Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана

Кирьянова, Светлана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана"

На правах рукописи

Кирьянова Светлана Владимировна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ а-Ь-ФУКОЗИДАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ГИДРОЛИЗАТОВ ФУКОИДАНА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

005540818

Воронеж - 2013

005540818

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: Бирюков Валентин Васильевич

доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой «Экологическая и промышленная биотехнология» ФГБОУ ВПО «Московский государственный машиностроительный университет» (МАМИ)

Ухина Елена Юрьевна

кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология переработки животноводческой продукции» ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени Петра I»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский химико-

технологический университет имени Д. И. Менделеева»

Защита состоится « 23 » декабря 2013 г в 12.00 ч на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, на соискание ученой степени кандидата наук Д 212.035.06 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий».

Автореферат разослан « 22 » ноября 2013 г.

Ученый секретарь л у

диссертационного совета у^Ш^у ^Шуваева Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время, согласно Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года, производство ферментов является одним из приоритетных направлений промышленной биотехнологии.

a-L-фукозидазы (ЕС 3.2.1.51) - ферменты, относящиеся к классу О-гликозидгидролаз, расщепляют внутренние a — 1,3, - 1,4 -гликозидные связи основной цепи молекул фукоидана - полисахарида клеточных стенок бурых водорослей. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза фукоолигосахариды и моносахарид фукоза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень фукозы в крови приводит к нарушению синтеза фукозилированных гликанов и вызывает хронический иммунодефицит и недоразвитость ткани тимуса (Park et al., 2007, АН et al, 2008). На основании вышеизложенного создание на основе продуктов гидролиза фукоиданов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами является актуальной задачей.

Спектр микроорганизмов — природных продуцентов a-L-фукозидаз довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.

В мировой практике для получения биотехнологически важных ферментных препаратов используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генной инженерии и микробиологии, для создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что позволяет повысить активность и выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.

Изучением a-L-фукозидаз занимались в основном зарубежные ученые: Sano (1992), Goso (2001), Katayama (2004), Miura (2005), Rodriguez-Diaz (2013) и другие. Однако число работ, посвященных выделению и клонированию генов a-L-фукозидаз с целью максимальной продукции фермента, увеличению его активности, изменения свойств ферментов для их промышленного применения, немногочисленно, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.

В настоящее время на рынке имеется коммерческий ферментный препарат термостабильной a-L-фукозидазы из Т. maritima фирмы

Megazyme. Однако он имеет низкую фукозидазную активность и высокую стоимость. На отечественном рынке коммерческих препаратов ферментов, способных расщепить сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует, что делает поиск и получение активных продуцентов a-L-фукозидазы актуальной задачей современной биотехнологии.

Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры биохимии и биотехнологии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных Сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственный контракт№ 14.512.11.0069 от 17.04.2013 г.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биотехнологии высокоактивной a-L-фукозидазы с использованием методов генной инженерии, исследовании некоторых физико-химических свойств ферментного препарата и определении пребиотической способности полученных фукозосодержащих гидролизатов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор микроорганизма - источника гена a-L-фукозидазы и системы экспрессии клонированного гена;

• получение рекомбинантного штамма - высокоактивного продуцента a-L-фукозидазы;

• определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;

• получение ферментного препарата a-L-фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;

• очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы;

• исследование ферментативной деструкции фукоидана;

• определение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.

Научная новизна. Впервые получен отечественный ферментный препарат высокоактивной a-L-фукозидазы с применением технологии рекомбинантных ДНК. Путем введения в составе плазмиды pet23b+ гена a-L-фукозидазы под контролем Т7 - промотора сконструирован штамм Е. coli Юр 10 - перспективный продуцент a-L-фукозидазы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не

уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам a-L-фукозидаз. Установлены оптимальные параметры биосинтеза генетически-модифицированного штамма; показано, что введение в состав питательной среды синтетического аналога лактозы - ИПТГ в концентрации, 0,1 мМ при pH 7,0 вызывает индукцию экспрессии гена фукозидазы, при этом в бактериальных клетках наблюдается активное накопление белка с молекулярной массой 45 кДа. Исследование стабильности функционирования гибридных плазмид в клетках продуцента показало, что в течение 10 пассажей генетически-модифицированный штамм Е. coli top 10 сохраняет свою стабильность.

Доказано, что введение в рацион опытных мышей фукозосодержащих гидролизатов в дозировке 0,04 % от массы тела в условиях экспериментального дисбиоза способствует восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры мышей, проявляя тем самым пребиотическую активность.

Практическая значимость. Разработана биотехнология рекомбинантной a-L-фукозндазы, способной гидролизовать фукоидан бурых водорослей до фукоолигосахаридов и фукозы, которые позволят существенно расширить рынок пребиотиков.

Полученные научные материалы используются в учебном процессе для студентов, обучающихся по направлению подготовки «Б иотехнология ».

Новизна технических решений отражена в заявке на изобретение (приоритет от 24.09.2013 № 2013143212).

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на отчетных конференциях ВГУИТ (г. Воронеж, 2011-2013 гг.); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011,2012 гг.).

Данная работа была удостоена диплома конкурса молодых ученых, проходившего в рамках VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».

Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.».

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 13 работ, в том числе 5 в журналах из списка ВАК.

источников, приложений и представлена на 123 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 20 рисунков и 9 таблиц. Библиография включает 145 наименований, в т. ч. 115 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследования.

ГЛАВА I. Обзор литературы. Проведен обзор данных литературы, касающихся характеристики растительных источников фукоиданов и выявлению наиболее перспективных из них. Рассмотрены различные продуценты a-L-фукозидаз, условия биосинтеза ими фермента. Отмечено, что известные микроорганизмы-продуценты a-L-фукозидаз обладают низкой фукозидазной активностью. На основании анализа исследований по клонированию генов a-L-фукозидазы показана возможность применения методов генной инженерии для повышения активности природных продуцентов. Представлена общая характеристика a-L-фукозидаз, их физико-химических свойств, способов выделения и очистки. Рассмотрены перспективные направления практического использования высокоактивных a-L-фукозидаз.

ГЛАВА II. Объекты, материалы и методы исследований.

Объектом исследования служил продуцент a-L-фукозидазы - бактерии штамма Lactobacillus rhamnosus (ВКПМ, ГосНИИгенетика, Москва). Для оживления и поддержания культуры использовали среду MRS.

Для клонирования применяли векторы pet23b (+) (Novagen, USA).

Последовательность нуклеотидов гена a-L-фукозидазы (AlfB) L. rhamnosus 12L была получена из базы данных NCBI. Кодирующую часть гена a-L-фукозидазы L. rhamnosus 12L (1088 п. н.) амплифицировали при помощи ПЦР, используя праймеры EcoRl: 5' — ctatgaattcatggttaaaccatcacctgtc - 3', Xhol: 5' -tacactcgagttaacgatcactaagttgctgc - 3' и хромосомную ДНК L. rhamnosus 12L в качестве матрицы. Полученный фрагмент клонировали в векторе pet 23 b (+) по сайтам рестрикции EcoRl и Xhol. Конструирование праймеров для амплификации клонируемого фрагмента ДНК осуществляли с помощью пакета программы Vector NTI.

Скрининг трансформированных клеток Е. coli top 10, несущих плазмиду pet 23 b(+) с клонированным фрагментом ДНК, проводили по устойчивости полученного штамма к ампициллину. Отобранные в результате скрининга колонии выращивали методом глубинного

культивирования в орбитальном шейкере-инкубаторе на питательной среде LB, содержащей ампициллин, в течение 6 часов, затем производили индукцию синтеза белка путем добавления ИПТГ.

Выделение хромосомной ДНК, рестрикция, лигирование, электрофорез в агарозном геле, ПЦР, трансформация проводились по стандартным методикам.

Культивирование нативных и рекомбинантных бактерий Е. coli top 10 проводили на питательной среде Лурия-Бертани в колбах Эрленмейера (0.75 л), на орбитальном шейкере Infors NT (ISO об/мин) в периодических условиях в течение 24 ч при температуре 35 - 37 °С.

Для культивирования нативных бактерий L. rhamnosus 12L использовали среду MRS следующего состава, г/л: протеозопептон -10,0, мясной экстракт - 10,0, дрожжевой экстракт - 5,0, глюкоза - 20,0, твин-80 - 1,0, цитрат аммония — 2,0, ацетат натрия - 5,0, MgS04— 0,1, MnS04 - 0,05, Na2HP04 - 2,0, pH 6,5.

Для сравнительного исследования a-L-фукозидаз различного происхождения использовали программу VMD. Для расчетов использовали последовательности и структуры a-L-фукозидаз из базы данных PDB.

Определение активности a-L-фукозидазы. Активность a-L-фукозидазы определяли по изменению количества свободной фукозы по методу Дише, основанному на способности фукозы при кипячении с сильными минеральными кислотами образовывать 5-метилфурфурол, в отличие от других гексоз, благодаря чему возможно ее дифференцированное определение.

За единицу активности a-L-фукозидазы принимали такое количество фермента, которое образует 1 мкМоль фукозы за 1 мин в стандартных условиях.

Реакционную смесь, состоящую из 1 см3 водного раствора фукоидана с массовой долей 1 % и 1 см3 раствора фермента a-L-фукозидазы, инкубировали при температуре 30°С в течение 1 ч. Через один час гидролиза реактивную смесь фильтровали и разбавляли водой в 20 раз. Затем 1 см3 пробы помещали в водяную баню и ставили в морозильник до образования корочки льда. Приливали 4,5 см3 H2S04, разведенной дистиллированной водой (1 часть дистиллированной воды -6 частей H;S04 конц.), перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Помещали пробу в кипящую водяную баню на 3 минуты, охлаждали проточной водой. Добавляли 0,1 см3 3 %-го раствора солянокислого цистеина, перемешивали и оставляли на 1,5 ч при комнатной температуре. Измеряли оптическую плотность растворов

на спектрофотометре против контроля при длине волны 396 нм (все сахара) и 430 нм (все сахара, кроме метилпентоз). В качестве контроля использовали инактивированный фермент а-Ь-фукозидазы.

Концентрацию фукозы в исследуемой пробе определяли по

формуле:

С=А-к-20,

где Д - разность оптических плотностей при А.1 и Х2,

к - калибровочный коэффициент, определяемый по

калибровочному графику каждый раз при смене реактивов. В качестве

стандартного вещества для построения калибровки использовали фукозу

х. ч. («Рапсгеас», Швеция),

20 — степень разведения реакционной смеси.

Активность фукозидазы рассчитывали по формуле:

С -С А = -—--1000 М пт

где А - активность фермента, ед/г или ед/см3, Со - концентрация фукозы в опытной пробе, мг, Ск - концентрация фукозы в контрольной пробе, мг, М — молярная масса фукозы, г/моль,

п - количество ферментного препарата (г) или культуральной жидкости (см3),

т — время гидролиза, мин.

Выделение ферментного препарата. По окончании выращивания биомассу бактерий отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осаждение ферментного препарата проводили различными органическими растворителями (96 % этанолом, 98 % изопропанолом) при температуре 2 - 4 °С. Для формирования осадка смесь выдерживали 30 мин, после чего осадок отделяли на рефрижераторной центрифуге при 3000 об/мин и высушивали при комнатной температуре.

Очистку рекомбинантного белка а-Ь-фукозидазы проводили методом аффинной хроматографии на колонках, заполненных никелевой агарозой.

Определение свойств фермента. Для определения оптимальных значений рН и температуры действия фермента проводили гидролиз фукоидана в интервале рН 5,0-9,0 и температур 20-60 °С. Различные значения рН среды устанавливали добавлением 1 н НС1 или ИаОН.

Определение степени гидролиза фукоидана. Для определения степени гидролиза фукоидана реакционную смесь, содержащую 1 см водного раствора фукоидана с концентраций 1%, 1 см 0,1 М

фосфатного буфера, рН 7,0, и 100 мкл раствора фермента выдерживали при 35 °С в течение 6 часов. Затем определяли количество свободной фукозы по методу Дише. Исходя из количества образовавшейся фукозы рассчитывали степень гидролиза.

Общие биохимические и микробиологические методы исследований. Содержание белка в пробах определили по методу Лоури, величину рН — потенциометрически. Состав питательной среды и условия культивирования варьировали в зависимости от задач и условий эксперимента.

Определение углеводного состава гпдролизатов фукоидана. Углеводный состав гидролизатов фукоидана определяли методом электрофореза. В качестве метчиков использовали высокомолекулярный (120 кДа) и низкомолекулярный (20 кДа) декстран-сульфат, а также бычий лактоферрин (80 кДа).

Исследование пребнотнческоП активности фукозосодержащих гидролизатов проводили путем однократного перорального введения мышам возрастающих доз препарата на фоне экспериментального дисбиоза. Экспериментальный дисбиоз индуцировали введением белым беспородным мышам массой 14-16 г антибиотика доксициклина гидрохлорида. Дозу фукозосодержащих гидролизатов рассчитывали, исходя из массы мышей и рекомендуемых в литературе норм потребления пребиотиков для человека. Пребиотические свойства фукозосодержащих гидролизатов изучали в сравнении с коммерческими пробиотиками «Лактобактерин» и «Бифидумбактерин», дозы которых рассчитывали, исходя из рекомендуемых для человека норм.

Просветную микрофлору анализировали по 3 пробам асептически взятых фекальных масс от 5 мышей. Исследование микрофлоры кишечника экспериментальных животных проводили по общепринятой методике.

Выделение бактерий из патологического материала и идентификацию штаммов проводили с использованием соответствующих стандартных дифференциально-диагностических сред (кровяной агар, агар Клиглера, среда Кларка, фенилаланиновый агар, МРС-4, среда Сабуро, среда Плоскирева, среда Симмонса, среда с лизином, среда Эндо, среда Блаурокка).

Статистическая обработка результатов. Все определения проводили не менее, чем в трех повторностях трех серий экспериментов. В диссертации представлены средние результаты серии экспериментов, обеспечивающие 95 % точности по статистическим критериям.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА III. Конструирование генетически-

модифицированного штамма - продуцента a-L-фукозндазы

Сравнительное исследование a-L-фукозидаз (alfB) различного происхождения. В настоящее время выделены и охарактеризованы a-L-фукозидазы из бактерий Bifidobacterium bifidum, Streptomyces sp„ Lactobacillus rhamnosus, Thermotoga maritima. С использованием программы VMD было проведено множественное структурное выравнивание последовательностей белка alfB.

Для расчетов использовали последовательности и структуры a-L-фукозидаз из базы данных PDB. Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Наиболее консервативные участки находятся между аминокислотными остатками - 210 - 250, 261 - 290, 310 - 340, 480 - 530. Вероятно, данные области молекулы фермента играют важную роль в осуществлении его функции и возможно составляют активный центр. Менее консервативные участки находятся между 380 - 420, 570 - 585 аминокислотными остатками. Различия в структуре данных областей возможно обусловлены субстратной специфичностью a-L-фукозидаз.

Проведенный анализ структуры и филогенетического родства фукозидаз свидетельствует о высокой степени гомологии и относительной консервативности аминокислот в молекуле различных фукозидаз в процессе эволюционного развития. Имеющиеся отличия в структуре молекулы фермента являются определяющим фактором при выборе источника гена a-L-фукозидазы для создания генетически-модифицированного штамма-продуцента данного белка.

Выбор объекта клонирования и системы экспрессии. Как показывают литературные данные, наиболее обширную группу микроорганизмов — продуцентов a-L-фукозидаз составляют микроскопические грибы и бактерии, при этом бактериальные продуценты несколько уступают грибным по активности. Выбор бактериальной культуры в качестве продуцента a-L-фукозидазы обусловлен доступностью генетических манипуляций для внесения изменений в бактериальный геном.

Среди бактерий - продуцентов a-L-фукозидаз большую группу составляют различные виды рода Lactobacillus. Из коллекции микроорганизмов ВКПМ ГосНИИгенетика в качестве источника целевого гена а^-фукозидазэ был выбран штамм Lactobacillus rhamnosus 12L, как обладающий достаточно высокой активностью и известной нуклеотидной последовательностью гена a-L-фукозидазы.

--!ЙСЙЙ14

(ш)!5б__ до._„Ж._, 'И™. 2®., Ш

а!р(и-(!<<,4Ншо5!41ж|1тВИЛж(н1|1т1о(Ч... (54) ------

1Л;а1«еа1р!и-1-1ш>йЛ»(Г1)тВа(Кг«(1е2а1еи1.. (44) 1>Н4|ЮМие№Я1 ЯШкШт МП 2—(Ж)

<Ыштп9Ч>Ш«ш*1кь^шя№9е<г« (Яавпй^хчрДО^гаихтмхм -аякл шук-ЙК

ДОНИимМиеЛот8айшж1ейкмкаоткг.. (я) -»¡йшиияя

•5!|)!и%в51с!г1ж(г<я111|итй«»п1®»и1Н18 (88) —«в»

СШЯ1ЯВ(ХЖ) I 1Г » В I Е Г, ПГ I ЕННОвГСЫ! а Т 7 V Т

----5«Ш15

(261) 26! ЯО________¿90_¡МО____¡НО _ 325

ФИНДОой** »««• МИкйим> Кил- (1«) ------~-----

рММ «ИШЖоиИивйип вМегаИв (кН- (Ш7) квНиМ^'тчк!»» МвИШ!

им-йкиИае&от ИИоЛЯЖинММ» 2... (М1) звызяж&хтг.* 1г|кг1>1КвЛР8гатвЕ1алЕ781нуат'05Л4)ВГ5У1А1Г1и»¡#р

<МшМм (154 ?*1^1вм.Евв .........в*иивстЦ^»ф$

а!рИз1-(исо5Ма?е Л.зга 0ж1гтойга «»»кйлоишг... (123) —аЕшмшфвмиДО

ДОа-йковМазе (гот йкшяедз таййгоа 1Н18 (15о) ЫЙвЗШк&таЕЬЙиг

----ыжигымагчет'Л»«»-

СИКЙИВ (261) К 01? ИЗ А ъг ГОТГ ЗУ ВЭ Ч Т <24 Е1К

-йнймб

(326) И8________________,340...............____________¿80_____________¡№) _...............Щ ___________Ж1

—Яезрв-гфЖзяйЗКга

*у ге^яЬггй<ш>в»2.....—

1,2-з«(кеМа»(от10Мо1)д(1в«т|1Л1шп2...(32б) аЩ.чаЩ^гоиздвмзЕвз-----дота&Ц^ЕДТОЯМртс—миммивйииР

фи ¿иМм Пни «ктшвд» вмМИНШрИ) ьхивтаяигайякквй;--------стюп|тт»ад»4р".....-##р»«*ги!г

<Мв4.4>«»>1»И *И» И»>1»0—И К»*»* (Щ «ЯЙНМММ»*«!!--------ОМИЯввиШюеЦР--------чм*ми**К

0»ШВЩ(Э26) 13 XV I» К Г И ге* М « в 3 1 --——-—■—— ъеОйт 7

(391) 39}____________да_____________¿10__________________________ш______________Ш_____________________4»

риШ»е4<иЧ.-(иакЛ5еГ|отВ«сбаа11»»кИ1..(229) ?гс*|хгртг;*ЕЯЕЯХЕЗВ1ВЭ1|Е1,иш»х------------------язвягс»акАВхи,я

и-а-Ыидаикю ¡ют тымам ЬМит 1~ (заз) гхв«&яЕязвЁвзм1авхяяг?мвя|в?в*»яззвгшя-----«ямюяттзАяквЕЬАЕ

й^Мпе'-о-ЬйнзкеаМеВаа^йиЕО!«!®»;.. (276) вуИгохвьзяэмооямояхьвгтсфягкоЕхлАв------------------------------

а!|<1м-^о5йетгготамаок1квийй1ао1111сг...(247) вв«*ОТЕИС*вгтко11Пг»ся»»Е|с1Я1»----п-----------------е---------

¡Й1.Ч|а-(|ко5«1,кеГготв1еп11о1ми11вй11та им (255) »Е^и^кувввВрвкгагивогаьэА'вкзЕ---------------------------------

фЬа-Ыишайгбг Лот РйфЬуншонак фпфуа&е (248) К0ВЫЕ!,ВТЕВ§АхриатААЗме'РЕгм|1(!1В!1С---------------------------------

Сопжяк(391) з X, А

-—----5есИм18

(456) 4И___________,470________ЦП 1*90 ___ £00___^___|10___880

аМв'(1-з,4>(1коЯ11а5е1т«1 шшжкиткм» (»>) вв-----

риЗД№ д1р»И-ЬГиокМа5е (гот ВаС&ПМ» (276) 6АВ6РНЕИП(ЕР-&В£НЯ§ХРЪЯтЩ}КХЕКЗМгкг^тЩ'Й^^Ог^^Е'АоЩАОЖЕКЕШвЕ и-а-ииавМз» Нот ВМоОасМшп ЬШит 2... (443) в11Е11те»1тавздт1ы*ГА<»Е1;)б»«т**мЬвщжвтея4МЙ1*1>|вз*г«явя»»А*

аМШ. <ис«Ии» Им» ВайноИкИкЪММаАг.. (262)------хсВяСЗД^тВвфЕ, к»е|кшат4$Зея

а!р!»Л(:(в!|)з«ГготИК1тМ«впипйпи1Н18(297)--------------«ге^ЕЯЕмДтря^шЯ«^^

ОПЯПЯКДО) 7 ЬЧЕ V 41 ЫЛКХ Р 4 в I ? О I 15 -

(521) __,Я0_а?_____________________Ш___________Ш.________

а1р1в-(1-з,4)-(иов»!азе (гет втиЬжмю 1яю... (349) «абИрЗтоя---------------мтяв&31Ции1ЕХЛгв$я----ЕстгаЕррЩЗГра

риИ0«а1рЬач.-(ии1!Иа!е11отвас(й1>Ми№са1-. (34") -----------------------------------------«о-ккг-----

Ц-а4.-%вЯ(И5е(10т ШШвШтШт2- (5«9) 1ЕЯгМ:;ШЕАЕЕЕЗЭОРА11.В87Г»Ь2.КЕЕЗЯГГ7КгНЬВЕ&89336ВВЫгата1'8Р|сЙРЬе

Мскйле'-о-Ьега-а'исжМеЬяа-ёисийжеГг.-Ь?«) оо|в9тг&в«*ввЯ1Ю1*ВЕв-----ышыигкЕт'МВРЬт-г----пензхвееммвья

в1р1|»ч.4кввИяе Ив» ВаиявМес вмшо&тмсг» (Э4в) - ЩЯктх---------------в--------------------тотпп|—

а1|*а-(и<оайа»1гат91«1по1(|да1гшалнШ1в(348! ^втчрптзчт---------------а-----------------------еслхгш—

а1рйа-Ьйяч«(1(гке втгмп Рв|1|>¥гипопа5 ца*1«а115 (Э32) |01®Е-:-§ЦтЕй8РРРЕЬЕР?5ЕР8тав8мьуьЕ'тар0ИАЗКЕ1Р----хгпюкпцр'ши

СОЖе|К|К(521) 1 А1'0 АХУА Е в

Рисунок 1 - Множественное выравнивание последовательностей белка а!ЯЗ.

В качестве организма - хозяина рекомбинантной ДНК выбрали бактерии Е. coli top 10. Бактерия Escherichia coli - один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов, геном которой был полностью секвенирован. Кроме того, бактериальные продуценты характеризуются быстрым ростом, что сокращает время на производство ферментного препарата и делает их наиболее перспективными для промышленного применения.

Создание генетических конструкций на основе вектора pet23b+. Для клонирования в качестве вектора был выбран экспрессионный вектор pet23b+, предназначенный для экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli и содержащий в своем составе ген резистентности к ампициллину. Ген a-l-фукозидазы клонировали в вектор экспрессии pet23b+ по сайтам рестрикции EcoRl-Xhol. Полученные генетические конструкции ввели в клетки Escherichia coli top 10 и провели скрининг трансформированных клеток, несущих плазмиду pet23b+ с клонированным фрагментом, по устойчивости к ампициллину на стандартной среде LB.

Отобранные генетически модифицированные клетки Е. coli top 10, содержащие плазмиду с геном a-1-фукозидазы, инкубировали с синтетическим аналогом лактозы - ИПТГ, для индукции экспрессии гена фукозидазы. После индукции наблюдалось активное накопление в бактериальных клетках белка соответствующей молекулярной массы (45 кДа) (рисунок 2).

Рисунок 2 - SDS-ПААГ-электрофореграмма клеточных

белков генетически

модифицированных бактерий Е. coli top 10:

1 - белки-стандарты молекулярной массы (сверху вниз -120 кДа, 66 кДа, 40 кДа);

2 - клеточные белки генетически модифицированных бактерий Е. coli top 10 без индукции;

3 - клеточные белки генетически модифицированных бактерий Е. coli top 10 после индукции ИПТГ.

Для оценки уровня экспрессии гена a-L-фукозидазы по активности фермента в питательной среде культивировали бактериальные клетки Е. coli top 10, трансформированные рекомбинантными плазмидами. В качестве контроля использовали нативный безплазмидный продуцент L. rhamnosits 12L. Активность нативного штамма L. rhamnosus 12L составила 121 ед/см3, активность генетически-модифицированного штамма - продуцента a-L-фукозидазы в культуральной жидкости выросла до 2240 ед/см1.

Таким образом, за счет введения в составе экспрессионного вектора pet23b+ гена a-L-фукозидазы, получен генетически-модифицированный штамм Е. coli top 10, продуцирующий a-L-фукозидазу, активность которой превышает активность нативного фермента в 20 раз.

Исследование стабильности генетически-модифицированного штамма Е. coli top 10. Исследование стабильности функционирования гибридных плазмид в клетках продуцента показало, что в течение 10 пассажей на питательной среде заметного изменения активности a-L-фукозидазы не наблюдалось, но при дальнейших пересевах культуры бактерий происходило постепенное снижение фукозидазной активности, что свидетельствует о частичной потере гибридных плазмид бактериальными клетками.

ГЛАВА IV. Получение рекомбинантной a-L-фукозидазы и исследование физико-химических свойств фермента.

Подбор оптимальных условий глубинного культивирования генетически-модифицированного штамма £ coli top 10. Культивирование генетически-модифицированного продуцента проводили на стандартной питательной среде Лурия - Бертани с последующей индукцией ИПТГ.

С целью оптимизации условий биосинтеза фермента было исследовано влияние концентрации индуктора ИПТГ, продолжительности индукции и исходного pH среды на уровень продукции целевого фермента генетически-модифицированным штаммом Е. coli top 10.

Влияние концентрации индуктора ИПТГ на биосинтез a-L-фукозидазы показано на рисунке 3. Самый высокий уровень продукции фермента наблюдался при концентрации ИПТГ 0,1 мМ. При повышении концентрации ИПТГ активность a-L-фукозидазы снижалась, что может быть связано с образованием неактивной нерастворимой формы белка.

Динамика биосинтеза a-L-фукозидазы генетически-модифицированным продуцентом Е. coli top 10 представлена на

рисунке 4, из которого видно, что максимальное значение активности фермента a-L-фукозидазы наблюдалось после 5 часов индукции ИПТГ.

Исследование влияния исходного значения рН среды на биосинтез рекомбинантной a-L-фукозидазы Е. coli top 10 представлено на рисунке 5. Продуцент проявлял способность к биосинтезу фермента в диапазоне значений рН от 6,0 до 8,0, максимальный биосинтез наблюдался при рН 7,0. Отклонение значений рН питательной среды от оптимальных для синтеза фермента как в кислую, так и в щелочную сторону приводило к снижению активности a-L-фукозидазы.

\ 3000

2500

йС о 2000

Н ? V 1500

! О

i tt : В 1000

- < 500

Рисунок 3 -Влияние концентрации индуктора ИПТГ на активность рекомбинантной а-L-фукозидазы.

0,01 0,1 1,0 3,0

Концентрация индуктора ИПТГ.мМ

3000 2500

"5 2000

О)

£ 1500

S юоо

£ <

500

3 4 5 6

Продолжительность индукции, ч

Рисунок 4 — Влияние

продолжительност и индукции на активность рекомбинантной a-L-фукозидазы.

Рисунок 5 -Влияние pH среды на активность рекомбинантной а-L-фукозидазы.

При оптимальных условиях культивирования рекомбинантного продуцента Е. coli top 10 активность a-L-фукозидазы составила 2750 ед/см' культуральной жидкости.

Рекомбинантный белок a-L-фукозидазы был очищен методом аффинной хроматографии с использованием колонок, заполненных никелевой агарозой. Были получены три фракции белка различной концентрации. Чистоту фермента проверили электрофоретически.

Получение спиртоосажденного ферментного препарата a-L-фукозидазы. Для изучения условий осаждения и влияния природы органических растворителей на полноту осаждения a-L-фукозидазы использовали 96 % этанол и 98 % изопропанол. Максимальный выход а-L-фукозидазы по активности (94 %) был получен в случае осаждения этанолом при его концентрации в смеси 75 % (в объемном соотношении культуральная жидкость:этанол — 1:3).

Исследования по влиянию pH на полноту осаждения этанолом a-L-фукозидазы Е. coli top 10 из культуральной жидкости проводили при концентрации растворителя 75 %. Результаты показали, что оптимальным являлось pH 7,0. На основании этих данных можно предположить, что изоэлектрическая точка a-L-фукозидазы находится в зоне нейтральных значений pH и фермент обладает нейтральными свойствами.

Проведенные исследования послужили основой для разработки технологии получения ферментного препарата a-L-фукозидазы, включающей культивирование генетически-модифицированного штамма при оптимальных условиях, концентрирование фильтрата культуральной жидкости методом ультрафильтрации (диаметр пор мембраны 0,02 мкм) в 50 раз, осаждение фермента этиловым спиртом,

3000

СО

Ъ ?чпо

ш 2000

U 1500

X ffl 1000

X 500

сублимационную сушку ферментного препарата и измельчение до степени дисперсности 50-100 мкм. В результате удельная активность спиртоосажденного ферментного препарата составила 120 ед/мг белка.

Исследование влияния рН и температуры на активность a-L-фукозидазы. Действие ферментного препарата зависит от ряда факторов, важными из которых являются рН реакционной среды и температура, при которой протекает процесс гидролиза. Эти исследования представляют определенный интерес, так как данные показатели являются важной характеристикой в разработке методов эффективного использования ферментного препарата.

Изменение активности a-L-фукозидазы в зависимости от концентрации ионов водорода представлено на рисунке 6. Из графика следует, что для a-L-фукозидазы Е. соИ top 10 оптимум действия наблюдался при рН 7,0. При рН 9,0 фермент почти полностью терял каталитическую активность.

Максимальная активность a-L-фукозидазы проявлялась при температуре 35 °С, отклонение температуры на 10 °С от оптимального значения приводило к снижению активности на 33 и 45 % соответственно (рисунок 7).

Рисунок 6

Зависимость активности

а^-фукозидазы (% от максимальной) от величины рН при температуре 35 °С.

Рисунок 7 - Влияние температуры на активность а-L-фукозидазы (% от максимальной) при рН 7,0.

ГЛАВА V. Исследование процесса ферментативной деструкции фукоидана растительного сырья и определение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов

Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза фукоидана и идентификация продуктов гидролиза.

Исследование процесса гидролиза фукоидана бурых водорослей спиртоосажденным рекомбинантным препаратом a-L-фукозидазы Е. coli top 10 с активностью 2580 ед/см3 проводили при оптимальных параметрах действия фермента.

На степень деструкции фукоидана большое влияние оказывает дозировка ферментного препарата и продолжительность гидролиза. Для определения этих параметров гидролизу подвергался раствор с массовой долей фукоидана 10 %. Фермент вносили в количестве 1-10 ед/г I

фукоидана. Об эффективности гидролиза судили по количеству образовавшейся фукозы, определяемой по методу Дише (рисунок 8).

Из рисунка видно, что дозировка 6 ед/г обеспечивала максимальную степень гидролиза фукоидана, равную 89 %, за 5 ч гидролиза. Более высокая концентрация фермента и увеличение продолжительности процесса не способствовали значительному увеличению степени гидролиза.

100

-*-8 ед/г

-•-10 ед/г

0 1 2 3 4 5 6

Продолжительность гидролиза, ч

Рисунок 8 - Зависимость степени гидролиза фукоидана бурых водорослей от концентрации фермента (ед/г фукоидана) при температуре 35 °С и рН 7,0.

Состав фукозосодержащих гидролизатов, полученных при оптимальных условиях гидролиза фукоидана бурых водорослей, исследовали методом электрофореза. В качестве метчиков использовали высокомолекулярный (120 кДа) и низкомолекулярный (20 кДа) декстран-сульфат, а также бычий лактоферрин (80 кДа) (рисунок 9).

Продолжительность гидролиза, ч

0.5 1 1.5 2 2.5 3

120 кДа

80 кДа

20 кДа

Рисунок 9 -Электрофореграмма продуктов гидролиза

фукоидана.

Из представленных данных видно, что к концу третьего часа в гидролизате еще присутствует незначительное количество олигомеров фукозы, которые полностью расщепляются лишь к концу 5 ч гидролиза.

Изучение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов. При исследовании нормофлоры мышей было установлено, что количество Escherichia coli, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, как наиболее важных представителей микрофлоры, составило, КОЕ/см3:Ю6 - 107, 103 и 1010, соответственно. При пероральном введении антибиотика в дозе 10 мг/мышь в течение 7 дней у животных наблюдалась элиминация нормальной микрофлоры и контаминация кишечника животных условно-патогенной микрофлорой. Среднее количество E.coli в фекалиях повышалось до 10 КОЕ/г, В bifidum не высеивались совсем, а содержание L. acidophilus сокращалось до 104 КОЕ/г (таблица 1).

Таблица 1 - Сравнительная оценка микрофлоры опытных партий мышей

Микроорганизмы Количество микроорганизмов, КОЕ/г фекалий

норма мыши из питомника мыши с дисбиозом

Е. coli 105-106 10" 10*

Bifidobacterium VP менее 10э 103 не обнаружены

Lactobacillus spp. 10ш 1010 104

Разовое пероральное введение в рацион мышей фукозосодержащих гидролизатов в возрастающих концентрациях показало, что оптимальным является их применение в дозировке 0,04 % от массы тела опытных мышей.

Результаты исследования микробиоценоза мышей при введении в суточный рацион питания фукозосодержащих гидролизатов и пробиотических препаратов «Бифидумбактерин» и «Лактобактерин», представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что фукозосодержащне гидролизаты, наряду с указанными препаратами, способствовали восстановлению состава и численности индигенной микрофлоры мышей в условиях экспериментального дисбиоза уже на 5 сутки после начала их введения.

Таблица 2 - Влияние фукозосодержащих гидролизатов и пробиотиков на микрофлору мышей на фоне дисбактериоза

Микроорганизмы Количество микроорганизмов, КОЕ/г фекалий при внесении в рацион

фукозосодержащих гидролизатов бифидумбакте рина лактобактери на

контрольное время - 5 сут

Е. coli 106 105 105

Bifidobacterium spp. 10J ю2 10J

Lactobacillus spp. 10" 101и 10ш

контрольное время — 10 сут

Е. coli 106 106 105

Bifidobacterium spp. 103 10J

Lactobacillus spp. 10* 10lü 1010

контрольное время - 15 сут

E. coli 10 107 106

Bifidobacterium spp. 10J 104 104

Lactobacillus spp. 10" 10iü 10"

Таким образом, применение фукозосодержащих гидролизатов в дозировке 0,04 % от массы тела опытных мышей в условиях экспериментального дисбиоза способствовало увеличению количества бифидобактерий и молочнокислых бактерий, что свидетельствует об их пребиотическом действии. Фукозосодержащие гидролизаты оказывали такое же действие на восстановление микрофлоры мышей на фоне индуцированного дисбиоза, как и коммерческие пробиотические препараты «Бифидумбактерин» и «Лактобактерин».

Расчет себестоимости рекомбинантной а-Ь-фукозидазы по предлагаемой технологии. Для оценки конкурентоспособности полученного фермента был произведен расчет себестоимости а-Ь-фукозидазы. Себестоимость рекомбинантной а-Ь-фукозидазы при его производстве по предлагаемой технологии составила не более 800 руб/г, что на порядок ниже стоимости представленных на рынке аналогичных ферментных препаратов.

выводы

1. Перспективным источником гена a-L-фукозидазы являются бактерии Lactobacillus rhamnosus 12L.

2. Создан генетически-модифицированный штамм Е. coli top 10, продуцирующий a-L-фукозидазу, активность которой составляет 2750 ед/см3, что в 20 раз превышает активность нативного фермента.

3. Оптимальными условиями культивирования генетически-модифицированного штамма Е. coli top 10, обеспечивающими максимальный синтез a-L-фукозидазы с активностью 2750 ед/см3 культуральной жидкости, следует считать концентрацию ИПТГ 0,1 мМ, продолжительность индукции 5 ч, рН 7,0. Исследование стабильности функционирования гибридных плазмид в клетках продуцента показало, что в течение 10 пассажей генетически-модифицированный штамм Е. coli top 10 сохраняет свою стабильность.

4. При разработке технологии получения ферментного препарата показано, что максимальный выход a-L-фукозидазы по активности наблюдался при осаждении этанолом при его концентрации в смеси 75 % и рН 7,0; при этом удельная активность спиртоосажденного фермента составила 120 ед/мг белка.

5. Был получен очищенный рекомбинантный белок a-L-фукозидазы, гомогенность которого доказана электрофоретически.

6. Установлено, что a-L-фукозидаза Е. coli top 10 проявляет максимальную активность при температуре 35 "С и рН 7,0.

7. Показано, что максимальная степень деструкции фукоидана бурых водорослей a-L-фукозидазой Е. coli top 10 составляет 89% при рН 7,0, температуре 35 °С, дозировке фермента 6 ед/г субстрата, продолжительности гидролиза 5 ч; при идентификации продуктов гидролиза фукоидана установлено, после пяти часов гидролиза в гидролизате присутствует преимущественно фукоза.

8. Применение фукозосодержащих гидролизатов в дозировке 0,04 % от массы опытных мышей в условиях экспериментального дисбиоза способствует восстановлению нормальной микрофлоры, что свидетельствует об их пребиотическом действии. Действие фукозосодержащих гидролизатов сравнимо с коммерческими пробиотическими препаратами «Бифидумбактерин» и «Лактобактерин».

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Выбор продуцента высокоактивной фукозидазы и оптимизация условий его культивироания [Текст] / О. С. Корнеева, Т. В. Санина, С. В. Кирьянова // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9. - 0,375 п. л. (лично автором - 0,125 п. л.).

2. Исследование бифидогенной активности фукозы и ее полимеров [Текст] / Т. В. Санина, С. В. Кирьянова, И. В. Черемушкина, О. С. Корнеева // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2011. -№ 1. - 0,25 п. л. (лично автором - 0,06 п. л.).

3. Антиоксидантная активность продуктов гидролиза природных полимеров (маннана и фукоидана) [Текст] / Д. А. Черенков, Е. П. Анохина, С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // Вестник ВГУИТ. - 2012. -№ 1. - 0,25 п. л. (лично автором - 0,06 п. л.).

4. Получение рекомбинантной а-фукозидазы (alffî) [Текст] / С. В. Кирьянова, Д. А. Черенков, А. А. Толкачева, Е. Г. Варламова, О. С. Корнеева // Вестник ВГУИТ. - 2013. - № 3. - 0,25 п. л. (лично автором -0,05 п. л.).

5. Экономическая эффективность производства фукозы из растительного сырья [Текст] / C.B. Кирьянова, A.A. Толкачева, О.С. Корнеева // Финансы. Экономика. Стратегия. - 2013. - (принята в печать).

Статьи и материалы конференций

6. Разработка биокаталитической технологии фукозы и исследование ее влияния на иммунный статус живого [Текст] / Д. А. Черенков, Т. В. Санина, С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и развитие», часть 2 (Москва 21-25 марта 2011 г.). - М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Менделеева. -2011. - 0,125 п. л. (лично автором - 0,03 п. л.).

7. Исследование влияния фукозы на репродуктивную функцию живого организма [Текст] / Д. А. Черенков, Т. В. Санина, С. В. Кирьянова // Материалы XLIX отчетной научной конференции за 2010 год : в 3 ч. - Воронеж: ВГТА. - 2011. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,02 п. л.).

8. Перспективы применения фукозидаз в медицине и сельском хозяйстве [Текст] / О. С. Корнеева, С. В. Кирьянова // Материалы XLIX

отчетной научной конференции за 2010 год : в 3 ч. - Воронеж: ВГТА. -2011. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,03 п. л.).

9. Оптимизация процесса экстракции фукоидана из бурых водорослей [Текст] / Т. В. Санина, С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск 13: ВГУ. - 2011. -0,5 п. л. (лично автором - 0,16 п. л.).

10. Разработка биотехнологии пребиотиков на основе фукозосодержащих гидролизатов и исследование их бифидогенных свойств [Текст] / С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // Материалы Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 2 (Москва 20-22 марта 2012 г.).- М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Менделеева. - 2012. - 0,125 п. л. (лично автором - 0,06 п. л.).

11. Получение высокоактивной фукозидазы с помощью методов генной инженерии [Текст] / С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // Материалы L отчетной научной конференции за 2011 год: в 3 ч. -Воронеж: ВГУИТ. - 2012. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,03 п. л.).

12. Сравнительный анализ апьфа-фукозидаз с применением методов биоинформатики [Текст] / C.B. Кирьянова, А. Самченко, М.С. Кондратьев, Д.А. Черенков, О.С. Корнеева // Актуальные биотехнологии. - 2010. - № 1. - 0,375 п. л. (лично автором - 0,075 п. л.).

13. Получение рекомбинантной а-фукозидазы [Текст] / С. В. Кирьянова, О. С. Корнеева // Материалы LI отчетной научной конференции преподавателей и научных сотрудников за 2012 год: в 3 ч. - Воронеж: ВГУИТ. - 2012. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,03 п. л.).

Подписано в печать 22.11.2013 г . Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ № 249

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО «ВГУИТ») Отдел полиграфии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» Адрес академии и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Кирьянова, Светлана Владимировна, Воронеж

ФГБОУ ВПО «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ»

04201455727

На правах рукописи

Кирьянова Светлана Владимировна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ а-Ь-ФУКОЗИДАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ГИДРОЛИЗАТОВ ФУКОИДАНА

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Корнеева О.С.

Воронеж - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.....................................................................................5

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................9

1.1 Фукоиданы растительного сырья: структура и свойства............................9

1.2 Фукозидазы: классификация, продуценты.......................................15

1.2.1 Продуценты a-L-фукозидазы..............................................17

1.2.2 Факторы, влияющие на биосинтез a-L-фукозидазы при культивировании продуцентов.....................................................19

1.3 Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов................................................................................22

1.3.1 Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК................22

1.3.2 Клонирование и экспрессия гена a-L-фукозидазы....................26

1.4 Получение препаратов a-L-фукозидаз и их характеристика.................27

1.4.1 Выделение и очистка a-L-фукозидаз....................................27

1.4.2 Физико-химические свойства a-L-фукозидаз различного происхождения........................................................................29

1.4.3 Продукты деструкции фукоидана...........................................34

1.4.3.1 Функциональные свойства фукозы и

фукоолигосахаридов.......................................................................34

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......36

2.1 Объект исследования и условия культивирования.............................36

2.2 Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе...........................................37

2.3 Методы молекулярного клонирования в бактериях...........................37

2.3.1 Выделение хромосомной ДНК L. rhamnosus 12L.......................37

2.3.2 Выделение плазмиды рЕТ-23Ь (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. coli.........................................................39

2.3.3 Полимеразная цепная реакция.............................................40

2.3.4 Создание генетических конструкций

«клонирующий вектор - встроенная ДНК»....................................42

2.3.5 Трансформация клеток химическим методом..........................42

2.3.6 Электрофорез в агарозном геле и визуализация ДНК.................44

2.3.7 Выделение ДНК из агарозного геля.......................................45

2.4 Определение активности a-L-фукозидазы......................................45

2.5 Очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы.............................47

2.6 Получение спиртоосажденного ферментного препарата.......................48

2.7 Определение физико-химических свойств фермента.........................48

2.8 Выделение фукоидана из биомассы бурых водорослей.......................49

2.9 Определение степени гидролиза фукоидана.....................................50

2.10 Исследование пребиотических свойств фукозосодержащих

ги дро лизатов..........................................................................50

2.11 Общие биохимические и микробиологические методы исследования.................................................................................51

2.12 Статистическая обработка экспериментальных данных.....................52

ГЛАВА 3 КОНСТРУИРОВАНИЕ

ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО

ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА a-L-ФУКОЗИДАЗЫ...............................53

3.1 Сравнительное исследование a-L-фукозидаз

различного происхождения..............................................................53

3.2 Выбор объекта клонирования и системы экспрессии.........................56

3.3 Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора рЕТ-23Ь (+)...................................................................................57

3.4 Исследование стабильности генетически модифицированного

штамма Е. coli top 10......................................................................62

ГЛАВА 4 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ a-L-ФУКОЗИДАЗЫ И

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА.....64

4.1 Подбор оптимальных условий глубинного культивирования генетически модифицированного штамма Е. coli top 10............................64

4.1.1 Очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы..........................67

4.2 Получение спиртоосажденного ферментного препарата a-L-фукозидазы............................................................................68

4.3 Технология получения ферментного препарата рекомбинантной

a-L-фукозидазы Е. coli top 10.........................................................71

4.4. Исследование влияния pH и температуры на активность

a-L-фукозидазы..........................................................................75

ГЛАВА 5 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ФУКОИДАНА РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ФУКОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ.....................................78

5.1 Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза фукоидана и идентификация продуктов гидролиза....................................78

5.2 Изучение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов........................................................................................................80

5.3 Расчет себестоимости рекомбинантной a-L-фукозидазы

по предлагаемой технологии............................................................82

5.4 Технико-экономический расчет производства фукозы и

фукозосодержащих гидролизатов......................................................86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................92

ВЫВОДЫ..................................................................................93

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ................................95

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................112

ВВЕДЕНИЕ

a-L-фукозидазы (ЕС 3.2.1.51) - ферменты, относящиеся к классу О-гликозидгидролаз, расщепляют внутренние a - 1,3, - 1,4 - гликозидные связи основной цепи молекул фукоидана - полисахарида клеточных стенок бурых водорослей. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза фукоолигосахариды и моносахарид фукоза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень фукозы в крови приводит к нарушению синтеза фукозилированных гликанов и вызывает хронический иммунодефицит и недоразвитость ткани тимуса (Park, 2007, АН et al, 2008). Поэтому актуальным является создание на основе продуктов гидролиза фукоиданов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами.

Спектр микроорганизмов - природных продуцентов a-L-фукозидаз довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.

Изучением a-L-фукозидаз занимались в основном зарубежные ученые: Sano (1992), Goso (2001), Katayama (2004), Miura (2005),

Rodriguez-Diaz (2013) и другие. Однако число работ, посвященных выделению и клонированию генов a-L-фукозидаз с целью максимальной продукции фермента, увеличению его активности, изменения свойств ферментов для их промышленного применения немногочисленно, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.

В настоящее время на рынке имеется коммерческий ферментный препарат термостабильной a-L-фукозидазы из Т. maritima фирмы Megazyme. Однако он имеет низкую фукозидазную активность и высокую стоимость. На отечественном рынке коммерческих препаратов ферментов, способных расщепить сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует. Поэтому поиск и получение активных продуцентов a-L-фукозидазы является актуальной задачей современной биотехнологии.

Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных Сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственный контракт № 14.512.11.0069 от 17.04.2013 г.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор микроорганизма - источника гена a-L-фукозидазы и системы экспрессии клонированного гена;

• получение рекомбинантного штамма - высокоактивного продуцента a-L-фукозидазы;

• определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;

• получение ферментного препарата a-L-фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;

• очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы;

• исследование ферментативной деструкции фукоидана;

• определение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.

Научная новизна. С применением технологии рекомбинантных ДНК впервые получен отечественный ферментный препарат высокоактивной a-L-фукозидазы. путем введения в составе плазмиды pet23b+ гена a-L-фукозидазы под контролем Т7 - промотора сконструирован штамм Е. coli top 10 - перспективный продуцент a-L-фукозидазы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам a-L-фукозидаз. Установлены оптимальные параметры биосинтеза генетически-модифицированного штамма. Доказано, что внесение фукозосодержащих гидролизатов дозировке 0,04 % от массы тела опытных мышей в условиях экспериментального дисбиоза, способствует восстановлению нормальной микрофлоры животных.

Практическая значимость. Разработана биотехнология рекомбинантной a-L-фукозидазы, способной гидролизовать фукоидан бурых водорослей до фукоолигосахаридов и фукозы, позволят существенно расширить рынок пребиотиков.

Полученные научные материалы используются в учебном процессе для студентов, обучающихся по направлению подготовки

«Биотехнология».

Новизна технических решений отражена в заявке на изобретение (приоритет от 24.09,2013 № 2013143212).

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных конференциях ВГУИТ (г. Воронеж, 2011-2013 гг.); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011,2012 гг.).

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 13 работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 123 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 20 рисунков и 9 таблиц. Библиография включает 145 наименований, в т. ч. 115 иностранных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фукоиданы растительного сырья: структура и свойства

Фукоиданы - это сложные сульфатированные гетерополисахариды, выделяемые преимущественно из бурых водорослей, основным моносахаридным звеном которых является Ь-фукоза. Содержание фукоиданов может достигать 25-30 % от сухого веса водоросли и зависит, в основном, от вида водоросли, а также от сезона или стадии развития водоросли, места сбора и других факторов. Строение фукоидана представлено на рис. 1.1. [ 1, 24]

Рисунок 1.1- Строение фукоидана бурых водорослей (по А. И. Усову).

Параметры, по которым различаются фукоиданы в зависимости от вида водорослей и условий ее произрастания, это молекулярная масса (от

10 до 1000 кДа), моносахаридный состав (помимо фукозы в их структуре могут присутствовать галактоза, ксилоза, манноза, арабиноза, рамноза, рибоза, глюкуроновая кислота), положение и содержание сульфатов (могут иметь 0-2 остатка серной кислоты в молекулах фукозы), а также тип связи между молекулами фукозы (а-(1—>3), (1—>2), (1—»4) либо их сочетание) и структура боковых цепей [2].

Несмотря на то, что фукоиданы известны давно, далеко не все их структурные особенности выяснены с достаточной определенностью. В первую очередь это относится к структуре фрагментов, включающих минорные моносахариды. В настоящее время установлено, что большинство известных фукоиданов относится к двум структурным типам: первый тип содержит в основной цепи а-1—>3-, второй тип — чередующиеся а-1—>3- и а-1 —>4-связанные остатки фукозы. Разветвления присоединены в положении 2, а сульфатные группы могут находиться при С4 остатка фукозы. Выделены фукоиданы, в которых сульфатные группы расположены при С2, а также при С2 и С4. Кроме того, известны фукоиданы, в которых остатки фукозы не только сульфатированы, но и ацетилированы [65].

Нужно отметить, что в большинстве случаев установлены структуры фракций фукоиданов, основным компонентом которых является фукоза. Эти полисахариды выделены из бурых водорослей, принадлежащих к порядкам Chordariales, Laminariales, Fucales. Бурые водоросли, принадлежащие порядкам Chordariales и Laminariales (Phaeosporophyceae), синтезируют полисахариды, состоящие из а-1—>3-связанных остатков фукозы. Основная цепь этих полисахаридов может иметь разветвления при С2 некоторых остатков фукозы (остаток D-GlcA ( Cladosiphon okamuranus ) или остаток Fue {Chorda filum)). Основная цепь фукоиданов водорослей порядка Fucales (Cyclosporophyceae)построена из чередующихся а-1—>3- и а-1 —>4-связанных остатков фукозы, в результате

чего формируется регулярная структура полисахаридной цепи. Однако в нативном фукоидане эта регулярность маскируется беспорядочным расположением сульфатных и ацетатных групп. Возможно, что различия в структуре основной цепи фукоиданов связаны с разным механизмом биосинтеза этих полисахаридов у бурых водорослей, принадлежащих Phaeosporophyceae и Cyclosporophyceae[66, 70].

Фукансульфаты морских ежей Arbacia lixula , Lytechinus variegates и голотурии (Ludwigothurea grisea) состоят из повторяющихся тетрасахаридных звеньев и, в отличие от фукоиданов, обладают четко выраженной регулярной линейной структурой и не содержат ацетатных групп.

Выяснение связи между структурой и биологической активностью фукоиданов в настоящее время является важной, но малоизученной проблемой. Следует отметить, что большинство исследователей приводят данные о биологической активности нативных фукоиданов, детали структуры которых, как правило, если и установлены, то лишь частично в силу своей сложности. Четкое установление структуры в сочетании с биологической активностью необходимо для разработки на основе фукоиданов как лекарственных средств, так и препаратов для научно-исследовательских целей [37, 38, 135].

Многочисленные исследования последних 10-15 лет посвящены биологическому действию фукоиданов и фукоолигосахаридов, полученных путем частичного гидролиза фукоиданов. Фукоиданы проявляют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что является причиной повышенного интереса к ним. Так, в литературе имеются сообщения о противоопухолевых, иммуномодулирующих, антибактериальных, противовирусных, противовоспалительных и других свойствах фукоиданов. По этой причине фукоиданы можно отнести к так называемым «поливалентным биомодуляторам» [131, 132]. Недавно было

показано, что фукоиданы, выделенные из бурых водорослей ингибируют обратную транскриптазу in vitro. [41, 66] Это открытие позволит сделать определенные шаги в направлении создания препаратов нового поколения для борьбы с вирусными заболеваниями. Такие выводы подкреплены недавними исследованиями японских ученых, показавших, что фукоиданы из морской водоросли Cladosiphon okamuranus при определенных условиях препятствуют развитию вируса тропической лихорадки [129]. В ряде исследований было выявлено наличие у препаратов водорослей противовирусной активности в отношении вируса иммунодефицита человека. Активность вируса иммунодефицита человека in vitro подавляли экстракты Dygenea simplex, полисахариды Fucus vesiculosus, сульфатированные полисахариды некоторых других видов морских водорослей [137]. Кроме того, полисахариды морских водорослей проявляли активность в отношении вируса герпеса, гриппа, цитомегаловируса, кори и эпидемического паротита [138].

Фукоидан из фукусовых водорослей ингибировал рост некоторых патогенных бактерий в культуре, а также стимулировал in vivo фагоцитоз и другие реакции клеточного и гуморального иммунитета. [

Информация о работе

Кирьянова, Светлана Владимировна
кандидата технических наук
Воронеж, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы