Разработка биотехнологии фукозы и исследование ее биологических функций

Санина, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологии фукозы и исследование ее биологических функций
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии фукозы и исследование ее биологических функций"

На правах рукописи

Санина Татьяна Викторовна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ФУКОЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ

Специальность 03.01.06 -Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

16ИЮН2011

Воронеж 2011 г

4849940

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия»

Научный руководитель: заслуженный работник высшей школы РФ,

доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Румянцева Галина Николаевна

ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

кандидат технических наук

Сысоева Марина Геннадьевна

ФГОУ ВПО «Воронежский государственный

аграрный университет им. К. Д. Глинки»

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская государственная

академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова»

Защита состоится «29» июня 2011 г в 15.°° ч на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.035.06 при ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия» по адресу: 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 19.

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные гербовой печатью учреждения, просим направлять по указанному выше адресу на имя ученого секретаря совета доц. Г. П. Шуваевой.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия». Автореферат размещен на официальном сайте академии: www.vgta.vrn.ru.

Автореферат разослан «27» мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время в мировой науке накоплен обширный материал, свидетельствующий о важной роли «минорных» Сахаров в основных физиологических процессах млекопитающих. Особую биологическую роль играет фукоза (б-дезокси-Ь-галактоза).

Современный интерес к производству фукозы вызван ее иммуностимулирующими свойствами и определяющей ролью во многих типах реакций межмолекулярного и межклеточного узнавания.

Наиболее доступными природными источниками фукозосодержащих полисахаридов служат водоросли родов Fucus и Laminaria, однако использование биомассы этих растений в качестве сырья для производства фукозы затруднено из-за отсутствия простых и недорогих методов их расщепления. Промышленное производство фукозы и фукозосодержащих олигосахаридов отсутствует как у нас в стране, так и за рубежом.

Одним из перспективных способов получения фукозы является ферментативный гидролиз фукоиданов - матричных полисахаридов бурых водорослей. В настоящее время коммерческих препаратов ферментов, способных расщеплять сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует. Сведения о выделенных и охарактеризованных на сегодняшний день фукозидазах немногочисленны, большинство из них обладают низкой активностью и являются 1,2-экзофукозидазами, вследствие чего не способны гид-ролизовать фукоидан водорослей, содержащий преимущественно 1,3-, 1,4- и 1,6-фукозидные связи.

В связи с вышеизложенным, задача поиска продуцента фукозидазы, способной эффективно расщеплять фукоидан, и разработки способа получения фукозы из растительного сырья путем ферментативного гидролиза, является весьма актуальной.

Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» при поддержке Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы, Госконтракт № П 260 от 23.07.2009 г.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биокаталитической технологии фукозы и исследовании ее влияния на иммунный статус и репродуктивную функцию организма.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- изучение различных видов растительного сырья в качестве источников получения фукоиданов и оптимизация способа их выделения;

- выбор активного продуцента фукозидазы среди микроорганизмов и определение оптимальных условий биосинтеза фермента;

- получение ферментного препарата фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;

- разработка технологии ферментативной деструкции фукоидана;

- изучение пребиотических свойств фукозы и ее полимеров;

- определение влияния фукозы на иммунный статус и репродуктивную функцию млекопитающих.

Научная новизна. Впервые получен ферментный препарат фукозидазы Aspergillus awamori ВКМ F-808, способный гидролизовать фукоидан бурых водорослей до фукозы. Впервые разработана биотехнология фукозы из биомассы бурых водорослей с применением ферментного препарата.

Практическая значимость.

На основании результатов исследований уровня антителообразования опытных животных и степени фукозилирования ооцита впервые практически подтверждено положительное влияние фукозы на иммунный статус и репродуктивную функцию млекопитающих. Разработана биотехнология фукозы, основанная на ферментативном гидролизе фукоидана бурых водорослей, которая может найти применение при производстве лекарственных средств и биологически активных добавок иммуностимулирующего и пребиотического действия в фармацевтической и пищевой промышленности, что позволит расширить спектр подобных препаратов.

«Фармобразование-2010», 2-ом международном конгрессе «Евразия-Био» (Москва, 2010 г), симпозиуме некоммерческого партнерства институтов РАН «ОрХиМед» «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ» в рамках конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (Санкт-Петербург, 2010 г), международном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2011», международном симпозиуме «Ökologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2010).

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», отмечена медалью за лучшую научно-исследовательскую работу. Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.»

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ, в том числе 2 в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (2 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 134 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 29 рисунков и 14 таблиц. Библиография включает 132 наименования, в т. ч. 107 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследования.

ГЛАВА I. Обзор литературы. Осуществлен аналитический обзор литературных данных по исследованию биологических свойств фукозы, источников сырья для получения фукозы и способов ее выделения. Представлен анализ отечественных и зарубежных исследований, касающихся продуцентов различных фукозидаз. Отмечено, что не найдено продуцентов ферментов, способных эффективно гидролизовать фукоидан бурых водорослей, промышленное производство фукозы для нужд фармацевтической и пищевой промышленности отсутствует и показана перспективность работ по разработке способов получения фукозы и исследованию ее влияния на иммунитет и репродуктивную функцию млекопитающих in vivo.

ГЛАВА И. Объекты, материала и методы исследовании. Схема экспериментальных исследований представлена на рис.1

Рисунок 1. Схема теоретических и экспериментальных исследований

Объектом исследования служила чистая культура микроскопического гриба Aspergillus awamori ВКМ F-808, которую поддерживали на агаризован-ном пивном не охмеленном сусле, культивировали жидкофазным способом на несменяемой среде в колбах емкостью 750 см3, содержащих по 250 см3

питательной среды заданного состава, в шейкере-инкубаторе Infers в течение 72 ч при температуре 30 - 35 °С.

Для определения пребиотических свойств углеводов использовали бактерии Bifidobacterium bifidum, как наиболее значимые представители нор-мобиоценоза кишечника. Культивирование бифидобактерий проводили на модифицированной среде Блаурокка. Объектом исследования также служили лабораторные мыши линии NMRI, самцы и самки весом 22-27 г, полученные из филиала института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова.

Определение активности фукозидазы осуществляли по методу Ди-ше, основанному на способности фукозы при кипячении с сильными минеральными кислотами образовывать 5-метилфурфурол, в отличие от других гексоз, благодаря чему возможно ее дифференцированное определение. За единицу активности фукозидазы принимали такое количество фермента, которое образует 1 мМоль фукозы за 1 мин в стандартных условиях.

Математическое планирование эксперимента. Для изучения влияния технологических факторов на процесс экстракции фукоидана с целью повышения его выхода, был реализован активный эксперимент по системе центрального композиционного униформ-ротатабельного планирования. Далее была проведена оптимизация процесса экстракции фукоидана.

Выделение ферментного препарата. По окончании выращивания мицелий гриба отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Далее выделяли фермент из культуральной жидкости осаждением. Осаждение ферментного препарата проводили различными органическими растворителями (96 %-ным этанолом, изопропанолом и химически чистым ацетоном) при температуре 2 - 4 °С. Для формирования осадка смесь выдерживали 30 мин. Осадок отделяли на рефрижераторной центрифуге при 3000 об/мин и высушивали при комнатной температуре.

Определение степени гидролиза фукоидана. Реакционную смесь, содержащую 1 мл водного раствора фукоидана с концентраций 1%, 1 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 и 100 мкл раствора фермента выдерживали при 30 °С в течение заданного времени. Затем определяли количество свободной фукозы по методу Дише. Исходя из количества образовавшейся фукозы, рассчитывали степень гидролиза.

Определение молекулярной массы продуктов гидролиза фукоидана.

Молекулярную массу продуктов гидролиза фукоидана определяли с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в трис-буфере при рН 8,6 в течение 1,5 ч при 100 В, после чего продукты гидролиза фукоидана окрашивали 0,5% раствором толуидинового голубого в течение 1 часа и затем отмывали в 1% растворе уксусной кислоты в течение 4 ч.

Общие биохимические и микробиологические методы исследований. Содержание белка в пробах определили по методу Лоури, величину pH - потенциометрически, микроскопирование культур осуществляли с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse 200.

Исследование пребиотической активности. Осуществляли культивирование бактерий Bifidobacterium bifidum in vitro на средах с различными источниками углерода. Культивирование бактерий проводили на среде Блау-рокка в модификации Г.И. Гончаровой. В ряде опытов в качестве источника углерода вместо лактозы добавляли инулин, маннозу, фукозу, фукоидан, гид-ролизат фукоидана (уравновесив по массе углерода). Были исследованы in vitro пребиотическая активность инулина из плодов цикория (Raftiline), фуко-зы, фукоидана из водорослей Fucus vesiculosis (молекулярная масса 170-200 кДа), гидролизата фукоидана (молекулярная масса 30-40 кДа).Накопление биомассы В. bifidum определяли нефелометрически, биохимическую активность бифидобактерий определяли по нарастанию активной кислотности среды.

Определение уровня антителообразования. Использовалась классическая схема иммунизации, когда введение антигена проводится с полным и неполным адъювантом в два этапа. Мыши были иммунизированы внутри-брюшинно афинно-очищенной карбоангидразой, выделенной из эритроцитов быка (AbD Serotec, США), по 50 мкг/особь. Первая иммунизация была проведена с полным адъювантом Фрейнда (Sigma, USA). Вторую иммунизацию проводили через 14 дней, используя неполный адъювант Фрейнда (Sigma, USA). Вторичный иммунный ответ измеряли после окончания 35-дневного курса применения фукозы.

Для определения вторичного иммунного ответа через 14 дней после вторичной иммунизации карбоангидразой выделяли сыворотку крови опытных животных и определяли в ней концентрацию антител с помощью имму-ноферментного анализа. В качестве антигена использовали карбоангидразу эритроцитов быка (AbD Serotec, США). Антителами служили антитела козы к IgG мыши, коньюгированные с биотином (StressGen Biotechnologies, Канада). Оптическую плотность измеряли при 405 нм на спектрофотометре Titertek Multiscan МСС/340, (Flow Laboratories, Финляндия).

Определение степени фукозилирования ооцита. У подопытных животных вызывали суперовуляцию путем последовательной инъекции сыворотки жеребых кобыл и хорионического гонадотропина внутрибрюшинно. Через 24 часа выделяли неоплодотворенные яйцеклетки путем промывания яйцеводов физиологическим раствором. Яйцеклетки инкубировали в растворе лектина Ulex europaeus (Sigma, США), коныогированного с FITC, затем отмывали физиологическим раствором и микроскопировали на флюоресцентном микроскопе при длине волны >.=494 нм. О степени фукозилирования мембраны ооцита судили по

изменению интенсивности свечения. Математическую обработку полученных микрофотографий для оценки интенсивности свечения мембраны ооцита проводили с помощью пакета ТЬС-тапа§ег 4.0.1.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 5-7 -кратном повторении. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведены в каждом опыте, достоверными считали различия с уровнем значимости я=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА III. Разработка биокаталитической технологии фукозы из растительного сырья

В чистом виде фукоза практически не встречается в природе. Наиболее богаты фукозой полисахариды бурых водорослей, в которых фукоза находится в виде фукоидана - сложного сульфатированного полисахарида. Содержание фукоидана в различных видах водорослей представлено в табл. 1.

Таблица 1 - Содержание фукоидана в различных видах водорослей (Аминина и др., 2007)____

Вид водоросли Содержание фукоидана, %CB Вид водоросли Содержание фукоидана, %CB

Laminaria japónica 2,54 Kjellmanella crassifolia 3,32

L. bongardiana 3,6 Sargassum pallidum 4,0

L. cichorioides 2,88 Fucus evanescens 6,04

Cystoseira crassipes 5,4 F. vesiculosis 7,2

В качестве источника сырья для выделения фукоидана для дальнейшего гидролиза с целью получения фукозы были выбраны водоросли вида Fucus vesiculosis, как отличающиеся максимальным содержанием фукоидана среди доступных на территории России водорослей. В качестве исходного способа выделения фукоидана из растительного сырья была принят метод разделения водорастворимых полисахаридов водорослей (Шевченко и др., 2004). С помощью методов математического моделирования был оптимизирован процесс экстракции фукоидана. В качестве основных факторов были выбраны температура проведения процесса, концентрация кислоты и продолжительность экстракции, в качестве критерия оптимизации - выход фукоидана. Проведение экстракции фукоидана в оптимальных условиях позволило повысить его выход с 4,8 до 5,6 % от воздушно сухой биомассы водоросли.

С целью поиска продуцента фукозидазы, способной расщеплять фу-коидан водорослей и перспективной для промышленного применения, был проведен скрининг микроорганизмов - потенциальных продуцентов фукози-даз. Для скрининга были отобраны представители родов, наиболее часто упоминаемых в литературе как продуценты фукозидаз: микромицеты рода

Aspergillus, бактерии родов Bacillus, Clostridium, Alteromonas, актиномицеты родов Thermus и Streptomyces, а также штаммы высокоактивных продуцентов карбогидраз из музея чистых культур кафедры микробиологии и биохимии ВГТА (всего 52 штамма). Скрининг проводили на минимальной агаризован-ной модифицированной среде Чапека с 1% фукоидана в качестве единственного источника углерода. Критерием отбора служила интенсивность роста микроорганизма на данной среде, указывающая на его способность расщеплять фукоидан до фукозы. По результатам скрининга для дальнейшего изучения были отобраны культуры, показавшие максимальную способность к росту. Для определения активности фукозидазы отобранные культуры микроорганизмов выращивали на жидкой среде Чапека с добавлением 1% фукоидана из водоросли Fucus vesiculosis. По результатам определения активности фукозидазы в культуральной среде при глубинном культивировании был выбран штамм A. aw amor i ВКМ F-808, показавший максимальную фукозидазную активность.

Известно, что микромицеты, как правило, синтезируют внеклеточные гликозидазы. Для определения локализации исследуемого фермента активность фукозидазы определяли в фильтрате культуральной жидкости и в биомассе мицелия гриба. Активность фукозидазы в биомассе мицелия не превышала 5 % от активности в культуральной среде, что указывает на внеклеточную локализацию фермента. Далее все опыты проводили с культуральной жидкостью.

Исследование влияния различных источников углерода и биосинтез фукозидазы.

Продолжительность культивирования, ч

Рисунок 2 - Зависимость активности фукозидазы от источника углеводного питания: 1 -фукоидан, 2 - фукоза, 3 - манноза, 4 - галактоза, 5 - ксилоза, 6 - глюкоза

Дозировка фукоидана,

Рисунок 3 - Зависимость активности фукозидазы от дозировки фукоидана

Исследования влияния источников углерода на биосинтез фукозидазы проводили на стандартной среде Чапека, поочередно варьируя качественный и количественный состав источников углерода (рис. 2, 3). Из представленных на рис. 2 данных видно, что максимальная активность фукозидазы была отмечена на среде с фукоиданом и фукозой, что свидетельствует об индуци-бельном характере фермента. Из рис. 3 видно, что наибольшая активность фукозидазы достигалась при внесении в среду 0,5% фукоидана.

Исследование влияния различных факторов на биосинтез фукозидазы. Известно, что на биосинтез ферментов оказывает определенное влияние ряд условий, среди которых величина рН, температура культивирования и интенсивность аэрации играют основную роль.

Исследование влияния исходного значения рН среды на биосинтез фукозидазы А. шатоп ВКМР-808 показало (рис. 4 а), что данный продуцент проявляет способность к биосинтезу фермента в широком диапазоне значений рН от 4,0 до 8,0, максимальный биосинтез наблюдался при рН 7,0. Отклонение рН питательной среды от оптимальных для синтеза фермента значений как в кислую, так и в щелочную сторону влечет за собой значительное снижение активности фукозидазы в культуральной жидкости.

6,5 7 7,5

рН.ед

25 30 35 40 Температура, оС

Рисунок 4 - Зависимость активности фукозидазы от рН среды (а) и температуры культивирования (б)

1 зо- I 2В1 JH20" #

100 - j0 « is 80, о " El 60- ¡В и 40 -

л ^15-£ а> § 10-

8 5 £ 20- I 0-

s ь 5 о,

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Продолжительность культивирования, ч

100 150 200 250 300 350 400 450 500 Объем питательной среды, дмЗ

Рисунок 5 - Динамика накопления Рисунок 6 - Влияние интенсивности

активности фукозидазы 11 аэрации на активность фукозидазы

На рис. 4 б показано влияние температуры на биосинтез фукозидазы A. awamori ВКМ F-808. Культивирование проводили при начальном значении рН питательной среды равном 7,0. Из представленных данных видно, что температура 30 °С обеспечивала наибольшее значение ферментативной активности. Увеличение температуры до 45 °С значительно угнетало синтез фермента, активность которого составляла не более 42 % от максимальной.

Исследование динамики биосинтеза фукозидазы при оптимальных значениях рН и температуры показало, что максимум активности фукозидазы достигался к 72 часам культивирования микромицета (рис.5).

Условия аэрирования создавали, помещая колбы на круговую качалку со скоростью 150 об/мин. Интенсивность аэрации культивирования микроскопических грибов A. awamori ВКМ F-808 варьировали изменением объема питательной среды в качалочных колбах емкостью 750 см3 от 100 до 500 см3 (с интервалом 50 см3). Максимальное значение фукозидазной активности было получено при соотношении объема воздуха к объему среды 2:1 , что соответствовало 250 см3 среды.

Таким образом, были определены оптимальные параметры культивирования для выбранного продуцента фукозидазы A. awamori ВКМ F-808: температура 30°С, рН 7,0, концентрация вносимого в качестве индуктора фукои-дана 0,5%, продолжительность культивирования 72 ч, соотношение объема воздуха к объему среды 2:1. При таких условиях активность фукозидазы достигала 35 ед/мл.

Разработка условий осаждения ферментного препарата. Известно, что для получения ферментных препаратов широко используется осаждение органическими растворителями - этанолом, ацетоном, изопропанолом.

Для изучения условий осаждения и влияния природы органических растворителей на полноту осаждения фукозвдазы мы использовали этанол 96,5 %, изопропанол 98 %, химически чистый ацетон. Максимальный выход фукозидазы (91,3 %) был получен в случае осаждения этанолом, при его концентрации в смеси 66,0 % (в объемном соотношении культуральная жидкость: этанол - 1: 2).

Исследования по влиянию рН на полноту осаждения фукозидазы из культуральной жидкости A. awamori ВКМ F-808 проводили при концентрации растворителей 66 %. Результаты показали, что при использовании в качестве осадителя этанола оптимальным является рН 6,5, следовательно, изоэлектри-ческая точка находится в зоне рН 6,5-7,0 и фермент обладает нейтральными свойствами.

Как известно из литературных данных, штамм A. awamori ВКМ F-808 продуцирует широкий спектр гидролитических ферментов: амилазу, инули-назу, инвертазу, маннаназу, глюканазу. [Мустафаев и др., 1990]. Полученный

спиртоосажденный ферментный препарат помимо фукозидазы с активностью 2310 ед/г, содержал также мананназу - 1240 ед/г, инвертазу - 750 ед/г, глюканазу - 630 ед/г, инулиназу - 240 ед/г.

Исходя из целей работы, а именно, применения ферментного препарата фукозидазы для гидролиза фукоидана, необходимо было исследовать основные физико-химические характеристики фермента с целью создания оптимальных для его действия условий при проведении гидролиза фукоидана водорослей.

Выбор оптимальных условий гидролиза фукоидана. Нами был исследован процесс гидролиза фукоидана спиртоосажденным препаратом фукозидазы с активностью 2310 ед/г.

Действие ферментного препарата зависит от ряда факторов, наиболее важными из которых являются рН реакционной среды, дозировка ферментного препарата, температура, при которой протекает процесс гидролиза, а также его продолжительность.

Для выбора оптимальных условий гидролизу подвергался раствор с массовой долей фукоидана 10%. Об эффективности гидролиза судили по количеству образовавшейся фукозы, определяемой по методу Дише.

На рис. 7 представлена зависимость степени гидролиза фукоидана от дозировки ферментного препарата фукозидазы. Фермент вносили в количестве 1-10 ед/г фукоидана. Из рус. 7 видно, что дозировка 6 ед/г обеспечивала максимальную степень гидролиза фукоидана, равную 84,2 %. Более высокая концентрация фермента не способствовала значительному увеличению степени гидролиза.

0 1 2 3 4 5 6

Продолжительность гидролиза, ч

Рисунок 7 - Зависимость степени гидролиза фукоидана от дозировки ферментного препарата

Далее исследовали влияние температуры на степень гидролиза фукоидана в интервале 20-50 °С при дозировке 6 ед/г. Как видно из табл. 1, при рос-

-«-1 ед/г -*-2 ед/г -*-4 ед/г -а-6 ед/г -»-8 ед/г 10 ед/г

те температуры до 30 °С степень гидролиза возрастала, а затем снижалась, что, видимо, объясняется инактивацией фермента.

Таблица 1 - Влияние температуры на степень гидролиза фукоидана (СГ, %)

Температура, °С СГ, % при продолжительности гидролиза, ч

1 2 3 4 5 6

20 14,3 38,1 46,3 62,2 77,3 78,2

30 18,1 36,2 58,2 66,2 80,2 83,9

40 16,2 29,3 42,3 55,2 60,2 61,3

50 12,8 30,1 38,4 45,4 54,3 54,8

Зависимость степени гидролиза фукоидана от рН реакционной среды представлена в таблице 2 (дозировка фермента 6 ед/г, температура 30°С). Из таблицы видно, что фермент наиболее активен в нейтральной среде, оптимум рН 7,0. В кислой среде при рН 4,0 за 5 часов гидролиза выход фукозы составлял около 30%, а при оптимальном рН 7,0 выход фукозы достигал 84% за то же время.

Таблица 2 - Влияние рН среды на степень гидролиза фукоидана (СГ, %)

рН СГ, % при продолжительности гидролиза, ч

1 2 3 4 5 6

4,0 8,9 14,6 19,4 23,7 29,6 30,5

5,0 13,1 24,8 39,6 44,3 48,2 49,7

6,0 17,2 34,6 57,9 62,4 78,9 79,2

7,0 18,3 35,2 59,1 65,8 83,8 84,1

8,0 16,8 33,1 45,8 59,2 71,8 72,4

Для определения продолжительности, обеспечивающей максимальную степень пиролиза, была исследована динамика процесса гидролитического расщепления фукоидана в оптимальных для действия фукозидазы условиях: рН 7,0, температура 30°С, дозировка фермента 6 ед/г (рис. 8). Из представленных данных видно, что максимальная степень гидролиза, равная 84,1%, наблюдалась за 5 ч гидролиза. Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза не приводило к увеличению степени гидролиза.

Характер действия фукозидазы на фуковдан исследовали, прежде всего, с помощью электрофореза (рис. 9). В качестве метчиков использовали высокомолекулярный (120 кДа) и низкомолекулярный (20 кДа) декстран-сульфат, а также бычий лакго-феррин (80 кДа). Из представленных данных видно, что к концу третьего часа в гадро-яизате еще присутствует незначительное количество олигомеров фукозы, которые полностью расщепляются лишь к концу 5 ч гидролиза.

Продолжительность гидролиза, ч

0.5 1 1.5 2 2.5

Продолжительность гидролиза, ч

Рисунок 8 - Зависимость выхода фукозы от продолжительности гидролиза

Рисунок 9 -Зависимость молекулярной массы продуктов от продолжительности гидролиза

По результатам проведенных экспериментов были установлены рациональные параметры процесса гидролиза фукоидана: дозировка ферментного препарата 6 ед/г, температура 30 °С, рН 7,0, продолжительность 5 ч. При таких условиях степень гидролиза фукоидана составляла 83-85%, что является достаточно высоким показателем и демонстрирует пригодность данного способа гидролиза для промышленного применения. Установленные рациональные параметры процесса гидролиза фукоидана послужили основой для разработки лабораторного регламента получения фукозы. На рис. 10 представлена технологическая схема производства фукозы из водоросли Fucus vesiculosis.

ГЛАВА IV. Исследование биологической активности фукозы

Изучение пребиотических свойств фукозы. По данным Института питания РАМН, в России наблюдается ухудшение состояния здоровья всех категорий населения, что в первую очередь связано со снижением иммунитета и полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. Не вызывает сомнения тот факт, что коррекция микробиоценоза кишечника должна являться базисной составляющей терапии значительного количества заболеваний человека. Один из путей поддержания нормальной микрофлоры кишечника - использование пребиотиков - веществ, являющихся субстратным и энергетическим материалом для пробиотической микрофлоры (бифидо- и лактобактерий).

Рисунок 10 - Схема производства фукозы из биомассы водоросли Fucus vesiculosis

Пребиотическую активность исследуемых углеводов оценивали по накоплению биомассы бифидобактерий и изменению активной кислотности среды. Полученные данные представлены на рис. 11 и 12.

Из представленных данных следует, что изменение величины рН, характеризующее интенсивность метаболических процессов у бифидобактерий, коррелировало с накоплением биомассы клеток. Максимальное снижение рН наблюдалось на всех испытываемых средах к 42 часам культивирования, наиболее интенсивное накопление кислот и биомассы бифидобактерий происходило на средах с фукозой и гидролизатом фукоидана.

Рисунок 11 - Динамика накопления органических кислот бифвдобакте-риями на средах с различными углеводами

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что введение в состав питательной среды фукозы и фукоолигосахарвдов оказывало выраженное стимулирующее влияние на биосинтез бифидобактерий, что свидетельствует о пребиотической активности фукозы и ее полимеров.

-в—контроль инулин манноза

-фукоидан

-фукоидан гид ролизованный -фухоза

18 24

Продолжительность

культивирования, ч

Рисунок 12 - Динамика накопления биомассы бифидобактерий на средах с различными углеводами

Исследование влияния фукозы на иммунный статус млекопитающих. Иммуноглобулины представляют собой гликопротеины, являющиеся основными инструментами иммунной системы и содержащиеся в плазме крови и в тканевой жидкости всех млекопитающих. В состав углеводной цепи иммуноглобулинов входят преимущественно манноза, галактоза и фукоза, причем фукоза всегда играет роль терминального сахара. Есть основания полагать, что при отсутствии в плазме крови минорных Сахаров, возможно нарушение синтеза углеводных цепей иммуноглобулинов и, соответственно, снижение их активности. Нами была поставлена задача исследования влияния фукозы в диете млекопитающих на иммунный статус и определения наиболее эффективной дозировки фукозы.

В эксперименте использовали мышей-самцов, разделенных 4 группы: 1 контрольную и 3 опытных, получавших фукозу в дозировке 40, 80 и 160 мг/кг соответственно. Фукоза была растворена в воде в концентрациях, обеспечивающих ежедневное потребление указанных доз. Мыши 2, 3 и 4 групп получали раствор фукозы вместо воды за 7 дней до первичной иммунизации и далее в течение всего эксперимента. Мыши контрольной группы получали воду. Из рис. 13 видно, что уровень антителообразования во всех опытных группах был выше, чем в контроле, что свидетельствует о положительном влиянии различных концентраций фукозы на иммунный статус опытных животных. Наиболее высокий уровень антителообразования был отмечен у жи-

вотных, получавших фукозу в дозировке 80 мг/кг.

разведения

Рисунок 13 - Влияние различных концентраций фукозы на уровень антителообразования у мышей

Изучение влияния фукозы на репродуктивную функцию опытных животных. Известно, что наружная оболочка яйцеклетки состоит из глико-протеиновых молекул, которые включают значительное количество фукозы, непосредственно участвующей в распознавании и адгезии сперматозоида (Intra et al, 2006, Lutjen et al, 1986). Следовательно, при недостатке фукозы могут возникать нарушения в процессе формирования яйцеклеток и их оплодотворения. В связи с этим было исследовано влияние включения фукозы в рацион опытных животных на степень фукозилирования оболочки ооцита и эффективность оплодотворения.

В экспериментах использовали мышей-самок: контрольную группу животных, не получавших фукозу, и опытную группу животных, получавших фукозу из расчета 80 мг/кг. Мыши опытной группы получали раствор фукозы в течение 30 дней перед выделением яйцеклеток, мыши контрольной группы получали воду. Затем у животных вызывали суперовуляцию и выделяли неоп-лодотворенные яйцеклетки.

На рис. 14 представлен пример внешнего вида яйцеклетки, способной к оплодотворению (а), и дефектной (б). Количество яйцеклеток вида (а) среди выделенных яйцеклеток в контрольной группе составило 25%, в опытной

группе - 75%, что свидетельствует о повышении доли способных к оплодотворению яйцеклеток в опытной группе.

Рисунок 14 - Вид яйцеклетки, дефектной (б") (увеличение 400х)

Для определения степени фукозилирования ооцита использовали способность лектина 1Лех выгорает, коньюгированного с флуоресцином, избирательно связываться с фукозой. О степени фукозилирования мембраны ооцита судили по изменению интенсивности свечения. Результаты по исследованию степени фукозилирования ооцита в контрольной и опытной группах животных представлены на микрофотографиях (рис. 15), из которых видно, что интенсивность свечения, а, следовательно, и степень фукозилирования яйцеклеток опытной группы выше, по сравнению с контрольной.

Рисунок 15- Степень флюоресценции типичной яйцеклетки контрольной (а) и опытной (б) групп животных (увеличение 400х)

Яйцеклетки опытной группы животных имеют значительно большее содержание фукозы в оболочке, кроме того, фукоза равномерно распределена по поверхности ооцита. Оболочка яйцеклетки контрольной группы животных содержит значительно меньше фукозы и, кроме того, имеет неоднородности в структуре. После математической обработки изображения с помощью пакета программ ТЬС-тапацег 4.0.1 было установлено, что интенсивность свечения, а, следовательно, и степень фукозилирования яйцеклеток опытной группы выше на 13,5%. Из полученных данных можно сделать вывод, что увеличение доли способных к оплодотворению яйцеклеток с 25 до 75% и степени фуко-

зилирования ооцита на 13,6 % при введении в рацион опытных животных фукозы в дозировке 80 г/кг массы косвенно свидетельствует о положительном влиянии фукозы на репродуктивную функцию опытных животных.

Положительное влияние фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих было подтверждено в исследованиях по определению рождаемости в опытной и контрольной группах животных, где прирост рождаемости в опытной группе составил 50 % по сравнению с контролем. В табл. 3 представлены данные, характеризующие влияние фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих.

Таблица 3 - Влияние фукозы на репродуктивную функцию опытных животных

Наименование показателя Контрольная группа Опытная группа

Количество способных к оплодотворению яйцеклеток, % 25 75

Степень фукозилирования ооцита, % 46,8 53,2

Количество детенышей в помете, шт. 6±1 9+1

Применение фукозы способно значительно улучшить репродуктивную функцию живого организма, что открывает путь к созданию на основе фукозы биологически активных и кормовых добавок для повышения плодовитости сельскохозяйственных животных.

ВЫВОДЫ

1. Источником сырья для получения фукозы являются водоросли Fucus vesicuiosis, отличающиеся максимальным содержанием фукоидана, достигающим 7,2 %. Оптимизация условий экстракции фукоидана из биомассы водорослей рода Fucus с помощью методов математического моделирования позволила повысить выход фукоидана с 4,8 % до 5,6 %.

2. Микромицет Aspergillus awamori ВКМ F-808 синтезирует внеклеточную фукозидазу с активностью 35 ед/мл при следующих условиях культивирования: температура 30°С, рН 7,0, концентрация вносимого в качестве индуктора фукоидана 0,5%, продолжительность культивирования 72 ч.

3. Максимальная степень гидролиза фукоидана фукозидазой A. awamori, составляющая 84%, обеспечивается при рН 7,0, температуре 30°С, дозировке фермента 6 ед/г, продолжительности гидролиза 5 ч.

4. Разработанная биотехнология получения фукозы из доступного растительного сырья позволяет достичь выхода фукозы 4,7% от воздушно сухой биомассы водоросли.

5. Выраженное стимулирующее действие фукозы и ее полимеров на биосинтез бифидобактерий В. bifidum in vitro указывает на их пребиотические свойства.

6. Увеличение уровня антителообразования при введении в рацион млекопитающих фукозы в дозировке 80 мг/кг свидетельствует о положительном влиянии фукозы на их иммунный статус.

7. Увеличение доли способных к оплодотворению яйцеклеток с 25 до 75% и степени фукозилирования ооцита на 13,6 % при введении в рацион опытных животных фукозы в дозировке 80 г/кг массы косвенно свидетельствует о положительном влиянии фукозы на репродуктивную функцию опытных животных. Повышение рождаемости в опытной группе животных на 50% подтверждает положительное влияние фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Фукоза: биологическая роль, пути получения и перспективы применения / Д. А.Черенков, Ю. А. Рыбаков, Т. В.Санина, Н. А Шкарин, О. С. Кор-неева, Д. А. Складнев // Биотехнология - 2010. - №6. - С. 63-71.

2. Исследование бифидогенной активности фукозы и ее полимеров / Т. В. Санина, С. В. Кирьянова, И. В.Черемушкина, О. С Корнеева // Вестник ВГУ: Серия: Химия. Биология. Фармация.-2011 -№1,- С. 141-143.

3.Korneeva, О. S. Ulilization of underutilized marine resources in order to obtain minor sugars /О. S. Komeeva, Т. V. Sanina // Euro-eco Hannover 2010, das internationale symposium "Okologishe, technologishe und rechtlice aspecte der lebensversorgung", Hannover, 2-3 dezember 2010, - program abstracts. - P. 57-58

4. Санина, Т. В. Биологическая роль фукозы и перспективы ее применения / Т. В. Санина, О. С. Корнеева // Материалы всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Воронеж: ВГТА, 2009. -С.77-79.

5.Корнеева, О. С. Перспективы применения фукозы в фармацевтической промышленности /О. С. Корнеева, Т. В. Санина, Д. А. Черенков // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ: материалы 4-ой Всероссийская с международным участием научно-методической конференция «Фармобразование-2010»: Воронеж: ИПЦ ВГУ, 2010. - С.215-217.

6. Биотехнология углеводов пребиотического и иммунотропного действия /О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Д. А. Черенков, Т. В. Санина, Е. П. Анохина, А. С. Глушенко, О. Ю. Божко // 2-ой международный конгресс «Евра-зия-Био» - 2010, Москва, 13-15 апрель 2010. С.98-99

7. Разработка способов получения минорных Сахаров / И. В. Черемушкина, Т. В. Санина, Е. П. Анохина, А. С. Глушенко, О. С. Корнеева //Материалы

ежегодной конференции РХО им. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и продуктов», Москва, 2010. -С. 121-122

8. Санина, Т. В. Разработка технологии фукозосодержащих олигосахари-дов из растительного сырья./ Т. В. Санина, О. С. Корнеева // Тезисы докладов Симпозиума некоммерческого партнерства институтов РАН «ОрХиМед» «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ» в рамках конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» Петербург. - 2010. - С. 335

9. Санина, Т. В. Перспективы биотехнологических способов получения фукозы и ее биологическая роль /Т. В. Санина, Д. А. Черенков // Материалы XLVIII отчетной научной конференции за 2009 год: в 3 ч.: Воронеж: ВГТА, 2010.-С. 55

10. Корнеева, О. С. Биотехнологические способы получения фукозы /О. С. Корнеева, Т. В. Санина, Д. А. Черенков// В мире научных открытий. -2010.-№4(10).- С. 95-96

11. Выделение фукоидана из водоросли Fucus vesiculosis и исследование его фракционного состава / О. С. Корнеева, Д. А. Черенков, Т. В. Санина, А. И. Шматова // «Новое в технике и технологии пищевых производств»: материалы международной научно-практической конференции, Воронеж, ВГТА 30 июня-2 июля 2010, с. 101-103

12. Разработка биокаталитической технологии фукозы и исследование ее влияния на иммунный статус живого организма / Т. В. Санина, Д. А. Черенков, С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и развитие», часть 2 (Москва 21-25 марта, 2011 г.) М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Менделеева, 2011 - С. 285 - 286

13. Исследование бифидогенной активности минорных Сахаров / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина. Т. В. Санина, Е. П. Анохина // Материалы 13-го славяно-балтийского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2011», С-Пб, 2011.-С.121

14. Санина, Т. В. Разработка биотехнологии фукозы / Т. В. Санина, О. С. Корнеева //«Инновационные технологии на базе фундаментальных научных разработок»: сб. тр. регион, науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, Воронеж, 14—16 марта 2011 года. С. 21-23

15. Санина, Т. В. Исследование влияния фукозы на репродуктивную функцию живого организма / Т. В. Санина, С. В. Кирьянова, Д. А. Черенков / Материалы XIЛХ отчетной научной конференции за 2010 год: в 3 ч., Воронеж: ВГТА., 2011 - С. 28.

Работы №1,2 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печага 26.05 2011. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 147

ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия» (ГОУВПО «ВГТА») Отдел полиграфии ГОУВПО «ВГТА» Адрес академии и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Санина, Татьяна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Строение и химические свойства фукозы.\ q

1.2 Фукоза в живых организмах.

1.2.1 Метаболизм фукозы.

1.2.1.1 Путь de novo.

1.2.1.2 Путь непосредственного фосфорилирования фукозы.

1.2.1.3 Другие пути метаболизма фукозы.

1.3 Строение и свойства фукоиданов.

1.4.1 Химические способы получения фукозы.

1.4.2 Способы получения фукозосодержащих олигосахаридов

1.4.3 Биохимические способы получения фукозы. Микроорганизмы - продуценты фукозидаз.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.1.1. Культивирование микроскопического гриба Aspergillus awamori В KM F-808.

2.2. Методы исследования.

2.2.1 Определение активности a-L-фукозидазы.

2.2.2 Определение степени гидролиза фукоидана.

2.2.3 Биохимические и микробиологические методы исследования.

2.2.4 Получение спиртоосажденного фермента.

2.2.5 Определение уровня антителообразования.

2.2.6 Определение степени фукозилирования ооцита.

2.2.7 Статистическая обработка данных.5 ^

2.3 Схема экспериментальных исследований.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ

ТЕХНОЛОГИИ ФУКОЗЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ.

3.1 Подбор источников фукоиданов из растительного сырья.

3.2 Выделение фукоидана из биомассы бурых водорослей.

3.2.1 Моделирование и оптимизация процесса экстракции фукоидана с использованием экспериментальностатистического подхода.

3.3 Поиск активного продуцента а-Ь-фукозидазы.

3.4 Выбор оптимальных условий культивирования продуцента фукозидазы.

3.4.1 Изучение влияния источников углерода на биосинтез фукозидазы.

3.4.2 Исследование влияния различных факторов на синтез фукозидазы.

3.4.3. Разработка условий осаждения ферментного препарата

3.5 Ферментативная деструкция фукоиданов.

3.5.1 Выбор оптимальных условий гидролиза фукоидана.

3.6 Разработка лабораторного регламента получения фукозы.

3.6.1 Получение фукозы из растительного сырья.

ГЛАВА 4.ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ФУКОЗЫ.

4.1 Изучение пребиотических свойств фукозы.

4.2 Исследование влияния фукозы на иммунный статус млекопитающих.

4.3 Изучение влияния фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих.Ю

РАСЧЕТ СЕБЕСТОИМОСТИ ФУКОЗЫ ПО ПРЕДЛАГАЕМОЙ у!

ТЕХНОЛОГИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологии фукозы и исследование ее биологических функций"

Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации и формирования иммунитета (Luther et al, 2009, Becker and Lowe, 2003). Гликаны клеточной поверхности представляют собой структуры, состоящие из линейных и разветвлённых цепей полисахаридов, содержащих фукозу. Отличительной характеристикой фукозы является её присутствие в терминальном положении, и отсутствие внутри олигосахаридных цепей гликоконьюгатов млекопитающих (Péterszegi et al, 2003). Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации и формирования неспецифического иммунитета. Установлено, что нарушение синтеза фукозилированных гликанов вызывает хронический иммунодефицит и недоразвитость ткани тимуса (Park et al., 2007, Ali et al, 2008). Абнормальное фукозилирование часто наблюдается при различных заболеваниях человека, включая рак, и часто связано с нарушением синтеза фукозидаз.

Необычайно важна роль молекул фукозы в репродуктивных процессах позвоночных. Установлено, что остатки фукозы, сконцентрированные на поверхности яйцеклетки, обеспечивают адгезию сперматозоида к оболочке ооцита. Сперматозоиды содержат фермент фукозидазу, локализованный на акросоме. Предполагается, что с помощью этого фермента обеспечивается адгезия сперматозоида к оболочке ооцита (Intra et al, 2006, Lutjen et al, 1986).

Одним из перспективных способов получения фукозы является ферментативный гидролиз фукоиданов — матричных полисахаридов бурых водорослей. В настоящее время коммерческих препаратов ферментов, способных расщеплять сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует. Сведения о выделенных и охарактеризованных на сегодняшний день фукозидазах немногочисленны, большинство из них обладают низкой активностью и являются 1,2-экзофукозидазами, вследствие чего не способны гидролизовать фукоидан водорослей, содержащий преимущественно 1,3, 1,4- и 1,6-фукозидные связи.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- получение ферментного препарата фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;

- разработка технологии ферментативной деструкции фукоидана;

- изучение пребиотических свойств фукозы и ее полимеров; определение влияния фукозы на иммунный статус и репродуктивную функцию млекопитающих.

Практическая значимость. На основании результатов исследований уровня антителообразования опытных животных и степени фукозилирования ооцита впервые практически подтверждено положительное влияние фукозы на иммунный статус и репродуктивную функцию млекопитающих. Разработана биотехнология фукозы, основанная на ферментативном гидролизе фукоидана бурых водорослей, которая может найти применение при производстве лекарственных средств и биологически активных добавок иммуностимулирующего и пребиотического действия в фармацевтической и пищевой промышленности, что позволит расширить спектр подобных препаратов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2009-2010 гг.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2010, 2011 гг.); 4-ой Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Фармобразование-2010», 2-ом международном конгрессе «Евразия-Био» (Москва, 2010 г), симпозиуме некоммерческого партнерства институтов РАН «ОрХиМед» «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ» в рамках конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (Санкт-Петербург, 2010 г), международном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2011», международном симпозиуме «Ökologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Санина, Татьяна Викторовна

выводы

1. Источником сырья для получения фукозы являются водоросли Fucus vesiculosis, отличающиеся максимальным содержанием фукоидана, достигающим 7,2 %. Оптимизация условий экстракции фукоидана из биомассы водорослей рода Fucus с помощью методов математического моделирования позволила повысить выход фукоидана с 4,8 % до 5,6 %.

5. Выраженное стимулирующее действие фукозы и ее полимеров на биосинтез бифидобактерий В. bifidum in vitro указывает на их пребиотические свойства. t

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе выполнения данной работы был выбран продуцент высокоактивной фукозидазы A. awamori ВКМF-808 и определены оптимальные условия его культивирования, а также подобраны условия осаждения ферментного препарата.

Оптимизация условий экстракции фукоидана из биомассы водорослей рода Fucus с помощью методов математического моделирования позволила повысить выход фукоидана с 4,8 % до 5,6 %. Экспериментально были подобраны и обоснованы условия проведения ферментативного гидролиза фукоидана с помощью полученного ферментного препарата.

Наиболее эффективно гидролитическое расщепление фукоидана с помощью фукозидазы A. awamori 808 протекает при 30 С, рН 7.0, дозировке фермента 6 ед/г, продолжительности гидролиза 5 ч.

Были изучены некоторые биологические свойства полученного препарата фукозы и установлено, что включение фукозы в диету млекопитающих оказывает положительное влияние на иммунный статус и репродуктивную функцию опытных животных (о чем свидетельствуют повышение уровня антителообразования и степени фукозилирования ооцита, а также повышение рождаемости в опытной группе животных). Кроме того, выявлена пребиотическая активность фукозы и ее полимеров.

Достоинством предлагаемой технологии является низкая себестоимость продукта, получаемого путем ферментативного гидролиза фукоидана бурых водорослей. Применение разработанной технологии в пищевой и фармацевтической промышленности позволит расширить спектр производимых препаратов пребиотического и иммуностимулирующего действия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Санина, Татьяна Викторовна, Воронеж

1. Аминина, Н. М. Состав и возможности использования бурых водорослей дальневосточных морей / Н. М. Аминина и др. // Вестник ДВО РАН. 2007. - №7. - С. 123-130.

2. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф., Коровкин. М.: Москва, 1988 г. - 704 с.

3. Биология и микробиология: учебное пособие / Г.П. Шуваева и др.. Воронеж, гос. технолог, акад. Воронеж, 2003. - 300 с.

4. Бойцов, А.Г. Описание пребиотиков / А.Г. Бойцов, В.Г. Лифляндский // Лечение дисбактериоза. — С-Пб.: Нева. 2003. - С. 179181.

5. Бывальцев, А.И. Моделирование и оптимизация технологических процессов отрасли : практикум по курсу: учеб. пособие / А.И. Бывальцев, Н.М. Дерканосова, A.A. Журавлев. Воронеж, гос. технол. акад. Воронеж, 2004. - 140 с.

6. Грачев, Ю.П. Математические методы планирования эксперимента /Ю.П. Грачев, Ю.М. Плаксин. М. : ДеЛи принт, 2005. - 296 с.

7. Диксон, М. Ферменты. В 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М. : Мир, 1982. - 1118 с.

8. Иммуностимулирующее влияние перорального введения бифидобактерий различных штаммов в эксперименте / Э.Н. Трушина и др. // Вопросы питания. 2006. - Т. 75. - № 5. - С. 70 - 74.

9. Кочетков, Н.К. Химия углеводов Текст. / Н.К. Кочетков, А.Ф. Бочков, Б.А. Дмитриев. М.: Химия, 1967. - 672 с.

10. Новик, Г.И. Исследование физико-биохимических особенностей бифидобактерий на поздних стадиях развития популяций / Г. И. Новик, Н.И. Астапович, A.A. Самарцев // Микробиология. 2001. -Т. 70. - № 4. - С. 495-502.

11. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. М. : Мир, 1997. - Т. 1. -С. 180-252.

12. Пат. № 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии. Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН.

13. Пат. № 2207370 Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549Т -продуцент фукоидан-гидролазы и питательная среда для его культивирования. Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН.

14. Пат. № 2247574. Средство, обладающее антикоагулянтным и иммунотропным действием. Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН.

15. Пат. № 2002135524. Антикоагулянт из бурой водоросли. Н.М. Шевченко и др.

16. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника : метод, рекомендации. М.: Минздрав СССР, 1986.-№10-11/31.-С. 14-23.

17. Практикум по микробиологии / А. И. Нетрусов и др.- М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 608 с.

18. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. - 592 с.

19. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей /Т. В. Кузнецова и др. //Вестник ДВО РАН. 2006. - №6. - С. 105-110.

20. Усов, А.И. Полисахариды водорослей. Выделение фракций фукой дана из бурых водорослей / А.И. Усов, А.В. Кирьянов // Биоорганическая химия. 1998. - № 24. - С. 437-445.

21. Усов, А. И. Полисахариды водорослей. Выделение фукоидана из бурой водоросли Laminaria cichorioides Miyabe / А. И. Усов, А. В. Кирьянов // Биоорганическая химия. №12. - 1994. - С. 1342-1348.

22. Хмелевский, Ю.В. Основные биохимические константы человека в норме и при патологии / Ю.В. Хмелевский, О.К. Усатенко. -Киев.: Изд-во «Здоров'я», 1987г. — 160 с.

23. Шевелева, С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты / С.А. Шевелева // Вопросы питания. 1999. - № 2. - С. 32 - 39.

24. Щендеров, Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики /Б.А. Шендеров // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. 2005. - № 2. - С. 23 -26.

25. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds / A. Cumashi et al. // Glycobiology. 2007. - V. 17. - P. 541-552.

26. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. / M. I. Bilan et al. // Carbohydrate Research. 2004. - V. 339.-P. 511-517.

27. Albermann, C. Preparative synthesis of GDP-beta-L-fucose by recombinant enzymes from enterobacterial sources / C. Albermann, J. Distler, W. Piepersberg //Glycobiology. 2000.-V. 10.-P. 875-881.

28. Ali, S. Leukocyte extravasation: an immunoregulatory role for a-L-fucosidase / S. Ali et al. // J. Immunol. 2008. - V. 181. - P. 2407-2413.

29. Aminoff, D. Purification and general properties of 1,2 -L-ficosidase from Clostridium Perfringens / D. Aminoff, K. Furukawa // J. Biol. Chem. -1970. — V. 245.-P. 1659-1669.

30. A molecular sensor that allows a gut commensal to control its nutrient foundation in a competitive ecosystem / L.Y. Hooper et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999. -V. 96. - P. 9833-9838.

31. An alpha-L-fiicosidase from Thermus sp. with unusually broad specificity / E. V.Eneyskaya et al. // Glycoconj J. 2001. - V. 18. - №10. - P. 827-834.

32. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweed / T.N. Zvyagintseva et al. // Carbohydrate Research. -1999. V. 322. - №1-2. - P. 32-39.

33. A non-anticoagulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo / E.M. Barroso // Planta Med. 2008. - V. 74. - № 7. - P. 712-718.

34. Anticoagulant activity of fiicoidans from brown algae / N.A. Ushakova et al. // Biomed Khim. 2008. - V. 54. - № 5. - P. 597-606.

35. Antitumor activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllumnodosum / M. Ellouali et al. // Anticancer Res. -1993. V. 13. - P. 2011—2019.

36. A study of fucoidan from brown seaweed Chorda filum / A.O. Chizhov et al. // CarbohydrateResearch. 1999. - V. 320. - P. 108-119.

37. A sulfated glucuronofucan containing both fucofuranose and fucopyranose residues from the brown alga Chordaria flagelliformis / M.I. Bilan et al. // Carbohydr Res. 2008. - V. 343. - № 15. - P. 2605-2612.

38. Athukorala, Y. Antiproliferative and antioxidant properties of an enzymatic hydrolysate from brown alga, Ecklonia cava / Y. Athukorala, K.N. Kim , Y.J. Jeon // Food and Chemical Toxicology. 2006. - V. 44. - P. 10651074.

39. Becker, D. J.Fucose: biosynthesis and biological function in mammals / D. J. Becker, J. B. Lowe// Glycobiology. 2003. - V. 13. - №13. -P. 41-53.

40. Bekesi, J.G. The metabolism of plasma glycoproteins. Studies on the incorporation of L-fucose-l-14-C into tissue and serum in the normal rat / J.G. Bekesi, R.J. Winzler // J. Biol. Chem. 1967. - V. 242. - P. 3873-3879.

41. Berteau, O. L-Fucosidases: Exoglycosidases with Unusual Transglycosylation Properties, / O. Berteau, J.Bielicki, A. Kilonda // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 7881-7891.

42. Cell surface associated alpha-L-Fucose moieties modulate human breast cancer neoplastic progression / K. Yuan et al. // Pathol. Oncol. Res. -2008.-V. 14.-P. 145-156.

43. Chang, S. An epimerase-reductase in L-fucose synthesis / S. Chang, B. Duerr, G. Serif//J. Biol. Chem. 1988. -V. 263. - P. 1693-1697.

44. Characterization and role of fucosemutarotase in mammalian cells / Park D. et al. // Glycobiology. 2007. - V. 17. - №9. - P. 955-962.

45. Characterization of a new alpha-L-fucosidase isolated from the marine mollusk Pectenmaximus that catalyzes the hydrolysis of alpha-L-fiicose from algal fucoidan (Ascophyllumnodosum) / O. Berteau et al. //Glycobiology. -2002. V. 12. - № 4. - P. 273-282.

46. Chen, Y.M. The organization of the fuc regulon specifying L-fucose dissimilation in Escherichia coli K12 as determined by gene cloning / Y.M. Chen, Y. Zhu, E.C. Lin//Mol. Gen. Genet. 1987.-V. 210.-P. 331-337.

47. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / M. Dubois et al. 11 Anal. Chem. 1956. - V. 28. - P. 350-356.

48. Crystal structure and biochemical properties of the D-arabinose dehydrogenase from Sulfolobus solfataricus / S.J. Brouns et. al. // J. Mol. Biol. 2007.-V. 371(5).-P. 1249-60.

49. Dahms, A.S. D-Fucose metabolism in a pseudomonad. I. Oxidation of D-fucose to D-fucono-lactone by a D-aldohexose dehydrogenase /A.S. Dahms, R.L. Anderson // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 2222-2227.

50. Dische, Z. A specific color reaction of methylpentoses and a spectrophotometric micromethod for their determination / Z. Dische, L. B. Shettles // J. Biol. Chem. 1948.-V. 175.-№2.-P. 595-603.

51. Distribution of O-glycosylhydrolases in marine invertebrates. Enzymes of the marine mollusk Littorinakurila that catalyze fucoidan transformation / M. I. Kusaykin et al. // Biochemistry (Mosc). 2003. - V. 68. -№3.P. 317-324.

52. Efficient production and purification of extracellular 1,2-alpha-L-fucosidase of Bacillus sp. K40T / Y. Kurimura et al. // Biotechnol Biochem. -1995. V. 59.-№ 4. - P. 589-594.

53. Fucoidan inhibits parainfluenza virus type 2 infection to LLCMK2 cells / N. Taoda et al. // Biomedical Research. 2008. - V. 29. - № 6. - P. 331-334.

54. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystisutricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies / N. M. Ponce et al. // Carbohydr Res.- 2003. -V. 338(2). P. 153-165.

55. Fucoidan: structure and bioactivity / B. Li et al. // Molecules. -2008.-V. 13.-№8.-P. 1671-1695.

56. Fukuta, K. Induction of hepatocyte growth factor by fucoidan and fucoidan-derived oligosaccharides / K. Fukuta, T. Nakamura // J Pharm Pharmacol. 2008. - V. 60. - № 4. - P. 499-503.

57. Ginsburg, V. Biosynthesis of L-fucose by mammalian tissue / V. Ginsburg // Biochim. Biophys. Acta. 1961. - V. 54. - P. 376-378.

58. Ginsburg, V. Formation of guanosine diphosphate L-fucose from guanosine diphosphate mannose / V. Ginsburg // J. Biol. Chem. — 1960. — V. 235. P. 2196-2201.

59. Giroldo, D. An extracellular sulfated fucose-rich polysaccharide produced by a tropical strain of Cryptomonas obovata (Cryptophyceae) / D. Giroldo, A.A.H. Vieira // Journal of Applied Phycology. 2002. - V. 14. - № 3 8921-8971.

60. Hacking. A.J. Disruption of the fucose pathway as a consequence of genetic adaptation to propanediol as a carbon source in Escherichia coli / A.J. Hacking, E.C. Lin// J. Bacteriol. 1976. - V. 126.-P. 1166-1172.

61. Hocher, B. Influence of dopaminergic agonists/antagonists on fucose metabolism in the rat brain / B. Hocher, F. Abou-Rebyeh, C. Bauer // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1993.-V. 31.-P. 347-351.

62. Huang, P.C. Studies on the metabolism of lactaldehyde. IV. The metabolism of D-rhamnulose-1 -phosphate and 6-deoxy-L-sorbose-l-phosphate /P.C. Huang, O.N. Miller//J. Biol. Chem. 1958. -V. 230. - P. 805-815.

63. Huang, P.C. The metabolism of lactaldehyde. V. Metabolism of L-fucose / P.C. Huang, O.N. Miller // J. Biol. Chem. 1958. - V. 231. - P. 201205.

64. Inhibition of reverse transcriptase activity of HIV by polysaccharides of brown algae / K.C. Queiroz et al. // Biomed Pharmacother. 2008. - V. 62. - № 5. - P. 303-307.

65. Intra, J. An a-L-Fucosidase Potentially Involved in Fertilization Is Present on Drosophila Spermatozoa Surface / J. Intra, F. Cenni, M.-E. Perotti // Molecular reproduction and development. 2006. - V. 73. - P. 1149—1158.

66. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro / M.O. McClure et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. - V. 8. - P. 19-26.

67. Isolation and characterization of a sulfated polysaccharide from the brown alga Sargassum patens and determination of its anti-herpes activity / W. Zhu et al. // Biochem Cell Biol. -2003. -V. 81(1). P. 25-33.

68. Isolation and characterization of marine bacterial strain degrading fucoidan from Korean Undaria pinnatifida Sporophylls / W.J. Kim et al. // J Microbiol Biotechnol. -2008. V. 18. - № 4. - P. 616-623.

69. Kaplan, D. Chelating Properties of Extracellular Polysaccharides from Chlorella spp. / D. Kaplan, D. Christiaen, S. Arad // Applied and environmental microbiology. 1987. - P. 2953-2956.

70. Kilker, R. D. Isolation and properties of porcine thyroid fucocinase / R. D. Kilker, D. K. Shuey, G. S. Serif // Biochim. etBiophys. Acta -Enzymology. 1979. - V. 570 - № 2. - P. 271-283.

71. Kochibe, N. Purification and properties of alpha-L-fucosidase from Bacillus fulminans /N. Kochibe // J. Biochem. 1973. - Y. 74. - P. 1141-1149.

72. Larson, G. Degradation of human intestinal glycosphingolipids by extracellular glycosidases from mucin-degrading bacteria of the human fecal flora / G. Larson, P. Falk, L.C. Hoskin // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 10790-10798.

73. Leukocyte Extravasation: An Immunoregulatory Role for a-L-Fucosidase / Ali S. et al. // The Journal of Immunology. 2008. - V. 181. - P. 2407-2413.

74. Lim, B.L. Purification, structural characterization, and antioxidant activity of antioxidant substance from the red seaweed / B.L. Lim, I.H. Ryu // J Med Food. 2009. - V. 12. - № 2. - P. 442-451.

75. Listinsky, J.J. Alpha-L-fucose: a potentially critical molecule in pathologic processes including neoplasia / J.J. Listinsky,G. P. Siegal, C.M. Listinsky // Am J ClinPathol. 1998. - V. 110.- № 4. - P. 425-440.

76. Loos, E. Composition of the cell wall of Chlorella fusca / E. Loos, D. Meindl // Planta. 1982. - V. 156. - P. 270-273.

77. Luther, K.B. Role of unusual O-glycans in intercellular signaling /K.B.Luther, R.S. Haltiwanger // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2009. - V. 41. - P. 1011- 1024.

78. Lutjen, P. A role for fucose in human spermatozoa pellucida recognition / P. Lutjen, M. Witt, Hoy // Clin. Reprod. Fertil. 1986. -V.4.- № 2. -P. 185-186.

79. Mehta, A. Fucosylated glycoproteins as markers of liver disease / A. Mehta , T.M Block . // Dis. Markers. 2008. - V. 25. - №4-5. - P. 259-265.

80. Metabolite control of L-fucose utilization / W.L. Richards, R.D. Kilker, G.S. Serif// J. Biol. Chem. 1978. -V. 253. - P. 8359-8361.

81. Mild acid hydrolysis of sulfated fucans: a selective 2-desulfation reaction and an alternative approach for preparing tailored sulfated oligosaccharides / V. H. Pomin et al. // Glycobiology. 2005. - V. 15. - № 12. - P. 1376-1385.

82. Miura, T. Purification and characterization of extracellular 1,2-alpha-L-fucosidase from Bacillus cereus / T. Miura, K. Okamoto, H. Yanase // J BiosciBioeng. 2005. - V. 99. - № 6. - P. 629-635.

83. Miyoshi, E. Biological function of fucosylation in cancer biology / E. Miyoshi, K. Moriwaki, T. Nakagawa // J. Biochem. 2008. - V. 143. - № 6. - P. 725-729.

84. Molecular cloning and expression of GDP-D mannose-4,6-dehydratase, a key enzyme for fucose metabolism defective in Lecl3 cells / C. Ohyama et al. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 14582-14587.

85. Molecular cloning of human GDP-mannose 4,6-dehydratase and reconstitution of GDP-fucose biosynthesis in vitro / F.X. Sullivan et al. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 8193-8202.

86. Mutation in GDP-fucose synthesis genes of Sinorhizobium fredii alters Nod factors and significantly decreases competitiveness to nodulate soybeans / Y. Lamrabet et al. // Mol. Plant Microbe. Interact. 1999. - V. 12. -P. 207-217.

87. Nwokoro, N.A. L-fucose metabolism in mammals. Kinetic studies on pork liver 2-keto-3-deoxy-L-fuconate:NAD+ oxidoreductase / N.A. Nwokoro, H. Schachter // J. Biol. Chem. 1975. - V. 250. - P. 6191-6196.

88. Om, P. Bahl Glycosidases of Aspergillus niger. Purificationand general properties of 1,2-L-ficosidase / Bahl Om P. // J. Biol. Chem. 1970. -V. 245.-P. 299-304.

89. Optimization of glycosidases production by Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T) / Y.V. Alexeeva et al. // Lett Appl Microbiol. -2002. V. 35. - № 4. - P. 343-346.

90. Pat. № 103234 Process methods for fucoidan purification from seaweed extracts Shaklee . N. Patrick et al.. 2008.

91. Pat. № 090631. Fucoidan-derived oligosaccharide. S. Fujikawa et al.. 2008.

92. Pat. № 054087. Degradation of brown alga-derived fucoidan oh. K. Duk. 2008.

93. Pat. № 017215. Endofucanases and method using same for preparing . fuco-oligosaccharides from fucanes , bacterium produsing endofucanases and uses of fuco-oligosaccharides for plant protection. 2000.

94. Pat. № 095427. Composition for prevention or theatment of thrombosis. L. Hiebert, T. Sakai, I. Kato. 2005.

95. Pat. № 091568. Cosmetic composition of two polysaccharides based on fucose and rhamnose. J.L. Gesztesi. 2004.

96. Pat. № 036555. Enzymatic conversion of GDP-mannose to GDP-fucose. E. Sjoberg. 1999.

97. Pereira, M. S.Mild acid hydrolysis of sulfated fucans / M.S. Pereira, P.A.S.Mourâo // Glycobiology. 2005. - V. 15. - № 12. - P. 1376-1385.

98. Pharmacological properties of fucose. Applications in age-related modifications of connective tissues/ G. Peterszegiet. al. // Biomedicine & Pharmacotherapy. -2003. V. 57. - P. 240-245.

99. Probing the catalytic mechanism of GDP-4-keto- 6-deoxy-d-mannose epimerase/reductase by kinetic and crystallographic characterization of site-specific mutants / C. Rosano et al. // J. Mol. Biol. 2000. - V. 303. -P. 77-91.

100. Production of GDP-L-fucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis, in recombinant Escherichia coli / S. G. Byun et al. //ApplMicrobiolBiotechnol. 2007. - V. 74. - № 4. - P. 768-775.

101. Protein estimation with folin phenol reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. -V. 193. - № 1. - P. 265 - 275.

102. Purification and characterization of alpha-L-fucosidases from Streptomyces sp. OH11242 / Y. Goso et al. // Comp BiochemPhysiol B BiochemMol Biol. 2001. - V. 130. - № 3. - P. 375-383.

103. Purification, NMR study and immunostimulating property of a fucogalactan from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum / L. Ye et al. // Planta Med.-2008.-V. 74. -№ 14.-P. 1730-1734.

104. Purification to apparent homogeneity and properties of pig kidney L-fucose kinase / S.H. Park et al. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 56855691.

105. Reitman, M.L. Mouse lymphoma cell lines resistant to pea lectin are defective in fucose metabolism / M.L. Reitman, I.S. Trowbridge, S. Kornfeld // J. Biol. Chem. 1980. - V. 255. - P. 9900-9906.

106. Ricken, J. Investigation of the metabolism of L-fucose in aortic tissue and cultured arterial wall cells / J. Ricken, M. Herting, P. Yischer // Biochem. Soc. Trans. 1990. -V. 18. - P. 963-964.

107. Ripka, J. Two Chinese hamster ovary glycosylation mutants affected in the conversion of GDP- mannose to GDP-fucose / J. Ripka, A. Adamany, P. Stanley // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 249. - P. 533545.

108. Sakai, T. A marine strain of flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan/ T. Sakai, H. Kimura, I. Kato // Mar Biotechnol (NY). -2002. V. 4. - №4. - P. 399-405.

109. Sano, M. Purification and characterization of alpha-L-fucosidase from Streptomyces species / M. Sano, K. Hayakawa, I. Kato // JBiol Chem. -1992. — V. 267. № 3. - P. 1522-1527.

110. Segal, S. On the biosynthesis of L-fucose and L-fucose metabolism in man / S. Segal, Y.J. Topper // Biochim. Biophys. Acta. 1960. - V. 42. - P. 147-151.

111. Shull, K.H. Formation in vivo of glycogen by certain intermediates of the lactate-propanediol pathway / K.N. Shull, O.N. Miller // J. Biol. Chem. -1960.-V. 235.-P. 551-553.

112. Structural and kinetic analysis of Escherichia coli GDP-mannose 4,6 dehydratase provides insights into the enzyme's catalytic mechanism and regulation by GDP-fucose / J.R. Somoza et al. // Structure Fold Des. 2000. - V. 8.-P. 123-135.

113. Structural basis of the catalytic reaction mechanism of novel 1,2-alpha-L-fucosidase from Bifidobacterium bifidum / M. Nagae et al. // J Biol Chem. 2007. - V. 282. - № 25. - P. 18497-18509.

114. Structure and anti-dengue virus activity of sulfated polysaccharide from a marine alga / K. I. Hidari et al. //BiochemBiophys Res Commun. -2008.-V. 376. -№ 1.-P. 91-95.

115. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum / U. Adhikari et al. //Phytochemistry. 2006. -V. 67. - P. 2474—2482.

116. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. / M.I. Bilanet al. // Carbohydrate Research. 2002. - V. 337. - P. 719730.

117. Structure of a highly pyruvylatedgalactan sulfate from the Pacific green alga Codiumyezoense (Bryopsidales,Chlorophyta) /M.I. Bilan et al. // Carbohydrate Research. 2006. - V. 341. - P. 238-245.

118. Structures of oligosaccharides derived from Cladosiphon okamuranus fucoidan by digestion with marine bacterial enzymes / T. Sakai et al. // Mar Biotechnol (NY). 2003. - V. 5. - № 6. - P. 536-544.

119. Sulfated galactofucan from Lobophora variegata: anticoagulant and anti-inflammatory properties V.P. Medeiros et al. // Biochemistry (Mosc). — 2008.-V. 73.-№9.-P. 1018-1024.

120. Synthesis of GDP-L-fucose by the human FX protein / M. Tonetti et al. //J. Biol. Chem. 1996. -V. 271. - P. 27274-27279.

121. Talyshinsky, M.M. Anti-viral activity of red microalgal polysaccharides against retroviruses / M.M. Talyshinsky, Y.Y. Souprun, M.M. Huleihel // 2002 Cancer Cell International. 2002. - V. 2. - P. 8.

122. The MURI gene of Arabidopsis thaliana encodes an isoform of GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, catalyzing the first step in the de novo synthesis of GDP-L-fucose / C.P. Bonin et al. // Proc. Natl Acad. Sei. USA. -1997. V. 94. - P. 2085 - 2090.

123. Zapopozhets, T.S. Antibacterial and immunomodulating activity of fucoidan / T.S. Zapopozhets, N.N. Besednova, I.N. Loenko //Antibiot. Khimioter.- 1995. V. 40. - P. 9-13.

Информация о работе

Санина, Татьяна Викторовна
кандидата технических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка биотехнологии фукозы и исследование ее биологических функций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы