Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологии β-маннаназы на основе рекомбинантного штамма B.Subtilis 168

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии β-маннаназы на основе рекомбинантного штамма B.Subtilis 168"

005005872

Анохина Екатерина Петровна ' '

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ р-МАННАНАЗЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА В. виВТИЛБ 168

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 2 ЛЕН 2011

Воронеж 2011 г

005005872

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Офицеров Евгений Николаевич

кандидат технических наук Лукина Галина Павловна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московский государственный

университет пищевых производств»

Защита состоится « 26 » декабря 2011 г в 1230 ч на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.035.06 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий».

Автореферат диссертации отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на официальном сайте ВГУИТ: www.vgta.vrn.ru.

Автореферат разослан « 25 » ноября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ( ^

кандидат биологических наук, доцент . ^ ^ Г. П. Шуваева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. р-Маннаназы (ЕС 3.2.1.78) - ферменты, относящиеся к классу О-гликозид-гидролаз, расщепляют внутренние р-1,4-гликозидные связи в маннанах - полисахаридах гемицеллюлозной фракции клеточкой стенки растений. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза манноолигосахариды и моносахарид манноза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень маннозы в крови приводит к анормальному гликозилированию иммуноглобулинов и нарушеншо структуры их углеводной части, а также нарушению синтеза других гликопротеинов [Hernández et al, 2008]. Поэтому актуальным является создание на основе продуктов гидролиза маинанов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами. Кроме того, р-маннаназы используют для получения высококачественной бумаги, растворимою кофе, комбикормов и некоторых других продуктов.

Спектр микроорганизмов - природных продуцентов р-маннаназ довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.

Достижения в области технологии молекулярного клонирования и генной инженерии позволяют решить данную проблему путем создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что позволяет повысить активность и выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.

Получением высокоактивных р-маннаназ занимались в основном зарубежные ученые: Arcand (1993), Tamaru (1997), Sunna (2000), Hatada (2005), Chen (2008) н другие. Однако исследования, направленные на создание рекомбинантных продуцентов Р-маннаназ, немногочисленны, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.

В настоящее время на рынке ферментных препаратов представлены коммерческие препараты Р-маннаназ зарубежного производства. Имеющиеся запатентованные отечественные комплексные ферментные препараты, продуцентами которых являются в основном микромицеты, обладают низкой маннаназной активностью, по сравнению с импортными ферментами, поэтому поиск и получение активных продуцентов Р-маннаназ является актуальной задачей современной биотехнологии.

В связи с вышесказанным, получение эффективного продуцента Р-маннаназы методом генной инженерии и разработка на его основе биотехнологии высокоактивной р-маннаназы являются актуальными.

Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных Сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по

приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», государственный контракт № 02.512.11.2206 от 26.06.2008 г.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биотехнологии высокоактивной ß-маннаназы с использованием методов генной инженерии, исследовании физико-химических свойств ферментного препарата и определении пребиотической способности полученных маннозосодержащих гидролизатов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор микроорганизма - источника гена ß-маннаназы и системы экспрессии клонированного гена;

• определение эффективного промотора для экспрессии гена ß-маннаназы;

• получение рекомбинантного штамма - высокоактивного продуцента ß-маннаназы;

• определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;

• получение ферментного препарата ß-маннаназы и исследование его физико-химических свойств;

• исследование ферментативной деструкции галактоманнана и идентификация продуктов гидролиза;

• определение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.

Научная новизна. С применением технологии рекомбинантных ДНК впервые получен отечественный ферментный препарат высокоактивной ß-маннаназы. Путем введения в составе многокопийного вектора рСВ20 дополнительных копий гена ß-маннаназы под контролем регулируемого промотора PST сконструирован штамм В. subtilis 168 -перспективный продуцент ß-маннаназы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам ß-маннаназ. Выявлены закономерности кислотной и термической инактивации рекомбинантного фермента. Установлены оптимальные параметры процесса ферментативной деструкции галактоманнана камеди рожкового дерева, обеспечивающие степень гидролиза галактоманнана 85 %.

Практическая значимость. Проведена апробация биотехнологии рекомбинантной ß-маннаназы на базе ИБФМ РАН и получена опытная партия фермента. Разработана технология получения маннозосодержащих гидролизатов, основанная на ферментативном гидролизе галактоманнанов ß-маннаназой, которая может найти применение при производстве функциональных продуктов и кормовых добавок с иммуностимулирующим и пребиотическим действием.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных конференциях ВГТА (г, Воронеж, 2009-2011 гг.); «Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых» (2009 г); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2010, 2011 гг.); 2-ом международном конгрессе «ЕвразияБно» (г. Москва, 2010 г.); 4-й всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010»; конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.); II Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева (г. Москва, 2010 г.) международном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2011» (г.Санкт-Петербург, 2011 г.).

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», где отмечена медалью за лучшую научно-исследовательскую работу.

Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.».

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 142 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 25 рисунков и 9 таблиц. Библиограф™ включает 160 наименований, в т. ч. 135 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследования.

ГЛАВА I. Обзор литературы. Осуществлен обзор данных литературы, касающихся характеристики растительных источников маннанов и выявлению наиболее перспективные из них. Рассмотрены различные продуценты р-маннаназ, условия биосинтеза ими фермента. Отмечено, что микроорганизмы продуцируют комплекс карбопщраз,. обладающий относительно низкой маннаназной активностью. На основании анализа исследований по клонированию маннаназных генов показана возможность применения методов генной инженерии для повышения эффективности природных продуцентов. Представлена общая характеристика р-маннаназ, их физико-химических свойств, способов выделения и очистки. Рассмотрены

перспективные направления практического использования высокоактивных ß-маннаназ.

ГЛАВА II. Объекты, материалы и методы исследований. Объектом исследования служили продуценты ß-маннаназ - бактерии рода Bacillus (ВКПМ, ГосНИИгенетика, Москва). Для оживления и поддержания культур использовали агаризованную среду Лурия-Бертани.

Скрининг штаммов из коллекции микроорганизмов ВКПМ, депонированных как продуценты различных карбогидраз, проводили на минимальной агаризированной среде с содержанием 0,1 % пептона, 0,1 % дрожжевого экстракта и 0,5 % камеди рожкового дерева в качестве источника маинанов. Наличие зон просветления вокруг колоний после заливки чашек-реплик 0,1 % раствором красителя Конго красного с последующей отмывкой водой от красителя указывало на активность ß-маннаназы.

Для отбора рекомбинантных плазмид использовали штамм Escherichia coli XL-1 blue.

Для клонирования применяли векторы pBlueScript KS (+) (Stratagen, USA), pCB20 (ГосНИИгенетика, Москва).

Последовательность нуклеотидов гена ß-маннаназы (ManF) В. subtilis 168 была получена из базы данных NCBL Кодирующую часть гена ß-маннаназы В. subtilis 168 (1038 п. н.) амплифицировали при помощи ПЦР, используя праймеры ManF For (EcoRV): 5'-ggGATATCgggggagttgcatttgtt-3', ManF Rev (SacI): 5'-ggGAGCTCatceagtgggaaggtgct-3' и хромосомную ДНК В. subtilis 168 в качестве матрицы. Полученный фрагмент клонировали в вектор pBlueScript KS (+) по сайтам рестрикции EcoRV и SacI.

В качестве промоторов для экспрессии гена ß-маннаназы нами были выбраны промотор PST В. subtilis, регулируемый фосфатным голоданием, и ксиланазный промотор XylA В. megaterium, который в комплексе с геном репрессора XylR индуцируется добавлением ксилозы.

Промоторы амплифицировали при помощи ПЦР (см. далее), используя соответствующие генспецифические праймеры и хромосомную ДНК В. subtilis 168 (PST) и B.megaterium (XylR-XylA) в качестве матрицы, и продукты амплификации клонировали в вектор pBlueScript ks (+), содержащий последовательность гена ß-маннаназы, по соответствующим сайтам рестрикции.

Для амплификции промотора XylR-XylA праймерами служили следующие олигонуклеотиды: XylR-XylA promoter For (EcoRV): 5'-ggGA-TATCgatttaagtgaacaagtt-3', XylR-XylA promoter Rev (Kpnl): 5'-ggGGTACC-ttaagatcaacgtgatat-3'.

При амплификации промотора PST использовали следующие праймеры: PST promoter For (Kpnl): 5-ggGGTACCactaaaaaaaacgctcac-3', PST promoter Rev (EcoRV): 5'-ggGAATTCACCTCCTgatatcGTATAAT-GTGTA-ATTTG-3'.

После трансформации клеток Escherichia coli XL-1 blue проводили скрининг клеток, несущих плазмиду pBlueScript KS (+) с клонированным

фрагментом, по устойчивости к ампицнлину на стандартной среде с ИПТГ и субстратом

Для получения рекомбинантной ДНК на основе вектора рСВ20 конструкции, содержащие кодирующую часть гена р-маннаназы под контролем промоторов Р8Т и Ху1А, были субклонированы из вектора рВ1ие8спр! К5 (+) с помощью рестрпктаз Крп1 и 8ас1 в вектор рСВ20 по тем же сайтам.

После введения гибридных плазмид в клетки В. хиЫШз отбор трансформированных клеток проводили на селективной среде с эритромицином.

Выделение хромосомной ДНК и плазмид, рестрикция, лигирование, электрофорез в агарозном геле, ПЦР, трансформация проводились по стандартным методикам.

Культивирование нативных и рекомбинантных бактерий В. зиЫШз проводили в колбах Эрленмейера (0.75 л), на орбитальном шейкере 1п/ог.$ \<Т (150 об/мин) в периодических условиях в течение 48 ч при температуре 35 - 37 °С.

Для культивирования нативных бактерий В. ¿пЫПк 168 использовали среду следующего состава: 1% камедь рожкового дерева, 1% пептон, 0.5% дрожжевой экстракт, 0.5% (МН4)2804, 0.4% Ма2НР04, 0.03% КН2Р04, 0.06% МеСЬ, 0.3% СаС12, 0.3% Ка2С03,0.001% Ре504, рН 7.0.

Клетки, имеющие в составе плазмиды ген р-маннаназы с ксиланазным промотором (Ху1А), выращивали на среде Лурия-Бертани (ЬВ). За 6 ч до окончания культивирования в качестве индуктора биосинтеза фермента в среду добавляли ксилозу до концентрации 0.8 %.

Культивирование бактерий, трансформированных плазмидой, содержащей ген Р-маннаназы под контролем промотора РБТ, проводили на среде ЬВ, обедненной фосфатами.

Для определения активности р-маннаназы реакционную смесь, состоящую из 200 мкл раствора камеди рожкового дерева с массовой долей 1 % в фосфатном буфере с рН 7,0, н 100 мкл раствора фермента, инкубировали в течение 20 мин при 37 СС. Освобождающиеся сахара измеряли методом Сомоджи-Нельсона. За единицу активности р-маннаназы принимали такое количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль маннансодержащих субстратов за 1 мин в стандартных условиях.

Выделение ферментного препарата. По окончании выращивания биомассу бактерий отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осаждение ферментного препарата проводили различными органическими растворителями (96 % этанолом, 98 % изопропанолом) при температуре 2 - 4 °С. Для формирования осадка смесь выдерживали 30 мин, после чего осадок отделяли на рефрижераторной центрифуге при 3000 об/мин и высушивали при комнатной температуре.

Определение свойств фермента. Для определения оптимальных значений рН и температуры действия фермента проводили гидролиз галактоманнана камеди рожкового дерева в интервале рН 5,0-9,0 и температур 20-60 °С. Кинетику кислотной и термической инактивации фермента исследовали в интервале рН 6,0 - 7,5 и в диапазоне температур 30 -50 °С. В процессе инактивации контролировали изменение р-маннаназной активности.

Определение степени гидролиза маннанов. Для определения степени гидролиза маннанов реакционную смесь, содержащую 200 мкл субстрата, 1 мл фосфатного буфера с рН 7,0 и 100 мкл фермента, выдерживали при 35 °С в течение заданного времени. Затем определяли восстанавливающие сахара по методу Сомоджи-Нельсона. Исходя из количества образовавшихся восстанавливающих Сахаров, рассчитывали степень гидролиза.

Общие биохимические и микробиологические методы исследований. Содержание белка в пробах определили по методу Лоури, величину рН - потенциометрически, титр клеток определяли нефелометрическим методом при длине волны 590 нм.

Определение углеводного состава гидролизатов методом тонкослойной хроматографии. При анализе углеводов использовали смесь растворителей, состоящую из пропанола-1, нитрометана и воды в соотношении объемных частей 7, 2 и 1 соответственно. В качестве проявителя для обнаружения углеводов применяли смесь, состоящую из 0,5 мл п-анисальдегида (4-метоксибензальдегид), 0,5 мл концентрированной серной кислоты, нескольких капель ледяной уксусной кислоты и 9 мл 95 % этанола. После опрыскивания пластинки инкубнров&аи при 121 °С в течение 5 мин. Идентификацию компонентов и их содержание проводили с использованием программного продукта «ТСХ-Менеджер».

Исследование прсбиотической активности маннозосодержащих гидролизатов проводили путем однократного перорального введения мышам возрастающих доз препарата на фоне экспериментального дисбиоза. Экспериментальный дисбиоз индуцировали введением белым беспородным мышам массой 14-16 г антибиотика доксициклина гидрохлорида. Дозу маннозосодержащих гидролизатов рассчитывали, исходя из массы мышей и рекомендуемых в литературе норм потребления пребиотиков для человека. Пребиотаческие свойства маннозосодержащих гидролизатов изучали в сравнении с коммерческими пробиотиками «Лактобактерин» и «Бифидумбактерин», дозы которых рассчитывали, исходя из рекомендуемых для человека норм.

Просветную микрофлору анализировали по 3 пробам асептически взятых фекальных масс от 5 мышей. Исследование микрофлоры кишечника экспериментальных животных проводили по общепринятой методике.

Выделение бактерий из патологического материала и идентификацию штаммов проводили с использованием соответствующих стандартных

дифференциально-диагностических сред (кровяной агар, агар Клиглера, среда Кларка, фенилаланиновый агар, МРС-4, среда Сабуро, среда Плоскирева, среда Симмонса, среда с лизином, среда Эндо, среда Блаурокка).

Статистическая обработка результатов. Все определения проводили не менее, чем в трех повторностях трех серий экспериментов. В диссертации представлены средние результаты серии экспериментов, обеспечивающие 95 % точности по статистическим критериям.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА Iii. Конструирование рекомбинанткого штамма -продуцента ß-маинаназы

Выбор объекта клонирования и системы экспрессии. Как

показывают литературные данные, наиболее обширную группу микроорганизмов - продуцентов ß-маннаназ составляют микроскопические грибы и бактерии, при этом бактериальные продуценты несколько уступают грибным по активности. Выбор бактериальной культуры в качестве продуцента ß-манианазы обусловлен доступностью генетических манипуляций для внесения изменений в бактериальный геном.

Среди бактерий - продуцентов ß-маннаназ большую группу составляют различные виды рода Bacillus. В результате скрининга штаммов этого рода из коллекции микроорганизмов ВКПМ ГосНИИгенетика в качестве источника целевого гена ß-маннаназы был выбран штамм Bacillus sublUis 168, как обладающий достаточно еысокой активностью и известной нуклеотидной последовательностью гена ß-маинаназы.

В качестве организма хозяина рекомбинантной ДНК выбрали бактерии того же вида. При экспрессии гена ß-маннаназы В. subtilis ¡68 в бактериях того же вида секреторный сигнал данного белка с высокой степенью вероятности будет корректно распознаваться клетками хозяина, что обеспечит способность клеток-продуцентов секретировать рекомбинантный белок в питательную среду. Данное обстоятельство является важным при получении ферментов, так как при этом значительно облегчается выделение и очистка белка. Кроме того, бактериальные продуценты характеризуются быстрым ростом, что сокращает время на производство ферментного препарата и делает их наиболее перспективными для промышленного применения.

Создание генетических конструкций на основе плазмидиого вектора pBiucScrijit Its (+). Для клонирования фрагментов ДНК использовали вектор pBlueScript ks (+). На основе данного вектора были созданы две генетические конструкции, содержащие кодирующую часть гена ß-маннаназы под контролем промотора PST или XylA. Структуры полученных плазмид pBS-PST promoter-ManF и pBS-XylA prcmoter-ManF представлены на рис. 1 и 2 соответственно.

/i-Лактамаза fA^ )

repfpMBl)

B.sublilis Ш ManF

\ Ea>RV(1825) Kpn\m\) PST-HPOMOTOP

8-Лакгамага {A^ )

epfjjMBJ)

I pBS-XylR-XylA-promater-ManF 5455 п.н.

£od(M8)

Терштйтор tpaHCtrpramiffi MariF

B.suhlüis 16Я ManF

RBS £coRV(i825) XyiA-промоКф

Kpnl(3254)

Рисунок 1. Конструкция на основе вектора pBUseScript ks (+), содержащая кодирующую часть гена ß-маннаназы под контролем промотора PST

Рисунок 2. Конструкция на основе вектора рВ!ие8спр1 кз (+}, содержащая кодирующую часть гена р-маннаназы по. контролем промотора Ху!А

ХуЖ

Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20. В качестве вектора для экспрессии клонированного гена р-маннаназы в работе использована многокопийная плазмида рСВ20, которая содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию гена после введения рекомбинанткой плазмиды в бактериальную клетку.

Для исследования экспрессии гена р-маннаназы под контролем различных промоторов и определения более эффективного из них в данной системе были созданы генетические конструкции на основе репликативного вектора рСВ20, способные автономно реплицироваться в клетках В. ьиЬШ'и: и экспрессировать целевой ген. Полученные конструкции рСВ-Ху1А ргоп^ег-МапР и рСВ-Р8Т ргото1ег-МапР представлены на рис. 3 и 4 соответственно.

10

J»S(rei>A-pSMt9035)

CDS leryK)

ß-Jlairiamaa (А, )

I pCB-XylXOCylA-promote-MfBiF 10182 D.H.

/

-&id(2660)

Терминатор травмфцощт MaiiF

В. subtilis Ш MaaT

X.ylA-промотор

Рисунок 3. Конструкция на основе вектора рСВ20, содержащая кодирующую часть гена р-маннаназы под контролем промотора Ху1А

:i)S(rcpA-pSM19035)

CDS&yR)

ß-Лактадаза (Ал)

Sacl (2660)

Терминатор трэнпфягщкй ManF В. subtilis 168 AfanF

RBS PST-промагор ^1(3973)

Рисунок 4. Конструкция на основе вектора рСВ20. содержащая кодирующую часть гена ß-маннаназы под контролем промотора PST

Выбор наиболее эффективного промотора для экспрессии гена ß-маинаназы. Для определения наиболее эффективного промотора для экспрессии гена ß-маннаназы оценили уровень экспрессии гена ß-маннаназы под контролем XylA и PST промоторов по активности фермента в питательной среде.

С этой целью культивировали бактериальные клетки В. subtilis 168, трансформированные рекомбинантными плазмидами pCB-PST-promoter-ManF и pCB-XylA-promoter-ManF. В качестве контроля использовали нативный безплазмидный продуцент. Активность ß-маннаназы в культур&иьной жидкости исходного и рекомбинантных продуцентов представлены на рис. 5.

По сравнению с конгролем, активность ß-маннаназы, продуцируемой генетически модифицированными штаммами, выросла в 16 и 20 раз (в случае промотора XylA и PST соответственно), что свидетельствует Об увеличении уровня синтеза целевого фермента. На основании экспериментальных данных из двух протестированных промоторов выбран промотор PST, как более эффективный в данной системе.

А, ед/мл

2500

2000 ■

1500

1000

500 ■

Рисунок 5. Активность нативной и рекомбинантных р-маинаназ в культураяьной жидкости: 1 - кативный продуцент, 2 - рекомбинантный штамм, трансформированный плазмидой, содержащей ген ß-маннаназы под контролем ксиланазнего промотора (XylA), 3 - рекомбинантный штамм, имеющий в составе плазмиды ген ß-маннаназы в комбинации с промотором PST

Таким образом, за счет введения в составе многокопийного вектора рСВ20 дополнительных копий гена ß-маннаназы гюд контролем регулируемого промотора PST, получен рекомбинантный штамм В. mbtilis ¡68, активно продуцирующий ß-маннаназу и превышающий уровень активности нативных бактерий более чем в 20 раз.

Исследование стабильности рекомбинантного плазмидногс штамма В. subtUis 168. Исследование стабильности функционирования гибридных плазмид в клетках продуцента показало, что в течение 10 пассажей на питательной среде заметного изменения активности ß-маннаназы не наблюдалось, но при дальнейших пересевах культуры бактерий происходило постепенное снижение маннаназной активности, что свидетельствует о частичной потере гибридных плазмид бактериальными клетками.

ГЛАВА IV. Получение рекомбинантной ß-маннаназы и исследование физико-химических свойств фермента

Подбор оптимальных условий глубинного культивирования рекомбинантного штамма В, subtilis 168. Для культивирования рекомбинантного продуцента применяли простую стандартную питательную среду с учетом оптимальных условий транскрипции гена ß-маннаназы под контролем промотора PST. Данный промотор инициирует синтез мРНК при недостатке в среде фосфатов, поэтому при культивировании рекомбинантного штамма использовали питательную среду Лурия - Бертани, обедненную фосфатами.

С целыо оптимизации условий биосинтеза фермента было исследовано влияние температуры, исходного рН среды, аэрации и времени культивирования на уровень продукции целевого фермента ргкомбинантным штаммом В. янЬНИх 168.

Исследование влияния исходного значения рН среды на биосинтез рекомбинанткой р-маннаназы В. виЫШз 168 представлено на рис. 6 а. Продуцент проявлял способность к биосинтезу фермента в диапазоне значений рН от 6,0 до 8,0, максимальный биосинтез наблюдался при рН 7,0. Отклонение рН питательной среды от оптимальных для синтеза фермента значений как в кислую, так и в щелочную сторону приводило к снижению активности Р-маннаназы, причем потерл активности р-маннаназы более существенна при изменении значен:« рН среды в щелочную сторону.

А%

100-

80&0-W\

гр-

о.

А

юо

во-60-W 20

"55 ¿5 &5 То 1.5 НО 3.5 рН °20 25 30 35 73 15 55 Т'С а б

Рисунок 6. Влияние рН среды (а) и температуры культивирования (б) на активность рекомбинантной р-маннаназы В. хиЫШз ¡68

100 i00 500 Y. см'

Рисунок 7. Влияние интенсивности аэрации на активность р-маннаназы В. subtilis 168

А.%

ЮО-

3360-СО-200-

титр-Ю'кп/ог'

12 Л 1б Ж б5

{рет V

Рисунок 8. Накопление активности р-маннаназы (1) в динамике роста бактерий В. тЬИШ 168 {2)

Влияние температуры на биосинтез р-маннаназы показано на рис. 6 б. Культивирование проводили при начальном значении рН питательной среды равном 7,0. Самый высокий уровень продукции фермента наблюдался при температуре 35 °С. Снижение температуры культивирования до 30 °С приводило к уменьшению активности р-маннаназы ка 60 %, а повышение температуры до 45 °С в значительной степени угнетало синтез фермента, активность которого достигала лишь 23 % от максимальной величины.

Влияние аэрации на биосинтез р-маннаназы исследовали при культивировании рекомбинантного штамма В. subtilis 168 в колбах Эрленмейера на орбитааыюм шейкере со скоростью 150 об/мин при температуре 35 °С. Интенсивность аэрации культивирования продуцента варьировали изменением объема питательной среды в качалочных колбах емкостью 750 см3 от 100 до 500 см3. Максимальное значение р-маннаназной активности было получено при соотношении объема воздуха к объему среды равному 2.75, что соответствовало 200 см3 среды (рис.7).

Динамика биосинтеза р-маннаназы рекомбинантньш продуцентом В. subtilis 168 представлена на рис. 8, из которого видно, что максимальное значение активности фермента р-маннаназы наблюдалось к 24 ч роста клеток, что соответствует стадии активного роста продуцента. К этому периоду времени тигр клеток достигал значения 6,1*109 кл/см3.

При оптимальных условиях культивирования рекомбинантного продуцента В. subtilis 168 активность р-маннаназы составила 2374 ед/мл культуральной жидкости.

Получение спиртоосажденного ферментного препарата р-маннаназы. Для изучения условий осаждения и влияния природы органических растворителей на полноту осаждения Р-маннаназы использовали 96 % этанол и 98 % изопропанол. Максимальный выход р-маннаназы по активности (86 %) был получен в случае осаждения этанолом при его концентрации в смеси 75 %.

Исследования по влиянию рН на полноту осаждения этанолом р-маннаназы В. subtilis 168 из культуральной жидкости показали, что оптимальным является рН 7,0. На основании этих данных можно предположить, что изоэлекгрическая точка р-маннаназы находится в зоне нейтральных значений рН.

Проведенные исследования послужили основой для разработки технологии получения ферментного препарата р-маннаназы, включающей культивирование рекомбинантного штамма при оптимальных условиях, концентрирование фильтрата культуральной жидкости методом ультрафильтрации (диаметр пор мембраны 0,02 мкм) в 50 раз, осаждение фермента этиловым спиртом, сублимационную сушку ферментного препарата и измельчение до степени дисперсности 50-100 мкм. В результате активность спиртоосажденного ферментного препарата составила 72000 ед/г, удельная активность 116 ед/мг белка.

Исследование влияния рН и температуры на активность р-маннаназы. При исследовании физико-химических свойств ферментов важное значение, как с теоретической, так и с практической точки зрения, имеют характеристики оптимальных условий их действия на субстрат-температура и рН.

Изменение активности р-маннаназы в зависимости от концентрации ионов водорода представлено на рис. 9. Из графика следует, что для Р-маннаназы В. яиЫШ.ч ¡68 оптимум действия наблюдался при рН 7,0. При рН 9,0 фермент почта полностью терял каталитическую активность.

Максимальная активность р-маннаназы проявлялась при температуре 40 °С, отклонение температуры на 10 °С от оптимального значения приводило к снижению активности на 60 и 40 % соответственно (рис. 10).

А.% 4%

Исследование кинетики кислотной и термической инактивации Р-маннаназы. Стабильность фермента является одним из критериев оценки качества препарата. Во многих случаях она играет доминирующую роль по сравнению с активностью, когда действие фермента связано с фактором времени. В связи с этим, была изучена динамика кислотной и термической инактивации рекомбикантной Р-маннаназы В. subíilis 168.

Как показали экспериментальные данные, наибозткная стабильность фермента наблюдалась в области рН 7,0 при температуре 30 °С (рис.11 а). В этих условиях через 6 ч инкубации фермент сохранял около 70 % активности. В слабокислой зоне при рН 6,5 и 6,0 за тот же период времени фермент сохранял 50 % своей активности. Более интенсивно инактивация проходила при рН 7,5, в этом случае за 6 ч инкубации остаточная активность составила менее 50 %.

При температуре 40 СС и рН 7,0 за тот же период инкубации остаточная активность фермента составила около 40 % (рис.11 б).

% 5 1о~ 0 хо 5 То Ъ 1Грн

°к 75 1 £ 15 Т; ю й 6Г/. х

Рисунок 9. Зависимость активности Р-маннаназы (% от максимальной) от величины рН при температуре 40 °С

Рисунок 10. Влияние температуры на активность р-маннаназы (% от максимальной) при рН 7,0

-рН 6.5 -«-рН 7.0 -*-рН 7.5 -е-рН 6.0

-рН6 5 -»-рН7.0 рН 7.5 -о-рНб.О

Рисунок 11. Динамика кислотной инактивации р-маннаназы при температурах 30 °С (а) и 40 °С (б)

Динамика термической инактивации показала, что для всех исследованных значений рН наибольшей стабильностью фермент обладал при температуре 30 °С, наименьшей - при 50 °С. Так, за б часов инкубации при увеличении температуры с 30 до 50 °С при рН 7,0 остаточная активность снижалась в 4 раза (рис. 12).

-»-ЗП5С -»-35?С -«-40'С -»-Е0?С

Рисунок 12. Динамика термической инактивации Р-маннаназы при рН 7,0

Учитывая полученные экспериментальные данные по термостабильности фермента, целесообразно проводить гидролиз при температуре 35 °С и рН 7,0.

ГЛАВА V. Исследование процесса ферментативной деструкции маннаиов растительного сырья и определение пребнотических свойств маннозосодержащих гидролшатов

Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза галактоманнанов и идентификация продуктов гидролиза.

Исследование процесса гидролиза галактоманнана камеди рожкового дерева спиртоосажденным рекомбинантным препаратом р-маннаназы В. виЬйШ 168 с активностью 72000 ед/г препарата проводили при оптимальных параметрах действия фермента.

На степень деструкции маннаиов большое влияние оказывает дозировка ферментного препарата и продолжительность гидролиза. Для определения этих параметров гидролизу подвергался раствор с массовой долей камеди рожкового дерева 1 %. Фермент вносили в количестве 6-15 ед/г маннана. Об эффективности гидролиза судили по количеству редуцирующих веществ, образующихся в процессе гидролиза (рис. 13).

Из рисунка видно, что дозировка 9 ед/г обеспечивала максимальную степень гидролиза галактоманнана, равную 85 %, за 3 ч гидролиза. Более высокая концентрация фермента и увеличение продолжительности процесса не способствовали значительному увеличению степени гидролиза.

продолжатбльность, ч

Рисунок 13. Зависимость степени гидролиза галактоманнана камеди рожкового дерева от концентрации фермента (ед/г галактоманнана) при температуре 35 °С и рН 7,0

Состав маннозосодержащих гидролизатов, полученных при оптимальных условиях гидролиза галактоманнана камеди рожкового дерева, и проанализированный методом тонкослойной хроматографии, представлен на рис. 14.

гедролизат:

свидетель (М2):

л<* оа

свидетель (М1):

Рисунок 14. Хроматограмма продуктов гидролиза галактоманнана камеди рожкового дерева, обработанная программой «ТСХ-Менеджер 4.0.1»: М1 - манноза, М2 - манкобиоза

O.W оя

Экспериментальные данные показали, что в гидролизатах присутствовали манноза, маннобиоза и незначительное количество других олигомеров маннозы. Полученные результаты согласуются с литературными данными по составу гидролизатов, образующихся под действием известных ß-маннаназ, и косвенно свидетельствуют о том, что ß-маннаназа В. sitbtilis 168 относится к ферментам эндо-дейстивия.

Изучение пребнотичсских свойств маннозосодержащих гидролизатов. При исследовании нормофлоры мышей было установлено, что .количество Escherichia coli, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, как наиболее важных представителей микрофлоры, составило, КОЕ/см3: 106- 107, 103 и 10ш соответственно. При пероральном введении антибиотика в дозе 10 мг/мышь в течение 7 дней у животных наблюдалась элиминация нормальной микрофлоры и контаминация кишечника животных условно-патогенной микрофлорой. Среднее количество E.coli в фекалиях повышалось до 108 КОЕ/г, В. bifidum не высеивались совсем, а содержание L. acidophilus сокращалось до 103 КОЕ/г (табл.1).

Таблица 1

Сравнительная оценка микрофлоры опытных партий мышей

Микроорганизмы Количество микроорганизмов, КОЕ/г фекалий

норма мыши из питомника мыши с дисбиозом

Е. coli lac* lO'-lO" 106 ю8

Bifidobacterium sop. менее 103 10J не обнаружены

Lactobacillus spp. 10ш 10ш 10J

Разовое пероральное введение в рацион мышей маннозосодержащих гидролизатов в возрастающих концентрациях показано, что оптимальным является их применение в дозировке 0,02 % от массы тела опытных мышей.

Результаты исследования микробиоценоза мышей при введении в суточный рацион питания маннозосодержащих гидролизатов и пробиотических препаратов «Бифндумбактерин» и «Лактобактерин», представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что маннозосодержащие гидролизаты, наряду с указанными препаратами, способствовали восстановлению состава и численности индигенной микрофлоры мышей в условиях экспериментального дисбиоза уже на 5 сутки после начала их введения.

Таблица 2

Влияние маннозосодержащих гидролизатов и пробиотиков на микрофлору мышей на фоне дисбактериоза

Микроорганизмы Количество микроорганизмов, КОЕ/г фекалий при внесении в рацион

маннозосодержащих гидролизатоз бифидумбакгерина лакгобактерина

контрольное время - 5 сут

Е. coli lac1" 10' 106 105

Bifidobacterium spp. 10J 10J 103

Lactobacillus spp. 10" 10" 10" ■

контрольное время - 10 сут

E. coli lac1" 10' ю7 106

Bifidobacterium spp. 10* vf 10J

Lactobacillus spp. 10ш ю11 10"

контрольное время -15 сут

E. coli Iac+ 10" 107 10й

Bifidobacterium spp. 10J 10» 103

Lactobacillus spp. 1 o'u 10" 10"

Таким образом, применение маннозосодержащих гидролизатов в дозировке 0,02 % от массы тела опытных мышей в условиях экспериментального дисбиоза способствовало увеличению количества

бифпдобактерий и молочнокислых бактерий, что свидетельствует об их пребиотическом действии.

Маннозосодержащие гидролизаты оказывали такое же действие на восстановление микрофлоры мышей на фоне индуцированного дисбиоза, как и коммерческие пробиотические препараты «Бифидумбактерин» и «Лакгобактсрин».

Расчет себестоимости рекомбинантиой р-маннанязы по предлагаемой технологии. Для оценки конкурентоспособности полученного фермента был произведен расчет себестоимости Р-маннаназы. Себестоимость рекомбинантиой р-маннаназы при его производстве по предлагаемой технологии составила не более 600 руб/г. Учитывая активность фермента ' (72000 ед/г), себестоимость 1000 ед. активности р-маннаназы составила 7,4 руб, что на порядок ниже стоимости представленных на рынке аналогичных ферментных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Бактерии В. хиЬИШ 168 являются источником гена р-маннаназы. Установлено, что регулируемый промотор РБТ является более эффективным, по сравнению с ксиланазным, для экспрессии гена р-маннаназы В. зиЫШз 168 в составе многокопийного вектора рСВ20 в бактериях того же вида.

2. Оптимальными условиями культивирования рекомбинантного штамма В. яиЬПШ 168, обеспечивающими максимальный синтез р-маннаназы с активностью 2374 ед/мл культуральной жидкости, следует считать температуру 35 "С, рН 7,0, продолжительность культивирования 24 ч.

3. При разработке технологии получения ферментного препарата показано, что максимальный выход р-маннаназы по активности наблюдался при осаждении этанолом при его концентрации в смеси 75 % и рН 7,0; при этом удельная активность спиртоосажденного фермента составила 116 ед/мг белка.

4. Установлено, что р-маннаназа В. 168 проявляет максимальную активность при температуре 40 °С и рН 7,0. При рН 7,0 и температуре 30 "С фермент обладает наибольшей стабильностью, сохраняя при этом около 70 % активности через б ч инкубации.

5. Показано, что максимальная степень деструкции галактоманнана камеди рожкового дерева р-маннаназок В. якЬИИх 168 составляет 85% при рН 7,0, температуре 35 "С, дозировке фермента 9 ед/г субстрата, продолжительности гидролиза 3 ч; при идентификации продуктов гидролиза галактоманнана установлено присутствие в гидролизатах преимущественно маннозы и маннобиозы.

6. Применение маннозосодержащих гидролизтов в дозировке 2 мг/мышь в условиях экспериментального дисбиоза и способствующее увеличению количества бифпдобактерий и молочнокислых бактерий свидетельствует об их

нребиотическом действии. Действие маниозосодержащих гидролизатов сравнимо с коммерческими пробиотическими препаратами «Бнфидумбактерин» и «Л а кто б актер см».

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. ß-Маннаназы различного происхождения: получение, характеристика и перспективы практического применения [Текст] / Д. А. Черенков, О. С. Коркгева, Е. П. Анохина, Е. Г. Новоселова, А. С. Глущенко, А. А. Слеиокуров, И. В. Черемушкина // Успехи современной биологии. -2010. - Т. 130. - № 2. - 1,25 п. л. (лично автором - 0,18 п. л.).

2. Получение рекомбинантного штамма Bacillus subtilis - продуцента ß-маннаназы [Текст] / И. В. Черемушкина, Д. А. Черенков, Е, П. Анохина, Ю. А. Рыбаков, О. С. Корнеева // Биотехнология - 2011. - № 5. - 0,75 п. л. (лично автором - 0,15 п. л.).

3. Оптимизация ферментативного гидролиза трудногидролизуемых маннаиов и исследование пребиотических свойств маннозы [Текст] / И. В. Черемушкина, А. С. Глущенко, Е. П. Анохина, Н. А. Чигорина, Д. А. Черенков, А. А. Слепокуров, Н. А. Михайлова, О. С. Корнеева // Биотехнология. - 2010. - № 5. - 0,75 п. л. (лично автором - 0,09 п. л.).

4. Роль биомодифицированных кормов в повышении качества продукции перепеловодства [Текст] / И. В. Черемушкина, Н. А. Чигирина, Е. П. Анохина, О. С. Корнеева // Вестник Воронежской государственной технологической академии. Серия: пищевая биотехнология. - 2010. - Т. 45. - № 3. - 0,38 п. л. (лично автором - 0,09 п. л.).

Статьи и материалы конференций

5. Получение генно-инженерного штамма - высокоактивного продуцента ß-маннанзы [Текст] / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Е. П. Анохина, А. А. Слепокуров // Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития): материалы III Международной научно-технической конференции в 3 т. Т.2. -Воронеж: ВГТА. - 2009. - 0,125 п. л. (лично автором - 0,03 п. л.).

6. Оптимизация экспрессии гена бактериальной ß-маннанзы [Текст] / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Д. А. Черенков, Е. П. Анохина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск 11 - Воронеж: В ГУ - 2009. - 0,19 п. л. (лично автором - 0,05 п. л.).

7. Исследование пребиотической активности маниозосодержащих гидролизатов [Текст] / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Е. П. Анохина, А. С. Глущенко Н Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск ноеых физиологически активных веществ: материмы 4-й

всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010». Ч. И. «Научные основы создания новых лекарственных средств». - Воронеж: ИПЦ ВГУ. - 2010. - 0,125 п. л. (лично автором - 0,03 п. л.).

8. Биотехнология углеводов пребиотического и иммунотропного действия [Текст] /О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Д. А. Черенков, Т. В. Санина, Е. П. Анохина, А. С. Глущенко, О. Ю. Божко // 2-ой международный конгресс «Евразия-Био» - М.: Изд. Копиринг. - 2010. - 0,125 п. л. (лично автором - 0,02 п. л.).

9. Разработка способов получения минорных Сахаров [Текст] / И. В. Черемушкина, Т. В. Санина, Е. П. Анохина, А. С. Глущенко, О. С. Корнеева // Материалы ежегодной конференции РХО им. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и продуктов». - М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева. - 2010. - 0,125 п. л. (лично автором - 0,025 п. л.).

10. Биотехнология маннозосодержащих гидролизатов из отходов древесного производства [Текст] / Е. П. Анохина, О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, А. С. Глущенко // Материалы конференции «Химия и полная переработка биомассы леса». - Санкт-Петербург. - 2010. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,016 п. л.).

11. Биотехнология высокоактивной ß-маннаназы с использованием генно-инженерного штамма Bacillus subtilis 168 [Текст] / Е. П. Анохина, Д. А. Черенков, И. В. Черемушкина, О. С. Корнеева Н Материалы XLVIII научной конференции за 2009 год, Ч. 1. - Воронеж: ВГТА. - 2010. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,016 п. л.).

12. Конструирование генетически модифицированного штамма -продуцента ß-маннанзы [Текст] / Е. П. Анохина, Д. А. Черенков, И. В. Черемушкина, О. С. Корнеева // Материалы XLIX научной конференции за 2010 год, Ч. 1 . - Воронеж: ВГТА. - 2011. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,016 п. л.).

13. Анохина, Е. П. Получение рекомбинантного штамма В. subtilis -продуцента высокоактивной ß-маннаназы [Текст] / Е. П. Анохина, И. В. Черемушкина, О. С. Корнеева // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Ч. 2. - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технолоши», РХТУ им. Д. И. Менделеева. - 2011. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,02 п. л.).

14. Корнеева, О. С. Разработка биотехнологии высокоактивной ß-маннанзы с целью получения маннозосодержащих гидролизатов и их применения в кормах для сельскохозяйственных животных [Текст] / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Е. П. Анохина // Материалы Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Воронеж: ВГТА. - 2009. - 0,19 п. л. (лично автором - 0,06 п. л.)

15. Исследование бифидогенной активности минорных Сахаров [Текст] / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина. Т. В. Санина, Е. П. Анохина // Материалы 13-го славяно-балтийского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2011», Санкт-Петербург. - 2011. - 0,06 п. л. (лично автором - 0,016 п. л.).

Выражаю глубокую признательность и благодарность сотрудникам Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика бо главе с проф. Синеоким Сергеем Павловичем за любезно предоставленные штаммы микроорганизмов, ценные указания и оказанную помощь в проведении работы.

Подписано в печать 25.11.2011. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 3&5"

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУВПО «ВГУИТ») Отдел полиграфии ФГБОУВПО «ВГУИТ») Адрес академии и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Анохина, Екатерина Петровна, Воронеж

61 12-5/1260

ФГБОУ ВПО «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ»

На правах рукописи

Анохина Екатерина Петровна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ р-МАННАНАЗЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА В. ЗЦВИЬК 168

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Корнеева О.С.

Воронеж - 2011

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.....................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................10

1.1. Маннаны растительного сырья и их характеристика...............................10

1.2. )3-Маннаназы: продуценты, условия биосинтеза...............................14

1.2.1. Продуценты (З-маннаназ.....................................................16

1.2.2. Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов............................................................................19

1.3. Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов................................................................................23

1.3.1. Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК...............23

1.3.2. Клонирование и экспрессия маннаназных генов.......................26

1.4. Получение препаратов (3-маннаназы и их характеристика...................28

1.4.1. Выделение и очистка (З-маннаназ..........................................28

1.4.2. Физико-химические свойства (З-маннаназ различного происхождения........................................................................30

1.4.3. Продукты деструкции маннанов.............................................37

1.4.3.1. Функциональные свойства маннозы

и манноолигосахаридов...............................................................38

1.5. Практическое применение (З-маннаназ...........................................40

Заключение..................................................................................43

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......45

2.1. Объект исследования и условия его культивирования........................45

2.2. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе............................................46

2.3. Методы молекулярного клонирования в бактериях...........................47

2.3.1. Выделение хромосомной ДНК.............................................47

2.3.2. Выделение плазмиды рВ1ие8спр1 кв (+) из грамотрицательных

микроорганизмов - Е. coli..........................................................49

2.3.3. Выделение плазмиды рСВ20 из грамположительных микроорганизмов - В. subtilis.......................................................51

2.3.4. Полимеразная цепная реакция.............................................52

2.3.5. Создание генетических конструкций

«клонирующий вектор - встроенная ДНК»....................................54

2.3.6. Трансформация клеток химическим методом..........................55

2.3.7. Электрофорез в агарозном геле............................................56

2.3.8. Выделение ДНК из агарозного геля.......................................57

2.4. Определение активности ферментного препарата.............................58

2.4.1. Определение активности ß-маннаназы...................................58

2.4.2. Методы определения активности сопутствующих

ферментов..............................................................................60

2.5. Получение спиртоосажденного фермента.......................................61

2.6. Определение физико-химических свойств фермента.........................61

2.7. Определение степени гидролиза маннанов......................................62

2.8. Определение качественного состава продуктов гидролиза..................62

2.9. Исследование пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов..........................................................................63

2.10. Общие биохимические и микробиологические методы исследования.................................................................................64

2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных....................65

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО

ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА ß-МАННАНАЗЫ....................................66

3.1. Выбор объекта клонирования и системы экспрессии.........................66

3.2. Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора pBlueScript ks (+)............................................................................69

3.3. Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20............74

3.4. Выбор наиболее эффективного промотора для экспрессии гена

(3-маннаназы.................................................................................78

3.5. Исследование стабильности рекомбинантного плазмидного

штамма В.subtilis...........................................................................81

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ (З-МАННАНАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА.....84

4.1. Подбор оптимальных условий глубинного культивирования рекомбинантного штамма В.subtilis...................................................84

4.2. Получение спиртоосажденного ферментного препарата (3-маннаназы................................................................................90

4.3. Технология получения ферментного препарата рекомбинантной (3-маннаназы В.subtilis 168...............................................................94

4.4. Исследование влияния рН и температуры на активность (3-маннаназы.................................................................................98

4.5. Исследование кинетики кислотной и термической

инактивации (3-маннаназы..............................................................101

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ МАННАНОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

МАННОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ..................................107

5.1. Исследование процесса ферментной деструкции маннанов растительного сырья и идентификация продуктов гидролиза...................107

5.2. Изучение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов........................................................................................................110

5.3. Расчет себестоимости (3-маннаназы по предлагаемой технологии.......112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................117

ВЫВОДЫ..................................................................................119

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ................................121

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................139

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. (З-Маннаназы (ЕС 3.2.1.78) - ферменты, относящиеся к классу О-гликозид-гидролаз, расщепляют внутренние (3-1,4-гликозидные связи в маннанах - полисахаридах гемицеллюлозной фракции клеточной стенки растений. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза манноолигосахариды и моносахарид манноза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень этого моносахарида в крови приводит к анормальному гликозилированию иммуноглобулинов с нарушенной структурой углеводной части, и также нарушению синтеза других гликопротеинов [53]. Поэтому актуальным является создание на основе продуктов гидролиза маннанов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами. Кроме того, (3-маннаназы используют для получения высококачественной бумаги, растворимого кофе, комбикормов и некоторых других продуктов.

Спектр микроорганизмов - природных продуцентов (З-маннаназ довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.

Достижения в области технологии молекулярного клонирования и генной инженерии позволяют решить данную проблему путем создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что позволяет повысить активность и выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.

Получением высокоактивных (З-маннаназ занимались в основном зарубежные ученые: Arcand (1993), Tamaru (1997), Sunna (2000), Hatada (2005), Chen (2008) и другие. Однако исследования, направленные на создание рекомбинантных продуцентов (З-маннаназ, немногочисленны, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.

В настоящее время на рынке ферментных препаратов представлены коммерческие препараты (3-маннаназ зарубежного производства. Имеющиеся запатентованные отечественные комплексные ферментные препараты, продуцентами которых являются в основном микромицеты, обладают низкой маннаназной активностью, по сравнению с импортными ферментами, поэтому поиск и получение активных продуцентов (З-маннаназ является актуальной задачей современной биотехнологии.

В связи с вышесказанным, получение эффективного продуцента (3-маннаназы методом генной инженерии и разработка на его основе биотехнологии высокоактивной (3-маннаназы являются актуальными.

Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных Сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», государственный контракт № 02.512.11.2206 от 26.06.2008 г.

Цель диссертационной работы заключалась в разработке биотехнологии высокоактивной (3-маннаназы с использованием методов генной инженерии, исследовании физико-химических свойств ферментного препарата и определении пребиотической способности полученных маннозосодержащих гидролизатов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор микроорганизма - источника гена Р-маннаназы и системы экспрессии клонированного гена;

• определение эффективного промотора для экспрессии гена ß-маннаназы;

• получение рекомбинантного штамма - высокоактивного продуцента ß-маннаназы;

• определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;

• получение ферментного препарата ß-маннаназы и исследование его физико-химических свойств;

• исследование ферментативной деструкции галактоманнана и идентификация продуктов гидролиза;

• определение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.

Научная новизна. С применением технологии рекомбинантных ДНК впервые получен отечественный ферментный препарат высокоактивной ß-маннаназы. Путем введения в составе многокопийного вектора рСВ20 дополнительных копий гена ß-маннаназы под контролем регулируемого промотора PST сконструирован штамм В. subtilis 168 -перспективный продуцент ß-маннаназы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам ß-маннаназ. Выявлены закономерности кислотной и термической инактивации рекомбинантного фермента. Установлены оптимальные параметры процесса ферментативной деструкции галактоманнана камеди рожкового дерева, обеспечивающие степень гидролиза галактоманнана 85 %.

Практическая значимость. Проведена апробация биотехнологии рекомбинантной ß-маннаназы на базе ИБФМ РАН и получена опытная партия фермента. Разработана технология получения маннозосодержащих

гидролизатов, основанная на ферментативном гидролизе галактоманнанов (З-маннаназой, которая может найти применение при производстве функциональных продуктов и кормовых добавок с иммуностимулирующим и пребиотическим действием.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных конференциях ВГТА (г. Воронеж, 2009-2011 гг.); «Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых» (2009 г); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2010, 2011 гг.); 2-ом международном конгрессе «ЕвразияБио» (г. Москва, 2010 г.); 4-й всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010»; конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.); II Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева (г. Москва, 2010 г.) международном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2011» (г.Санкт-Петербург, 2011 г.).

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», где отмечена медалью за лучшую научно-исследовательскую работу.

Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.».

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 142 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 25 рисунков и 9 таблиц. Библиография включает 160 наименований, в т. ч. 135 иностранных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Маннаны растительного сырья и их характеристика

В последние годы полисахариды сложных лигнифицированных клеточных стенок растений, среди которых преобладают гемицеллюлоза и целлюлоза, рассматривают как потенциальный источник моно- и олигосахаридов, в которые они могут быть превращены при действии гемицеллюлаз - ферментов, катализирующих расщепление гемицеллюлоз [19].

Гемицеллюлозы - структурные полисахариды клеточных стенок растений со степенью полимеризации 50-200, которые являются вторым по массе компонентом клеточной стенки растений после целлюлозы.

Маннаны являются важным компонентом гемицеллюлоз, основная цепь которых состоит в основном из остатков D-маннозы. Они представлены в природе в виде четырех основных форм: линейной, состоящей только из остатков маннозы; галактоманнана, состоящего из остатков маннозы, имеющих боковые группы в виде галактозы; ацетилированного глюкоманнана, состоящего из чередующихся остатков глюкозы и маннозы; и галактоглюкоманнана (рис. 1.1).

В большинстве случаев в основной цепи остатки Сахаров связаны между собой (3-1,4-гликозидными связями, а боковые заместители с основной цепью - а-1,6 связями, однако наблюдаются и иные структуры.

А

НО.

-оНО-

,он

-О

Мап

НО.

.О' НО-

он

-О

Мап

но.

,0' 110-

он

-О

Мап

но.

Х>' НО-

он о

Мап

Мап

Мап

Мап

Мап

НО

ОН

Рис. 1.1 Различные виды маннанов: А - маннан, Б - галактоманнан, В - глкжоманнан, Г - галактоглюкоманнан

Линейные маннаны являются гомополисахаридами, которые состоят из линейных цепей, образованных ß-D-маннопиранозными остатками, связанными между собой 1,4 связями, и содержат менее 5 % галактозы. Некоторые из этих манннанов, главным образом из aloe vera, показывают иммуно-фармакологические и терапевтические свойства. Они содержатся в скорлупе орехов слоновой пальмы и зеленых кофейных бобах [102] и обычно присутствуют в эндосперме Palmae, таких как Phytelephas macrocarpa [96].

Маннаны были найдены в красных морских водорослях Porphyra umbilicalis и в различных видах зеленых морских водорослей Codium [108]. Подкласс зеленых водорослей Siphonales содержит Р-1,4-связанный маннан со структурой, похожей на структуру целлюлозы [102].

Растительные галактоманнаны состоят из растворимых в воде 1,4-связанных ß-D-маннопиранозных остатков с боковыми цепями, образованными 1,6-связанными a-D-галактопиранозными остатками, присоединенными вдоль основной цепи [34]. Различия в распределении D-галактозных единиц вдоль структуры маннана обнаружено в галактоманнанах из различных источников [153]. Истинными галактоманнами являются те маннаны, которые содержат более чем 5 % D-галактозных остатков по весу [102].

Галактоманнаны найдены в семенах восьми ботанических семейств, главным образом, в семенах семейства Leguminosae и локализованы в эндосперме семян. Они выполняют функцию энергетического резерва и регулятора водного баланса семени при прорастании [25].

Галактоманнаны присутствуют в видах Аппопасеае, Convolvulaceae, Ebenaceae, Loganiaceae и Palmae [102], а также выделены из Retama

raetam, дикого растения, принадлежащего к семейству Fabaceae [142], из семян Astragalus falcatus Lam. [20], плодов верблюжьей колючки Alhaagi persarum L. [8] и семян некоторых представителей рода Gleditsia [5].

Кроме этого, эти полисахариды выделены из некоторых видов лишайников. Их основная цепь образована a-D-маннопиранозными остатками, соединенными а-1,6 связями, с различным порядком замещения при втором или при четвертом атоме кислорода свободными единицами a-D-маннопираноз и (З-Б-галактопираноз соответственно [143].

Глюкоманнаны - полисахариды, представленные в большом количестве в гемицеллюлозной фракции мягкой древесины. Они содержат цепи, в которых беспорядочно расположены (3-1,4-связанные D-маннозные и (3-1,4-связанные D-глюкозные остатки в отношении 3 : 1 и степенью полимеризации более чем 200. В твердой древесине содержатся полисахариды с соотношением глюкозы и маннозы 1:1.5-2 [102].

Содержание глюкоманнанов в хвойной древесине составляет около 11 %. Они также представлены в небольших количествах в гемицеллюлозных компонентах покрытосеменных растений и составляют 3-5 % всего материала клеточных стенок [43].

Глюкоманнан клубней Amorphophallus konjac известен под названием «конъяк-маннан». Полисахарид содержит глюкозу и маннозу в отношении 2:3. Его полигликозидная цепь разветвлена, концевыми группами являются как глюкозные, так и маннозные остатки. В основной цепи преобладают 1,4-(3-гликозидные связи [102].

Кроме того, глюкоманнаны были выделены из семян Lupinus varius [144] и корней Eremurus fuscus [3].

Галактоглюкоманнаны - полисахариды, основная цепь которых состоит из (3-(1^>-4)-0-маннопиранозных и (3-(1—>4)-В-глюкопиранозных остатков, к кото