Разработка диагностических тест-систем для инфекционной бурсальной болезни на основе иммуноферментного анализа

Оковытая, Татьяна Владимировна

Автореферат диссертации по теме "Разработка диагностических тест-систем для инфекционной бурсальной болезни на основе иммуноферментного анализа"

На правах рукописи УДК 619:616.476-022.6.616-078.33

РГ5 ОД

ОКОВЫТАЯ Татьяна Владимировна 7" ¿Др 2000

РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

03.00.06.

"Вирусология"

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Владимир - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

Научный руководитель - кандидат ветеринарных наук, старший научный

сотрудник БОРИСОВ A.B.

Научный консультант - кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник ДРЫГИН В.В.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор УЗЮМОВ В.Л. (ВНИИЗЖ, г. Владимир);

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник КУРИННОВ В.В. (ВНИИВВиМ, г.Покров)

I

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный научно-

исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва)

Защита состоится 16 мая 2000 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода России по адресу: 600900, Г.Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ Автореферат разослан 14 апреля 2000 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета - Семенова Г.М.

рУ73

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) - широко распространенное высококонтагиозное заболевание, к которому в возрасте до 22 недель восприимчивы куры всех пород. Возбудителем ИББ является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Birnaviridae роду Avibirnavirus. Инфекция, в основном, передается алиментарным путем. Вирус является лимфоцитотропным и репродуцируется в ^-лимфоцитах и макрофагах, поэтому наиболее выраженные патологические изменения происходят в фабрициевой сумке, что проводит к снижению ее главной функции - воспроизводству иммунокомпетентных клеток и, в итоге, выражается в иммунодепрессии птиц (Allan W.N. et al, 1972; Faragher J.T. et at, 1974; Hirai K.,1974). Заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать до 90%, при этом переболевшая птица приобретает повышенную восприимчивость к большинству известных инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии. В связи с этим ИББ наносит значительный экономический ущерб птицеводству.

С середины 70-х годов наличие ИББ было зарегистрировано практически во всех экономически развитых странах мира (Laser H.N., 1994). В настоящее время, в связи с широкими мероприятиями по ликвидации и специфической профилактике (Tsukamoto K.etal, 1995; Haddad Е.Е. et al, 1997), ИББ не проявляется в виде эпизо-отий. В последние годы в России вакцинация против бурсальной болезни осуществляется практически во всех крупных птицеводческих'хозяйствах.

Диагноз на ИББ устанавливается на основании вирусологических и серологических исследований, а также клинических, паталогоанатомических и эпизоотологи-ческих данных. Серологическая диагностика ИББ является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболеваний, так и для оценки эффективности специфической профилактики. Важным и актуальным вопросом для диагностики ИББ является выявление вируса в организме птиц. Кроме того большой интерес представляет определение концентрации антигена в вирусном сырье, используемом для производства живых и инактивированных вакцин против ИББ.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах основано на имуноферментном анализе (Snyder D.B. et al, 1986; Kumar A. et а/,1991; Tsukamoto K.etal, 1995). Достоинствами ИФА являются:

высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов.

Для выявления антител и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованным на планшете, далее антитела, в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом (Solano W. et al,1986 Fahey K.J. et al. 1987; Zajac J. et al, 1992). В свою очередь, для обнаружения и оценки титра антигена в биологических материалах широко применяют, так называемый, непрямой сэндвич-вариант, где исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат (Tsukamoto К. et al, 1995; Mohamed К. H. et al, 1996; Kardi V. et al,1997).

На основе ИФА разработаны и описаны различные тест-системы и выпускаются готовые коммерческие диагностические наборы с прилагаемыми инструкциями (IDEXX, KPL (США), BioChek (Голландия)). При этом все известные наборы, позволяющие проводить количественный анализ, являются импортными, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. Важно отметить, что в литературе не обнаружено публикаций, в которых дано описание подготовки используемых компонентов, выбора их концентраций, условий проведения анализа и обоснования количественных показателей реакции.

Учитывая очевидную перспективность методов ИФА, создание отечественных тест-систем для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ в сыворотках крови птиц и соответствующего антигена в биологических материалах является, безусловно, актуальным.

Цели и задачи исследований. Главной целью исследований была разработка тест-систем на основе ИФА для выявления и определения титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (непрямой вариант), а также для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах (сэндвич-вариант).

При разработке тест-системы, предназначенной для выявления и определения титров антител к вирусу ИББ, на основе непрямого варианта ИФА необходимо было решить следующие задачи: '

-отработать методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА с последующей иммобилизацией его на планшеты;

-определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компо-. нентов реакции;

-установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при титровании проб в одном разведении;

-сопоставить результаты непрямого варианта ИФА и РДП, определить показатели коррелятивной связи и оценить относительную чувствительность данных тестов;

-с помощью разработанной тест-системы провести исследования напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ.

При разработке тест-системы для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах на основе сэндвич-варианта ИФА были поставлены следующие задачи:

-определить оптимальные концентрации взаимодействующих компонентов и-условия проведения анализа;

-установить пороговые величины показателей реакции и разработать процедуры расчета титра антигена;

-сопоставить титры антигена, установленные в ИФА, РДП и титрами инфекционного вируса, определить их корреляцию и относительную чувствительность тестов;

- с помощью разработанного сэндвич-варианта провести исследования содержания антигена в органах птиц и в сырье для производства инактивированных вакцин против ИББ.

Научная новизна. Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ при тестировании сывороток в одном разведении. При этом отработаны методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА, с последующей иммобилизацией его на планшет, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан

способ опосредованного расчета титра антител при титровании проб в одном разведении.

Сопоставлены результаты непрямого варианта ИФА и РДП и установлена корреляция между титрами, полученными этими методами, а также проведена оценка относительной чувствительности этих тестов,

С помощью разработанной тест-системы проведено изучение напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ.

Впервые разработана отечественная тест-система для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах на основе сэндвич-варианта ИФА, при этом определены оптимальные концентрации взаимодействующих компонентов и условия проведения анализа, разработана процедура расчета титра антигена.

Проведено сопоставление титров антигена, установленных в ИФА с титрами, полученными в РДП и титрами инфекционного вируса, определена корреляция между показателями, полученными этими методами, и показана относительная чувствительность тестов.

Проведено определение содержания антигена в органах птиц и в вирусном сырье, используемом для производства инакгивированных вакцин против ИББ.

Практическое значение работы. Полученные результаты научных исследований легли в основу 9 нормативных документов, методик, инструкций, указаний и рекомендаций по диагностике ИББ, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ, утверждены директором института или Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России.

Тест-система, разработанная на основе непрямого варианта ИФА с субстратами ОФД и АБТС, в качестве официально зарегистрированных коммерческих диагностических наборов применяется для диагностики ИББ в различных регионах России и странах ближнего зарубежья.

Во ВНИИЗЖ диагностические наборы в период с 1997 до 2000 г. были использованы для исследования более 100 000 проб сывороток, присланных для анализа более чем из 500 птицеводческих хозяйств Российской Федерации и ближнего зарубежья. Было реализовано 1039 указанных диагностических наборов, при этом стоимость одного исследования, выполненного с помощью разработанных наборов примерно в 4 раза дешевле, чем с использованием импортных.

Тест-система на основе непрямого сэндвич-варианта И' ' при».' ^ется для оценки концентрации антигена в сырье, используемом для производств : инактиви-рованных вакцин против ИББ.

Основные положения, выносимые на защиту:

-тест-система, разработанная на основе непрямого варианта ИФА для выявления и оценки титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования: оптимальных концентраций, условий взаимодействия компонентов, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;

-результаты использования непрямого варианта ИФА для исследования материнского иммунитета у цыплят и поствакцинального иммунного ответа птиц после использования живых и инактивированной вакцин против ИББ;

-тест-система, разработанная на основе сэндвич-варианта ИФА для выявления и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах, включающая обоснование оптимальных концентраций взаимодействующих компонентов, условий проведения анализа, установление пороговых показателей реакции и процедура расчета титра антигена;

-результаты использования сэндвич-варианта для оценки концентрации антигена вируса ИББ в органах птиц и сырье для производства инактивированных вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ВНИИЗЖ в 1995-1999 годах, на Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных» (Владимир, 1995г.); на научной конференции «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию открытия вируса ящура (Владимир, 1997г.); на научной конференции «Современные аспекты ветеринарной патологии животных», посвященной 40-летию ВНИИЗЖ (Владимир, 1998г.); на научной конференции «Производство и контроль медицинских и ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ», посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ (Вольгинский, Владимирской области, 1999г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

б

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах, включая приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Список литературы включает 164 источника.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Вирус. Использовали вакцинный производственный штамм «БГ» вируса ИББ, предоставленный лабораторией болезни птиц ВНИИЗЖ, в виде лиофилизованного гомогената тканей куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы. БРЯ- эмбрионы кур в возрасте 11 суток фирмы 1.оНтапл Т1еЬггисМ (Германия).

Культивирование вируса ИББ. Вирус культивировали в 10-11суточных. БРЯ-куриных эмбрионах, после заражения на ХАО.

Получение антигена вируса ИББ. Вируссодержащим материалом является 20%-ная суспензия тканей эмбрионов.

Предварительная очистка и инактивация вируса. После двукратного замораживания вируссодержащий материал обрабатывали хлороформом (10% от объема исходной суспензии) и осветляли центрифугированием при 3000 д в течение 15 мин. Инактивацию вируса проводили аминоэтилэтиленимином (0,2% чистого вещества от объема исходной суспензии) в течение 24 часов при 27°С.

Концентрирование антигена. Антиген осаждали полиэтиленгликолем в течение 16 часов при 4°С, добавляя 7,5% сухого вещества. Полученный осадок ресус-пендировали из расчета около 1/70 от исходного объема.

Очистка антигена в градиенте плотности хлористого цезия. Концентрированный антиген очищали центрифугированием в градиенте плотности СзС1-сахароза при 70 000 д в течение 5 часов.

Оценка структурного состояния антигена. Антигенсодержащую суспензию исследовали под электронным микроскопом.

Подготовка антигенсодержащих проб для сэндвич-варианта ИФА. Ис-

1

следовали осветленный центрифугированием (3000 д, 15 мин) гомогенат тканей (25%-ная суспензия) с размером частиц не более 0,3 мм.

Реакция диффузионной преципитации (РДП). Оценку титров антител к вирусу ИББ или титров соответствующего антигена определяли согласно "Временному наставлению по применению набора для диагностики инфекционной бурсальной болезни в РДП".

Иммунные сыворотки, гомологичные вирусу ИББ. Ис ; ьзс иммунные сыворотки клинически здоровых 40-дневных цыплят после двукратьс.1 прививки . вакцинным штаммом "БР (титр сывороток в непрямом варианте ИФА от 6400 до 12800), а также иммунные сыворотки кроликов и морских свинок после гипериммунизации антигеном вируса ИББ (титр в непрямом варианте ИФА от 50000 до 100000).

Сыворотки, тестируемые в непрямом варианте ИФА. Исследовали образцы сывороток крови кур не содержащие макроскопических признаков бактериальной или грибковой контаминации.

Диагностические наборы для выявления и оценки концентрации сывороточных антител к вирусу ИББ. Использовали коммерческий диагностический набор фирмы KPL (США).

Пероксидазные конъюгаты. Использовали антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, а также антивидовой иммуно-пероксидазный конъюгат против IgG кур производства фирмы KPL (США).

Растворы и реактивы, необходимые для постановки ИФА. Для иммобилизации антигена или антител на планшеты применяли 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6-9,5. Испытуемые и контрольные сыворотки и антигены, а также конъюгаты антивидовых антител разводили в растворе 0,05 М Трис-HCI с 0,2 М NaCI, 0,1% твин-20. Для заполнения свободных мест на твердофазном сорбенте (блокировка) применяли раствор 0,05 М Трис-HCI с 0,2 М NaCI, 0,1% твин-20 с 10% сыворотки крови лошадей. Отмывку сорбента от несвязавшихся компонентов проводили раствором 0,05 М трис-HCI с 0,2 М NaCI и 0,1% твин 20 рН 7,4-7,6. В качестве субстратов пероксидазы использовали: 0,04% раствор ортофенилендиами-на (ОФД) в фосфатно-цитратном буфере рН 4,9 и 0,4% Н202 и 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту с перекисью водорода (АБТС). для остановки реакции при использовании ОФД применяли 10% раствор серной кислоты, при АБТС - 5% раствор додецилсульфата натрия.

Обработка результатов экспериментов. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Statistical Basic Statistics and Tabes.

s

Расчет величины титра инфекционного вируса (ЭИД50), установленный на куриных эмбрионах, производили по методу Кербера. Оценки титров сывороток и антигенов, установленные в ИФА или РДП, представлены в виде значений, обратных величинам разведений.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Разработка непрямого варианта ИФА

Подготовка антигена и иммобилизация его на планшеты. Предназначенный для иммобилизации на пла_ншеты антиген вируса ИББ получали из гомоге-ната тканей и жидкостей SPF-куриных эмбрионов. Антигенсодержащий препарат, обработанный инактивантом, очищенный и сконцентрированный содержал белка около 5 мг/мл.

С помощью электронной микроскопии было установлено, что суспензия состоит на 2/3 из структурно-целостных гексагональных частиц размером 55 нм, соответствующих морфологическим характеристикам вируса ИББ.

В 10-ти повторностях исследовали эффективность реакции контрольной специфической сыворотки (в разведении 1:400) с различными концентрациями иммобилизованного антигена. Установили, что концентрация антигена, соответствующая 10 мкг/мл является оптимальной для проведения реакции.

Исследовали влияние условий иммобилизации на специфическую активность антигена. Сравнивали интенсивность реакции положительной контрольной сыворотки с антигеном, иммобилизованным на планшет в течение 16 часов при температуре 4°С и двух часов - при 37°С. По результатам 6-ти опытов установили, что технологически оптимальной была экспозиция антигена в лунках в течение 16 часов при 4°С. Иммобилизованный антиген практически не изменял своих свойств в течение года.

Определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток. По величине оптической плотности (0/7) оценивали интенсивность реакции отрицательной и положительной контрольных сывороток в разведении 1:400 в зависимости от времени инкубирования (от 5 до 70 мин) при температуре 37°С. По данным 10-ти экспериментов установили, что для достижения стабильных оптических показателей реакции необходимо и достаточно, чтобы экспозиция сывороток в лунках планшета составляла 30 минут.

Выбор величины разведения сыворотки, позволяющей наиболее корректно прогнозировать оценку титра антител. В качестве хромогенных суб-

стратов использовали ОФД и АБТС. Исследовали возможность юсрзанного расчета титра антител на основе S/P показателя, установленного для единственного разведения испытуемой сыворотки:

S/P = (ОПисывороткаоп отр. 1Юнтроль)/(ОП полож. «жтраль'ОГ/отр гонтраль) (1)

Последовательными разведениями устанавливали титр (Т) испытуемых образцов сывороток. Для 80-ти образцов имеющих разную активность определяли корреляцию между оценками 1дТ и IgS/P, установленными для различных разведений и производили построение соответствующих математических моделей. Было показано, что статистически наиболее надежным оказался прогноз титра на основе S/P-показателя, установленного для разведения 1:400 (рис.1).

При проведении анализа для контрольных и испытуемых сывороток в качестве рабочего приняли разведение 1:400. Для опосредованного вычисления титров в качестве моделей связи между показателями 1дТ и IgS/P были использованы соответствующие регрессионные уравнения, полученные для субстратов ОФД и АБТС.

Определение диапазона значений показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролвй. Диапазоны допустимых значений O/7-показателей отрицательного и положительного контролен являются обязательными для тест-систем ИФА. Использование контрольных показателей вне установленных границ не позволяет в итоге получать корректные результаты анализа. На различных планшетах, более чем в 50 повторностях исследовали вариации O/7-показателей, как отрицательного, так и положительного контролей в разведениях 1:400 для обоих типов субстратов. На основании выборок величин 0/7 и производили вычисления средних значений и границ 95,5%-ных соответствующих доверительных интервалов.

Допустимый диапазон оптических показателей отрицательного контроля для ОФД составил от 0,060 до 0,150, для АБТС - от 0,104 до 0,144. Допустимые значения положительного контроля для ОФД и АБТС были от 0,439 до 0,919 и от 0,518 до 0,838, соответственно.

•и

3.6

(-

-Э 3.2

2.8 2.4 2

а)

н

4 6 4.2 3.8 3 4 3 2.6 2.2 1.8

1ВТ = 3.9765 + 2.0087 • ^/Р) Корреляция: г = 0.97; р=12.4б

ж* У

оо

о оодхГоо

У 3 о

/о

1 -0.8 -0.6 , -0.4 -0.2 0 0

1в(5/Р)

1ВТ = 3.8546 + 1.7136 * В(5/Р)

Корреляция: г = 0.95; Р =9.06

/

о а

юда Г

эо

------- V О 1

У

О

-1.6 -1.4 -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 ДО/Р)

[^ижюп 95% сопПа.

1^ге55ЮП 95% сопПс!.

б)

Рис.1 Распределения значений 1д(Т) соответственно показателям 1д(8/Р) для субстрата ОФД (а) и АБТС (б). Указаны коэффициенты корреляции (г), регрессионные уравнения 1дТ=А+В*1д(8/Р) и Я-показатели, характеризующие адекватность модели.

Определение значений Б/Р-поназателсй, используемых • для разграничения неспецифической, сомнительной и специфической реакций.

Одним из наиболее важных аспектов при разработке непрямого варианта ИФА и интерпретации его результатов являлось обоснование пороговых показателей, разграничивающих неспецифическую (отрицательную), сомнительную и специфиче-

скую (положительную) реакции. В настоящих исследованиях оп[ лял.; этические показатели более 50 образцов сывороток, свободных от антик-к виру./ ИББ, но имеющих уровень неспецифической реакции, превышающий отрицательный контроль.

Задачей исследований было установление максимального значения S/P для неспецифически реагирующих сывороток и нахождение минимальной оценки для специфически реагирующих сывороток. В качестве пороговой величины для отрицательной реакции приняли S/P показатель, который соответствовал верхней границе 95,5%-ного доверительного интервала исследованной выборки значений ОП Для ОФД данный показатель составил 0,13, для АБТС 0,14. Пороговой величиной, соответствующей минимальной ожидаемой положительной реакции считали значение S/P, установленное для верхней границы 97,7%-ного доверительного интервала указанной выборки. Для ОФД эта величина составляла 0,17, для АБТС 0,18. Промежуточные величины соответствовали зоне "сомнительных" результатов.

Определение ожидаемого диапазона вариации показателей титров. Для корректной интерпретации результатов анализа, на основе эмпирических дисперсий оценок IgT, установленных для сывороток, имеющих различную активность, были определены ожидаемые диапазоны вариации показателей титров. Соответственно группам сывороток, в каждой из которых было не 'менее 20-ти образцов, в 5-ти повторностях исследовали вариации значений IgT. Определяли средний коэффициент вариации (KV, %). Для ОФД коэффициенты вариации составили: 2,22; 1,75 и 1,00. Для АБТС: 2,15; 1,55 и 0,60.

Приняли, что с достаточной точностью диапазон вариации показателя IgT может быть ограничен 95,5%-ым доверительным интервалом (JPlo.o«=2w), который вычисляли по формуле ±J-lgTxC, где C=2xKV/100, то есть ожидаемый диапазон вариации логарифмического значения титра имел вид [IgT-J + /дТ+J]. Значения коэффициентов С, установленных соответственно субстратам и уровням активности сывороток, представлены в табл.1.

Таблица 1

Значения коэффициентов С для вычисления интервала ±J= IgTxC,

соответственно субстрату и активности сывороток.

Тип субстрата Активность сыворотки |

1дТ< 3,0 3,0 < 1дТ<3,6 1дТ> 3,6 |

ОФД I 0,045 0,037 0,020

АБТС | 0,043 0,031 0,016

Сравнение оценок титров сыворотки, установленных в РДП и в предлагаемой тест-системе. Оценки титров сывороток, установленные в разработанной тест-системе сравнивали с результатами, полученными в реакции диф-' фузной преципитации, которая традиционно используется в диагностике инфекционной бурсальной болезни. Для каждого субстрата параллельно испытывали более 40 образцов сывороток. Было установлено, что сыворотки, имеющие величину Ти®д<Ю00 для ОФД и ТИФА<500 для АБТС в РДП были отрицательными. В диапазоне величин 1 йТРдп<32 коэффициент корреляции между значениями 1дТИФА и IдТрдп составил 0,97 (р< 0,05) для ОФД и 0,98 (р2 0,05) для АБТС. Однако, при этом чувствительность ИФА превосходила РДП более чем в 700 раз при использовании ОФД и более чем в 500 раз при использовании АБТС. На этом основании сделали вывод, что непрямой вариант ИФА является более предпочтительным при диагностике ИББ, особенно для исследования сывороток с низкими титрами антител.

Разработка способа перерасчета оценок титра, установленных с помощью предлагаемой тест-системы и коммерческого набора фирмы КР1..

В настоящее время для оценки титров сывороточных антител против вируса ИББ существуют разные коммерческие диагностические наборы. Однако, взаимная интерпретация результатов, полученных средствами различных наборов, затруднительна. Исследовали возможность взаимного перерасчета показателей титров, параллельно установленных в предлагаемой тест-системе и коммерческом наборе фирмы КР1.. Для каждого субстрата было исследовано по 57 образцов сывороток, для которых определяли показатели Б/Р. Между соответствующими парами показателей исследовали наличие связи. Было установлено, что коэффициенты корреляции превышали величину 0,9, а соответствующие модели связи имели вид: 1д(5/Р)кР1-0,125^0,763х!д(3/Р)аа,:, и 1д(3/Р)кп=0,168Ю,572х1д(8/Р)А5гс-

Используя принцип расчета титра по инструкции КР1_ {1дТ=3,614+1,172х1д(Б/Р)) были выведены формулы (3 и 4), позволяющие по экспериментальным значениям Т0Фд и ТАвтс определить теоретическую оценку Т*«..

1д Т^ = 1,991+0,445 х1дТ0Фд (3)

1д Тт. = 2,303 + 0,391 х1дТАБТС (4)

Подобные перерасчеты необходимы в случаях, когда Мониторинг птицепого-ловья осуществлялся с использованием различных диагностических наборов и возникает необходимость сравнения значений титров.

2.2.2. Практическое использование разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА

Исследование титров материнских антител, соответственно возрасту цыплят. Тестировали сыворотки крови цыплят в возрасте от,1 до 20 дней, полученных от кур яичных и мясных пород, вакцинированных против ИББ. Для каждой породы, с интервалом в 1 день в 3-6 образцах сывороток определяли значения титров антител и устанавливали их связь с возрастом птиц. Определяли коэффициенты корреляции и строили модели регрессии пассивно приобретенного гуморального иммунитета (рис. 2 и 3).

3.6 3.2 2.8 2.4 2 1.6

Л

о № о < 1 ° < о ,

0 ь.

О ( п 1 о '

о о < О4* N

1 о ° 1

Кезгеиюп 95% сопПс!.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Д

Рис.2 Соотношение возраста в днях (Д) и величины титра (1дТ) сывороточных антител у цыплят мясной породы. Коэффициент корреляции г=0,928. Регрессионная модель вида 1дТ = 3,854 - 0,094 ж Д.

4 3.8 3.6

3.4 « 12

3 2.8 2.6 2.4

■к

о . о ' У

и : °,

N

№ N ч.

о ( ° о N

•Г

8 10 12 14 16 18 20

Д

Кевгезэюп 95% сопЛа.

Рис.3 Соотношение возраста в днях (Д) и величины титра (1дТ) сывороточных антител у цыплят яичной породы. Коэффициент корреляции г=0,954. Регрессионная модель вида 1дТ = 3,961 - 0,065 хД.

Было установлено, что средствами данных моделей возможен достаточно надежный прогноз величины титра сывороточных антител у цыплят, соответственно их возрасту. Определены показатели Пю - ожидаемого периода полураспада титров антител (П1/2=1д2/к, где к- регрессионный коэффициент), которые составили для яичной породы 1д2/0,65=4,6 (дня), для мясной породы 1д2/0,94=3,2 (дня).

На основании показателя Пш и величины допустимого титра материнских антител у молодняка (Тйют) была предложена формула (5) для расчета оптимального возраста цыплят для вакцинации:

Д=До + 3,322 х (1дТ0 - 1дТд0П.) х Пи, (5)

где: Д - возраст цыплят, когда должна быть произведена вакцинация; Д0. возраст цыплят на момент взятия крови (дни); Т0 - средний титр антител, установленный в исследованных сыворотках; Твои, и П,/2 - определены ранее.

Изучение динамики роста титра антител в начальные сроки после иммунизации живой вакциной. Цыплят кросса "Родонит" в возрасте 22 дней, не имеющих антител к вирусу ИББ, прививали живой вакциной (штамм "БГ" в дозе 1000 ЭИД/5о). В период от 4 до 20 дней после вакцинации с интервалом в 2 дня в группах

от 10 до 12 голов определяли средние величины титров сывороточных антител. Соответствующие результаты представлены на рис. 4. 4

3.8 3.6 3.4 3.2 & 3 2.8 2.6 2.4 2.2

10

12

14

16

20

22

Д

Рис.4. Распределение среднегрупповых величин титров (1дТ) сывороточных антител у цыплят соответственно дням (Д) после вакцинации живой вакциной.

Было установлено, что иммунный ответ у птиц мог быть зарегистрирован, начиная с 6-го дня после вакцинации, и соответствовал величине /д7"=2,556 (7=360).

, Далее до 12-го дня прирост средней концентрации антител был наиболее интенсивным и достиг величины 1д7=3,685 (7=4839), после чего наблюдали тенденцию к стабилизации средних значений титров. На 18-й день средняя оценка титра составила 1д 7=3,796 ( 7=6252). При этом уменьшалась вариация индивидуальных иммунных ответов. Величина коэффициента вариации убывала от 37% для шестого дня до 10% в среднем для периода с 12-го по 20-й день.

Анализ распределения значений титров, в зависимости от времени после вакцинации предоставлял возможность обоснованного определения периода, когда иммунный ответ птицы в среднем достигнет величины, гарантирующей защищенность вакцинированного поголовья.

Изучение динамики роста и сохранение титров антител у птиц после иммунизации инактивированной вакциной. Цыплят 30-дневного возраста, не содержащих антител к вирусу ИББ, в количестве 30 голов однократно иммунизировали инактивированной эмульсионной вакциной против ИББ. В продолжении 12 ме-

сяцев после вакцинации, начиная с 7-го дня и далее в различные периоды определяли средние титры антител. Результаты исследований представлены на рис.5.

Рис.5 Распределение средних показателей титров сывороточных антител у птиц (1дТ), соответственно времени (месяцы, М) после иммунизации инактивированной вакциной.

Было отмечено, что характер иммунного ответа птиц на инактивированную и живую вакцину различался. Значения титров и динамика их роста для инактивиро-ванного препарата были выше. На 7-й день после вакцинации средняя оценка титра составила 1д7=3,635 (7=4315) Далее происходил быстрый рост концентрации антител, который на 20-ый день наблюдений соответствовал среднему показателю 1д7=4,115 (7=13032). Затем значения титров на определенное время были стабильными и, примерно, с 60-го дня начинали постепенно снижаться. Дальнейшее уменьшение напряженности иммунитета было менее интенсивным и в 12 месяцев его показатель составил 1д7=3,98 (7=9550). В практическом аспекте наиболее важное значение имели титры, установленные в период активной яйценоскости птиц, поскольку позволяли судить о возможном уровне антител у потомства при их трансовариаль-ной передаче.

2.2.3. Разработка сэндвич-варианта ИФА.

Установление оптимальной концентрации конъюгата. При выборе рабочей концентрации конъюгата использовали принцип минимизации уровня неспецифической реакции. В непрямом варианте ИФА в 6-ти повторностях производили

взаимную раститровку сывороток морской свинки (нормальной и специфической) в диапазоне от 1:100 до 1:12800 и конъюгата.в диапазоне от 1:750 до 1:24000. Критерием выбора считали наименьшее разведение конъюгата, при котором неспецифическая реакция его с нормальной сывороткой морской свинки практически отсутствовала. Было установлено, что эта концентрация соответствовала разведению конъюгата 1:3000.

Определение оптимального соотношения концентраций улавливающих и детекторных антител. Использовали сэндвич-вариант ИФА, где при постоянной дозе отрицательного и положительного антигенов в 4-х повторностях производили взаимную раститровку сыворотки кролика (улавливающие антитела) в диапазоне от 1:100 до 1:10000 и сыворотки морской свинки (детекторные антитела) в диапазоне от 1:500 до 1:10000. Критерием оптимального соотношения концентраций считали наибольшую величину P/N, где Р и N - показатели оптической плотности положительного и отрицательного антигена. Наибольшее значение среднего показателя P/N=25,61 соответствовало разведениям сыворотки морской свинки 1:2000 и сыворотки кролика 1:3000. Данное соотношение разведений считали оптимальным и использовали его во всех дальнейших исследованиях.

Оптимизация условий иммобилизации улавливающих антител. Исследовали влияние температуры и времени на сорбцию улавливающих антител в лунках планшета. Испытывали различные режимы иммобилизации сыворотки кролика (1:2000). Определяли активность реакции иммобилизованных антител с различными концентрациями (серийными разведениями) отрицательного и положительного антигенов. Оценкой активности реакции служил средний P/JV-показатель, установленный в 4-х повторностях. Технологически оптимальными были условия иммобилизации улавливающих антител на планшеты в течение 16 часов при 4°С.

Определение оптимального времени экспозиции исследуемого антигена и детекторной сыворотки. Определяли время, необходимое для образования устойчивого комплекса "улавливающие антитела - антиген", а также времени экспозиции детекторной сыворотки. Изучали интенсивность реакции иммобилизованных антител с отрицательным и положительным антигенами (1:100) в диапазоне времени экспозиции от 15 до 190 мин. при температуре 37°С. Определяли средние значения 0/7, по 4-м повторностям. Было установлено, что при 37°С стабилизация показателей специфической реакции с антигеном наступала после 60 минут. Такая

же экспозиция была необходима и достаточна для взаимодействия с детекторной сывороткой.

Титрование антигена. При разработке способа количественной оценки результатов анализа в качестве основного принципа приняли положение о пороговой величине отрицательного контроля, которая при данных условиях эксперимента могла характеризовать наибольший ожидаемый уровень неспецифической реакции. Более чем в 30-ти повторностях исследовали оптическую плотность серийных разведений гомогенатов тканей фабрициевых сумок и селезенок цыплят, а также эмбриональной ткани, не содержащих антигена вируса ИББ. Установлено, что пороговой величиной (Н) может являться верхняя граница 99,7%-го доверительного интервала отрицательного контроля (Н = ОПср. отр.к. + Зсг, где: ОПср (ХПрК. - средняя величина оптической плотности отрицательного контроля; <т - величина дисперсии). Для вычисления значения Н была предложена упрощенная процедура.

Оценкой титра считали проекцию на ось разведений точки пересечения пороговой линии с графиком титрования (рис. 6).

Рис.6 Графический способ определения титра антигена (1дТ),

где: 1дТ, - величина наибольшего разведения, при котором оптический показатель исследуемого образца (0/7() превосходит пороговое значение (0/7/ > Н); 1дТг -вели чина наименьшего разведения, при котором оптический показатель исследуемого образца (ОГ72) меньше порогового значения {ОПг<Н).

Величина титра могла быть определена непосредственно, путем построена на графике или вычислена методом линейной интерполяции между двумя ближай шими оптическими показателями по формуле (6)

IgT = IgT, + (lgT2 - IgT,) x (0П, - H) /(0П, - 0П2), (6) где использованы обозначения, указанные на рис.6. • Для практического применения вычислительный метод был более точным и удобным.

Сравнение титров антигена, установленных в РДП и в предлагаемой тест-системе. Сравнивали показатели титров антигенов, параллельно установленные, в сэндвич-варианте ИФА и РДП. Исследовали 30 антигенсодержащих образцов в 3-х_повторностях. Было определено, что антигенсодержащие образцы, имеющие титр в сэндвич-варианте менее 1200, в РДП были отрицательными. Коэффициент корреляции тест-систем составил 0,918 (р<0,01). Сэндвич-вариант обладал значительно большей разрешимостью и в среднем был в 1400 раз более чувствителен.

Сравнение величин титров вирусного антигена и инфекционного вируса. В сырье для производства вирусвакцины против ИББ (гомогенате тканей куриных эмбрионов) параллельно определяли оценки титра антигена и титра инфекционного вируса (ЭИДилимл). Установлено, что по данным 17 опытов коэффициент корреляции тест-систем составил 0,914 (р<0,01). При этом чувствительность сэндвич-варианта ИФА составляла в среднем 4,55х103 ЭИДи/ил- Полученная оценка чувствительности ИФА может иметь практическое использование, поскольку предоставляет возможность в течение 4-х часов ориентировочно определить величину титра вируса в сырье или вакцине.

2.2.4. Практическое использование разработанного сэндвич-варианта

ИФА

Определение титров антигена вируса ИББ в тканях фабрициевых сумок и селезенок цыплят, иммунизированных живой вакциной. Серонегативных цыплят яичной породы (50 голов) в возрасте 22 дней прививали сухой вирусвакци-ной против ИББ из штамма "БГ в дозе 1000 ЭИДМ. В течение 10 дней после прививки, через каждые два дня, производили контрольный убой 12 иммунизированных птиц, у которых извлекали фабрициевы сумки и селезенки. Образцы тканей органов исследовали в разработанном сэндвич-варианте ИФА и определяли величину титра антигена. Соответствующие результаты представлены на рис.7.

Рис.7 Значения титров антигена (1дТ) в ткани фабрициевых сумок (—) и селезенок (---) цыплят, иммунизированных живой вакциной, соответственно дням (Д) после прививки.

Было установлено, что антиген вакцинного штамма «БГ» вируса ИББ мог быть обнаружен в образцах исследуемых тканей, начиная со 2-го дня после иммунизации. Уровни накопления его в обоих органах существенно различались, но профили распределений показателей титров были подобны. Коэффициент корреляции значений титров в тканях обоих органов составил 0,913 {р<0,01). На 2-й день средние величины логарифмических значений титров антигена в тканях фабрициевых сумок и селезенок составили 1д1,632±0,062 и 1д1,138±0,155, соответственно. Наибольшая концентрация антигена в обоих органах была установлена на 4-й день. Максимальные средние величины титров в фабрициевых сумках и селезенках составили 1дТ=3,430±0,256 и 1дТ=1,532±0,177, соответственно. Далее, до 10-го дня наблюдений происходило плавное снижение концентрации антигена до 1.686±0.181 п фабрициевых сумках и 0.959±0.028 в селезенках.

Следует отметить, что появление сывороточных антител, установленное у вакцинированных птиц, на 6-ой день после иммунизации (см. рис.4) вероятно соответствовало "переломному" моменту инфекционного процесса в организме, поскольку активный прирост титров антител происходил в дальнейшем на фоне снижения концентрации вирусного антигена.

Оценка концентрации антигена в сырье для инактивированных вакцин. Исследовали вируссодержащие гомогенаты тканей куриных эмбрионов, используемые в качестве сырья для изготовления 8-ми серий инактивированной вакцины против ИББ. Определяли среднюю величину титра антигена в пробах сырья, полученных до и после очистки хлороформом, а также до и после этапа инактивации. Каждую пробу тестировали в 3-х повторностях и определяли средние значения титров антигена. Задачей экспериментов была оценка сохранения концентрации специфического антигена после воздействий хлороформа (1,5%) и инактиванта (0,02% аминоэтилэтиленимина при температуре 27°С в течение 24 часов). В качестве контроля на этапе инактивации использовали очищенный хлороформом образец, который содержался пр'1 тех же условиях, что и инактивируемый. Соответствующие результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Средние величины титров антигена в пробах сырья для изготовления вакцины до и после воздействий хлороформа и инактиванта.

Значение титра, соответственно образцу

№ п/п исходный после очистки хлороформом после инактивации контрольный

1 468 413 398 416

2 520 486 412 473

3 392 374 378 362

4 428 412 384 396

5 558 532 492 516

6 364 348 326 332

7 286 252 310 298

8 520 538 422 483

В результате установили, что потери при очистке хлороформом находились в диапазоне от 3,73% до 7,63%. Потери антигена при инактивации составляла от 0% до 10,61% (в контрольном образце от 0 до 6,18%).

Исследование содержания антигена в вирусном сырье для инактивированной вакцины средствами ИФА было оправданным, поскольку в данном случае в качестве сырья используют гомогенат ткани куриных эмбрионов и применение РДП было бы неэффективно. Разработанный сэндвич-вариант позволял выявлять антиген вируса ИББ и оценивать его концентрацию в сырье на различных стадиях производства вакцины.

22

3. выводы

1. Разработана процедура получения эмбрионального антигена вируса ИББ, включающая этапы очистки, инактивации и концентрирования. Установлена оптимальная концентрация антигена и определены условия иммобилизации его на планшеты для проведения непрямого варианта ИФА

2. На основе непрямого варианта ИФА с использованием хромогенных субстратов ОФД и АБТС разработана тест-система для выявления и оценки титра антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении. Определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции. Установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, предложены уравнения опосредованного вычисления титров при титровании проб в одном разведении, а также способ взаимного перерасчета их значений с тест-системой фирмы КР1_.

3. Произведено сравнение величин титров антител, параллельно установленных в непрямом варианте ИФА и РДП. Коэффициент корреляции титров для ОФД составил 0,97, для АБТС 0,98. Значения титров, установленные в ИФА превосходили аналогичные показатели в РДП более чем в 700 раз с субстратом ОФД и более .чем в 500 раз с субстратом АБТС.

4. С использованием разработанной тест-системы ИФА исследован пассивный иммунитет у цыплят, полученных от вакцинированных несушек. Изучена динамика его снижения и соответственно породам принципиально показана возможность вычисления оценки периода полураспада материнских антител, которые для яичных пород составили 4,6 дня, для мясных 3,2 дня. Предложен способ расчета оптимальных сроков вакцинации.

5. Предложенный непрямой вариант ИФА позволил изучить динамику поствакцинального иммунного ответа птиц в ранние сроки после использования живой вакцины против ИББ из штамма «БГ» и продолжительность иммунной реакции после прививки инактивированной вакциной. Иммунный ответ птиц на живую вакцину зарегистрирован с 6-го дня и после активного роста стабилизировался к 12-му дню после вакцинации. Значения титров сывороточных антител после применения

инактивированной вакцины были выше и сохранялись в течение всего периода яйценоскости.

6. На основе непрямого сэндвич-варианта ИФА разработана тест-система для выявления и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах. Определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия. Установлен пороговый показатель, разграничивающий неспецифическую и специфическую реакции, и разработан порядок расчета величины титра антигена.

7. Произведено'сравнение показателей титров антигена, установленных в ИФА, РДП и титров инфекционного вируса ИББ. Коэффициент корреляции с титрами в РДП составил 0,918, при этом их значения в сэндвич-варианте были в среднем в 1400 раз выше. Корреляция с титром ЭИДя составила 0,914. Чувствительность предложенной тест-системы была в среднем около 4500 ЭИДго/ил-

8. Разработанная тест-система позволила изучить динамику накопления антигена вируса ИББ в фабрициевых сумках и селезенках цыплят, иммунизированных сухой вирусвакциной против ИББ из штамма "БГ, а также определить концентрацию указанного антигена в сырье для инактивированной вакцины против ИББ на разных стадиях ее производства.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований явились основой следующих нормативно-технических документов (ТУ, наставлений, инструкций, методик, указаний и рекомендаций) для внедрения в практику коммерческих наборов для диагностики ИББ:

1. Методика получения антигена вируса инфекционной бурсальной болезни для иммуноферментного анализа (утверждена директором ВНИИЗЖ 28.10.99 г);

2. Методические рекомендации по определению титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур в непрямом варианте иммуноферментного анализа способом одного разведения с использованием различных хромогенных субстратов (одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ 28.10.99 г.);

3. Методические рекомендации по взаимному перерасчету показателей титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни, установленные в сыворотках

крови кур средствами различных диагностических наборов ИФА (утверждены директором ВНИИЗЖ 28.10.99 г.);

4. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса инфекционной бурсальной болезни кур иммуно-ферментным методом (утверждена директором ВНИИЗЖ 06.12.99 г.);

5. Технические условия (ТУ 9388-028-00495527-00) на кчабор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28.02.00 г.);

6. Наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28.02.00 г.);

7. Технические условия (ТУ 9388-020-00495527-00) на набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 09.03.00 г.);

8 . Временное наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении №13-7-2/1903 (утверждено департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 09.03.00 г.);

9. Методика выявления и оценки титра антигена вируса инфекционной бурсальной болезни в непрямом сэндвич-варианте ИФА (утверждена директором ВНИИЗЖ 11.04.00 г.).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мудрак Н.С., Оковытая Т.В., Щербакова Л.О., Федосеев К.Ю., Борисов A.B. Оптимизация условий постановки непрямого тврдофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни II Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции. - Владимир, 1995.- С. 245.

2. Мудрак Н.С., Федосеев К.Ю., Оковытая Т.В., Кузнецов В.Н., Борисов A.B. Сравнительная оценка ИФА и РДП в диагностике инфекционной бурсальной болез-

ни // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции. - Владимир, 1995,- С. 246.

3. Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Количественная оценка концентрации антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур по одному разведению в иммуноферментном тесте // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: Тезисы докладов конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура,- Владимир, 1997,- С. 162163.

4. Гусев С.А., Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Борисов A.B., Федосеев К.Ю.,. Ми-халишина З.Я., Гирин М.В., Гусев A.A., Дрыгин В.В. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ у цыплят, полученных от непривитых и вакцинированных кур II Современные аспекты ветеринарной патологии животных: Матерериалы конференции, посвященной. 40-летию ВНИИЗЖ.- Владимир, 1998.- С. 192-196.

5. Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я., Оковытая Т.В. Исследование различных адъювантов для инактивированной вакцины против инфекционной бур-сальной болезни II Производство и контроль медицинских ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ: Тезисы докладов конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ. - Вольгинский, 1999. - С.56.

6. Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Взаимный перерасчет показателей титра 'антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур, исследованных при использовании различных наборов ИФА II Производство и контроль медицинских ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ: Тезисы докладов конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ. - Покров, 1999. - С.84-85.

7. Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В. Определение титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур в непрямом варианте ИФА при тестировании их в одном разведении с использованием различных хромогенных субстратов // Производство и контроль медицинских ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ: Тезисы докладов конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ. - Покров, 1999. - С.85-86.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ

Тираж 80 экз. апрель 2000

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Оковытая, Татьяна Владимировна

ВЕДЕНИЕ.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведения об инфекционной бурсальной болезни.

1.2. Диагностика инфекционной бурсальной болезни.

1.3. Иммуноферментный анализ в диагностике ИББ.

1.3.1. Непрямой вариант ИФА.

1.3.2. Сэндвич-вариант.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка диагностических тест-систем для инфекционной бурсальной болезни на основе иммуноферментного анализа"

Актуальность темы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) -широко распространенное высококонтагиозное заболевание, к которому в возрасте до 22 недель восприимчив молодняк всех пород [16, 41, 82]. Возбудителем ИББ является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Birnaviridae роду Avibirnavirus [30, 100]. Инфекция, в основном, передается алиментарным путем. Вирус является лимфоцитотропным и репродуцируется в р-лимфоцитах и макрофагах [36, 68, 97, 119], поэтому наиболее выраженные патологические изменения происходят в фабрициевой сумке [41], что проводит к снижению ее главной функции -воспроизводству иммунокомпетентных клеток и, в итоге, выражается в иммунодепрессии птиц. Заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать до 90% [37, 40], при этом переболевшие птицы приобретают повышенную восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии [24, 42, 56, 123, 129, 130, 133, 160].

С середины 70-х годов наличие ИББ было зарегистрировано практически во всех экономически развитых странах мира. В настоящее время, в связи с широкими мероприятиями по ликвидации и специфической профилактики, ИББ не проявляется в виде эпизоотий [62, 152, 158]. В последние годы, в России вакцинация против инфекционной бурсальной болезни осуществляется практически во всех крупных птицеводческих хозяйствах.

Диагноз на ИББ устанавливают на основании клинических, патологоанатомических и эпизоотических данных, а также вирусологических и серологических исследований. Серологическая диагностика ИББ является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболеваний, так и оценки эффективности специфической профилактики. Важным и актуальным вопросом для диагностики ИББ является выявление вируса в организме птиц. Кроме того большой интерес представляет определение концентрации антигена в вирусном сырье, используемом для производства живых и инактивированных вакцин против ИББ.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах, основано на имуноферментном анализе (ИФА) [33, 54, 98, 101, 143, 146, 139, 155]. Достоинствами ИФА являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов.

Для выявления антител и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованным на планшете, далее антитела, в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. В свою очередь, для обнаружения и оценки титра антигена в биологических материалах широко применяют так называемый непрямой сэндвич-вариант, где исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат [14].

На основе ИФА разработаны и описаны различные тест-системы [38, 57, 86, 91, 109, 118, 140, 144, 150, 164] или выпускаются готовые коммерческие диагностические наборы с прилагаемыми инструкциями [77, 78, 79]. При этом все известные наборы, позволяющие проводить количественный анализ, являются импортными, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. Важно отметить, что в литературе не обнаружено публикаций, в которых дано описание подготовки используемых компонентов, выбора их концентраций, условий проведения анализа и обоснования количественных показателей реакции.

Учитывая очевидную перспективность методов ИФА, создание отечественных тест-систем для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ в сыворотках крови птиц и соответствующего антигена в биологических материалах является, безусловно, актуальным.

Цели и задачи исследований. Главной целью исследований была разработка тест-систем на основе ИФА для выявления и определения титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (непрямой вариант), а также для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах (сэндвич-вариант).

При разработке тест-системы, предназначенной для выявления и определения титров антител к вирусу ИББ, на основе непрямого варианта ИФА необходимо было решить следующие задачи:

-отработать методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА с последующей иммобилизацией его на планшеты;

-определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции;

-установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при титровании проб в одном разведении;

-сопоставить результаты непрямого варианта ИФА и РДП, определить показатели коррелятивной связи и оценить относительную чувствительность данных тестов;

-с помощью разработанной тест-системы провести исследования напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ.

При разработке тест-системы для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах на основе сэндвич-варианта ИФА были поставлены следующие задачи:

-определить оптимальные концентрации взаимодействующих компонентов и условия проведения анализа;

-установить пороговые величины показателей реакции и разработать процедуры расчета титра антигена;

-сопоставить титры антигена, установленные в ИФА, РДП и титрами инфекционного вируса, определить их корреляцию и относительную чувствительность тестов;

- с помощью разработанного сэндвич-варианта провести исследования содержания антигена в органах птиц и в сырье для производства инактивированных вакцин против ИББ.

Научная новизна. Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ при тестировании сывороток в одном разведении. При этом отработаны методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА, с последующей иммобилизацией его на планшет, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при титровании проб в одном разведении.

Сопоставлены результаты непрямого варианта ИФА и РДП и установлена корреляция между титрами, полученными этими методами, а также проведена оценка относительной чувствительности этих тестов.

С помощью разработанной тест-системы проведено изучение напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ.

Впервые разработана отечественная тест-система для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах на основе сэндвич-варианта ИФА, при этом определены оптимальные концентрации взаимодействующих компонентов и условия проведения анализа, разработана процедура расчета титра антигена.

Проведено сопоставление титров антигена, установленных в ИФА с титрами, полученными в РДП и титрами инфекционного вируса, определена корреляция между показателями, полученными этими методами, и показана относительная чувствительность тестов.

Проведено определение содержания антигена в органах птиц и в вирусном сырье, используемом для производства инактивированных вакцин против ИББ.

Практическое значение работы. Полученные результаты научных исследований легли в основу 9 нормативных документов, методик, инструкций, указаний и рекомендаций по диагностике ИББ, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ, утверждены директором института или Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России.

Тест-система, разработанная на основе непрямого варианта ИФА с субстратами ОФД и АБТС, в качестве официально зарегистрированных коммерческих диагностических наборов применяется для диагностики ИББ в различных регионах России и странах ближнего зарубежья.

Во ВНИИЗЖ диагностические наборы в период с 1997 до 2000 г. были использованы для исследования более 100 000 проб сывороток, присланных для анализа более чем из 500 птицеводческих хозяйств Российской Федерации и ближнего зарубежья. Было реализовано 1039 указанных диагностических наборов, при этом стоимость одного исследования, выполненного с помощью разработанных наборов примерно в 4 раза дешевле, чем с использованием импортных.

Тест- система на основе непрямого сэндвич- варианта ИФА применяется для оценки концентрации антигена в сырье, используемом для производства инактивированных вакцин против ИББ.

Основные положения, выносимые на защиту:

-тест-система, разработанная на основе непрямого варианта ИФА, для выявления и сценки титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования: оптимальных концентраций, условий взаимодействия компонентов, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;

-результаты использования непрямого варианта ИФА для исследования материнского иммунитета у цыплят и поствакцинального иммунного ответа птиц после использования живой и инактивированной вакцин против ИББ;

-тест-система, разработанная на основе сэндвич-варианта ИФА для выявления и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах, - включающая обоснование оптимальных концентраций взаимодействующих компонентов, условий проведения анализа, установление пороговых показателей реакции и процедура расчета титра антигена;

-результаты использования сэндвич-варианта для оценки концентрации антигена вируса ИББ в органах птиц и сырье для производства инактивированных вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены й обсуждены на заседаниях учёного совета ВНИИЗЖ в 1995-1999 годах, на Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных» (Владимир, 1995г.); на научной конференции «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию открытия вируса ящура (Владимир, 1997г.); на научной конференции «Современные аспекты ветеринарной патологии животных», посвященной 40-летию ВНИИЗЖ (Владимир, 1998г.); на научной конференции «Производство и контроль медицинских и ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ», посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ (Вольгинский, Владимирской области, 1999г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах, включая приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Список литературы включает 164 источника.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-2000 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г.Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность к.в.н. A.B. Борисову, к.б.н. В.В. Дрыгину, к.б.н. Н.С. Мудрак, к.б.н. Г.М. Фалиной, к.б.н. В.Н. Кузнецову, Ю.В. Кузнецову, к.б.н. С.Н. Колосову, к.б.н. В.Ю. Кулакову, д.б.н. А.П. Пономарёву, Ю.В. Зинковскому, В.Н. Ирзе, М.В. Гирину, к.б.н. М.А. Волковой, H.H. Луговской, В.Н. Овсянниковой, - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Оковытая, Татьяна Владимировна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана процедура получения эмбрионального антигена вируса ИББ, включающая этапы очистки, инактивации и концентрирования. Установлена оптимальная концентрация антигена и определены условия иммобилизации его на планшеты для проведения непрямого варианта ИФА.

2. На основе непрямого варианта ИФА с использованием хромогенных субстратов ОФД и АБТС разработана тест-система для выявления и оценки титра антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении. Определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции. Установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, предложены уравнения опосредованного вычисления титров при титровании проб в одном разведении, а также способ взаимного перерасчета их значений с тест-системой фирмы KPL.

3. Произведено сравнение величин титров антител, параллельно установленных в непрямом варианте ИФА и РДП. Коэффициент корреляции титров для ОФД составил 0,97, для АБТС 0,98. Значения титров, установленные в ИФА,превосходили аналогичные показатели в РДП более чем в 700 раз с субстратом ОФД и более чем в 500 раз с субстратом АБТС.

4. С использованием разработанной тест-системы ИФА исследован пассивный иммунитет у цыплят, полученных от вакцинированных несушек. Изучена динамика его снижения и соответственно породам принципиально показана возможность вычисления оценки периода полураспада материнских антител, которые для яичных пород составили 4,6 дня, для мясных 3,2 дня. Предложен способ расчета оптимальных сроков вакцинации.

5. Предложенный непрямой вариант ИФА позволил изучить динамику поствакцинального иммунного ответа птиц в ранние сроки после использования живой вакцины против ИББ из штамма «БГ» и продолжительность иммунной реакции после прививки инактивированной

98 вакциной. Иммунный ответ птиц на живую вакцину зарегистрирован с 6-го дня и после активного роста стабилизировался к 12-му дню после вакцинации. Значения титров сывороточных антител после применения инактивированной вакцины были выше и сохранялись в течение всего периода яйценоскости.

6. На основе непрямого сэндвич-варианта ИФА разработана тест-система для выявления и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах. Определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия. Установлен пороговый показатель, разграничивающий неспецифическую и специфическую реакции, и разработан порядок расчета величины титра антигена.

7. Произведено сравнение показателей титров антигена, установленных в ИФА, РДП и титров инфекционного вируса ИББ. Коэффициент корреляции с титрами в РДП составил 0,918, при этом их значения в сэндвич-варианте были в среднем в 1400 раз выше. Корреляция с титром ЭИД50 составила 0,914. Чувствительность предложенной тест-системы была в среднем около 4500

ЭИД5о/мл.

8. Разработанная тест-система позволила изучить динамику накопления антигена вируса ИББ в фабрициевых сумках и селезенках цыплят, иммунизированных сухой вирусвакциной против ИББ из штамма "БГ", а также определить концентрацию указанного антигена в сырье для инактивированной вакцины против ИББ на разных стадиях ее производства.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований явились основой следующих нормативно-технических документов (ТУ, наставлений, инструкций, методик, указаний и рекомендаций) для внедрения в практику коммерческих наборов для диагностики ИББ:

1. Методика получения антигена вируса инфекционной бурсальной болезни для иммуноферментного анализа ( утверждена директором ВНИИЗЖ 28.10.99 г);

2. Методические рекомендации по определению титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур в непрямом варианте иммуноферментного анализа способом одного разведения с использованием различных хромогенных субстратов (одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ 28.10.99 г.);

3. Методические рекомендации по взаимному перерасчету показателей титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни, установленные в сыворотках крови кур средствами различных диагностических наборов ИФА (утверждены директором ВНИИЗЖ 28.10.99 г.);

4. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса инфекционной бурсальной болезни кур иммуноферментным методом (утверждена директором ВНИИЗЖ 06.12.99 г.);

5. Технические условия (ТУ 9388-028-00495527-00) на набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28.02.00 г.);

6. Наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28.02.00 г.);

100

7. Технические условия (ТУ 9388-020-00495527-00) на набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 09.03.00 г.);

8 . Временное наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении №13-7-2/1903 (утверждено департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 09.03.00 г.);

9. Методика выявления и оценки титра антигена вируса инфекционной бурсальной болезни в непрямом сэндвич-варианте ИФА (утверждена директором ВНИИЗЖ 11.04.00 г.).

101

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оковытая, Татьяна Владимировна, Владимир

1. Алиев A.C. Специфическая профилактика инфекционного бурсита кур // Ветеринария,- 1991,- №3,- С. 36-40.

2. Алиев A.C., Джавадов Э.Д., Леонтьева М.Н. Реакция непрямой гемаглютинации при инфекционном бурсите кур // Ветеринария. 1989. -№12. - С. 33-35.

3. Атамась В.А., Гуркало А.Н., Дудниченко И.П. и др. Инфекционная бурсальная болезнь птиц в Одесской области // Инст. эксп. клин. вет. мед.: Инф. бюл,- Харьков, 1995.- С.148.

4. Бакулин В.А., Севостьянов Г.А., Миркина J1.M. Электронно-микроскопическое исследование при болезни Гамборо // Ветеринария. -1985. №1. - С. 38-39.

5. Барташевич Ю.Э. Супермутагены. М.: Мир, 1966,- С. 211.

6. Бочаров М.К. Методы математической статистики в географии. М.: Мысль, 1971,- С. 371.

7. Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина H.B. М.: ВНИТИБП, 1998,- С. 928.

8. Вирусология. Методы. / Под ред. Мейхи В.- М.: Мир, 1988,- С. 183-184.

9. Волкова М.А., Гуленкин В.М., Мудрак Н.С. Методическое руководство по определению титра антител при проведении непрямой реакции ИФА методом одного разведения (на примере ССЯ-76). Владимир: ВНИИЗЖ, 1998.

10. Гринин A.C., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.: Колос, 1971.- С. 86-96.

11. Доел Т.Р. Инактивация вирусов, продуцируемых в культурах клеток животных//Биотехнология клеток животных. М., 1989,-Т.2,-С.145-169.

12. Дудников С.А., Шажко Ж.А., Мудрак Н.С., и др. Методические указания по выявлению и типированию вируса ящура в непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа. Владимир: ВНИИЗЖ, 1997.

13. Дутко Ю.С., Федоров Г.П., Балабанов В. А. Течение инфекционного бурсита у цыплят-бройлеров в эксперименте // Ветеринария. 1988. - №9. -С. 34-36.

14. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991,- С.77-100.

15. Еременко В.П. Элементы математической обработки биологических экспериментов.-Л.: Ленинградский ветеринарный институт, 1975,- 48 с.

16. Кудрявцев Ф.С., Барышников С. А., Радчук Л.А. Ингибирующее действие вируса болезни Гамборо // Ветеринария,-1981.- №3,- С. 36-37

17. Мисюк Н С, Мастыкин А.С., Кузнецов Г.П. Корреляционно-регрессионный анализ. М.: Медицина, 1975. - 192 с.

18. Сеймур П.Х. Иммуноферментный анализ антител // Иммуноферментный анализ. М.: Мир, 1988,- С. 193-205.

19. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев: Урожай, 1993. - 368 с.

20. Тихоненко Т.И. Методические основы биохимии вирусов,- М.: Медицина, 1973,- С. 152-252.

21. Хайн Р.Г. Контроль и предупреждение инфекционного бурсита // Проспект фирмы "Интервет интернейшнл", Боксмеер, Голландия.

22. Abdu P.A. Studies on the profile and relationship of maternal and vaccinal antibodies in the prevention of infectious bursal disease in chickens: M. Sc. Thesis, Ahmadu Belio University, Zaria, Nigeria, 1985.

23. Allan W.N., Faragher J.T., Culler) G.A. Immunosuppression by the infectious bursal agent in chickens immunized against Newcastle disease // Vet. Rec.-1972,- Vol.90.- P. 511-512.

24. Anderson W.I., Reid W.M., Lukert P.D., Fletcher O.J. Influence of infectious bursal disease on the development of immunity to Eimeria tenella // Avian Dis.-1977,-Vol. 21,- P.637-641.

25. Angelov A., Lyupke V. Demonstration of precipitating antibody to avian infectious bursitis virus in yolk samples and its significance for immunoprophylaxis // Vet. Sbirka. 1985. - Vol. 83. - P. 28-30.

26. Armstrong L.D., Tabel H., Riddel C. Subclinical infectious bursal disease in commercial broiler flocks in Saskatchewan // Can. J. Comp. Med. 1981. - Vol. 45. - P. 26-33.

27. Auti M.N. Infectious bursal disease (Gumboro) and vaccination // Poultry Guige. 1987. - Vol. 24, №11-12.- P. 217-219.

28. Azad A.A., Jagadish M.N., Brown M.A., Hudson P.J. Deletion mapping and expression in Escherichia coli of the large genomic segment of a birnavirus // Virology.- 1987.-Vol.161.- P. 145-152.

29. Baxendale W., Lutticken D. The results of field trials with an inactivated Gumboro vaccine // Dev. Biol. Stand. -1981. Vol.51. - P. 211-219.

30. Becht H. infectious bursal disease virus // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1980. - Vol. 90. - P. 107-121.

31. Becht H., Muller H., Muller H.K. Comparative studies on structural and antigenic properties of two serotypes of infectious bursal disease virus // J. gen. Virol.-1988,-Vol.69.- P. 631-640.

32. Benton W.J., Cover M.S., Rosenberger J.K. Studies on the transmission of the infectious bursal agent (IBA) of chikens // Avian Dis. 1967. - Vol. 11. - P. 430438.

33. Brown F. The classificatoin and nomenclature of viruses: Summary of results of meetings of the International Committee on Taxonomy of Viruses in Sendai // Intervirology.- V. 25,- P. 141-143.

34. Brown J., Resurrección R.S., Dickson T.G., Home A. The relationship of egg yolk and serum antibody. I. Infectious bursal disease virus // Avian Dis.- 1989,-Vol. 33,- №4,- P. 654-656.

35. Burkhardt E., Muller H. Susceptibility of chicken blood lymphoblasts and monocytes to infectious bursal disease virus (IBDV) // Arch. Virol. 1987. - Vol. 94. - P. 297-303.

36. Bygrave A.C., Faragher J.T. Mortality associated and Gumboro disease // Vet. Rec. 1970. - Vol.86.- P.758-759.

37. Chantler S.M., Clayton A.L. The use of ELISA for rapid viral diagnosis: Viral antigen detection in clinical specimens // ELISA and other solid phase immunoassays. Chichester ets, 1988,- P. 279-301.

38. Chettle N.J., Stuart J.C., Wyeth P.J. Outbreak of virulent Infectious bursal disease in East Anglia // Vet. Rec. 1989. - Vol. 125. - P. 271-272.

39. Cheville N.F. Studies on the pathogenesis of Gumboro disease in the bursa of Fabricius, spleen and thymus of the chicken // Am. J. Pathol.- 1967,- V.51.-P.527-551.

40. Cho B.R. Experimental dual infections of chikens with infectious bursal and Marek's disease agents. I. Preliminary observation on the effect of infectious bursal agent on Marek's disease //Avian Dis. 1970. - Vol. 14. - P. 665-675.

41. Cho Y., Edhar S.A. Characterization of infectious bursal agent // Poultry Sci. -1969.-Vol.48. P. 2102-2109.

42. Comps M., Mori J., Poisson F., Bonami J.R. Biophysical and biochemical properties of the RBV, and unusual birnavirus pathogenic for rotifers // J. gen. Virol. 1991. - Vol. 72. - P. 1229- 1236.

43. Contarero LA., Butler J.E., Osborn J.V. The absorptive characteristics of proteins for polystyrene and their significance in solid phase immunoassays // Anal. Biochen.- 1980,- Vol.105,- P.375.

44. Cosgrove A S. An apparently new disease of chikens avian nephrosis // Avian Dis. - 1962. - Vol.6. - P. 385-389.

45. Crowther J.R. ELISA. Theory and practice. II Methods in Molecular Biology. -Totowa, New Jersey, 1995,- P. 64, 161-176.

46. Cullen G.A., Wyeth P.J. Response of growing chickens to an inactivated IBD antigen in oil emulsion // Vet. Rec. 1976,- Vol. 99. - P.418.

47. Cullen G.A., Wyeth P.J. Quantitation of antibodies to infectious bursal disease // Vet. Rec. 1975,- Vol. 97,- P. 315.

48. Cursiefen D., Vielitz E., Langraf H., Becht H. Evaluation of vaccine against infectious bursal disease in field trials 11 Avian Pathol. 1979. - Vol. 8. - P. 341351.

49. Dietzen R.G., Francki R.I.B. Nonspecific binding of immunoglobulins to coat proteins of certain plant viruses in immunoblots and indirect ELISA // J. Virol. Meth.- 1987,- Vol. 15,- P. 159-164.

50. Dobos P. Peptide map comparison of the proteins of infectious bursal disease virus //J. Virol.- 1979,- Vol.32.- P. 1046-1050.

51. Dobos P., Hill B.J., Hallet R., e.a. Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented double-stranded RNA genomes // J.Virol.- 1979,-Vol.32.- P.593-605.

52. Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry.- 1971,- Vol.8.- P. 871-874.

53. Eterradossi N., Toquin D., PicaultJ.P., e.a. Monoclonal antibody typing of recent isolates of infectious bursal disease virus from France // Int. Symp. on Infect. Bursal Dis. and Chiken Infect. Anemia. Rauischholzhausen, Germany, 1994. -P. 188-195.

54. Fadly A.M., Winterfield R.W., Olander H.J. Role of the bursa of Fabricius in the pathogenicity of inclusion body hepatitis and infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1976. - Vol. 20. - P. 467-477.

55. Fahey K.J., Crooks J.K., Fraser R. Assessment by ELISA of passively acquired protection against infectious bursal disease virus in chickens // Aust. Vet. J.-1987,- Vol. 64, №7,- P. 203-207.

56. Fahey K.J., O Donnell I.J., Azad A.A. Characterization by Western blotting of the immunogens of infectious bursal disease virus // J. gen. Virol.- 1985.-Vol.66.- P. 1479-1488.

57. Faragher J.T., Allan W.H., Wyeth C.J. Immunosuppressive effect of infectious bursal agent on vaccination against Newcastle disease // Vet. Rec.- 1974.- Vol. 95. P. 385-388.

58. Giambrone J.J. Efficacy of live vaccines against serologic subtypes of infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1990. - Vol. 34. - P. 7-11.

59. Haddad E.E., Whitfill C.E., Avakian A.P., e.a. Efficacy of a novel infectious bursal disease virus immune complex vaccine in broiler chickens // Avian Dis. -1997. Vol. 41, №4. - P. 882- 891.

60. Hatfield R.M., Morris B.A., Henry R.R. Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of humoral antibodies // Avian Pathol.-1987,-Vol. 16,- P. 123-140.

61. Hein R.G., Mengel-Whereat S. Epiidemiological study of the prevalence of new antigenically distinct infectious bursal disease viruses in the USA // 11-th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc.: Abstr.- Budapest, Hungry, 1997,- P. 180.

62. Helmboldt C.F., Garner E. Experimentally induced Gumboro disease (IBD) // Avian Dis. 1964. - Vol. 8,- P. 561 - 575.

63. Herrmann J.E., Collins M.F. Quantitation of immunoglobulin absorption to plastics //J. Immunol. Meth.- 1976,-Vol.10.- P.363.

64. Herrmann J.E., Hendry R.M., Collins M.F. Factors involved in enzyme-linked immunoassay and evaluation of the method of identification of enteroviruses // J. Clin. Microbiol.- 1979,-Vol. 10,- P. 210-217.

65. Hirai K., Calnek W. In vitro replication of infectious bursal disease virus in established lymphoid cell lines and chicken B lymphocytes /7 Infect. Immun. -1979. Vol. 25. - P. 964-970.

66. Hirai K., Shimakura S. Structure of infectious bursal disease virus // J. Virol. -1974. Vol. 14. - P. 957- 964.

67. Hirai K, Shimakura S., Kawamoto E., e.a. The immunodepressive effect of infectious bursal disease virus in chickens // Avian Dis. 1974. - Vol. 18.- P.50-57.

68. Hitchner S.B. Immunization of adult hens against infectious bursal disease virus //Avian Dis. 1976. - Vol. 20,- P. 611-613.

69. Hitchner S.B. Infectivity of infectious bursal disease virus for embryonating eggs 11 Poultry S. 1970. - Vol. 49. - P. 511-516.

70. Hitchner S.B. Persistence of parental infectious bursal disease antibody and its effect on susceptibility of young chickens // Avian Dis. 1971. - Vol. 15,- P. 894900.

71. Howell E.B., Nasser J., Schray K.J. Coated tube enzyme immunoassay: Factors affecting sensitivity and effects of reversibl protein binding to polystyrene // J. Immunol.-1981.-Vol. 2,- P. 205-225.

72. Howie R.I., Thorsen J. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for infectious bursal disease virus // Can. J. Comp. Med.- 1981,- Vol. 45, № 1.- P. 51-55.

73. Ide P.R., Schulte-Nordholt J.A., Dewitt W,F., Smith J.D. Broiler- breeder vaccination against infectious bursal disease and persistence of maternal antibody in progeny//Can. Vet. J. -1978. Vol. 19. - P. 123-127.

74. IDEXXs instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc. Westbrook,USA, 1996,- 30 p.

75. Infectious bursal disease antibody test kit. Instruction. Catalog № 54-81-01/ KPL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, 2 Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 800 638 3167.

76. Infectious bursal disease antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113 // BioChek C. V. Weth. Venteweg 143. 2805 JN Gouda. Holland.

77. Ismail N., Saif Y.M. Differentiation between antibodies to serotypes 1 and 2 infectious bursal disease viruses in chiken sera // Avian Dis. 1990. - Vol. 34. -P. 1002- 1004.

78. Jackwood D.J., Jackwood R.J. Infectious bursal disease viruses: Molecular differentiation of antigenic subtypes among serotype 1 virus // Avian Dis. 1994. -Vol. 38. - P. 531- 537.

79. Jackwood D.J., Saif Y.M., Huches J.H. Characteristics and serologic studies of two serotypes of infectious bursal disease virus in turkeys // Avian Dis. 1982. -Vol. 26. - P. 871- 882.

80. Jackwood D.J., Saif Y.M. Prevalence of antibodies to infectious bursal disease virus serotypes I and II in 75 Ohio chicken flocks // Avian Dis. 1983. - Vol. 27. -P. 850- 854.

81. Jackwood D.J., Sommer S.E., Odor E. Correlation of enzyme-linked immunosorbent assay titers with protection against infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1999. - Vol. 43, №2,- P. 189- 197.

82. Kardi V., Perenyi T., Kocsis G., e.a. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring antigen concentration of infectious bursal disease virus//Acta Vet. Hung.- 1988,-Vol.36, №1-2.- P. 123-134.

83. Kardi V.,Szegletes E., Forgach K, e.a. Use of ELISA methods for determination of IBD (Gumboro) virus antigen and antibody // 11-th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc.: Abstr.- Budapest, Hungry, 1997,- P.269.

84. Kaufer I., Weiss E. Significance of bursa of Fabricius as target organ in infectious bursal disease of chickens // Infect. Immun. 1980. - Vol. 27. - P. 364367.

85. Kemeny D.M., Challacombe S.J. Microtitre plates and other solid phase supports // ELISA and Other Solid Phase Immunoassays. Chichester ets, 1988,- P. 31-39.

86. Kemeny D.M.,Chantler S. An introduction to ELISA. // ELISA and Other Solid Phase Immunoassays. Chichester ets, 1988,- P. 3-5.

87. Kouwenhoven B., Van der Bos. J. Control of very virulent infectious .bursal disease (Gumboro disease) in the Netherlands with so called "hot" vaccines // Proc. 42th Western Poultry Dis. Conf. Sacramento, California, 1993. - P. 3740.

88. Kumar A., Rao A.T. Doubl-antibody sandwich ELISA for detection of infectious bursal disease virus // Br. Vet. J.- 1991.-Vol.147, №3,- P. 251-256.

89. Kurstak E., Tijssen P., Kurstak C., Morisset R. Enzime immunoassay in diagnostic medical virology // Bull. FAO.- 1986,- Vol.64, №3,- P. 465-479.

90. Lamichhane C.M., Kirkegaard L., Collins W. ELISA provides better detection of antibodies to infectious bursal disease virus (IBDV) // 11-th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc.: Abstr.- Budapest, Hungry, 1997,- P. 41.

91. Landgraff H., Vielitz E., Kirsch R. Occurrence of an infectious bursal affecting the bursa of Fabricius (Gumboro disease) // Dtsch. tierarztl. Wschr. 1967. - Bd. 74.-S. 6-10.

92. Laser H.N'., Shane S.M. Infectious bursal disease // World Poultry Sci. J. 1994. -Vol. 50. - P. 133-166.

93. Lucio B., Hitchner S.B. Infectious bursal disease emulsified vaccine: Effect upon neutralizing-antibody levels in the dam and subsequent protection of the progeny // Avian Dis. 1979. - Vol. 23. - P. 466 - 478.

94. Lukert P.D.,Saif Y.M. Infectious bursal disease // Diseases of Poultry. 10th edn. Ames, Iowa, 1997. - P. 721-738.

95. Mandelli G., Rinaldi A., Cerioli A., Cervio G. Aspetti ultrastrutturali della borsa di Fabrizio nella malattia di Gumboro de polio // Atti. Soc. Ital. Sci. Vet. 1991. -Vol. 21. - P. 615-619.

96. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines / Office International des Epizooties, World Organisation for Animal Health. Paris, 1996. - 723 p.

97. Marquardt W., Johnson R.B., Odenwald W.F., Schlotthoher B.A. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring antibodies in chickens infected with infectious bursal disease virus // Avian Dis.- 1980,- Vol. 24,- P. 375-385.

98. McClaren M.L., Liilywhite J.E., Andrew C.S. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Practical aspects of standartization and quality control // Med. Lab. Sci.-1981,- Vol. 38,- P. 245-251.

99. McFaney K.J., Erny K., Crooks J. A conformational immunogen on VP2 of infectious bursal disease virus that induces virus-neutralizing antibodies that passively protect chickens //J. gen. Virol.- 1989.- Vol.70, №6.- P.1473-1481.

100. McFerran J.B., McNulty M.S., McKillop E.R. e.a. Isolation and serological studies with infectious bursal disease viruses from fowl, turkeys and ducks: demonstration of a second serotype // Avian Pathol. 1980. - Vol. 9. - P. 395 -404 .

101. McNulty M.S., Saif Y.M. Antigenic relationship of non-serotype 1 turkey infectious bursal disease viruses //Avian Dis. 1988. - Vol. 32.- P. 374-375.

102. Mohamed K. H., Saif Y.M., Shawky S. Comparison between antigen-capture ELISA and conventional methods used for titration of infectious bursal disease viruses//Avian Dis. 1996. - Vol. 40,- P. 562-566.

103. Morgan M.M., Macreadie I.G., Harley V.R., e.a. Sequence of the small double- stranded RNA genomic segment of infectious bursal disease virus and its deduced 90-kD product//Virology.- 1988,-Vol. 163,- P. 240-242.

104. Muller H., Bech H. Biosynthesis of virus-specific proteins in cells infected with infectious bursal disease virus and their significance as structural elements for infectious virus and incomplete particles //J. Virol.- 1982,- Vol.44.- P.384-392.

105. Muller R., l/Ve/'ss I.K., Reinacher M., Weiss E. Immunofluorescent studies of early virus propagation after oral infection with infectious bursal disease virus (IBDV) // Zentralbl. Vet. Med. - 1979. - Vol.26.- P.345-352.

106. Mundt E., Beyer J., Muller H. Identification of a novel viral protein in infectious bursal disease virus-infected cells // J. gen. Virol.- 1995,- Vol.76.- P.437-443.

107. Nachimuthu K., Raj G.D., Thangavelu A., Venkatesan R.A. Reverse passive hemagglutination test in the diagnosis of infectious bursal disease // Trop. Anim. Health Prod. -1995. Vol. 27. - P. 43-46.

108. Nakane P., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody. A new method of conjugation //J. Histochem. Cytochem.-1974.-Vol. 22,- P. 1084.

109. Naqi S.'A, Millar D.L., Grumbles L.G. An evaluation of three commercially available infectious bursal disease vaccines // Avian Dis. 1980- Vol. 24.- P. 233-240.

110. Nick H., Cursiefen D., Becht H. Structural and growth characteristics of infectious bursal disease virus //J. Virol.- 1976,- Vol. 18,- P.227-234.

111. Nicholas R.A., Reed N.E., Wood G.W., e.a. Detection of antibodies against infectious bursal disease virus: a comparison of three serological methods // Res. Vet. Sci.- 1985,- Vol. 38, №2,- P.189-192.

112. Nikai T., Hirai K. In vitro infection of fractionated chicken lymphocytes by infectious bursal disease virus //Avian Dis. -1981- Vol. 25,- P. 831-838.

113. Panigraphy B.L., Misra L.K., Naqi S.A, Hall C.F. Prolongation of skin allograft survival in chickens with infectious bursal disease // Poultry. Sci. 1977. -Vol. 56. - P. 1745.

114. Panisup A.S., Verma K.S., Mohaty G.C. Age resistance in chickens against infectious bursal disease // Acta Vet. Scandinavica. 1984. - Vol. 28. - P. 561566.

115. Parsons G.H. Antibody-coated plastic tubes in radioimmunoassay // Methods in Enzymology. N. Y., 1981,-Vol. 73. - P. 5.

116. Pejkovski C., Davelaar F.G., Kouwenhoven B. Immunosuppressive effect of infectious bursal disease virus on vaccination against infectious bronchitis II Avian Pathol. 1979. - Vol.8. - P. 95-106.

117. Penzes Z., Meszaros I. Comparison of different computational methods for measuring antibodies to avian infections bronchitis virus in single serum dilution //Acta Vete. Hungarica.- 1992,- Vol. 40, №4,- P. 311-321

118. Perce A.J., Ford D.J., Gaizutis M.A. Quantitative and qualitative aspects of immunoassays // Scand. J. Immunol.- 1978,- Vol.8, №7,- P.1.

119. Peters G. Histology of Gumboro disease // Berl. Munch, tierarztl. Wschr. -1967. Vol.80. - P. 394-396.

120. Rosenberger J.K. Vaccination of broiler-breeder and their progeny with Infectious bursal disease virus // Proc. Symp. Inf. Bursal Dis. (Gumboro dis.). -Atlanta, 1977. P. 12-16.

121. Rosenberger J.K., Cloud S.S. Isolation and characterization of variant infectious bursal disease viruses abst. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1986. - Vol. 189. - P. 357.

122. Rosenberger J.K., Gelb J. Response to several avian respiratory viruses as affected by infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1978. - Vol. 22. - P. 95105.

123. Rosenberger J.K., Klopp S., Eckroade R.J., Krauss W.C. The role of the Infectious bursal agent and several avian adenoviruses in the hemorrhagic-aplastic-anemia syndrome and gangrenous dermatitis // Avian Dis. 1975. - Vol. 19. - P. 717-729.

124. Rosenberger J.K., Saif Y.M., Jackwood D.J. Infectious bursal disease // A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens / Published by the American Association of Avian Pathologists, 1998,- P. 215-218.

125. SaifY.M. Infectious bursal disease virus types // Proc. 19th Nat. Meet. Poult. Health Condemn. Ocean City, MD, 1984,- P. 105-107.

126. Sharma J.M. Effect of infectious bursal disease virus on protection against Marek's disease by turkey herpes virus vaccine // Avian Dis. 1984. - Vol. 28,- P. 629-640.

127. Sharma J.M., Dohms J.E. Comparative pathogenesis of serotype 1 and variant serotype 1 isolates of infectious bursal disease virus and their effect ofhumoral of specific-pathogen-free chickens // Avian Dis. 1989. - Vol. 33, №1 -P. 112-124.

128. Silim A., Venne D. Comparison of egg-yolk and serum antibody titers to four avian viruses by enzyme-linked immunosorbent assay using paired field samples //Avian Dis. 1989. - Vol. 33, №4,- P. 643-648.

129. Snyder D.B. Changes in the field status of infectious bursal disease virus 11 Avian Pathol. 1990.-Vol. 19. - P. 419-423.

130. Snyder D.B.,Marquardt W.W., Mallinson E.T., e.a. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. 4. Association of infectious bursal disease serology with broiler flock performance // Avian Dis.- 1986,- Vol. 30,- P. 139-148.

131. Snyder D.B, Vakharia V.N., Savage P.K. Naturally occurring- neutralizing monoclonal antibody escape variants define the epidemiology of infectiousbursal disease virus in the United States // Arch. Virol. 1992. - Vol. 127. - P. 89101.

132. Solano W., Giambrone J. J., Williams J.C., e.a. Effect of maternal antibody on timing of initial vaccination of young white leghorn chickens against infectious bursal disease virus //Avian Dis.- 1986,-Vol. 30, №4,- P. 662-671.

133. Tham K.M., Young L.W., Moon C.D. Detection of infectious bursal disease virus by reyers transcription-polymerase chain reaction amplification of the virus segment A gene //J. Virol. Meth. -1995. Vol. 53. - P. 201-212.

134. Thayer S.G., Viilegas P., Fletcher O.J. Comparison of two commercial enzyme-linked immunosorbent assays and conventional methods for avian serology//Avian Dis.- 1987,- Vol. 31,- P. 120-124.

135. Thorton D.H., Pattison M. Comparison of vaccines against infectious bursal disease //J. Comp. Pathol. 1975. - Vol. 85, № 4,- P. 597-610.

136. Todd D., McNulty M.S. Biochemical studies with infectious bursal disease virus: comparison of some of its properties with infectious pancreatic necrosis virus //Arch. Virol.- 1979,-Vol. 60,- P.265-277.

137. Thorton L. Mississippi IBD problem, solutions are explaind // Poultry Dis.-1982,- V.41, №490,- P.604-605.

138. Tsukamoto K., Matsumura T, Mase M., Imai K. A highly sensitive, broad-spectrum infectivity asay for Infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1995. -Vol. 39, №3. - P. 575-586.

139. Tsukamoto K., Obata H., Hihara H. Improved preparation of ELISA antigen of infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1990 - Vol. 34, №1 - P. 209-213.

140. Tsukamoto K., Tanimura N., Kakita S.: e.a. Efficacy of three live vaccines against highly virulent infectious bursal disease virus in chickens with or without maternal antibodies // Avian Dis. 1995. - Vol. 39, №2. - P. 218-247.

141. Urbanek R., Kemeny D.M., Samuel D. Use of enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of allergen-specific antibodies // J. Immunol Meth.-1985,-Vol.79.- P.123.

142. Van der Marel P., Snyder D.B, Lutticken D. Antigenic characterization of IBDV field isolates by their reactivity with a panel of monoclonal antibodies // Dtsch. tierarztl. Wschr. 1990. - Bd. 97. - S. 81-83.

143. Van Weeman B.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate // FEBBS.- 1971.-Vol. 15,- P. 232-237.

144. Vogt R.F., Phillips D.L., Henderson L.O., e.a. ELISA microtiter plates // J. Immunol. Meth.- 1987.- Vol. 101P. 43-50.

145. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Dynatech Europe.- UK.

146. Winterfield R.W. Immunity response to the infectious bursal agent // Avian Dis. 1969. - Vol. 13. - P.-548-557.

147. Winterfield R.W.,Fadly A.M., Bickford A. Infectivity and distribution of infectious bursal disease virus in the chicken. Persistence of the virus and lesions // Avian Dis. 1972. - Vol. 16. - P. 622-632.

148. Wyeth P.J. Effect of infectious bursal disease on the response of chickens to S. typhimurium and E. coli infections //Vet. Rec. 19.75. - Vol. 96. - P. 238-243.

149. Wyeth P.J., Chettle N. Comparison of the efficacy of four inactivated infectious bursal disease oil emulsion vaccine //Vet. Rec. 1982. - Vol. 110. - P. 359-361.

150. Wyeth P.J., Cullen G.A. Susceptibility of chicks to infectious bursal disease (IBD) following vaccination of their parents with live IBD vaccine // Vet. Rec. -1978. Vol. 103. - P. 281-282.

151. Wyeth P. J., Cullen G.A. The use of an inactivated infectious bursal disease oil emulsion vaccine in commercial broiler parent chickens II Vet. Rec. 1979.-Vol.104. - P. 188-193.

152. Zajac J., Novotna L. Evaluation of the results of ELISA in the quantitative determination of antibodies against bursitis in poultry // Vet. Med. (Praha).-1992,-Vol.36, №12,- P.737-743.копия1. МЕТОДИКА

153. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА.

154. Авторы: Оковытая Т.В., Фалина Г.М., Мудрак Н.С., Кузнецов Ю.В. Дрыгин Б.В., Борисов A.B.

155. Рассмотрено и одобрено методкомиссией: протокол № 6 от 4.07.99 Ученым советом: протокол 16 от 6.10.99лопия верна: Ученый секретарь ВН1004.2000г.1. М. Семенов1. CL1. Л " П <. ■<>^,4«. УТВЕРЖДАЮ1. А. А. Гусев 1999г.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

156. ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТИТРА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАПЬНОЙ БОЛЕЗНИ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ КУР В НЕПРЯМОМ ВАРИАНТЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА СПОСОБОМ ОДНОГО РАЗВЕДЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХХРОМОГЕННЫХ1. СУБСТРАТОВ.

157. Авторы: Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Кулаков В.Ю.1. СОГЛАСОВАНО

158. Зам. директор по ,ЙИР / . ■. /1С/ Захаровдиректор по,-^рЯ^.з/к1999г.

159. ДирфрблЯш И И 3 Ж Д.Гусев 1999г.

160. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВЗАИМНОМУ ПЕР ЕРА СЧЕТУ ПОКАЗА ТЕЛЕЙ ТИТРА АНТИТЕЛ К ВИР УСУ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ, УСТА НОВЛЕИНЫХ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ КУР СРЕДСТВАМИ РАЗЛИЧНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ НАБОРОВ ИФА.

161. Авторы: Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Кулаков В.Ю.

162. Рассмотрено и одобрено методкомиссией: протокол № 6 от 4.07.99 и Ученым советом: протокол 16 от 6.10.991201. КОПИЯ

163. СОГЛАСОВАНО Зам.директора института1. В.М.Захаров199?г.1. КОПИЯ БЕЕ1. Ученый секрета; 28.03.2'

164. РАЗРАБОТЧИКИ: Борисов A.B. зав. лаб. №6; Дрыгин В.В., зав. лаб. №11; Мудрак Н.С., вед. н. с. лаб, №11; Оковытая Т.В., вед. инж.-химик лаб. №111. Г.М.Семенова

165. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОКП 938870 УДК 619:616.476-022.6:616-078.23/049.32)1. Группа Р-5Аекгора по НИР учно-исследовательского I животных В.М.Захаровгооог.

166. НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ.

167. Технические условия ТУ 9388-028-00495527-99

168. Без ограничения срока действия Срокдействия с феВРАЛЯ 2000г.1. СОГЛАСОВАНО

169. Директор Всероссийа научро-исследоват^ ков^Гер!1НОГО1. РАЗРАБОТЧИКИ

170. Директор Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных1. АА Гусев1993 г.т1. А. В. Борисов 1993 г.

171. Заведую!: ЦИЙ ОТЯ1 рлом ВНИИЗЖ1. В.В.Дрыгин1/уО" } 1999 г./

172. Продолжение на следующем листе

173. Продолжение титульного листа ТУ

174. Ведущий научный сотрудник ВНИИЗЖд/рМАЛ Н.С.Мудрак ■ АС" 1990г.1. Технолог ВНИИЗЖ

175. Т. В. Оковытая " ¿У 1991. г.

176. НАСТАВЛЕНИЕ по применению набора для определения ат-ител к вирусу инфекционной бурсапьной болезни иммуноферментным методом-Селиверстов2000г.

177. Набор предназначен для определения специфических антител против вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) в сыворотках крови кур иммуноферментным методом (ИФА)',

178. Для исследования в лабораторию доставляют из птицехозяйств сыворотки крови кур от 25 голов (по 0,2-0,3 см3 ). Пробы сывороток хранят в морозильной камере бытового'холодильника.

179. В состав набора входят 9 компонентов (К1-К9).

180. КОПИЯ ВЕРНА Ученый секрета 27.03.2001. Г.М.Семеновал