваннях на частотах бшьш 50 кГц можна знехтувати поверхневими ефсктами на елекгродах та деградацию поверхш електрод1в при aGcpirainii, що дае можлив1сть створювати стабшып бюсснсори, як/ мало залежатг, вш пегрядпцц

** перетворювача.

Враховуючи щ результата для Рис. 3. Залежтсть реальноГ скпяаовоГ шпедшсу кондуктометричних вим1рювань в для елгкгродЫ з рЬних штсрШв шд часу подальш„х експериментах вико-36epiramw ix в 5 мМ кллш-фосфатному

буфер:, рИ 7.4. Ви.шрювлння проводились ристовуваласъ частота змшного ип частотах 100 кГц (!) та 200 Гц (2). струму 100 кГц. Були проведен!

експерименти, в яких вимфювалась npoBiaHicTb розчину в залежное™ вш iOHHO'i сили (концентрацн КС1) електродами з pi3HHX матер1ал!в. Таким засобом модулювалася змша npoeianocTi nia час ферментативно! реакц'н. KpiM того, тестувалась можлив'ють роботн рпнпх кондуктометричних перетворювачш в рщииах з великою iomioio силою. Показано, що чутлиш'сть до концентрацп KCI для Аи-, Си-, Ni- елекгрод^в можна nopiBiuoBaTi!, тод! як Cr- i Ti- електроди, а особливо А1- елекгроди, показують значно мепшу чутлившть (на порядок). Вони досягають повного насичения по npooi/tHOcri вже при концентрами 5-10 мМ КС1, що робить неможливим використання i'x в якост! кондуктометричних иеретворювач1в при розробщ ферментних та клптшних 6iocencopiB, тому що з останшми плануеться працювлти в бюлопчних рщинах, як\ як правило мають пелику фонову провшшеть.

Подальша робота Сула сконцентрована на розробш кондуктометричних 6ioceiicopiB для медично! д1агностики та мошторингу навколишнього середовища з застосуванням в рол1 чутливого елемента pi3HHx за своею природою бюлопчно активних матср1ал1в, а саме уреазн, глюкозооксидази, ацетнлхолшестерази, бутирилхолшестераза та дикою шгаму метилотрофних дрЬкдаав Candida boidimi 706.

РОЗРОБКА УРЕАЗНОГО КОНДУКТОМЕТРИЧНОГО БЮСЕНСОРА

Загалыюприйняп лабораторш бюхЫчш мстоди визначення кониентращй сечовини в розчиш та актнвност! уреази базуються на використаши або прямих кольорових реакшй, або спектрофотометрично! ¡ндикацц амошю, який утворюеться при каталггичному розщеплеш сечовини уреазОю. Ц1 засоби включають складш та тонкз процедур», яи потребують для '¡х вщтворення значного часу. Кр1м того, використання ультраф10летово! спектрофотометра досить лЫгговаио при вивченш кольорових розчишв, таких, наприклад, як кров.

В дашй глав1 для ц>е'1 мети пропонуеться використати кондукгометричний перетворювач. Попередт дослщження не дають повного уявлення о перспективах

практичного використання такого бюсенсора [Солдаткин и др., 1993}. На його властивосп значно впливають р1зш фактори анал1зуемо1 рщини, 1 цей вплив необхщно враховувати при розробш процедура анал1зу.

Кондуктометричний метод визначення концентрашй сечовини базуеться на реестра ци заряджених ¡ошв, яю утворюються пш час ферментативного пдролЬу сечовини:

= ° + + Н+ ■И=* Я®4+ + НСОз"

И 2**

На рис. 4 показано вплив концентраца сечовини на початкову швидю'сть змщи провщносп розчину пщ час ферментативноТ реакцп для вЬьноУ (а) та 1ммобшзован01 (б) уреази.

[сечовика], им (сечоьина), »М

(а) (б)

Рве. 4. КалЮрувальнз крива кондукгометркчного Бюсенсора з вилкою (а) та шмобЫзованою (6) уреазою для визначення сечовини в 5 мМ калШ-фосфатному буфер!, рН 7,4.

Експериментальш результате. були перебудоваш в крив! 1дЬХофсл, шо дозволило визначити значения Км = 1.33 мМ з коеффвдентом кореляш/ Я = 0.99.

Кшетичш законом!рносп ¡ммобшзованих фермент в. також шдчнняються р1вня]шю М1хаел1са-Ментен з Т1ею лише розницею, що замлеть Км буде вшначатись ефекгавне (уявне) значения константи М1хагл1са КМ(уяв). Це вшбуваеться тому, шо концентращя субстрату поблизу ферменту (локальна) може вшрпнятись вш концентраци субстрату у всьому об'ем! системи. Км(уяв) в цьому випадку повинна залежати вщ розподшу субстрату мЬк вшьним розчином та ферментного мембраною. Значения Км(уцв) було 3.73 мМ з коефф1щентом кореляца И = 0.997. Таке збшыисне значения КМ(уяв) можна пояснити тим, що по-перше, при ¡ммобийзаци може вщбуватися змша споршненосп фермента до субстрату ¡з-за конформащйних змш, а по-друге, ферментативний процес в мембраш може контролюватися дифузШними процесами, а саме внутр^шньою дифуз1ею продуктов та субстрата в ферментшй мембраш. В шшадку дифузШного Л1мпування практично весь субстрат, який проходить в мембрану, реагуе та витрачаеться в приповерхневих шарах носъя, а глибинш обласп його вже не мають, чи в мембран! виникае градгёнт концентрашй субстрату та продукту 1 цей факт необхщно враховувати при анал!з1

класичних рпзнянь. Величина Км для вшьно! та ¡ммобинзовано! уреази, отрнмана за допомогою кондуктометрпчного методу, близька до величин, експерименталъно отриманих як за допомогою шших електрох!м1чних метогив, так i класичних 6ioxiMi4Hiix засоб!в [Cullen et al, 1990].

На властивосп уреази дуже впливають pi3Hi фактори середовища, а саме pH, буферна емн!сть та ¡онна сила ротшну. 1ммобиташя ферменту може привести до зм1ни иього впливу, а це дуже важливо для ошнкп можлнвостей практичного застосування 6ioceiicopiß, як! використовують саме ¡ммобЫзовану форму фермента.

На рис.5 представлено крнву залежноси швидкост! фермента-тивно1 реакци Bin pH середовища для вшьно'! та шмобЫзовано! уреази. Оптимум pH для вшьно! уреази у 5 мМ калШ-фосфатному буфер! знаходиться близько 6.5.. BiH дещо зеунутий в кислу область у пор!внянш з pH-оптимумом, отриманим фенол-ппохлоритним бюх1м!чним методом у 100 мМ калШ-фосфатному буфер1 [Бубряк и др., 1993]. Такнй ефект, можливо, пов'язаний з тим, то у розчинах з ннзькою буферного емностю, в результат! накопичення ioniB амошю, залужнення середовища копенсуеться не при бшьш високих локалышх

Рис.

5. Залежи1стъ швидкостI ферментаттгвгюТ рейкц/Г гглрол/зу сечовпни в'щ рН середовища для вольно? (I) та ¡ммобШзовано! (2) уреази. Вторювання проводились в 5 мМ калШ-фосфатному буферI з р/знчми рИ, концентрац'ш добавляемо! сечовиии - 5 мМ. повшетю, тому фермент фактично функцюнуе значениях рН, шж рН буферного розчииу, то використовуеться. При ¡ммобишаци ферменту в мембрану, рН-оптимум для уреази розширюеться, Внаслшок цього швидюсть ферментативно'! реакци стае менш чутливою до змши рН, особливо в облает! рН 7.4, що дуже важливо для експериментш з б^олопчними рщинами. Подабний ефект може бути пояснений Л1м1туванням дифузи субстрату в мембран).

Як правило 61олог1чн1 ршини мають високу буферну емпкть, тому було проведено сксперименти по вивченню впливу буферно! емносп середовшца на кшетичний вщгук уреазного бюсенсора. На рис.б наведено залежшеть початково! швидкост! ферментативно! реакци для вшьно! та ¡ммобинзовано! уреази вщ буферно! емносп середовища при рН калш-фосфатного буферу 7.4. Видно, що для в1Льно! уреази при зростанш концентраци буферу до 5 мМ, швготость реакш! змен-шуеться в 2 рази, при лалъшому збшьшешй буферно! емносп, вона зменшуеться незначно. Цей ефект пов'язаний з тим, що в пипадку вшьно! уреази ¡они, що утворюються гид час реакци, не зв'язуюгься складовими частиками буферу при цизькш буфернШ емносп, зп!дси й значна змша провщност! розчину. Для буферу з великою буферного емн!стю, частина ¡ошв, яи утворилися, зв'язуеться частниками буферу, тобто залужнення середовища частково компенсуеться, в результат проходить незначна змша провщносп розчину. Для ¡ммобинзовано! уреази на цей ефект накладаеться дифуз!йне л1м1тування, що приводить до того, що швидмсть реакци майже не зал ежить вщ буферно! емност! реакцШного середовища.

0.8

06

5 од

02

10

20

(буфер). кМ

30

'—1

40

1.0 -)«„_-,-.-,2 Для б!оЛОПЧНИХ Р1ДИН

характерними е висою концентраци р!зних солей, тому. вивчення залежносп величини кшетичного вщгуку б!осенсора в!д юнно! сили середовища е доскть 1 важливим для розробки уреазного б1осенсора. Було показано, що як для вшьно! уреази, так 1 для ¡ммобшзованно!, величина вщгуку значно залежить вщ концентраци КС1 в розчиш. Це можна пояснити Рнс. 6. Залежн/сть швидкосп ферментативно! там, що наявшсть нереагуючих реакцй шромзу сечовини вщ концентрацП ¡0шв в розчиш зменшуе чупншсть калШ-фосфатного буферу, рН 7.4 для вшъноГ кондуктоме1ричного мет0ДУ) i крЫ (!) та !ммобт!зошано1 (2) уреази. Коинен- ,

тратя добавляемо! сечовини - 0.5 мМ. того. Добавления в систему розчину

з високою юнною силою приводить до екраиування зарядасених груп активного центру ферменту та шнизованих груп розчину. Виявилось, що пщвищення концентраци сол! вщ 0 до 100 мМ призводкть до зниження величини сигналу приблизно на 70 - 80 %. При подальшому зростанш концентраци сол! до 400 мМ величина вщгуку эмщюваласъ незначно. Таким чином, дня усунення впливу ¡окно! сили середовища, при визначенш ршню сечовини в йсшопчних р ¡динах необхщно у вихщний буфер додавати КС1 в концентраци 100 мМ.

1з наведених результатов можна зробити висновок, що за допомогою кондуктометричного уреазного бюсенсора можна з усшхом проводити визначення концентраци сечовини в бюлопчних рщинах. Зг!дно данних по складу кров!, концентрацш сечовини в нШ може зм!нюватись вщ 6 - 8 мМ 'В норм! до 40 мМ та бшьше при патологи [Хмелевский, 1988]. Оскшьи робочий Д1апазон б!осенсора е меншим, пробу кров! требд розводити. При розбавлен! цщьно! рщини в 20 раз!в отримують д!апазои змши концентрашй сечовини в розчиш, який ствпадае з робочою областю кондуктометричного уреазного бюсенсору (0.1 - 2 мМ сечовини). Це забеспечуе найбшьш точи! результата вимфювань.

На рис.7 наведено результата експериментш з сироваткою кров! кроля. Сдочатку в ком!рку об'емом 2 мл два рази пщряд добавлялася сечовина до кшцево! коицентрацн 0.2 мМ, В результат! отримувались в!дгуки бюсенсора на вщому коицетрацио субстрата, що дозволяло збудувати лшшний участок кал!брувально! криво» сенсора. Попм в ком1рку добавлялась цшьна сироватка кров! порцщми по 160 мкл, що приводило до и 20-кратного розведення. В результат тако! внутр!шньо! калЮровки та в припущенн1 лшшно! залежносп сигналу бюсенсора в)Д концентраци сечовини в даному д1апазош концентрацй отримали, що концентрацш сечовини в роэведенШ кров! склала 0.2 мМ, що вщпов!дае 4 мМ сечовини в1 ц!пьнШ кровЬ

Б, мкСм

Рис. 7. Залежн1сть вихЫного сигналу бюсенсора в1д часу при добавлен/' до 3 мМ калШ-

фосфатного буферу (рН 7.4), який мостить 150 л/Л/ КС!, 0.2 мМ сечовини (1) та

¡00 мкл сироватки кров/ кроля (2).

Таким чином, розроблено лабораторний прототип уреазного кондуктометричного б1осеисору, який можна використовувати для визначення складу сечовини в кров!.

РОЗРОБКА ГЛЮК03Н0Г0 КОНДУКТОМЕТРИЧНОГО БЮСЕНСОРА ТА ПОШУК МОЖЛИВОСТЕЙ ПОЛ1Г1ШЕННЯ ЙОГО АНАЛ1ТИЧПИХ ХАРАКТЕРИСТИК

Серед велико! млькост! бюсенсор1в домшуюче положения займаготь датчики на глюкозу, тому що глюкоза е одним з головнпх метабол Мв, який визначаеться в бюлопчннх ссрсдовишах. На данний час вшома велика кшьюсть бюсенсорш для пизначення глюкози, але комершйних и рил ал ¡и на 1х оснот створено мало [На«, 1990].

Шпроке застосуванпя глюкозних бюсенсорш на практиц! лшгговано рядом 1х недо;икш. В дсяких випадках це недостатньо висока чутлив!сть та стабшьтстъ сенсору, а частше за все - вузький динам1чний л:апачоп концентраций, що визначаються. Також характеристики вщомих бюсенсорш дуже залежать вщ юнно! сили, буфер! юТ смпосп та рН середовшца, що завжди нсобхщно враховувати при розробш процсдури аналпу. Для усунення цих недолшв необхщно перш за все виичити азастивост! ¡ммобшзовано! глюкозооксидази, як1 лежать в основ! роботи ферментних бюсенсорш на глюкозу.

В основ! роботи кондуктометричного бюсенсора для визначення глюкози лежить реестрашя змшн провщносп розчину в мембраш за рахунок змши кониешраци мротонш в результат! днссошаци глюконово» кислотн, яка утворюеться в мембраш при окислен! глюкози з допомогою ГОД за схемою:

ГОД

р-Э-глюкоза + 02 + Н2О..........> Б-глюконо-б-лактон + Н2О2

1

глюконова кислота И

залншок глюконово? кислота + Н+

Визначення концентрацн глюкози за допомогою бюсенсора можна проводити двома засобами: по максимальнш швидкосп змши провщноеп розчипу пщ час ферменгативно1 реакш! та по величин! вщгуку бюсенсору, коли в систем) встановлюеться р\вновага.

Як можна бачити з рис.9 динам1чний д1апазон визначення глюкози в обох випадках практично однаковий. Гранична концентрацш глюкози, що визначалася бюсенсором, 0.01 мМ, область лшШно! залежност) величини вщгуку вщ концентрацн субстрату була до 2 - 3 мМ, чушшсть 5 мкСм/хв*мМ в кшетичному режим! визначення та 8 мкСм/мМ - в сташонарному. Експериментальш результата

[.-локоэа], иМ {глоноза), иМ

(а) (б)

Рнс. 9. Кал '1брувальт крив! кондукгометрнчного глюкозного б'юсенсору в юнетичому (а) та

стационарному (б) режимах вимрювань. Ви.уирювання проводились в 5 мМ калШ-

фосфатному буфер!, рН 7.4

Лшшшсть кал1брувально1 кривел кондуктометричного бюсенсора збер!галась до 2 - 3 мМ глюкози. При бшьш високих концентрацшх глюкози спостер^гаеться насичення. Але концентрацш глюкози в кров! змшюеться вщ 3 - 5 мМ в норм! до 40 мМ при патологи, шо потребуе розведення проби кров! при и вим1рюванш ¡з-за вузького динам1чного шапазона бюсенсора. Тому пошук цшшв розошрення динам!Чного диапазону бюсенсора е досить важливнм для розробки експресного датчика на глюкозу..

Такий вузький диапазон може бути пояснений л1мпуванням ферментативно! реакци гшролоу киснем, який е в нШ косубстратом. Тому було запропоновано слщуюч1 шляхи розширення динаммного д!апазону роботи глюкосенсора, а саме:

1). Збшьшення концентрацн" кисню в зрачках пробулькуванням останнього.

2). Кхмммобшзащя в ферментну мембрану додаткового ферменту каталази, яка розщеплюе Н2О2 з вшиленням кисню.

3). Змша концентрацн активного ферменту ГОД в мембраш шляхом змши сшввщношения фермент-БСА.

4). Змша дифузШних характеристик ферментно!' мембрани за рахунок використання додаткових мембран р1зн01 природа.

При пробулькуванш киснем дослщжуемого зразка верхня межа динам1чного диапазону б1осенсора як в кшетичному режим! вимфювань, так I в стацшнарному, зсуваеться в сторону бшьш високих концентращй глюкози, а саме до 5 - ДО мМ.

При коЫмобшзацм каталази ефект розширення динамичного д1апазону досить незначнин (рис.10, крива 3). Це можна поясннти тим, що каталаза не продукуе додатковий кисень и мембран!, а таьки частково ре ген с рус вже використаний ранние (на дги молекули використованого рашше кисшо може регенуватись лише одна молекула).

При зменшен) ствтяношешш ГОД.-БСА в мембран! вщ 9:1 до 1:9 (сумарна концентращя бшка - 10 %) динам!чний д1апазон роботи сенсора розширюеться до 5 мМ, однак, досить сильно зменшуеться чутливють сенсора. Це може бути пов'язано з слшуючнм. Коли в мембран! знаходиться велика кЫьк!сть ферменту, то вся глюкоза, яка проходить всередину, зразу ж реагуе в приповерхневих шарах мембрани, I при великих концентрациях субстрату, кисню недостатньо. Тому 1 насичення по глюкоз! вщбуваеться вжс при 2 мМ. Якшо зменшити калькасть активного фермента в мембрлш, то в приповерхневих шарах мембрани в реакш'ю включасться менша кшьюсть глюкози, а вщповщно ! кисню. Тобто вони дифундують дал! всередину мембрани ) на швидисть ферментативно! реакци вже починають впливати дифуз!йн! процеси, що приводить до незначного розширення диапазону.

Значну увагу в подальипй робот! було сконцентрованэ на використанш рЬних додаткових мембран, як! напосяться поверх ферментно! мембрани для змпш Г! дифузнншх властивостей. В цьому випадку створюеться дпфузиишй бар'ер для проникненпя в мембрану молекул глюкози, в той час як розчинений кисень мае змогу вшьно проходити всередину мембрани. В якосп таких

,„ . додаткових мембран використову-

Рис. 10. Капюрувалыи крив: коидуктометричного __' , , „

глюкозного бюсснсору в кшелпшому юл" БСА та ДВЕ (рис.10). Видно, режим/ вим:рюваш, для ГОД-мембрашг (5), шо використання додатково! БСЛ-ГОД+катаяаза-мембраип (3) та р'пилх мембрани (крива 1) не присолить додаткових мембран: БСА (1), 5% ПВБ (2) д0 зСшьшення диапазону роботи

та 29е ПВБ (■}). Внмфювапня проводились в ___ . „ „..«,.,.„,„

5 мМ калШ-фосфагпом\' буфф, рИ 7.4. сенС0Ра' а ТИЬКН 3иаЧНО ЗМСНШуС

величину вшгуку та збшьшуе час

вщгуку (до 10 хв ! вище). Використання же 2 % ПВБ-мембрани дозволяе розширити дииамшний Д1апазон роботи датчика до 9 - 10 мМ з незначним зменшенням чутливосп. При В!!Користа!ш! бьтьш щйыю! 5 % ПВБ-мембран» динам!ч!тй диапазон робот сенсора ще трохи розширюеться, але чуглнв!сгь сенсору падае. Для сенсора з додатковою 10 % ПВБ-мембраною вщгуюв на додавання глюкози не спостер|галось.

В таблиц! 1 приведен! значения уявних кшетичних параметр!В ферментативно! реакш! для ¡ммобшзовано! глюкозооксидази. Видно, що для розширення динамичного д!апазону робота коидуктометричного глюкозного б!осенсора без попршення його чутливосп найбшьш ефективно використання додатково!' 2 % ПВБ-мембрани.

Таблица Уявн! кинетичн! паршетри ферментативно!реакцИдля ШмобШзовано!р!зними засовами гяюкозооксидази.

Тип мембрани год ГОД+каталаза Дод. 2% ПВБ Дод. 5% ПВБ Дод. БСА

Кц(уяв), мМ 1.57 3.1 4.2 5.4 1.4

Вщгук, мкСМ/хв 20.5 16.4 21.3 11.3 5.0

5 10

[глйкоээ]. ыМ

На рис.11 показан! камбро-вочш крив! в стационарному режим! вим1рювань для глюкозного кондуктометричного б1осенсора з додатковими NAFION-мeмбpaнaми р!зно! товщини. Видно, що збшьшення товшини ЫАИОМ-мембрани приводить до збшьшення динамичного диапазону роботи датчика до 10 мМ за рахунок дифузшного лгмпувашш та до значного збшьшення величини Рис. 11. Кал1брувальн! крив! кондуктометричного вшгуку. Збшьшення величини глюкозного б!осенсору в стац!онарному вЦцуку мае мюце ¡з-за того, що при режим! вимфювань з додатковими використанн! Ы/ШСЖ-мембрани, №РЮ№мембранами р!зно> товшини: ,.„ „„„,?„„„„„..„„. „:„ „„„™.л„„,„ ; - без МАРЮЫ-мембрат, 2 - 1 шар, 3 - ми позбавляемосъ вщ додаткового

2 шара, 4 - 3 шара, 5 - 4 шара ЫАРЮЫ- каналу полеплено! дифузи протонш пал/меру. Вимфювання проводились в ¡з мембрани за рахунок, так 40 мМкалШ-фосфатному буфер!, рН 7.4. званого, ассоадйованого з частниками буферу транспорту протон!в, вщповщно збшьшуеться провщшсть в мембран!.

Б10Л0Пчн|' рщини мають досить велику буферну емшсть, тому важливим параметром глюкозного бюсенсора е запежшсть в!дгуку сенсора вщ буферно! смност! розчину. Як можна бачити з рис.12 величина вщгуку сенсора значно зменшуеться 31 збшьшенням буферно! емносп (крива 1) (в 10 разш при ЗМ1Н1 концентрацЦ буферу вщ 1 мМ до 10 мМ). Подальше збшьшення концентраца буферу до 40 мМ вже незначно впливае на величину вщгуку глюкозного кондуктометричного б!осенсора. Залежшстъ величини В1дгуку вщ буферно» емносл можна поясшгги тим, що в мембран! разом 31 звичайною дифуз1ею протошв ¡з мембрани !з-за градиенту 1х концентраца присутня ! полегшена дифузш, коли прогони, що генеруються в хода ферментативно! реакш!, зв'язуються частниками буферу, який легко проникае до мембрани, тобто присутш два канали днфуза протон!в ¡3 мембрани. Таким чином, чим бшьша буферна емшсть розчину, тим бшьше протонш зв'язано, 1, вщповщно, тим менша величина вщгуку.

Коли використовусться додаткова NAFION-мембрана, то глюкочиий кондуктометричний бюсеисор стае менш чутливим до 3MiHH буферно! емност! середовища (крива 2). Таке зменшення впливу буферно! емност! на вщгук сенсора може бути пояснено властивостями NAFION-ncwiMepy. Було показано, що дифузшний коеф1ц1ент всередшн NAFION-мембрани для Na+ в 100 pmiD вище чим для СГ [SoMatkin et al, 1994}. Такий ефект Рис.12. Залежи!сть величтт вщгуку кондукто- визиваеться негативно-зарядже-метричного глюкозного б!осенсора вщ ,

концентрат буферного розчнну без ними сульфатними трупами додатково! мембрани (!) та з додатковнми всередин! NAFION-мембрани, що NAFION (2) та ПВБ (3) мембранами, приводить до потенщйного бар'еру Вим1рювання проводились в калШ- дщ, дифу3ц негативно-заряджених фосфатному буфер!, pH 7А, концеюрацЫ ^ Тобто присут1сть NAFION-добавляема тлюкози -1 мм. _ ,

мембрани ефективно блокуе

ранспорт негативно-заряджених частинок: буферу через мембрану, внасл1аок чого шокуеться полегшений канал дифузГ! прототв ¡з мембрани. Таким чином [меншуеться вплнв буферно! емност! середовища.

При використанш додатково! ПВБ-мембрани (крива 3), вплив буферно! :м1юст1 середовища на величину вщгуку глюкозного кондуктометричного Посенсора стае ще меншим. Це може бути пояснено бар'срними пласт и в остями 1ВБ-шару для дифузи гщрофьтьних частинок буферу (наявшсть шрофобннх ipyn а надлишкового негативного заряду).

Було вивчено залежшсть шдгуку кондуктометричного глюкозного 6iocencopy вд концентрацц KCl. Показано, що capiaiuH ionnoi сили зразка не вплиюе на знетику вщгуку сенсора, тобто час вщгуку бюсенсора на додаваиня глюкоз« [рактично стадий. А так як чутлиашть кондуктометричного перетворювача лшШно алежить вщ фоново! пров!дносп середовища,то можна зробити внсновок, що ¡ганова концентрация ioiriu не впливае на ферментативну кшетнку i масоперенос ipoTOHiB в мембран), але впливае на чутлишсть самого перетворювача, що [рнводить до зменшення сумарного вщгуку при збшьшеш» кокцентрацК KCl. 1рисутн!сть же додатково! NAFION-мембрани зменшуе цей вплив за рахунок ифуз1йного л!м1тування.

Таким чином, розроблено лабораторний протогип ферментного :оидуктометр1гчного бтсенсора для визначення концентраци глюкози в Kpoui з :ол|'пшеними характеристиками.

РОЗРОБКА ФЕРМЕНТНОГО КОНДУКТОМЕТРИЧНОГО БЮСЕНСОРА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ФОСФОРОРГАН1ЧНИХ ПЕСТИЦИД1В

Необхщшсть контролю за станом навколишнього середовища стае сьогодн! все бшьш гострою. Визначення токсичних речовин класичнкми методами потребуе чутливих та точних аналличних приладив, яй включають високоточну та дорогу аппаратуру. Bei вони, не дивлячись на високу чутлишеть та точншть, мають ряд недолив: це с клади! та дОвп вим1рювання, необхадншть поетапног оцшки результатов та досить складна ¡нтерпретацш даних.

Потеншометричн! та аМперОметричш методи, яй базуються на ¡нпбуванш холшестераз, е швидкими та точними, але все-таки недостатньо чутливими. Тому виршено було розробити 6iocencop на основ) кондуетометричних тонкопшвчатих електродав, хоча до цих nip тай датчий використовувались тгльки для визначення концентрацШ субстрапв, а саме глюкоз», сечовини та ¡нших.

В основ! роботи кондуктомстричних 6ioceHcopiB на основ! холшестераз лежить змша провщноетт внаслщок зм'ши концентрацп протон'ю, що генеруються в ход! ферментативно! реакци, яка катал1зуеться вщповшшм ферментом, а саме:

CHj Q бутиршосолшесгерма ^,0 Q . СН]

CHj-N+-(CH2)2-0-C-(CjH7)-^^(C3H7bC4+H0-(raz>2-N+-CH3+H+ сн}/' О о" СН3

CHj Q тпкшшис»;!» ^o Q СН3

CHJ-N+-(CH2)2-0-C-CH3 Д Q> СН3-С +HO-(CH2)Z-N -CHJ +Н+ си/ О 2 О" 4 CHj

Холшестерази мають в активному центр! залишок серину, я кий приймае участь в каталшгчному акт! ферментативно! реакци. фосфороргашчш сполуки приеднуються до гидроксильно! групи залишку серину в активному центр!, що приводить до утворення катали-ично неактивно! noxümoi.

I f

_ _ у\)К шпбуиання .OR

Ферм-Сср-ОН + HO-PN -► Ферм-Сер-О-Р^ „ + Н?0

Д 0R II OR ^

0 О

. Ревень ¡нпбування холшестераз залежить вщ концентрацп фосфороргаа1чних сполук. Таким чином, пор^вшоючи активность ферменту до та шеля дн iHriöiTOpa, можна визначати концентрацию останнього.

На рис.13 наведено кгшбру-вальш Kpimi для кондуктометрич-ного бюсенсора з ¡ммобшзовян-нйми AXE та БуХЕ в кшетичному режим! вмирювань. Можна бачити, що динам1чний диапазон робота 6ioceHcopis в обох випадках дуже

близький,

5 10 15

[Субстрат], им

"не. 13. Кал!брувальн1 крив! в юнетичному pemmi вимфювань для кощукгометртних GioccHcaplB на основi AXE (крива 1) та БуХЕ (крива 2). Вим!рювання проводились в S мМ калШ-фосфатному буферi, рН 7.4.

К,

м(уяв)

складають

13.6.мМ для ¡ммобШзовано! AXE та 10.8 мМ для ¡ммобЫзовапсц БуХЕ та добре Kope.uoroiù з величинами, отрима-ними шшими методами. Час вшгуку таких б!осенсор1в складае 2 -5 сек, що затрудняе вимфювання в юнетичному режим!, тому наступш вимфювання було вир!шено проводити в стационарному режим!, тобто аналвувалась стащонарна величина вщгуку.

Кал!брувальн! крив! для фосфороргашчних пеетишшв приведен! на рис.14.

100 ■ 80 ' 60

10"" 10"'° 10"* 10"' 10'' 10"' 10"' (лестиииди] , M

g 60 £

з 40

l0-t!,0-»10-» (û-i 10-i tO"« 10'! 10 ' 10"' [niCTuJUSL'] , M

(a)

(6)

'ne. 13. Кал!брувальн1 кривi для кондуктометричного 61осенсора на основi AXE (а) та БуХЕ (б) для визначення р!зних фосфороргаШчних пестицид/в: I - ДФФ, 2 -трнхлорфон, 3 - параоксон-етл, 4 - параоксон-метнл. Втпрюванпя проводились в 5 мМ калШ-фосфатному буферi, рН 7,4, час ¡нкубацп в розчинах пестнццщв -10 хв.

Аналггичш характеристики таких 6ioceHcopiB зведеш в табл. 2.

ю

Таблиц« 2. Характеристики кондуктометричних 6ioceHCopiB для визначення песгишшв.

АХЕ-мембрана БуХЕ-мембрана

Пестициди Мш1мальна Динам1чний М1шмальна Дннамршнй

концентрашя диапазон концентрацш дтпазон

мкг/л M M мкг/л M M

ДФФ 0.009 510-" 510-11 _ю-7 0.009 510-И 5-10-И -10-8

Параоксон-етил 2.8 10-8 10-8 . ю-4 275 ю-« Ю-« . ю-4

Параоксон-метил 123 5-10-7 510-7-10-4 1237 510-6 5-10-6- ю-З

Трихлорфон 128 510-7 510-7- ю-5 1287 510-6 5-Ю-6 - 10-4

1нпбування ¡ммобшзованих холшестераз фосфороргашчними пестицидами досить сильне та необратиме, тому при звичайних умовах вщмивки фермент не вщновлюе свою актившсть на протяз! довгого часу, що передбачае одноразове використання датчика. Наприклад, ДФФ в ход! реакци приеднуеться до пдроксильно'1 групи залишку серина в активному центр!. Ковалентний зв'язок, що утворюеться, не порушуеться в водних розчинах, однак, може бути порушений бшьш нуклеофшьними реагентами, такими, наприклад, як оксими. В данжй робот! в експериментах використовувався тридин-2-альдоксим метйодид (ПАМ), який пщ час реакци порушуе каталптично неактивний комплекс дизопропилфторфосфатного еф!ру та вщновлюе активний центр фермента:

На рис.14 представлено велйчини вщгуюв сенсора за вщсутносп та в присутносп пестициду, а також до та теля реактиваци Ю-4 M ПАМ (вщгук, отриманий за вщсутносп ¡нпбггора, приймаеться за 100 %). Можна бачити, що в випадку великого ступени шпбування AXE величина вщгуку вщновлюеться реактиватором не повшетю. Це може бути пов'язано з дифузШними проблемами (коли оксими всередиш мембрани терплять змши пщ шею фосфороргашчних

-го

20

40 час, xb

60 80 100

14. 1нпбування AXE, ¡ммобишовано! в мембрану 10"8 M ДФФ з часом 1нкубацш 10 хв (а) та 80 хв (б) та ïï реактиваШя. 1 -шпбування, 2 - вщмивка в S мМ калШ-фосфатному буфер!, рН 7.4, 3 - в!дмивка реактиватором ПАМ.

у водних розчинах та показано

компонент 1 створюються трудновд з IX виходом з мембрани) чи з присутностю на холшестера:» двох р1зних по спорщненост! сайт1В зв'язування пестицидш.

Питания реактиваци

¡ммобш13овано1 холшестерази, що ¡нактивуеться необратимими

¡нпбкорами, е дуже важливим, тому що реактивац1я дозволяе багатократно внкористовувати б!осенсор для визначення концентрацШ фосфорорганЫних пестицид!в.

Таким чином, розроблено лабораторний макет ковдуктомет-ричного ферментного б!осенсора для визначення фосфороргашчних можливють вщновлення активност!

ммобийзованого ферменту теля ди на нього iHri6iTOpie.

ис.

РОЗРОБКА КОНДУКТОМЕТРИЧНОГО КЛ1ТШ1НОГО БЮСЕНСОРА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЕТАНОЛУ

Питания визначення концентраций етанолу е дуже важливим в токсикологи, ipn KOiiTpojii бютехнолопчних npoueciB та в харчовш промисловосп. На ьогодшшшй день ¡снуе ряд ферментних та неферментних ceHCopiB для визначення танолу. Переваги клтшних 6iocencopiB у nopimumni з ферментними електродами Л1дуюч1: 1) менша чупншсть до шпбування; 2) бшьша толерантность до змш рН та емператури; 3) бшьший час жнггя cencopie; 4) низька варпсть. Проте вже юзробленим клтншнм сенсорам на ochobi рН-чутливих польових транзистор(в Korpan et al, 1993) притаманш деяк! вади - низька стабшьн1сть робочих елемеитш елемент одноразового застосування) за функцшнування та збер1гання. Для ир1шения uiel проблеми було проведено пошук MiKpoopraiiiaMiB серед штам1в [икого типу роду Candida, яи злати! до росту на середовиип з етанолом та арактеризуються високим р!внем закислення у вщповщь на додавання С2Н5ОН. $становлено, що клггини Candida boidinii 706 володноть необхадними ластивостями i можуть бути застосоваш для конструювання клтшних liKpocencopiB для аналИу концентрацн етанолу.

В основ! роботи клтшного кондуктометричного бюсенсора лежитъ еестраш'я зм1ни пров!дност1 у мембран! з альпнату калышо за рахунок пронесу екрецп кислих метабол!т!в клптшами метилотрофних др1ждж!в C.boidinii 706 при одаванн! спирту у реакц!йне середовище.

ИАВ ИАОНШ) NAD КАБН(Н+)

СоАБН

С2Н5ОН

-»■ СН3СНО-

АСН(-шп II)

АЛШ

-»• СН3СООН ■

♦ СНзСОвСоА

СН3СОО" + Н+

Коли етанол добавляють в буферний розчин, його молекули проникають через клггинну мембрану 1 окислюються в два етапи. По-перше, алкогольдегшрогеназа (тип II) каталсзуе формування ацетальдепду при окисленш етанолу, а поим ацетальдегш дегщрогеназа катал ¡зуе перетворення ацетальдепду в оцгову кислоту. В1домо, що клтши метилотрофних др'гждаав Н.Ро1ушогрЬа та Р.рип», вирощеш на середовшщ з етанолом, не здатш закислювати середовшце шкубацп у присушос-п С2Н5ОН. Поява процесу ефективного викиду протонов у клтши дикого типу роду СаасМа може бути пояснена, перш за все, виникненням спонтанно! мутацй', яка призводить до пошкодження процесу окисления етанолу на стада утворення оцтово! кислоти 1 зачшае актившсть ацетил-ЗСо-синтетази (схема).

Час вадгуку кондуктометрич-ного кл1Тинного сенсора був 3 -5 хв. Кашбрувальна крива для нього представлена на рис.15. Вим1рювання проводились в кшетичному режим! вшмрювань в дистильовашй вода (крива I) та 2 мМ/рН шдамисс-буфер!, рН 7.0 (крива 2) з концентрацию клтш в мембран! 20 мг/мл. Залежшсть була лжШною в д1апазон1 концентрацШ етанолу вщ 5 ' до 100 мМ

„ ,г в- , (у логарифм1чному масштаб!).

Рис. 15. Кал1брувш.на крива в к!нетичному г,. .

режим! вишрювань для кондукгометричиото Мшшальна концешрашя етанолу, м!кроного сенсора на етанол. Вим!рювання ни> визначаеться, - 0.5 мМ. проводились в дистильованШ водI (1) та При збшьшенн! буферно!

2 мМ/рН полшжс-буфери рН 7.0 (2); емносп розчину наблюдалося

кониентрашя Ытин в мембран! - 20 мг/мл; нтення величини

кониентрашя СаСИ - 10 мМ. значив зменшення величини

. сигналу. Це мае м1сце внаслщок полегшено! дифузц протошв 1з мембрани, тому що протони дифундують ¡3 мембрани не тшыа! як вЬн>н1 йони, але й год впливом взаемодц з частниками буферу, що приводить до залежност) вщ буферно! емноси.

Для вивчення залежносп величини вццуку кондуктоме1ричного кл1тинного б1осенсора в'щ рН використовували складну буферну систему, яка характеризуеться стабильною буферною емшспо у даапазош рН 4.0 - 9.0. Огримано, що зм1на рН середовища не впливае на величину вщгука сенсора. Це може бути пов'язано з впливом властивостей гелю-нос1я на процеси переносу протошв в мембран!.

1 ю

[Етанол!. »М

100.

<\лгшат - це пол1мер, який мостить в co6i хоногенш карбоксилы« групп, яю можуть зв'язувати прогони, i таким чином впливати на ix дифузио.

ОперацШна стабшыйсть розробленного клшшного кондуктометричного генсора була значно бшьшою за попередш розробки i складала 5 годин (15 повторних визначень ¡з штервалом 30 хв), а стандартне вщхилення величин сигналу эюсенсора у даному випадку не перевищувало 10 %. Було також протестовано :таб!лмпсть вщгуку кондуктометричного бюсенсора за збер1гання. Коли оюмембрана сенсора функщонувала щоденно протягом 2-х годин та зберйилась у 20 мМ водному розчиш CaCl2 за температур» 20-25 °С, сигнал був стабшьним протягом 3-х дшв. Праге, при збер!ганш робочих елементхв сенсоров при 4 °С -кондуктометричний сигнал був стабшыпш протягом 12 джв.

Результати визначення

концентраци етанолу у реальних рщинах (пиво (1), горшка (2), коньяк (3) та харчовий спирт (4)), отркман! за допомогою кондуктометричного сенсора на ochobi клгош C.boidinii 706 та методу газо-рщинно! хроматограф!? представлено на рис.15. Bei BUMipn проводилися у дистильованш водь Коефипснти розведення зразыв складають 250 разт для горшки та коньяку, 500 pa3iB для спирту та 25 раз)в для пива. Встановлено хороший pineifb кореляци даних, отриманих за допомогою юитинного бюсенсора, з результатами, визначеними референтним методом.

Коефщшцт кореляци складае 0,9988.

Таыщ чином, розроблено кондуктометричний клггинний бюсенсор для зизначення кондентрац11 етанолу в деяких алкоголышх напоях на ocnoßi штактних üiiTHH метнлотрофних яр1ждж1в Candida boidinii 706.

О 20 40 60 80 100 [Етамол), % оо - Хроматограф

J5. Результата визначення концентраци етанолу в реальних piaimax: I - пиво, 2 -горшка та л:кери, 3 - л'оньяки, 4 - харчовий спирт. Вмпрювання проводились в дистилвован1(1 вод).

ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Кондуктометричний метод вим!рювань може бути використаний для реестраци перебегу ферментативных npouecie. Bin е ушверсальним, забезпечуе бшьшу точн1сть та меншу трудосмшсть nopiewuio з загальновщомими методами бюх!м1чного анал'пу. Використаиня при виготовлеш перетворювач!в недорого! тонкошнвчато! стандартно! технологи разом з оптимизованою методикою (ммобш.заци бюлолчного матер!алу на !х поверхню дозволяе значно зменшити як соб1варпсть таких пристрой, так i вартють анал!зу в циюму.

В po6ori експериментально пщтверджена можлив^сть вивчення за допомогою кондуктометричних тонкошнвчатих перетворювач!в взаемоди ферментш з • субстратами та шпбггорами за pi3HHX умов та створено на ц!й основ! лабораторш прототнпи б)осенсор!в для визначення концентрашй сечовини, глюкози, етанолу та фосфороргашчних пестишшв.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що при робот! на високих частотах змшного струму електрох1м1Чний ¡мпеданс системи тонкошивчатий перетворювач в розчин! визначаеться головним чином об'емними властивостями контактуючих фаз, що дае можлив1сть знехтувати поверхневими ефектами на електродах та !х деградашею при 36epiraHiii та дозволяе використовувати кондуктометричш перетворювач! для створення ферменты их 6ioceHCopie.

2. Розроблено лабораторний прототип уреазного кондуктометричного 6iocencopa з лшШним динаммннм дтпазоном роботи 0.1 - 5 мМ сечовини, який викорисгано для визначення складу сечовини в Kpo&i.

3. Створено макет ферментного кондуктометричного б!осенсора для визначення концентрац!! глюкози в Kpoei з полшшеннми анал!тичними характеристиками. Показано, що використання додаткових мембран з ПВБ та NAFION дозволяе розширити динамйший Д1апазон роботи датчику до 10 мМ глюкози без попршення чутливост1 сенсора та значно зменшити вплив на величину вщгуху б!осенсора факторов середовиша (рН, буферна емшсть, юнна сила).

4. Розроблено лабораторний прототип кондуктометричного ферментного 6ioceHcopa для визначення фосфороргашчних пестицид! в у водних розчинах. з високою чутливостю, яка склала 510-" М для дпзопропшфторфосфату, 10"8 М для параоксон-ет!лу, 5-10-7 м длЯ параоксон-метшу та 5-10-' М для трихлорфону i показано можливхсгь вщновлення активноей ферменту в мембраш, використовуючи реакпватор т'рщин-2-альдоксим метйодид.

5. Розроблено лабораторну модель кондуктометричного клпшшого 6iocencopa для визначення концентраци етанолу на основ! ¡нтактних клтш метилотрофних дрЬкдаав Candida boidinii 706 з динам1чшш дшпазоном роботи у межах 5 - 100 мМ етанолу та показано, що сконструйований сенсор може усщшно застосовуватись для визначення концентрацн етилового спирту у деяких алкоголышх напоях - mmi, ropumi, коньяку та харчовому спирт!.

Список основних po6iT, опублшованих за темою дисертацм

1. A.A.Shul'ga, S.V.Dzyadevich, A.P.Soldatkin, S.V.Patskovsky, V.J.Strikha. Conductometric biosensors for glucose and urea based on microfabricated thin-film interdigitated array-electrodes // Diologi ItaUani.- 1993,- V. 23, N 6,- P. 40-45.

2. А.А.Шульга, С.В.Дзядевич, А.П.Солдаткин, С.В.Пацковский, Н.Ф.Стародуб, В.И.Страха, А.В.Ельская. Тонкопленочный кондуктометрический энзимобиосенсор для определения глюкозы и мочевины в крови // Электрохимия- 1993.- Т. XXIX, № 8,- Стр. 998-1002.

3. С.В. Дзядевич, Я.И.Корпан, А.П.Солдаткин, АЛ.Шульга, В.И.Стриха, А.В.Ельская. Использование кондукгоыетраческих микросенсоров для определения кинетических параметров ферментов Ц Укр, биохимический журнал.- 1993.- Т. 65, № 5,- Стр. 47-54.

4. Y.l.Korpan, S.V.Dzyadevich, V.P.Zharova, A.V.El'skaya. Conductometric biosensor for ethanol detection based on whole yeast cells // Ukrainian Biochemical Journal.- 1994,- V. 66, № 1,- P. 82-86.

5. A.P.Soldatkin, A.V.El'skaya, AA.Shul'ga, A.S.Jdanova, S.V.Dzyadevich, NJaffrezic-Renault, C.Martelet, P.CIechet. Glucose sensitive conductometric biosensor with additional NAFION membrane: reduction of influence of buffer capacity on the sensor response and extension of its dynamic range // Anal. Chim. Acta.- 1994.- 288,-P. 197-203.

6. A.A.Shul'ga, S.V.Dzyadevich, A.P.Soldatkin, S.V.Patskovsky, V.J.Strikha &

A,V.El'skaya. Thin-film Conductometric Biosensor for Glucose and Urea Determination // Biosensors & Bioeiectronics.- 1994,- V. 9.- P. 217-223

7. С.В.Дзядевич, А.А.Шульга, С.В.Пацковский, В.Н.Архипова, А.П.Солдаткин,

B.И.Стриха. Тонкопленочный кондуктометрический датчик для ферментных биосенсоров // Электрохимия,- 1994,- Т. XXX, № 8.- С.982-987.

8. С.В.Дзядевич, А.П.Солдаткин, А.А.Шульга, В.И.Стриха, /ьВ.Ельская. Кондуктометрический биосенсор для определения фосфороорганических пестицидов // Журнал аналитической химии,- 1994.- Т. 49, № 8.- Стр. 874-878.

9. С.В.Дзядевич, А.П.Солдаткин, В.К.Россохатый, Н.Ф.Шрам, А.А.Шульга,

B.И.Стриха. Амперометрическнй ферментный биосенсор с мембраной глюкозооксидаза-полианшшн Ц Укр. биохимический журнал.- 1994.- Т. 66, № 3.-

C. 54-60.

10. С.В.Дзядевич, О.П. Солдаткин. Кондуктометричиий метод виинрювань в ферментному аиалЬ! // Укр. (Яох1м1чню1 журнал - 1994,- Т. 66, № 4,- С. 30-42.

LI. A.M.Nyamsi Hendji, N.Jaflrezic-Renault, C.Martelet, A.A.Shul'ga, S.V.Dzyadevich, A.P.Soldatkin, A.V.El'skaya. Enzyme biosensor based on micromachined interdigitated conductometric transducer: application to the detection of urea, glucose, acetyl and butyrylcholine chlorides // Sensors and Actuators.- 1994,- В 21.- P. 123-129.

12. S.V.Dzyadevich, GAZhylyak, Y.I.Koipan, A.P.Soldatkin, A.V.El'skaya. Application of conductometric biosensor for studying urease inactivation by heavy metal ions // Technical Digest of the Fifth International Meeting on Chemical Sensors, Rome, 1994, July 11-14,- Roma: "Fratelli Palombi srl".- 1994,- P.189-192.

Dzyadevich S.V. Elaboration of enzyme and cell conductometric biosensors for determining of concentrations of some substrates and inhibitors of enzymes.

Thesis for a degree of Doctor of Phylosophy (PhD) in Biology, Special Option -Biotechnology, A.V.PaIIadin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1995.

The thesis contains the results on elaboration of laboratory prototypes of highly-selective enzyme and cell conductometric biosensors for determining of concentrations of urea, glucose, ethanol and organophosphorus pesticides. Physical and chemical processes into electrochemical conductometric cell as well as influence of immobilization on properties of enzymes and dependence of value of biosensor response on parameters of sample solution are investigated. The optimization of working parameters of enzyme conductometric biosensors and ways for improvement of their analytical characteristics are determined. It is established that the formation of an additional membranes of the definite nature results in extension of the dynamic range of the sensor and substantial reduction of influence of the medium factors such as pH, buffer capacity and salt concentration in solution.

Дзядевич C.B. Разработка ферментных п клеточных кондуктометрических биосенсоров для определения концентраций некоторых субстратов и ингибиторов ферментов.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.23 - биотехнология, Институт биохимии имАВ.Палладина НАН Украины, Киев, 1995.

В диссертационной работе представлены результаты по разработке лабораторных макетов высокоселективных ферментных и клеточных кондуктометрических биосенсоров для определения концентраций мочевины, глюкозы, этанола и фосфорорганических пестицидов. Исследованы физико-химические процессы в электрохимической коцауктометрической ячейке,/влияние иммобилизации на свойства ферментов, зависимости величины сигналов биосенсора от параметров реакционной среды. Определены оптимальные условия работы ферментных кондуктометрических биосенсоров и пути улучшения их аналитических характеристик. Установлено, что использование дополнительных мембран определенной природы позволяет расширить динамический диапазон работы датчиков без ухудшения их чувствительности и значительно уменьшить влияние факторов среды (рН, буферная емкость, концентрация солей в растворе).

Ключоы слова: 6iocencop, кондуктометричний метод, ¡мпеданс, глюкоза, сечовина, фосфороргашчш пестицида, етанол.