Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства вируса и лабораторная диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вируса и лабораторная диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА й ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФВДЕРАЦШ ВСЕРОССИЙСКИЙ ^.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССВДОВАТЕЛЬСККЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ,СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТПРЕПАРЛТОВ

На правах рукописи

ЮШКОВА ОТЪНАН КЕНТАЕБНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИГ/СА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННОЙ ЕУРСАЛДОЙ БОЛЕЗНИ ИНДЕЕК .

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на солскание учаной степени кандидата биологических наук

Москва -

1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводстзэ.

Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник АЛИЕВ A.C.

Офихшальяие оппоненты : доктор биологических наук, профессор

осадзз н.г,

кандидат ветеринарных наук СМОЛЕНСКИЙ В.И. .

Ведущая организация : Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины.

90

часов

Запета состоится "5 " Ю9я г. в

на зпсоданш! Специа^гизирозанкого совета Д 120.85.01 при Всероссийском Государственном научно-к^следова! ельсксм институте контроля, стандартизации и сертификации ветнрепаратов по адресу : 123022, Москва, Звэкигородскс? шоссе, 5.

С диссортяпиеЯ можно ознакомиться в библиотека Всероссийского Государственного научнс-ксследовательского .института контроля, стандартизации я сертификации ветпрепаратов.

Автореферат разослан "___" 1Э95 года

Зчоякй секретарь Спеададнзированного совета

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

I.I. Актуальность проблемы. В настоящее время з сзранах о интенсивно развитии промышленным птицеводством одной из важнейших проблем является борьба с инфекционными заболевай. ш нтшг, ореда которых особув опасность представляют заболевания вирусной, этиология из-за их недостаточной изученности,высокой кснтагиоз-ноати, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного материала.

Проблема вирусных болезней преобретает всевозрастающую актуальность еще я по той причине, что ряд пнфояшй от а.та протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной а бактериальной природа/ Кудрявцев Ф.С.,Алаев А.П. ,1984 Алиев A.C. Д894 /.

В последние годи ь напей стране как и во зсох страна" мира широкое распространение получила лпфэкцлышая бурсальнзя болезнь, которая причиняет существенный экономический ущерб промшленному птицеводству»

Особую опасность данное заболевание представляет при субклиническом течении болезни при отсутствии видимых клинических признаков ввиду иммукодепрессизного влияния вируса на организм больных wmißßnhyci et d. ,I"38Q;JKcu> did. ,1Э84/.Шиунодефпяпт у птиц создает опасность возникновения в стяе секондарных инфекций, ведущих к экономическим потерям,размеры которых трудно дажэ пред-полокить'"/Алиев A.C.,1939; jHe. Реггоп et аЛ. ,1882/.

Б течете многих дат считалось.что куры являются единственным видок птиц,восприимчивым д заражению Еирусом инфекционной бурезлькой болезни (ИЕБ)0 Однако в настоящее время установлено [плячие второго серотияа вируса ИББ у индеек, который хотя и а :еет некоторое антигенное родство с вирусом ИББ 1-го евротипа, зо биологически сна существэнно оглнчаются.

Известно„что вирус ИББ 2-гз серотша вызывает в -ргаказме йЕдеек шмунодепрессив из-за морфологических изменений. в бурса je вызывая при этом клинического проявления болезна /£?илл. егЛ ütotitn ,1984; РелЛмап Ь. tnl Hettvt i.».„I935,/

При суб'-лшшческой форме болезни при отсутствии, каких-либо клинических и видимых датологоанатошческих признаков особо важ-зоо значение имеет лабораторная диагностика НЕЕ.

Предлояоянке зарубежными авторами метода для диагностики ИЕБ

3

у индеек (реакция нейтрализации а метод флюоресцирующих антител! яв.литоя довольно трудоемкими и требуют специального оборудования / CfUttlt. М.1. гЛ<1985; Мс. Fevtun p.ial. ,1988; $aJiwo<H chj-etot, 1584/.

Учитывая, что роль вируса 2-го серотипа вируса ИЕБ в патологии птиц до конца не изучена и ранее, в нашой стране исследо -вгния в этом направлении не проводились, а такие не разработаны методы лабораторной диагностики ИЕБ у иццвек изучение данной прс блэмы, разработка и внедрение методов лабораторной диагностики ИЕБ у индеек являются актуальными и имеют большое научное и npai тачоское значение.

1.2.Цель л задяди исследований. Целью настоящих исследований являлась разработка и 'исгагтание. имглуноферментпого метода диагностика ИББ у ивдеек, основанного на выявлении специфических антител к вирусу КЕБ.

В соответствии с поставленной целью.в задачи исследований входило:

1. Изучить биологические.морфологические,культуральныз и антигенные свойства вируса ИББ 2-го серотипа.

2. Разработать и экспериментально обосновать методику постановки иммуноферментного анализа (1®А) для обнаружения антител к вирусу ИББ з сыворотках, крови индеек.

3. Изучить дкагностичекуи ценность ИФА в'сравнении с реакцией нейтрализация (РН) при .диагностике .ИББ индеек.

4. Испытать непрямой вэриакт ИМ для диагностики'ИББ индеек в производственных условиях

1.3 „Научная новизна .Впь'овые в нашей стране выделзаы и иде] тифшшрованн штат® вируса ИББ 2-го серотипа у индюшат, проведено изучение их биологачесаих, серологических и i.., льтуралышх сво] сиз. дане опенка патогенным свойствам вируса ИББ 2-го серотипа для cns-эмбрионов 'кур-, эмерионое уток, цыплят и индюшат. Впервые для серологической, .диагностики вируса ИББ у индеек разработан н< прямой вариант ИМ с использованием отечественных препаратов и реактивов. Дана сравнительная оценка.непрямого варианта IM с р< акцией койтрализацпи'вируса'. Изучена .кинетика накопления антате, к вирусу ЯББ индеек з крови эчспер:шентаЛько зараженных индгаат Установлена высекая чувствительность 1-®А для- диагностики ЯББ ин-

ДЭОК. .

практическая ценность.На осяойзяиа..приведенных' исследовани:

д " . .

~.азра0отана шмунофарментвая тест-система для диагностики инфекционной йурсальн-эй болезни индеек и методические рекоыен -йшш по ее применению в птицевод-эских хозяйствах я нэучно-про-18водотввннку. лабораториях. Показана перспективность применения ;ГФА при проведении массовых серологических исследований. Простора постановки ИМ делаат реальным внедрение его в широкую про -1зводственную практику.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всэсо-озной конференции молодых ученых и вспирантоз (ЕНИТИС,Москва, [993), на Методическом и Ученом советах Всероссийского НИВИ пти-деводства (Санкт-Петербург,1994-95гг.У.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7-ми печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ' страницах машинописного .текста и включает : введение, обзор лы-ге'ратуры, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, бнводы, практические предложения, список литературы я приложение .

Работа иллюстрирована 23 таблицами и 18 рисунками. Слисок литературы включает 303 источника литературы, в том числе 255 зарубеяных авторов.

2 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в отделе вирусологии и вичарш Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птице -водства.

Вирусы. 3 экспериментах аслолззовани'агоаымн вируса ИЫБ индеек : "М-92" ,"СК" и "Омский" , выделенные у индшат из различных хозяйств СНГ и еталонные штаммы вируса КББ: 2-го серотета-"ТУ-89"; ."-ГС-вирулентный "52/70-ÍJ" и вадлинный "ВНИВШ". Все ввдвлен-иые штамма идентифицировали в перекрестной реакции нейтрализации как штаммы вируса ИББ 2-го сероткг;а.

Исследуемые пташьг характеризовали по морфолог теским, куль-туралышм и антигенным свойствам, а также по степени патогеннос-ти для СПФ-эмбрионов кур и уток,а также для восприимчивой птицы и изучали их устойчивость к воздействию физико-химических факторов.

Птица и лаборатонке кивотные. В опытах использовано 420 ин-

5

индюшат, 376 цыплят ра&ного возраста, 840 курлных и 510 утиных, эмбрионов различного срока инкубации, а -также 18 хомячков, 26 белых мышей я 16 кроликов лороды"шиншилла"о

Испытание непрямого варианта ША-теота в производственных условиях проводили исследуя Н80 проб сывороток крови индеек разного возраста.

Культура клеток. Б исследованиях использовали первичнотрип-санизиризаннуп культуру клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), а также перевиваемые культуры BGM-70 я Veto о Б отдельнгк опытах использовали первичную культуру клеток почэк эмбрионов кур (ЗЭК).

Сыворотки. Гипериммунные сыворотки крови индеек и кур к вирусу ЙКБ получали на индшатах и цыплятах, доставленных из хо -зяйетв, благополучных по острым инфакциокнкм заболеваниям» Перед иммунизацией сыворотка крови птиц исследовали на наличие антител против вируса ИББ. В контроле . . использовали иммун-вке сыворотка к гетерологичным вирусам болезней индеек и кур, а также нормальные сыворотки. Гяпериммуняые сыворотки такие получали на хомяках, мышах а кроликах.

Методы. Культивирование вируса ИББ проводили заражением раз-виваюцихся эмбрионов кур.и уток различного срока инкубации. Куриные эмбрионы заражали в желточный мешок, в аллантоасную полость и на хораоналлантоисяуо оболочку. Наличие вируса оценивали по гибели храненных эмбрионов и наличию патологоаиатомичзс-к.их измонэкий.

Для гзучения культурадьных свойств вируса заражали первичные и шрэзиваемнв культуры клеток различного происхождения.

Инфекционный титр вируса определяли в куриных эмбрионах и в культурах маток и расчитывали.по методу Рида и Мента.

Ка всех станах исследований вируссодержащии материал проверяет на стерильность путем высева на мясопэптонный агар, мясо-пезтоаннй бульск, мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом и агар Сабуро. .

Устойчивость вируса ИББ к воздействии фи з ик о -химичо с к их факторов определяли титрованием в .культура клеток до и после обработки его данными факторами.

г.ияшкообразукцув способность вируса изучали по методу,описанному в работе СНо '.ci ai. (I08S).

Электронную микроскопию проводила о целью индикации и вдектификации выделенных штаммов i lpyca ИББ. Препараты для электронной микроскопии готовили пс методу негативного контрасиро-зания и исследовала в электронном микроскопе НЕМ -100 при ускоряющем напряжении 80 kV .

Реакции нейтрализации ставили с использованием ICU ЩЦ^мл а 20 нейтрализующих доз сыворотки, которые определяли титрована-эм вируса и антител.

Индюшат и цыплят заражали интраназально и в грудную шшцу в дозе 0,2 , 0,5 и 1,0 см3. Заражение лабораторных яивотнкх проводили внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно и подкскно. чровь у птицы брали из иодкрыльцовой вены, у кроликов из ушной раковины , у хомяков и мышей ратробульбарным способом.

Статистическую обработку результатов собственных исследований проводили по методикам,.описанным-в руководстве Н.П.Ашма-рша и А.А.Воробьэва£1962).

3. РЕЗУЛЬТАТУ СОБСТВЕННЫХ ИССВДПАЮМ

3.1. Идентификация ввделенных изолятов вируса ИББ индеек.

Б связи с. тем, что эпизоотические штаммы неоднородны в антигенном и иммунологическом отношениях, мы сочли необходимым определить антигенную принадлежность выделенных нами отечественных штаммов вируса ИББ индеек. Для этого -роводгта перекрестную реакцию нейтрализации в культуре клеток. Степень антигенного родства определяли по индексам нейтрализации вируса с гомологичными и гетерологичными сыворотками индтзшат. .

По полученным данным реакции перекрестной нейтрализации вируса ИББ установлено, что выделенные , . штаммы следует отнести к вирусу ИББ 2-го серотипа.Взаимосвязь ввделенных штаммов и эталонного штамма "ТУ-89" вируса ИББ 2-го серотипа была больше 70;t. Антигенное родство выделенных изолятоз со штаммом "ВНИВИП" вируса ИББ 1-го серотипа равнялось нулю. При изучение взаимо -связи между отечественны.':» иэолятами установлено, что сыворотки, полученные к выделенным штаммам нейтрализовали все выделенные штаммы. Степень антигенного родства з последнем случае такие был выше 3%.

3.2. Изучение биологических евойс. . вируса .

При изучении биологических свойств вируса ИБЕ важным лвля-

ется определение степени его патогенности для развивакнщхся эмбрионов. При проведении данных исследований установлено, что ЫФ-эмбрионы кур являются чувствительный к заражению вирусом ИЕБ 2-гс серотипа. Менее чувствительны утиные вибрионы.

Зараженные эмбрионы независимо от используемого для ино -куляидл штамма значительно отставали в росте и развитии. Максимальную табель эмбрионов,как правило, отмечали на 5-6-й суши после инфицирования. У давших эмбрионов отмечали, разлитые геморрагии на коже в области головы, шеи и конечностей. Печень эи-бриоков была ярко желтого ила желтовато-золеного цвета.

Характер изменений при заражении утиных эмбрионов был аналогичным. Однако, гибель утиных эмбрионов в отличие от эмбрионов кур отмечали только в первых двух пассажах, что свидетельствует о низкой степени адаптации вируса к данной системе.

При исследовании, биологической активности вируса ИББ 2-го серотипа установлено,что максимальная инфекционная активность вируса выявлена в гомогенатах тушек зародышей и хорионалланто-исной оболочке (ХАО) зараженных эмбрионов.

Сравнительное изучение методов заражения СПФ-экбряонов ( в аллаятоясяуи полость, в желточный мешок и на ХАО) показало,что наиболее пригодным для получения объективных данных при выделении, идентификации и титращш вируса ИЕБ 2-го серотипа является метод заражения на ХАО эмбрионов.

Следующим этапом при изу ник биологических свойств вкде -ленных изолятов являлось определение степени их патогенности для згег.рщйгшвой птицы. С этой целью проводили экспериментальное заражение индюшат и тгтят выделенными и эталонными птамма-ка вируса ИББ. При этом установлено„что введение индюшатам в разном возраста Еируса ИББ 2-го -серотипа (шта-ч "М-92") не приводило к вдшическому проявлению болезни, однако вызывало мик -роскодические поражения в фабриаиевой сумке зараженной птицы.

При аграленил илдюиат виру лент.чым штаммом 1-го серотипа "52/70--Ы" тайна не наблюдали клинических и патологоанатомичес-

КИХ K3V.SHCHr.fi,

При .исследовании в РН сывороток крови зараженных птенп.ов установлено наличие антител к вирусу ИББ-

Янокуляидя г.ыпля'там выделенных и эталонных штаммов вируса ИББ 2-го серотипа не вызывало клинических признаков л патолого-анатомичэсккс изменений, характерных для 1ШГ>. С

При заражении пнплнт эталоннш виру .яентным штаммом "52/70-!1" установлено клиническое проявле .ие заболевания с выраженными клиническими признаками и характерными для ИББ патологоанатоми-чосяпли изменениями у павшей птицы. Клинические признаки проявлялись в виде угнетения, отказа от корна,диареи, сопровоздаю-цейся выделением беловато-желтого помета. Продолжительность заболевания составила 7-8 суток. Отход птицы составил 60?.

Таким образом, проведенные исследования показали, что штаммы вируса ИББ 2-го серотипа являются апатогенннми для цыплят и индюшат. Введение индюшатам вирулентного штамма "52/70-М" вируса ИВЕ 1-го серотипа не вызывало клинического проявления забо -левакия и патологоанатомяческих изменений в органах, в то вре.мя как инокуляция его цыплятам чувствительного возраста сопровоя -далось ярко выраженной клиникой и патолсгоанетомичес-кой картиной заболевания.

В опытах по изучению динамики накопления вируснейтраллзую-щих антител к вирусу ИББ установлено, что штаммы вируса ИВБ как первого тик и второго серотипов способны вызыг ть в организме индеек и кур образованно вкрусспецифетеских антител и динамика их накопления различается в зависимости от используемого серотипа и вида птицы.

Еируснейтралиэувщнэ антитела к 1-му и 2-му серотипак у индеек еыявляли через 7 дней после инфицирования у всех птенцов, кроме группы индюшат, зараженных в суточным возрасте вирусом штамма "52/70-1.!". Однако, средний геометрический титр антител при введении штамме "М-92" был выше, чем при заражении штаммом "52/70-Г.Г.

Пик максимального накопления антител :< обоим сэротипам вируса определяли на 4-й неделе после инфицирования. Затем наступал заметный спад титров, который для штамма "М-92" наблюдали до когща опыта .

В настоящее время в качестве биологической модег для выделения и культивирования вирусов широко используются культуры тканей различного происхождения. /Голубев Д.Б. и сотр.,1986/.

Для изучения кульгуральных свойств выделенных изолятое вируса ИББ 2-г" серотипа проведен отбор имеющихся б нашем распо -ряжении клеток длч культивирования и накопления вируса НЕ!.

В первичной культуре ФЭК и ПЭК цитопатотеннкй *а§ект(ИПЭ),

от воздействия вируса ИББ 2-го серотипа наблюдали через 72-96 часов. ЦПЭ характеризовался появлением очагсв дегенерации клетоя, состоящих из отдельных округлнх слегка увелсчсэнных в размере клеток на фоне сохранившегося монослоя.

По мере адаптации вируса к культуре клеток титр его повы -шалея и достигал максимального уровня на пячж пассаяе (культура ФЭК) и составил 7,03i0,22 Ш50/мл.

Б эксперименте по изучению максимальных заражающих доз установлено, что активность вируса ИББ 2-го серотипа при меньшей инфицирующей дозе была кияэ чем преле заражения культуры вирусом в высоких дозах. Наиболее активное размножение ьируса установ -лено при заражении культуры в дозе 0,01 ТЦД50на клетку. Титр вируса (штамм "I'-92") через 72 часа после инфицирования составил ?,о + 0,08 ф ад5сДл. /

При использовании для культивирования вируса ИББ 2-го серотипа штамма "М-92" перевиваемых линий BGM-70 и У его установлено,что активность вируса в этих культурах не превышала 4,26±0,18 и 4,71^0,06 tg ЩД5д/(лл соответственно, на уровне 4-го пассаяа , несмотря на то, что в процессе пассирования биологическая актив-кость вируса заметно возрастала.

При изучении блшккообразующэй способности вируса ИББ 2-го серэтила установлена способность вирусной популяции штамма "М-92" образовывать бляшка мелких размеров.

Изучая влияние различных те"чературных факторов на итэмм "М-92" вируса ИББ 2-го серотипа определили, что при 4°С он сохраняет своп активность на протяжении 3 месяцев, при 37°С - в течение 24 часов, при 5о°С - в течение часа.

Вирус ИББ 2~го серотипа Чпггамм "М-92") оказался также устойчивым я афиру и-хло^юформу и рН среды при значениях 2,0 и 12,0.

При электроиномикроскопическом исследовании различных штаммов вируса ИББ 2-го серотипа выявлены отдельные вирионы и их скопления с характерно?! икосаэдрической формой . Диаметр вя- . риопов состаэлял 55-58 нм. Вираон не имел оболочки и содержал на грани по Ц капсомеро^. 'V..-

3.3. Получение: специфических кошонентов для игмуносрершнт-ного анализа. ■

Для ¡тс о ко лдз кия пмг.:у н оформз н тн ого анализа необходимо .получение высокоактивного антигена для сорбции планшетов.. С зтей целью Т.0

использовали зируссодержащум куль тура льнув жидкость (титр вируса 7.0±0,I2 ^ ЩД50/ыл) согласно VottemJ. eJ~d£. /1Э84/.

3 ряде работ имеются сообщения о возможности использования ультразвука с целью повышения активности антигена. Нами лопыты -валось влияние "озвучивания" антигена на его антигенную актив -ность в ИМ .и биологическую активность. При этом установлено,что обработка вирусоодержашей суспензии ультразвуком о амплитудой 12 мкм увеличивает активность . вируса ИББ на 0,5-1 eg ЩД50/ мл, но не .влияет на его активность в ИФА,

Иммунизацией индюшат вирусом ИББ штамма "М-92" о последую -щей ревакцинацией была получека высоиоактивг я гиперяммунная сыворотка индеек против вируса ИББ 8-го серотипа. Активность сыворотки состагила в ША 1:25600.

3.4. Разработка иммуноферментных тест-систем дня выявления антител к вирусу ИББ индеек.

Разработка ишуноферментных тест-систем для выявления антител к вирусу ИББ на основе твердофазного ША с использованием по-лаотироловых панелей еклг ала подбор дозы и условий Фиксации антигена, рабочего разведения конъюгата, оптимизацию физико-хтшч-чоских параметров проведения ИЗД.

При выборе оптимальной дозы сорбируемого антигена учитывали отношение величины оптической плотности (ОД450) положительного контроля (П) к величине отрицательного контроля '(II), при

различных разведениях шруссодержащей суспензия. . ...

Значение С.Я^д в лунках с положительным контролем достигало максимума при использовании вируса в разведении 1:2 я в неразведен-ном состоянии и составило I,О.Экстинция продукта пероксидазной реакции отрицательного контроля при использовании неразведенного антигена зыиэ чем при разведении 1:2,что приводит у уменьшении значения П/if. Следовательно, наиболее оптимальная является ясполь зование антигена в разведении 1:2.

При выборе оптимального значения рН буферного раствора для сорбции антигена на полистироловых планшетах были взяты буферные растворы с рН 4,4; 7,4; 9,6;11,0.

Анализируя полученные данные по влянию рН раствора на сенсибилизирующую активность специфического антигена, сделали вы -вод,что интенсивность реакции достигает максимума при рН 7/1 и 9,6. При подборе оптимальных температурно-времекных режимов сорб-

П

ции антигена установлено, что насыщение поверхности лунок ноли-отироловых панелей наступало при 37°С через 2 ч, при 20°С - через 4 ч, а при 4°С - через 16 ч. Однако длн удобства нами в дальнейшем сорбция антигена проводилась в течение 16-18 ч при 4°С.

Следующим ртаком при проведении непрямого ИМ-метода является внесение испытуемой сывор^оки. При наличии в испытуемой сыворотке антител образуются комплексы антиген-антитело. При последующем введении лнтялддового конъюгата против-^} иддеек антитела свяжутся с антителами конъюгата и реакция считается положительной.

При выборе сроков инкубаци". антител (исследуемых сыворток) и конъюгата были использованы следующие параметры : 30, S0, 90, 120 мин. при иемпературе 37°С. На основании полученных резуль-. татов было установлено, что оптимальное время инкубации на всех этапах 9G мин.

Важным условием при проведении ИФА является выбор оптимального рабочего разведения конъюгата. С этой целью использовала разведения конъюгата 1:100 - 1:3200 при использовании стандартных доз антигена и антител.

Максимальное значение экстинциа положительного контроля (0J^5q=I,Ü) установлено при разведениях конъюгата 1:100 - 1:800. Однако максимальное значение П/Н равное 10,0 отмечали при раз -ведении конъюгата 1:400 в свя. д с тем, что при меньших разведениях конъюгата увеличивается значение ОД450 отрицательного контроля.Это приводит к уменьшению значения П/Н.

Специфичность непрямого метода ИФА проверяли путем посте -новки реакции с нормальными сыворотками индеек и иммунными сыворотками к другим заболеваниям птиц. Данные сыворотки не реагировали в ИФА с антигеном вируса ИББ, Значение экстинции в лунках с отрицательным контролем было равно значениям экстинцай в лунках без сыворотки.

При визуальной оценке результатов реакции ИФА окраску про дукта ферментативной реакции,полученную при использовании испытуемого материала', сравнивали с окраской, полученной при анализе положительного и отрицательного контроле?:. Учет результатов проводили по 4-хкрестовоЯ системе : -н-++ - интенсивная коричневая окраска, н-н- - коричневая окраска, ++ - телто-коричневая окраска, 12

+ - желтая окраска, - - окраска отсутствует.

При визуальной оценке результатов реакции ММ за титр сыворотки принимали такое разведенке его, которое обеспечивает окраску продукта пэрокслдазной реакции на "+".

Сравнение титров сывороток при визуальной и инструментальной оценке показало полное совладение результатов исследований.

Вследствие ограниченности .информации по использованию ИМ' при инфекционных болезнях птиц для оптимизации физико-химичео -ких параметров проведено изучение влияния различных буферных систем на специфичность и чувствительность ь.,аднза. С этой целью нами были испытаны II различных буферных систем на основе 0,01 М фосфатно-буферного раствора (ФБР) рН 7,4 с включением различных ингредиентов, препятотвуших неспецифическсй сорбция : твин- 20; ЛаО. ; бычий сывороточный альбумин (БСА). Наилучшие результаты получены при использовании в качестве промывного буфера 0,01 М Ш рН 7,4 +с добавлением 1.6%Ж& ,0,05% твива-20 и 0,055? ПСА, который обеспечивает наибольшее значение П/Н при достаточно низком фоне Ш/Н=9,0Э).

Ка заключительном этапе проведения ША в качестве субстрата использовали Ортофеяилендиамин (ОЗЩ) ка цитратно-фосфатном буфере рН 5,0 в присутствии 0,005$ Ь^О^. Лля выбора оптимального времени проведения субстратной реакции определяли значение ОД^д в положительном и отрицательном контролях через 10, 20, 30,40, 50 минут.

Результаты исследований показали,что оптимальное время проведения субстратной реакции 30 минут.

3.5. Испытание иммуноферментного анализа в лабораторных

услов:шх

Основные«! методами серологической диагностики инфекционной бурсальной болезни индеек являются реакция нейтрализации п реакция иммунофлюоресцэнции. Однако длительные сроки исследования, трудоемкость, потребность в культуре клеток , спф-эмбрионах и специальном оборудовании ограничивают возможность практического использования данных методов. В токе время отсутствие клинических признаков :: патологсенатомических изменений при ИББ ипдоок, е также высокая контагиозяость вируса л возраст ная эоспряимча-

73

вооть к ному птиц трес„ют быстрой и своевременной диагностики заболевания.

В наших исследованиях показана возможность применения ИМ для обнаружения в сыворотке крови экспериментально зараженных ищглат специфических антител к вирусу КББ.

Отработав методику постановки иммунофврментной тест-системы на основе непрямого варианта Шк, мы поставили перед собой задачу изучить кинетику накопления вирусспецифических антител в сыворотках крова экспериментально зараженных индюшат.

В опытах попользовала индюшат 7- и 28-суточного возраста. Предварительно у птенцов производили взятке крови. Полученные сыворотки исследовали на наличие антител к вирусу ИЕБ в РП я ИФА. Индюшат заражали вирусом КЗБ (штамм "М-92") в дозе I06,3 '■¡ЦД^о/мл. У зараженных индюшат каждый день в течение первой недели, а затем еженедельно брали кровь для исследований.

По результатам ИФА все исследуемые сыворотки от зараженных индюшат реагировали положительно в Шк через 6 суток после инфицирования.и до конца опыта. При этом каких-либо различий при использовании в качестве антигенов вирусов I и 2 серотипа обнару -жено не было. Активность одних и тех же сывороток в Ш>А как о вирусом 1-го так и с вирусом 2-го серотипа была одинакова, что свидетельствует о наличии перекрестной реакции между двумя серо-типами и в ИФА участвуют общ: э антигенные компоненты.

При сравнительном изучении чувствительности РН и ША было установлено, что чувствительность ИЗД-теста была наивысшей. Результаты обоих тестов коррелирунн между собой.( t =0,711).

3.6. Испытание иммуноферментного анализа в производственных

условиях

Учитывая диагностическую ценность а высокую информативность серологических методов , направленных на выявление специфических антител» при эпизоетологичееком обследовании хозяйств, мы оочли необходимым апробировать ИФА с целью выявления антител к вирусу ИББ в сыворотках крови индеек из разных птицехозяйств и сравнить данный метод по чувствительности u специфичности с ?Н в полевых условиях.

Согласно результатам проведенных исследований титры.антител против вируса ИБЕ в Шк и РН отмечались во всех обследованных-14

хозяйствах . Самый высокий уровень антител был чарегистрирован у индеек 30-суточного возраста ив птицефабрики "Березовская" Омской области, который составил 1:11300 в И$А и 5,93 в РП. самый низкий - в пробах из хозяйства "Вазерская" Пензенской области (1:3800 в ИуА и 4,18 Ыв 14). В реакции нейтрализации были выявлены антитела в низких титрах я вирусу ИЗБ 1-го серотипа (2,36 Ь>2 ) индюшат 28-35-суточного возраста птицэфабрики Мояодэчненскэя". У птиц этого хозяйства также определялись ан -титела ко 2-му серотипу вируса ИББ. Па в одном из хозяйств на было зарегистрировано клинического проявления заболевания.

Таким образом, проведенное обследование ряда индейкоаод -ческих хозяйств показало,что естественная инфекция у индеек вирусом ИББ достаточно широко распространена.

3.7с Использование гинериммуиных сывороток млекопитающих при проведении иммуноферментного анализа.

Учитывая результата предыдущих опытов о непригодности ИФА для опредолзния антител к различным серотипам вируса ИББ наши дальнейшие исследования были поавящены поиску подходящей модели для получения иммунных сывороток, пригодных для серотипирования вирусов КЕБ в непрямом варианте ®А.

Неожиданные результаты были получены при использовании в качества таких моделей хомяков, мышей и кроликов. Так„ получонные . на лабораторных животных иммунные сыворотки против вируса ИББ I-го серотипа реагировали в ИЭА только с антигеном Бируса ИББ 1-го серотипа и не связывались с вирусом ИББ 2-го серотипа» а сыворотки крови ко 2-му серотипу вируса ИББ давали положительную реак -цию с вирусом 2-го серотипа и не реагировали с антигеном вируса ИББ 1-го серотипа.

Таким образом, проведенные исследования показали, что на -прямой вариант ИМ можно использовать для определения антител к разным серотипам. Однако, для этого необходимо получать гипер -иммунные сыворотки крови на хомяках , или мышах, или кроликах.

ВЫВОДЫ

I. Исследованиями антигенной структуры выделенных изолктсв и эталонных аташов в перекрестно;!, реакция нейтрализации з куль-

15

туре клеток установлено два серологических типз вируса ИББ. Выделенные изстаты "М-92", "СК" и "Омский" по результатам перекрестной реакции нейтрализации отнесены ко второму соротнпу вируса ИБЕ.

2. Выявлено раз.шние мегду штаммами 1-го ч 2го серотша вируса инфекционной бурсальнем болезни по характеру поражения СПФ-эмбрионов кур н их роста в культуре клеток, а также по вирулентным и серологическим свойствам .

3. Еыделенный тгада "М-Бй" вируса ИЕБ 2го серотипа культи-вируоется на СЕФ-ш5рионах кур, вызывая гибель и патологоапатощие ские изменеаия, характэрнко для КЕБ. Максимальное накопление вируса отметено на 4-ом п. оса те к составило 5,00±0,28 ЭВДздДш.

4. Экспериментально доказсно.что инфекционная бурсальная болезнь у индеек протекает субклинически при заражении вирусами 1-го ели 2-го серотипа.

5. Штаммы вируса ИББ 2го серотша по результатам биопробы, а также гистологических исследований фабрициевых сумок заратен-еых птиц следует отнести к апатогенным штаммам,

6. Вирус инфекционной буроальной болезни 2-го серотша ак -тдвно репродуцируется в культуре клеток куриных фиброблзотов , вызывая выраженный цитопатический эффект. Титр биологической активности вируса в культуре ФЭК составил 6,5^ 0,03 - 7,0±0,12 ^ ЩДзд/мл. При заражении перевиваемых клеточн"х культур титр вируса не превышал 4,71±0Д7 и 4,26±0,П в культурах БСГЛ-70 и соответственно.

7. Устойчивость штаммов вируса ИБЕ 2-го серотипа к воздействию хЕрорастворителей указывает на отсутствие лшшдов в сос -таве вириона вирусов. Стабильность биологической активности вируса при изменении температуры и рН среды является показателем их устойчивости в условиях повышенной температуры и к воздействии химических веществ.

8.Изучена динамика изменения уровня вируснейтрализующих антител у индюшат и цыплят, экспериментально зараженных различными штаммами вируса ИЕБ.

Установлено, что антитела появляются через 7 дней после заражения и достигают максимума к четвертой неделе после инфицирования.

Э. Остановлено,что оптимальными параметрами проведения ИФА-теста при ИББ являются :сорбция антигена и инкубация исследуе _ 16

mux сывороток при 37°С в течение 2 ч или при 4°С в течение 1"6-18 ч ; инкубация конъюгэта в рабочем разведения 1:400 при 37°С е течение 45 мин или 1,5 ч яри 2С-22°С; ироведекие субстратной реакции в течение 30 мин ; использование в качестве .промывного раствора 0,01 М фосфатно-буферного раствора с добавлением 1,6% J/a.C£- ,0,05$ твина-20 и 0,05!? бычьего сывороточного альбума-на(рН 7,4 ).

10. Предлагаемый непрямой ИФА-тест для диагностики инфекционной бурсальной болезни ивдеек является высокочувствительным методом по сравнению с реакцией нейтрализации и позволяет выявлять антитела на б-s сутки, после инфицирования. Антитела в ША методе определялись в течение 8-ми недель (срок наблюдения).

11. Серотипирование возбудителя инфекционной бурсальной■болезни в непрямом методе ©А следует проводить с применением штаммоспецифическкх сывороток, полученных на млекопитающих.

12. Исследованиями в ИМ сывороток крови индеек, доставленных из рг8 личных птмцехозя^ств, установлено наличие антител ккв вирусу инфекционной бурсальной болезни в 94,ЗУ-случаях, что свидетельствует о широком распространении данного заболевания среди индеек.

ПРАКТИЧЕСКИЙ ПР2ДЛ0ЖНКИЯ

На основании проведенных исследований предлагается "Метода--ческие рекомендации по применению иммуноферментного анализа для диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц", для использования в работе ветеринарных лабораторий и научно-исследовательских учрезздекий.

СПИСОК РАБОТ, ОШЪШКОВАНШХ ПО ТЕМЕ 'ДИССЕРТАЦИИ:

1. Калыкова Т.К., Репликация вирусов инфекционной бурсаль -пой болезни I п 2 серэтшов в первичной культуре фибробластов эмбрионов кур // Депонировано в ВИНИТИ,- Д2343-вЭЗ,М.. 1993 -7с.

2. Калыкова Г.К., Некоторые культуральные и физико-химические свойства вируса инфекционной бурсальной болезни индеек//Те -'гиен докл.науч.кон^ер.молодых ученых и аспирантов,ШИТИП, Серги-ев-Посад, 1993,- с, 14-15.

3. Калыкова-Г.К. Диагностика инфекционной бурсальной бо -

лезки индеек // Тезисы докл.науч.конфер.молодых "ученых и аспирантов.- ЕНИТИП,- Сергиев-Иосад, 1933.- о.16-17.

4. Калыковя Г.К. .Алиев A.C. Инфекционная булсальная болевн* индеек // Т<ззиоь- докл. науч. конфер .молодых ученых а аспирантов.-ЕСШ. Екатеринбург, 1992.- с.21.

5. Калыкова Г.К. Вирус инфекционной бурсальной болезни индеек // Тезисы докл. научно-практической конф. "Влрусные болезни сельскохозяйственных ашвотных?-ЕНИИЗЖ,- Бладимир,19Э5,- с. 25Ü.

6. Калыкова Г.К..Алиев А.С.,Белостоцкая Г.Б. Экспресс-диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек // Тезисы научно-практической конф, "Зирусные боязни сельскохозяйственных кивот— ных" .-ШШЖ.-Владиьшр, 1995,- с.251.

7. Калыкова Г.К..Алиев A.C., Сошш П.Ф..Бисвас Паритои Ку-мар // Чувствительность цыплят к вирусу инфекционной бурсальной (!олезнм 2 серотипа // Труды СПБИ ''Актуальные проблемы ветеринарии" .-С-Петербург, 1994.- с; 68-69,