Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства вируса и лабораторная диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вируса и лабораторная диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА ¡1 ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФВДЕРА1ШИ ВСЕРОССИЙСКИЙ ].Х)СУДДРСТВЕННЫЙ МУЧЕО-ИССЛЩОВАТЕЛЬааЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВВТПРШАРА.ТОВ

-ГГ- ОД-■-:--

На правах рукописи

) 1 rt.il шпн

КАЛЫКОВА 1УЛЫАН КШГАЕБНА

БШЛОШЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЗ БОЛЕЗНИ ИНДЕЕК

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание учаной степени кандидата биологических наук

Мосч?а - 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводстза.

Иаучкнй руководитель : доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник АЛИЕВ A.C.

Официальные оппоненты : доктор баодогачееках наук, профессор ОСЩЗЕ Н.Г.

кандидат ветеринарных наук СМОЛЕНСКИЙ Б.И, .

Ведущая организация : Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицина.

Защита состоится " f " 199я г. в часов

на заседании Специа-гизЕрсзанного совета Д 120.85.01 при Всероссийском Государственном наутао-^слодозааелъсксм институте контроля, стачдэрткзацли и сертификации ветиреяаратов по адресу : 123022, Москва, Звенигородски шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветпрапаратов.

Автореферат разослан "__"___года,

УчошЛ; секретарь Спемиажзированного сове та

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТУ

1.1. Актуальность птюблеш. В настоящее время з странах о антенсавно развитам промышленный птицеводством одной из важнейших прошлом является борьба с инфекционными заболевай. ш птиц, ореди которых особу» опасность представляют заболевания вирусной этиология из-за их недостаточной язучекносгя,высокой ксятагаоэ-нооте, большого разнообразия путей и факторов передачи вяфеяцп-онного материала.

Проблема вирусных болезней преобрзтает всевозрастащу» актуальность еще и по той причине,что ряд Енфояпвй ста.та протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов виру оно S и бактериальной природы/ Кудрявцев Ф.С.Длаеэ A.Ü. ,1984 Алиев A.C.,1994 /„

В последние годи б нашей стране как и во всех стрела:: мера широкое распространен»? получила шфекпденная бурса льная болезнь, : которая нркчиняот существенный экономический ущерб прошилонвому птицеводству«

Особую опасность данное заболевание представляет при субклиническом течении болезни при отсутствии видамш: клинических признаков ввиду дамунодопрессизного влияния вируса на организм больных n-riaiffynkjaS.H tt al. ,1930; Jffa/i dal. ДЭ84/.14шунодейлпит у птиц создает опасность возникновения в сгяе се^чдарныг инфекций, ведуида н экономическим потерям,размеры которых трудно даже предположив'/Алиев A.C.,1939; Jllc. Feiwn ^ aß.. ,1982/.

Б течение многих лет считалось,-что куры являются единственным видам птиц,восприимчивым ж" заражения вирусом инфекционной бурсалъкой болезни (ШдБ}„ Однако в настоящее время установлено тличге второго соротипа вируса ИББ у индеек, который хотя и а :эет некоторое антигенное родство с вирусом ИББ 1-го серотипа, но биологнчзскл они существэнно отлзчавтея.

Известно „что вирус ИББ 2-го серотша вызывает в ргаклзмз индеек шмунодепреосив из-за морфологических изменений в бурса не вызывая при атом клинического проявления болевна / dhul егЛ ütoiitn ,1934; P&iiimar) Ь. Ы. fatlet f.», 1935/

При суб"линической форме болезни при отсутствии, каких-либо клинических и видимых па т оло го а на томиче склх признаков особо южное значение имеет лабораторная диагностика ИЕБ.

Предложенные зарубежными авторами метода для диагностики ИББ

3

у индеек (реакция нейтрализации л метод флюоресцирующих антител) яз—лится довольно трудоемкими и требуют специального оборудования /' Cju-tt-fo M.jf.etaí., 1985; Me. Fernán ttai. ,1988; ^aJ'.wood Jj.^. et o¿, 1584/.

Учитывая, что poja вируса 2-го серотига вируса ИББ в патологии птиц до конца не изучена и ранее в нашей стране исследо -вашу, в этом направлении не проводилась, а также не разработаны методы лабораторной диагностики ИББ у индеек изучение данной проблемы, разработка и внедрение методов лабораторной диагностики ИЕБ у .индеек являются актуальными и имеют большое научное и практическое значение.

1.2„Цель я задачи исследований. Дела» настоящих исследований являлась разработка и исгытание иммуноФерментпого метода диагностика ИББ у нвдеек, основанного на выявлении специфических антител к вирусу КБЗ.

В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило;

1. Изучить биологические,морфологические,кудьтуралъныз и антигенные свойства вируса ИЕБ 2-го серотшга.

2. Разработать и экспериментально обосновать методику постановки имыуноферментного анализа(ИФА) для обнаруяения антител к вирусу ИББ з сыворотках крови индеек.

3» Изучить диагностичекуи цешость ИФА в сравнения с реак-uaefi нейтрализация (РН) прл диагностике ИЕБ индеек.

4. Испытать непрямой вариант ИМ для диагностики ИББ индеек в производственных условиях

1.3.Ка?чкая новизна.Впь^вне в нашей стране выделзнн и идентифицированы штаммн вируса ИББ 2-го серолица у индюшат, проведено изучение их биологических, серологических и хя льтуралышх сеой-ств. Дана оценка патогенным свойствам вируса ИББ 2-го серотида для GHS-змбрионов кур, эмерионор уток, цыплят и индюшат. Впервые для серологической диагностики вируса ИББ у индеек разработан непрямой вариант 1Ш с использованием отечественных препаратов и реактивов. Лака сравнительная оценка непрямого варианте ISA с реакцией нейтрализации вируса. Изучена кинетика накопления антител к вирусу ИББ икдеок в крови экспериментально заражению; индгаат., Усыновлена высекая чувствительность ИМ для диагностики ИЕБ индеек. .

¡Фактическая данность .На осаойзяид. проьоденьых исследований

и " - • ■•.'•••"•■'•'.■.''-

разработана шмуноформенткая тест-систеглг для диагностики инфекционной бурсальн-лй болезни индеек и методические рекомея -дашш по ее применено в птицевод~эспих хозяйствах л научно-производственных лабораториях. Показана перспективность применения ИФА при проведении массовых серологические исследований. Простота постановки ИФА делает реальным внедрение его в широкую про -язводстаеннук практику.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых и аспирантов (ШИТИС,Москва, 1993), на Методическом и Ученом советах Всероссийского НШЖ птицеводства (Санкт-Петербург,1994-95гг.)»

Публикация. Основные положения диссертации опубликованы в 7~т печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена ка страницах машинописного текста и включает : введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуздэ-ние, внеоды, практические предложения, список литературы а приложение .

Работа иллюстрирована 23 таблицами и 18 ^асунками. Список литературы включает 303 источника литературы, в том числе 255 зарубевных авторов.

2.МАТЕРШЫ И 1ЖГ0ДУ ЖСВДОЕАЮЙ

Работа выложена в отделе вирусологии и вувдрия Всароссий-ского научно-исследовательского ветеринарного института птице -водстЕа.

Вирусы. 3 экспериментах использованы ятаыш вируса ИББ индеек : "М-92" ,"СК" и "Омский" , выделенные у индшат из различных хозяйств СНГ и 8талонные штаммы вируса ИББ: 2-го серотша-^У-еЭ; ."-го-вирулентный "52/70-М" и вакцинный "ВНИЗИ1Г. Все выделенные штаммы идентифицировала в перекрестной реакции нейтрализации как штаммы вируса ИББ 2-го серотина.

Исследуемые штаммы характеризовали по морфолог теским, куль-туралышм и антигенным свойствам, а также по степени патогенное— ти для СПФ-эмбрионов кур и уток,а такта для восприимчивой птицы и изучали их устойчивость к воздействию физико-химических факторов.

Птица и лаборатоные кивотные. В опытах использовано 420 кн~

5

индотат, 376 цыплят ра&ного Еозраста, 840 курных и 510 у тинт. эмбрионов различного сроке иккубапии» а та:«е 18 хомячков, 26 белш: мьстей я 16 кроликов яороди"шшшш]а"»

Испытание непрямого варианта ИФА-теота в производственных условиях проводили исследуя 1180 проб сывороток крови индеек разного возраста.

Культура клеток. Б исследованиях использовали первичнотрип-синизировзннув культуру клеток фиброй ластов эмбрионов кур (ФЭК), а также перевиваемке культуры ВЯЛ-70 и Vetó «В отдельнпх опытах использовали первичную культуру клеток почзк эмбрионов кур (ПЭК)„

Оьгвототян. Гипералмуншго сыворотки -крова индеек и кур к вирусу ИББ получали на индюшатах и цыплятах, досташтекншс из хо -зяviera, б^.гспо лучных по острнм ннфакциокнзм заболеваниям. Перед иммунизацией сыворотка крови птиц исследовали на наличие антител против вируса ИББ. В контроле . использовали жмун-кке сыворотка к гетерологичкнм вирусам болезней индеек и кур, а такяе нормальные снворотки. Гипериммунннэ сыворотки таккэ получали ка хомяках, милах и кроликах.

Методы. Культивирование вируса ИББ проводили заражением развивающихся эмбрионов кур и уток различного срока инкубации. Куриные эмбрионы заражали в желточный мешок, в аллантоасную полость и па хорионадлантожеяую оболочку. Наличке вируса оценивали по гибели аараяенных вмбриов^в л наличии патологоапатомичзс-ких изменений.

Дди дзучения культуральных свойств вируса зарэжзли первкч-ныо и перззиваемые культуры клеток различного происхождения,

Иифзндаонкнй титр вируса определяли в куриных эмбрионах и в культурах клеток и расчитывали по методу Рида и Мента.

Ка всех станах исследований вируссодерададл материал про-• веряла на стерильность пу-?ем высеэа на мясопептонный аир, мяео-пептоннмй бульсн, мясоотптонный печеночный бульон под вазелиновым маслом и агар Сабуро.

Устойчивость вируса ИББ к воздействии физико-хшдтеских факторов определяли титрованием в культура клеток до и после обработки его данными ^акторами.

гляшкообразущта способность вирусе изучали по методу,описанному з работе СНо сi al- (1089).

'Электронную микроскопию проводила о целью индикация и идентификации выделенных штаммов х 1руса ИББ. Препарата для электронной микроскопии готовили сс методу негативного контрастирования и исследовали з электронном микроскопе ЗЕМ -100 при ускоряющем напряжении 80 кУ .

Реакции нейтрализации ставили с использованием Юи ТЦД^мл и 20 нейтрализующих доз сыворотки, которые определяли титрованз-ем вируса и антител.

йндшат и цыплят заражали штраназально и в грудную мышцу в доза 0,2 , 0,5 и 1,0 см3. Заражение лабораторных тавотных проводили внутримышечно, внутривенно, внутрибртинко и подкскно. Кровь у птицы брали из подкрыльцовой вены, у кроликов из упшоД раковины , у хомяков и мышей ратробудьбэркшл способом.

Статистическую обработку результатов собственных исследований проводила по методикам, описанным в руководстве И.П.Аша-рина и А,.А..Воробьева£1962).

3. РЕЗУЛЬТАТ СОБСТВЕННЫХ ШСЛЕЩПАШЙ

3.1. Идентификация выделенных иэолятов вируса ИББ индеек.

В связи с тем, что эпизоотические штэшы неоднородны в антигенном и иммунологическом отношениях, мы сочли необходимым определить антигенную принадлежность выделенных нага отечественных штаммов вируса ИВБ индеек. Для этого -роводш перекрестную реакции нейтрализации в культуре клеток. Степень антигенного родства определяли по индексам нейтрализации вируса с гомологичными и гетеродогичными сыворотками индпшат.

По полученным данным реакции перекрестной нейтрализации вируса ИЕБ установлено, что выделенные . . штаммы следует отнести к вирусу ИББ 2-го с&ротида .Взаимосвязь ввделенных штаммов и эталонного штамма "ТУ-89" вируса ИББ 2-го оеротила была больше70$. Антигенное родство выделенных изолятоз со шташом "БНИВИС" вируса ИЕБ 1-го серотипа равнялось нулю. При изучеши. азашо -связи к езду отечественными лзолятами установлено, что сыворотки, полученные к выделенным штаммам нейтрализовали вое выделенные гатпмчн. Степень антигенного родства в последней случае тзк-ле был вше 2%.

3.2. Изучение биологических евойс. . вируса .

При изучении биологических свойств вируса ИЕБ ззжнкм явля-

ется определение степени его патогенности дяя развивающихся эмбрионов. При проведении данных исследован.!;! установлено, что ЫФ-эибриоаы кур являются чувствительными к заражению вирусом КЕБ 2-го серотхшг. Менее чувствительны утиные эмбрионы.

Караженнне эмбрионы независимо от 1?си эльзу емо го для иио -кулягал штамма значительно отставали в росте и развитии. Максимальную гибель эмбрионов,как правило, отаечали на 5-6-й сугки после инфицирования. У давших эмбрионов отмечали разлитые геморрагии на коже з области головы, шеи и конечностей. Печень эмбрионов была ярко желтого шш яелтовато-золеного цвета.

Характер изменений при заражении утиных эмбрионов был аналогичным. Однако, гибель утиных эмбрионов в отличие от эмбрионов кур отмечали только в первых двух пассажах, что свидетельствует о низкой степени адаптации вируса к данной системе.

При исследовании биологической активности вируса ИББ 2-го серотшта установлено,что максимальная инфекционная активность вируса выявлена в гомогекатах тушек зародышей и хорионалланто-есной оболочке (ХАО) зараженных эмбрионов.

Сравнительное изучение методов заражения СПФ-эмбрлонов ( в аллантоисяую полость, в желточный мешок и на ХАО) показало,что -наиболее пригодяш! для получения объективных данных при выделении, идентификации и татрэциа вируса ИЕБ 2-го серотша является метод заражения на ХАО эмбрионов.

Следующем этапом при изу ник биологических свойств виде -ленных кэолятов являлось определение степени их патогенности для зо01*ривмтивой Ц'гицы. С этой цельв проводили экопершенталь-ное заражение индюшат и цьг;тат выделенными л эталонными штамма-т вируса ИЕБ. При этом установлено,что введение индояатам в разном возрасте вируса ИЕБ 2-го серотипа (шта-ч "М-92") не приводило к клиническому проявлению болезни,однако вызывало мяк -роскопические порзкенйя в фабрипиевой сумке зараженной птицы.

При заракении иядшат виру лент.чнм штаммом 1-го серотша "52/70--М" тгкна не наблюдали клинических и патологоакатомичес-ких изменений.

При доследовании в РН сывороток крови зараженных птенцов установлено наличие антител к вирусу ДОЗ.

Инокуляция цыплятам выделенных и эталонных штаммов вируса ИББ 2-го серотгаа ие зкэувало клинически иризпазоБ и патслого-«патомичееких изменений, характерных для !ШГ>. О

При заражении сыплнт эталонным виду .лентным штаммом "52/70-М" установлено клиническое проявле .ие заболевания с выраженными клиническими признаками я характерными для ИББ сатологоанатоми-чеекгми изменениями у павшей птицы. Клинические признаки проявлялись в виде угнетения, отказа от корка.диарей, сопровождающейся выделением беловато-желтого помета. Продолжительность заболевания составила 7-8 суток. Отход птицы составил СС^.

Таким образом, проведенные исследования показали, что штаммы вируса ИББ 2-го серотина являются апатогенными для цыплят и индшат. Введение индюшатам вирулентного штамма "52/70-М" вируса ИЕЕ 1-го серотияа не вызывало клинического проявления' забо -леваняя и патолох'оанатомичеекпх изменений в органах, в то время как инокуляция его цыплятам чувствительного возраста сопровозс -далось ярко выраженной клиникой и патолегоанетогазчеекой картиной заболевания.

В опытах по изучении динамики накопления вируснейтраллзув-щих антагел к вирусу ИББ установлено, что штаммы вируса ИЕЗ как первого тик и второго серотипов способны вызыг гь в организме индеек и кур образование вирусспецифических антител и динамика их накопления различается в зависимости от используемого серо-типа и вида птицы.

Вяруснейтрализущяз антитела к 1-му и 2-му серотипак у индеек выявляли через 7 дней посла инфицирования у всех птенцов, кроме группы индюшат, зараженных в суточн^.л возрасте вирусом штамма "52/70-№*. Однако, средний геометрический титр антител при введении штамме "М-Э2" был выше, чем при заражения штаммом " 52/70-},Г.

Пик максимального накопления антител а обоим серотипем вируса определяли на 4-й неделе после йнфщирования. Затем наступал заметный спад титров, который для штамма "М-92" наблвдали. до конца опыта .

В настоящее время в качестве биологической модег для выделения и культивирования вирусов пшропо используются культуры тканей различного происхоздения. /Голубев Д.Б. и сотр.,1586/.

Для изучения культуральных свойств выделенных изолятов руса ИББ 2-г" сэротша проведен отбор имеющихся в канем рзспо -ряжении клеток для культивирования и накопления вируса КВБ.

В первичной культуре $£К и ПЭК цитчпатотепявй зЖуэктОГО),

5

от воздействия вируса ИББ 2-го серо тала наблюдали через '72-96 часов, ЦПЭ характеризовался появлением очатсв'дегенерации илето-t, состоящих из огдельних округлых слегка увеличенных в размере клеток на фоне сохранившегося монослоя.

По мере адаптации вируса к культуре клеток титр его повы -шлея и достигал максимального уровня на пятом пассаже (культура ФЭК) и составил 7,03±0,22 Ц ЩД50/мл.

В эксперименте по изучению максимальных заражающих доз установлено, что активность вируса ИББ 2-го серотипа при меньшей инфицирующей дозе была нижа чем преле заражения культуры вирусом в высоких дозах. Наиболее активное размножение вируса установ -леко при заражении культуры в дозе 0,01 ЩД50на клетку. ТНтр вируса (штамм "H~92") через 72 часа после инфицирования составил 7,0 + 0,08 % :иД5сА!Л.

При использовании для культивирования вируса ИББ 2-го серо-тлпа штамма "M-S2" перевиваемых линий BGM-70 и Veso установлено,что активность вируса в этих культурах не превышала 4,26±0,18 и 4,71*0,06&} ИДдд/мл соответственно, на уровне 4-го пассажа , несмотря на то, что в процессе пассирования биологическая актив-кость вируса заметно возрастала.

При изучении бляшкообразущэй способности вируса ИББ 2-го серотипа установлена способность вирусной популяции штамма "М-92" образовывать бляшки мелких размеров,.

Изучая влияние различных те-чературнчх факторов на итамм "М-92" вируса ИББ 2-го серотипа определили, что при 4°С он сохраняет своп активность ка протяжении 3 месяцев, при 37°С - ь течение 24 Ч..ЮОВ, при 5S°C - в течение часа.

Вирус ЖБ 2~го серотипа Штамм "М-92") оказался танке устойчивым а эфиру и хлороформу и рН среды при значениях 2,0 и 12,0,

При электронномкроскопическом исследовании различных штаммов вируса ИББ 2-го серотипа выявлены отдельные вирионч и их скопления с характерной икосаэдрической формой . Диаметр ви-риопов составлял 55-58 нм. Вирион не имэл оболочки и содержал на грани по Ь «аясомврос.• . ...

3.3. Получение специфических компонентов для лчмунойзршнт-ного анализа.

Для провелцзния иммуноферментногэ анализа' необходимо получение высокоактивного антигена для сорбции планшетов. С этей целью

использовали зцруссодержащуы культура льнув жидкость (титр Еируеа 7.0±0,12 § ТВД50/мл) согласно Л.Д9В4/.

3 ряде работ имеются сообщения о возмоянссм использования ультразвука с паль» повышения активности антигена. Нами испиты -валось влияние "озвучивания" антигена на его антигенную актив -нооть в ИФА .и биологическую активность. При этом установлено,что обработка вируссодержашей суспензии ультразвуком с амплитудой 12 мкм увеличивает активность вируса ИББ на 0,5-1 Щ КД50/

мл, но не влияет на его активность в ЙФА.

Иммунизацией индюшат вирусом ИББ штамма "М-92" о последую -щей ревакцинацией была получена высокоактивг я гипериммунная сыворотка индеэк против вируса йББ 2-го серотипа. Активность сыворотки составила в ИМ 1:25600.

3.4. Разработка иммуноферментяых тест-систем для выявления антител к вирусу ИББ индеек.

Разработка мшуноферментинх тест-систем: для выявления антител к вирусу ИББ на основе твердофазного ®А с использованием полистироловых панелей вклг ала подбор дозы и условий фиксации антигена, рабочего разведения коныогата, оптимизацию физико-хамич-чосяих параметров проведения ИМ.

При выборе оптимальной дозы сорбируемого антигона учитывали отношение величины оптической плотности (ОД450) положительного контроля (П) к величине ОД450 отрицательного контроля (Н), при различных разведениях вирусоодержащей суспензии. Значение СД450 в лунках с положительным контролем достигало максимума при использовании вируса в разведении 1:2 я в неразведанном состоянии и составило 1,0,Экстинцея продукта пероксидазной реакции отрицательного контроля при использовании неразведанного антигена выше чем при разведении 1:2,что приводит у уменьшении значения ПД(. Следовательно, наиболее оптимальная является исполь зование антигена в разведении 1:2.

При выборе оптимального значения рН буферного раствора для сорбции антигена на полистлроловых планшетах были взяты буферные растворы с рН 4,4; 7,4; 9,5;11,0.'

Анализируя полученные данные по влянию рН раствора на сея-сибалпзаруицу» активность специфического антигена, сдала.®! зк -вод,что интенсивность реакции достигает максимума при рН 7/1 и 9,6. При подборе оптимальных темпоратурно-временных режимов сор£--

II

цен антигена установлено, что насыщение поверхности лунок ноли-стироловых панелей наступало при 37°С через 2 ч, при 20°С - через 4 ч, а при 4°С - через 16 ч. Однако длн удобства нами в дальнейшем сорбция антигена проводилась б течение IG--I8 ч при 4°0.

бедующим ргапо-М при проведении непрямого ИМ-метода является внесение испытуемой сывор'-ока. При наличии у испытуемой сыворотке ansa тел образуется комплексы антиген-аитстело. При последующем введении антииздового копъггата против ладеек антитела свяаутся с антителами коншгата и реакция считается положительной.

При выборе сроков инкубаци™. антител (исследуемых сыворток) и конызгата были использованы следующие параметры : 30, SO, 90, 120 мин. при иемдературе 37°С. На основании полученных резуль-. татов было установлено, что оптимальнее время инкубации на всех этапах 90 мин.

Важным условием при проведении ИФА является выбор оптимального рабочего разведения ноньюгата. С этой целью использовала разведения конъигата 1:100 - 1:3200 при использовании стандартных доз антигена и антител.

Максимальное значение акстшщии положительного контроля (0%с=1,0) установлено при разведениях конъигата 1:100 - 1:800. Однако максимальное значение П/Н равное 10,0 отмечали при раз -ведении конъюгата 1:400 в свял с тем, что при меньших разведениях конъигата увеличивается значение 0Д^50 отрицательного контроля.Это приводит к уменьшению значения G/H.

Специфичность непрямого метода ИФА проверяли путем поста -нозки реакции с нормальными сывороткам индеек и иммунными сыворотками в другим заболеваниям птиц. Данные сыворотки не реагировали в Шк о антигеном вируса ЙББ. Значение экстинщш в лунках с отрицательным контролем было равно значениям экстшщий в лунках без сыворотка.

При визуальной оценке результатов реакции ISA окраску про -дукта ферментативной реакции,полученную при использовании испытуемого материала, сравнивали с окраской, полученной при анализа полстательнсго и отрицательного контоолаЗ. Учет результатов проводили по 4-хкрес?,оЕой системе : -Н-++ - интенсивная коричневая окра сна, -t-н- - коричневая окраска, ++- - .талто-корпчневая окраска, 12

* - желтая окраска, - - окраска отсутствует.

При визуальной оценке результатов реакции ИМ за титр сыворотки принимали такое разведенке его, которое обеспечивает окраску продукта пэроксдцазной реакции на "+".

Сравнение титров сывороток при визуальной и инструментальной оценке показало полное совладение результатов исследований.

Вследствие ограниченности .информации по использовании ИМ" при инфекционных болезнях птиц для оптимизации физико-хвмичео -. клх параметров проведено изучение влияния различных буферных систем на специфичность и чувствительность а^адиза. С этой целью нами были испытаны II различных буферных систем на основе 0,01 М фосфатно-бу^ерного раствора (ФБР) рй 7,4 с включением различных ингредиентов, препятствующих неспешфическсй сорбция : твин- 20; JJa.CZ. ; бычий сывороточный альбумин (БСА). Наилучшие результаты получены при использовании в качестве промывного буфера 0,01 М ФЕР рН 7,4 +с добавлением 1,6%ЖС1 ,0,05% твияа-20 и 0,05?? БСА, который обеспечивает даибольиее значение П/Н при достаточно низком фоне (П/Н=9,0Э).

На заключительном этапе проведения ИМ в качестве субстрата использовали Ортобенилендиамин (ОФД) на цитретно-фосфатном буфере рН 5,0 в присутствии 0,005?' ^^ Для выбора оптимального времени проведения субстратной реакции определяли значение ОД^эд в положительном и отрицательном контролях через 10, 20, 30,40, 50 минут.

Результаты исследований показали,что оптимальное время проведения субстратной реакции 30 минут.

3.5. Испытание имяуноферментного анализа в лабораторных

условиях

Основными методами серологической диагностики инфекционной бурсальной болезни индеек являются реакция нейтрализации п реакция кгдмунофлзворесцвнции. Однако длительные сроки исследования, трудоемкость, потребность в кудатуре клеток , спф-змбрионах п специальном оборудовании ограничивают возможность практического использования данннх методов. В тохе время отсутствие клинических признаков и патологоэнатоипческих изменений при ИББ мцдеок, г также высокая кочтагеозность вируса л козргст ная эосприиичи-

ГЗ

вооть к ному птнд трес„ог быстрой и своевременной диагностики заболевания:.

В наших исследованиях а ска за на возможность применения ИМ для обнаружения в сыворотке крови экспериментально зараженных шуртат специфических антител к вирусу ИБ5.

Отработав методику постановки цммуноферыентной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА, мы поставили перед собой задачу изучить кинетику накопления вируссяецяфических антител в сыворотках крова экспериментально зараженных индюшат.

В опытах использовали ицдапат ?- и 28-суточного возраста. Предварительно у птенцов производили взятие крови. Полученные сыворотки исследовала на наличие антител к вирусу ИББ в РН я ИФА. Индюшат заражали вирусом КЗБ (штамм "''-92") в дозе 10®'^ ЧЦДдо/ид. У зараженных индюшат кавдгй день в течение первой недели, а затем еженедельно брали кровь дли исследований.

По результатам ИФА все исследуемые сыворотки от зараженных индюшат реагировали положительно в ®А через 6 суток после инфицирования.к до конца опыта. При этом каких-либо различий при использовании в качестве антигенов вирусов I и 2 серотша обнару -хено не было. Активность одних и тех же сывороток в ййА как о вирусом 1-го так и с вирусом 2-го серстала была одинакова, что свидетельствует о наличии перекрестной реакции между двумя серо-ишаш и в ИФА участвуют общ: 1 антигенные компоненты.

При сравнительном изучении чувствительности РН а ША было ' установлено, что чувствительность ИФА-теста была наивысшей. Результаты обоих тестов коррелируй® между собой.( £ =0,711).

3.6. Испытание иммуноферментного анализа в производственных

условиях

Учитывая диагностическую ценность и внеоку» информативность серологических методов , направленных на выявление специфических антител, при впизоотологическом обследовании хозяйств, мы сочли необходимым апробировать ИФА с целью выявления антител к вирусу ИН5 в сыворотках крови индеек из разных птицехозяйотв и сравнить данный метод по чувствительности а специфичности с ?Н в полевых условии.

Согласно результатам проведенных исследований титры антител против вируса ИБЕ в ЖА а РН отмечались во всех обследованных 14

хозяйствах . Самый высокий уровень антител был '«регистрирован у индеек 30-суточного возраста из птицефабрики "Березовская" Омской области, который составил 1:11300 в Ж>А и 5,93 в РН, самый низкий - в пробах из хозяйства "Еазерспая" Пензенской области (1:3300 в ММ и 4,18^з 1'1). В реакции нейтрализации били выявлены антитела в низких титрах к вирусу ИЗБ 1-го сероти-да (2,36 Ьд ) у идпвшат 28-35-суточного возраста птицефабрики Молодечненслая". У птиц этого хозяйства такяе определялись ан -титела ко 2-му серотипу вируса ИББ. Ни в одном из хозяйств нэ било зарегистрировано клинического проявления заболевания.

Такт! образом, проведенное обследование ряда вддейковод -ческих хозяйств показало,что .естественная инфекция у индеек вирусом ИББ достаточно широко распространена.

3.70 Использование гипериммунных сывороток млекопитающих при проведении иммуноферментного анализа.

Учитывая результаты предыдущих опытов о непригодности ИФА для определения антител к различным серотипам вируса КЕБ пааи дальнейшие исследования были посвящены поиску подходящей модели для получения иммунных сывороток, пригодных для серотапирова.чия вирусов ИББ в непрямом варианте ГШ..

Неожиданные результаты были по,пучены при использовании в качестве таких недолей хомяков, мышзй и кроликов. Так» полученные на лабораторных животных иммунные сыворотки против вируса ИББ I-го серотша реагировали в 1Ш только с антигеном вируса КББ 1-го серотипа п нэ связывались с вирусом ИББ 2-го серотипа» а сыворотки крови ко 2-му серотийу вируса ИББ давали полояительнув реак -цию с вирусом 2-го серотипа и не реагировали с антигеном вируса ИББ 1-го серотша.

Таким образом, проведенные исследования показа.та, что но -прямой вариант ИФА можно использовать для определения антител к разным серотипам. Однако, для этого необходимо получить гкпер -иммунные сыворотки крови на хомяках , или мылах, или кроликах.

ВЫВОДЫ

I. Исследованиями антигенной структуры выделенных изолктлв и эталонных пташов в перекрестной реакция нейтрализации в ¡гуль-

То

туре клеток установлен два серологических типа вируса ИББ. Ввделениые изо тага "М-92", "СК" и "Омский" по результатам перекрестной реакции нейтрализации отнесены ко второму серотипу в вируса 11КБ,

2. Выявлено различие мегду штаммами 1-го ч 2го серотша вируса инфекционной бурсальноЯ болезни но характеру поражения СПФ-эмбрионов -пур и их рос?а в культуре клеток, а также по вирулентным и серологическим свойствам .

3. Выделанный штамм "М-32" вируса ИББ 2го оеротида кулъш-вирусется на СГ.Ф-змбрионах кур, вызывая гибель и па то логоапь тонические изменения, характерные для ИББ. Максимальное накопление вируса отмечено на 4-ом п. осаже и составило 5,00±0,28 к) ЭЙД50/мл.

4. Экспериментально доказано,что инфекционная бурсальнея болезнь у индеек протекает субкяиничоски при заражении вирусами 1-го ели 2-го серотша.

5. Штаммы вируса ИББ 2го серотипа по результатам биопробы,

а также гистологических исследований фабрициевых сумок заракен-еых птиц' следует отнести к апатогенным штаммам,

6. Вирус инфекционной буреальной болезни 2-го серотша ак - ■ тдвно репродуцируется в культуре клеток куриных фиброблаотов , вызывая выраженный цитопатический эффект. Титр биологической активности вируса в культуре ФЭК составил 6,5^ 0,03 - 7,0^0,12 'ЛШ5С/(.!Л. При заражении перевиваемых клеточн-х культур титр вируса не превышал 4,71±0Д7 и 4,26±0,П в культурах БС1Л-70 и ^его соответственно.

7. Устойчивость штаммов вируса ИББ 2-го серотипа к воздействия кирорастБорителей указывает на отсутствие липздов в сос -таве вириона вирусов. Стабильность биологической активности вируса при изменении температуры и рН среды является показателей их устойчивости в условиях поваленной температуры и я воздействии химических веяеств.

8.Изучена динамика изменения уровня вируснейтрализутацкх антителу индюшат и цыплят, экспериментально зараженных различ-ншя штаммами вируса ИББ.

Установлено, что антитела появляются через 7 дней после заражения и достигай? максимума к четвертой неделе после инфицирования.

Э. Остановлено,что оптимальными параметрами проведения ИФА-тоста при ИББ является :сорбция антигена и инкубация последуе _ 16

мых сывороток при 37°С в течение 2 ч или при 4°С в течение 1618 ч ; инкубация конъвгэта в рабочем разведении 1:400 при 37°С е течение 45 ша юга 1,5 ч при 2С~22°С; проведение субстратной реакции в течение 30 мин ; использование в качестве промывного раствора 0,01 М фосфагно-буферного раствора с добавлением 1,6% J/a-C-ß- ,0,05$ твина-20 и 0,05^ бычьего сывороточного альбумина (pH 7,4 }.

10. Предлагаемый непрямой И£А-тест для диагностики инфекционной бурсальной болезни ивдеек является высокочувствительным методом по сравнению с реакцией нейтрализации и позволяет выявлять антитела на 6-е сутки после инфицирования. Антитела в ИФА методе определялась в течение 8-ми недель (срок наблюдения}.

11. Серотапирование возбудителя инфекционной бурсальной болезни в непрямом методе ИМ следует проводить с применением штаммоспецифичесяих сывороток, полученных на млекопитавдих.

12. Шследованяями в ИФА сывороток крови индеек, доставленных из рш личных птицехозя^ств, установлено наличие антител ккв вирусу инфекционной бурсальной болезни в 94,3%случаях, что свидетельствует о широком распространении данного заболевания среди индеек.

ПРАКТИЧЕСКИЕ! ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагается "Метода--ческие рекомендации по применению иммуноферментного анализа для диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц", для использования в работе ветеринарных лабораторий и научво-исследователь-скюс учреждений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Калынова Г.К., Репликация вирусов инфекционной бурсаль -ной болезни I и 2 сероишов в першнной культуре фибробластов эмбрионов кур // Депонировано в ВИНИТИ.- №2343-в93,М.,1993 -7с.

2. Калнкова Г.К., Некоторые культуральные и физико-химические свойства вируса инфекционной бурсальной болезни индеек/УТе -гисы докл.науч.кон^ер.молодых ученых и аспирантов,ШИТИП, Сергп-ев-Посад, 1933.- с, 14-15.

3. Калнкова Г.К. Диагностика инфекционной бурсальной бо -

левый индеек // Тезисы мокл.науч.кояфер.молодых ученых л аспирантов,- ЕНШЖ,- Сергиев-Посад, 1993.- с.16-17.

4. Калыкова Г.К,,Алиев A.C. Инфекционная бу.-сальная болезнь Едцеок // Тозиоь- докл.науч.конфер.молодых ученых а аспирантов.-ЕСХИ. Екатеринбург, 1992.- c.2ü:„

5. Калыкова Г.К. Вирус инфекционной бурсальной болезни индеек // Тезисы докл. научно-практпчоской коней. "Вирусные болезни сельскохозяйственных яшвотныхТ-ШИИЗЖ.- Владимир,1995.- с. 25ö.

6. Калыкова Г.К.,Алиев A.C. .Белоотоцкая Г.Б. Экспресс-диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек // Тезисы научно-практической kohJ, "Пирусныэ бо-^эни сельскохозяйственных кивот-иых",-БНИИЗЖ.-Владимир, 1995.- 0.251.

7. Калыкова Т.К.,Алиев A.C., Сошш П,Ф.,Еисвао Паритош Ку-;>йр // Чувствительность цыплят к вирусу инфекционной бурсальной болевнк 2 серотила // Труды ШВИ ''Актуальные проблемы ветеринарии" .-С-Яетербург, ISS4.- с; 68-G9.