Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГРУППЫ BACILLUS THURINGIENSIS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГРУППЫ BACILLUS THURINGIENSIS"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи СМИРНОВА Лидия Павловна.

УДК 576.8 : 632.937.15

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГРУППЫ BACILLUS THURINGIENSIS

Специальность 03.00.07 — микробиология и 06.01.11—защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1985

О 1 ■

Работа выполнена во . Всесоюзном научно-исследовательском институте микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратов Главмикробиопррма.

Научные руководители — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор ) В. И. Полтев;) кандидат биологических наук Л. П. Синицина.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. Б. Фрейман кандидат биологических наук А. П. Тонконоженко.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится ./Л » 1985 г.

в /У час. на заседании Специализированного совета К-120.35.01 в Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им. К. А.. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49, Ученый Совет ТСХА. .

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « /У» 1985 г.

Ученый секретарь Спецсовета —

кандидат с.-х. наук " Н. А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В «Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1981 —1985 годы и на период до 1990 года», принятых на XXVI съезде КПСС,-*а»также в решениях майского (1982 г.) Пленума ЦК КПСС, принявшего Продовольственую программу СССР, определены ос» новные задачи в области сельского хозяйства. Одной-из них является курс .на. дальнейшее повышение эффективности сельского хозяйства в том числе за счет снижения -'потерь сельскохозяйственной продукции от вредных насекомых: - В осуществлении этой задачи -значительное место отводится бактериальным препаратам. В комплексе биологических методов борьбы с вредными насекомыми нашли практическое применение бактерии группы Bacillus thuringiensis. Они об; ладают способностью образовывать белковые кристаллы, оказывающие токсическое действие на вредных насекомых. На их основе в нашей стране и за рубежом налажен промышленный выпуск энтомопатогенных препаратов. '

Расширяющееся производство бактериальных' препаратов выдвигает задачу изучить инсектицидные свойства-"препаратов, условия их применения и разработать методы оценки их качества, основанные на новейших научных данных, что позволит отечественной микробиологической промышленности выпускать препараты с высокой стабильной активностью на уровне мировых стандартов. - ■

Цель и задачи. Работа посвящена разработке биологических методов оценки активности' препаратов группы Вас. thu-ringiensis. -

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:'«

— изучить инсектицидную активность препаратов Вас. thuringiensis на различных видах вредных насекомых, наносящих ущерб человеку, животным, растениям. ■ Установить величины летальной (ЛК50) концентрации как критерии их активности;

--- исследовать влияние биотических и абиотических фак-

торов на эффективность инсектицидного действия препаратов Вас. Шипп^егЫь;

"— провести изучение иммунологических свойств белка кристалла (6-зндотоксина) Вас. Шипп^егшз; установить антигенную специфичность белка кристалла различных сероти-пов,- Вас. Шипп^регшз; выявить взаимосвязь между токсичностью для насекомых 6-эндоюксина и его способностью нре-ишштироиать с гомологичной аитисывороткой;

— разработать экспресс-метод оценки качества дендроба-ииллина по относительному содержанию в нем кристаллического эндотоксина;

— определить продолжительность сохранения инсектицидной активности препаратов Вас. ^иппр^егЫБ в условиях различных температур. >

Научная новизна. Проведено исследование инсектицидной активности отечественных эталонных образцов препаратов Вас. ШиппрегшБ дендробацнллнна, энтобактерина, ннсектина, экзотоксина на различных видах вредных насекомых с целью установления специфичности действия препаратов. Разработаны биологические основы стандартизации бактериальных препаратов энтобактерина, ннсектина, дендробациллина, экзотоксина при их промышленном выпуске. Исследованы иммунологические свойства белка кристаллов (6-эндотоксина). Вас. Шипг^епБ^э. Показана антигенная специфичность белка кристаллов I,-,IV, V серотипов Вас. Шипг^епз^э. Выявлена взаимосвязь между токсическими для насекомых свойствами кристаллического эндотоксина и его способностью преципити-ровать с гомологичной антисывороткой. Установлено влияние температуры на длительность сохранения титра жизнеспособных спор и вирулентности препаратов Вас. Шипп^ег^в.

. Практическая ценность. Подобраны тест-насекомые для биооценки препаратов Вас. Мтипп^'ег^з в лабораторных и заводских условиях. Установлены и внесены в технические условия и ГОСТ на выпускаемые препараты величины летальной концентрации как критерии их активности в процессе биооценки. Разработан метод ускоренной биооценки энтобактерина, позволяющий сократить время определения качества препарата. Метод внесен в технические условия и ГОСТ на энтобактерин (ТУ Мв 21.108.75). Проведены производственные испытания нового экзотоксинсодержащего - препарата турингии-2 (в форме миазоля-2) против мухи Вольфарта, которые позволяют рекомендовать препарат для широкого применения в производственных условиях. Разработан иммуно-спектрофотометрический экспресс-метод оценки качества дендробациллина по относительному содержанию в нем кристаллического эндотоксина. Определены сроки сохранения инсектицидной активности и титра жизнеспособных спор энтобак-

о

теряна, инсектина, дендробйцйллина■ в условиях рЗзлгг-ш'гЛЯ температур.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Всесоюзном координационном совещании по. микробиологическим препаратам для сельского хозяйства (Москва, 1972 г.); на совещании по координации научно-исследовательских работ в области микробиологических средств защиты растений (Москва,. 1972 г.); на 1-й.Всесоюзной научной конференции по применению бактериальных препаратов в сельском хозяйстве (Кишинев, 1976 г.).. ,

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в журналах и сборниках.-

Структура и объем работы^.Диссертация состоит из введения, об'зора литературы, шести глав, выводов, списка использованной литературы, приложения. Материал изложетна 188 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы и 25 рисунков. Список использованной литературы включает 331 наименование, в том числе 140 — зарубежных авторов.

Всем коллегам, принимавшим, участие в исследованиях, автор приносит сердечную благодарность, особую признательность автор выражает канд. биол. наук В. Н. Трофименкову за длительное и плодотворное сотрудничество с ним. . - •

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Обзор литературы

Представлен анализ литературного материала о развитии микробиометода борьбы с вредными" насекомыми в СССР и за рубежом (L. Paster, 1870; Е. Berliner, 1911; В. П. Поспелов, 1926, 1933, 1940), о применении препаратов на основе Вас. thuringiensis в природных условиях (Е. В. Талалаев, 1954; А. Б. Гукасян, 1967; В,- В; Гулий, 1981; \V. Tomas, D. Ellar,'1982; N. Rishikesh, 1983).

.Рассматриваются факторы,, влияющие на эффективность действия энтомопатогенных препаратов (А. Штейнхауз, 1950, 1952; X. Суитмен, 1964; LHall, 1964; Я- Вайзер, 1973; R. Smith et al., 1983; С. Ignoffo et al, 1983).

Обобщены.литературные данные о безвредности бактериальных препаратов Вас. thuringiensis для человека, теплокровных Животных и птиц (Л. Krieg, 1955, 1961; R. Fisher, L. Rosner, 1959; H. Burges, 1966; В. И. Полтев, 1958; А. П. Тонконоженко; 1967). . .

Представлен материал о состоянии вопроса.по определению качества бактериальных препаратов Вас., thuringiensis (H. Dulmage, 1981; Е. Davidson, 1982; С. Ignoffo et al., 1983).

Анализ литературного материала по оценке активности

препаратов Вас. thuringiensis указывает на отсутствие определенного метода оценки, единого для всех стран тест-насекомого, единого метода статистической обработки результатов оценки, а также общих для всех стран критериев, выражающих инсектицидную активность бактериальных препаратов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2. Материал, и методы ,

Экспериментальная часть работы была выполнена в лаборатории оценки и контроля, качества энтомопатогенных препаратов и лаборатории химико-аналитических исследований ВНИИбакпрепарат, лаборатории синантропных насекомых ВНИИДиС. Полупроизводственные и производственные испытания были проведены в совхозах Московской и Ташкентской областей, лесхозах Саратовской области, Нежинском районе УССР, Краснодарском крае, овцеводческом совхозе им. Р. Люксембург Новоазовского района Донецкой области.

Изучению подвергались отечественные эталонные препараты Вас. thuringiensis дендробациллин, инсектин, энтобакте-рин, экзотоксин^ турингин-2 (в форме миазоля-^).

Насекомых для экспериментальной работы выращивали в лабораторном инсектарии. Некоторые виды были собраны в природных условиях. . , ' •

Методики выращивания и заражения насекомых, использованные нами, разработаны в лаборатории оценки и контроля качества энтомопатогенных препаратов ВНИИбакпрепарат (под руководством зав. лаб. к.б.н. Синицыной Л. П.).

Заражение насекомых бактериальными препаратами проводили методом свободного скармливания искусственного корма, смешанного с различными'концентрациями испытуемых препаратов. Летальную концентрацию (ЛК50) препаратов вычисляли по системе пробитов по способу Пригге (И. Ашмарин, А. Воробьев, 1962) .

Определение титра жизнеспособных спор проводили путем высева культуры в агаризованную питательную среду в чашки Петри и подсчета выросших колоний. . ' -

Для иммунологического исследования белка кристаллов Вас. thuringiensis выращивали спорокристаллическую биомассу культур vaг. galleriae (штаммы 61—68, 69—6), var. in-sectus (штаммы 1,3), var. dendrolimus (штаммы 9,12) на.сухом питательном агаре. Кристаллы выделяли из споро-кристаллической биомассы по методу Pendleton, Morrison (1968). Выделенные кристаллы были использованы в качестве антигена.

Моноспецифическую антисыворотку получали путем иммунизации кроликов породы шиншилла раствором белка кристаллов I, IV,.V серотипов Вас. thuringiensis. , '

Иммунологические исследования белка кристаллов проводили с помощью метода двойной радиальной иммунодиффу-зии по Ухтерлони (Э. Бэм, 1979) и разработанного нами им-муноспектрофотометрического (ИСФ) метода.

3. Изучение инсектицидных свойств препаратов Bacillus thuringiensis

В целях подбора тест-насекомых для биооценки препаратов различных серотипов Вас. thuringiensis в условиях лабораторных и вегетационных опытов нами была изучена инсектицидная активность отечественных эталонных образцов бактериальных препзратов энтобактерина, инсектина, дендроба-циллина, экзотоксина на различных видах вредных насекомых, в том числе на насекомых, имеющих эпидемиологическое 'и эпизоотологическое значения.

При подборе тест-насекомых для биооценки мы исходили из двух основных требований:

1. степени восприимчивости насекомых к препаратам;

2. возможности круглогодичного получения насекомых в искусственных условиях.

В таблице 1 приведены данные, свидетельствующие о высокой ларвицидной активности экзотоксина в отношении различных видов зоофильных мух. Летальная концентрация (ЛК5о) препарата для личинок комнатной мухи составила 0,02%, для личинок синей весенней мухи— 0,15%. Полупроизводственные и производственные опыты подтвердили лабораторные данные.

Широкие производственные испытания экзотоксинсодер-жащего препаоата турингин-2 в борьбе против личинок мухи Вольфарта,. вызывающей опасное заболевание животных — вольфартиоз, показали высокую эффективность препарата.

Результаты изучения действия препаратов Вас. thuringiensis на имаго рыжих, черных и среднеазиатских тараканов показали,' что они не'оказывают на них эффективного действия (табл. 1).

Исследование инсектийидности эталонных бактериальных препаратов на хвое — листогрызущих насекомых показало, что наибольшую восприимчивость ко всем испытуемым препаратам, проявили .гусеницы капустной белянки и капустной моли. ЛКъо препаратов составила 0,01—0,02%. Гусеницы кольчатого шелкопряда также показали достаточно высокую восприимчивость к препаратам (ЛКбо 0,1—0,2%). Гусеницы златогузки были" особенно восприимчивы к дендробацилл'ину

Сравнительная инсектицидная активность »талонных препаратов Bacillus thuringlensls для вредных насекомых

Таблица I

. Вид насекомого

Возраст личинок и . куколок

Препараты

ЛКзо (95% доверит, пределы)

I Эятобактерин

Дендробациллин

Икссктин

Экзотоксин

Капустная моль , , . Капустная белянка . , Капустная совка . . . Большая вощинная моль Кольчатый шелкопряд Златогузка .... Непарный шелкопряд Комнатная муха . . Синяя весенняя муха Муха Вольфарта .

Таракан рыжий . . Таракан черный . , Таракан среднеазиатский

2 3 5 7 2 3 2

2-дневные 2-дневные 2-дневные

имаго

имаго

имаго

0,02 (0,0096- 0,028) 0,02 (0,0094 -0,025) 0,9

(0,65-1,52) 0.10 (0,091-0,16) 0,10 (0,092-0,17) 0,10 (0,093 - 0,15) 1,0

(0186-1,12) >10,0

>10,0

>10,0 >10,0 >10,0

0.01

(0,0096-0.017) ' 0.02 (0,0097-0,026) 0,9 (0,7-1,64) >10,0 '

0,10 (0,094-0,15)

0„05 (0„04—0,12)

0,04 (0,03—0,09) >10,0

>10,0

>10,0 >10,0 >10,0

0,02 (0.0094-0.026) 0,02 (0,0092-0,028) 1,0

(084-1.20 >10,0

0,20 (0,09 - 0,22) 10,0 (8,69-11,2) 0,4

(0,32 - 0,50) >10,0

>10,0

>10,0 >10,0 >10,0

001

(0,0094-0.016) 0,02 (0 0095-0 026) 0,20 (0,0ö6—025) 1.20 (1,12-1,32) 0,10 (0,09-0,14) 2,20 (2..0-262) 10,0 (9,1-120) 0,02 (0,014-0,026)

0,15 (0.08-0.19) 100% гибель от 0.02% суспензии >10,0

>10,0

>10,0

(ЛК50 0,05%). Для гусениц капустной совки летальная концентрация препаратов составила 0,9—1,0%. Исключением является экзотоксин, ЛК50 которого соответствовала 0,2% (табл. 1).

Изучение инсектицидного действия бактериальных препаратов* на большую вощинную моль — злостного вредителя, наносящего огромный ущерб пчеловодству, показало, что наибольшей вирулентностью обладает энтобактерин. Его ЛКзэ составила 0,10%.

Для гусениц непарного шелкопряда более патогенными были дендробаииллин и инсектин (ЛКзо 0,04 и 0,4% соответственно).

Сопоставление результатов проведенных исследований позволяет сделать вывод о том, что одни препараты Вас. thu-ringiensis имеют более широкий спектр инсектицидной активности, в то время как действие других — более специфично. Учитывая достаточную степень восприимчивости насекомых и возможность их массового круглогодичного получения в условиях инсектария для биооценки нами предложены следующие виды тест-насекомых: личинки комнатной мухи — для биооценки экзотоксина, гусеницы непарного шелкопряда — для биооценки дендробациллина и инсектина, гусеницы большой вощинной моли — для биооценки энтобактерина.

4. Изучение влияния биотических и абиотических факторов на эффективность препаратов Bacillus thuringiensis

Восприимчивость тест-насекомых к бактериальным препаратам в значительной мере зависит от различных биотических и абиотических факторов.

К числу биотических факторов, имеющих значительное воздействие на эффективность бакпрепаратов, имеют возрастные стадии развития насекомых.

Изучение нами- инсектицидного действия препаратов на различные стадии развития насекомых показало, что незначительно овицидное действие и действие на стадию имаго. Наибольшая восприимчивость насекомых наблюдается на гусеничной- или "личиночной стадии развития, причем младшие возраста проявляют большую восприимчивость к препаратам, чем старшие, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице-2. Это позволило рекомендовать для целей биооценки такие стадии развития тест-насекомых, которые обеспечивали бы среднюю реакцию восприимчивости насекомых к препаратам и давали бы объективные данные о качестве препаратов.

При установлении эффективности бактериальных препаратов необходимо учитывать состав среды, в которой разви-

Таблица 2

Изменение инсектицидного действия бактериальных препаратов',. . в зависимости от возрастных стадий развития насекомых

• Препарат Тест- насекомое Возраст личинок- ЛКю (95% доверит, пределы). %

Энтобактерин' Большая вощинная ' моль " 4 '•5 6 7 0,02 (0.017-0,038)' ' 0,04 (0,03— 0,056) ' 0,14 (0.08-0,20) • 0,15.(0,07-0,20)

Дендробацкллмн Непарный шелкопряд 1 2 3 . 0.01 '(0,006—0,618)'" 0,04 (0,028—0,052) " • 0,1 (0,065—0,23)

Инсектия Непарный шелкопряд 1 ' 2 з- 0,08 (0,04-0,11) ', 0.4 (0,31-0.54) ' ' « ' 0,6 (0.41—0,76) ■ '

Экзотоксин Комнатная муха яйца личинки ' 2-дн. • • »маго • 25%. гибель личинок . от 1% суспензии. 0.02 (0,014-0.628)' . 5.0 (4,1—6,8)-,

ваются бактерии в кишечнике хозяина. Состав этой среды специфичен для различных видов насекбмык'и определяется пищей''(искусственный1 или естественный корм};> находящейся в процессе переваривания. Состав питательной,среды и ее рН оказывают существенное влияние на процессьг.жизнедеятельности насекомых, на их восприимчивость к препаратам и на эффективность действия препаратов (табл. 3, 4). Как.показали результаты опытов, повышение кислотности,корма до 4,95—5,5 снижает эффективность препаратов, а. повышение щелочности до 7,8—9,8 — увеличивает.ее (табл. 4).',' ',

Поданным Heimpel и Angus (1963), это объясняется,'.тем, что в условиях щелочности происходит интенсивное растворение кристаллического эндотоксина, его энзиматическйй,', грд: ролиз. . .'

В соответствии с полученными данными, кассовое кру'глЬ-годичное разведение тест-насекомых в лабораторных и.'заводских инсектариях необходимо проводить на, искусственной среде с нейтральным или слабокислым рН, что соответствует естественному, корму и обеспечивает стабильность восприимчивости насекомых к препаратам. ,-'.,.,.

На эффективность бактериальных препаратов значительное воздействие оказывает .температура окружающей среды.' Для получения, высокой активности, бактериальных, препара-

Таблица^З

Устойчивость гусениц большой вощинной моли к энтобактерину

Вид корма1 Средняя гибель гусениц (в %) по воврастам

4 1 5" 6 • ; 7

Естественный корм . 59,2 70.0: 40.0 . ! 37,0

79,6 59,2 . 42,3 ' 20,2

60,2 64.7 . 17,1 38,7

71.1 72.3 20,5 ; , 33.,0

52.0 66.9 46.Г ■ ; 15*7

67.0 . 52,0 30,2 ■ 21,0

80,6 69,0 ' 27,6 . • 39,0

М±т М±т М±т М+т

67.0 ¿г 10,0 64,8 ±7,1 31,9 ±11,3 29,2 ±9.9

Искусственный корм- юао 99 в , . 85,9 76,1

100,0 •• 100,0 •- 87,3 • 77,0

99,8 98,5 . 86.2 • ' 74.7

100,0 100,0 87.0 77,3

99.6 97,9 ' 84,3 , ' 76.6

100..0 96.8 . 88.2 • . 75.5

100,0 99.9 •. ' 86,6. •' ; 7Т«2

,Ч±т. • М±т М±т М±т

99,9 ±0,1 с 99.8 ±0„2 . 86.5 ±0,23 . 743.2:0,1

тов необходимо-совпадение внешней температуры,; при которой проводится применение препаратов, с температурным оптимумом развития микроорганизма.

Изучение влияния температурного фактора на скорость развития патогенеза показало,'что с повышением температуры в пределах жизненного оптимума тест-насекомого наблю-

, . " " "* Таблица 4

Эффективность бактериальных препаратов в зависимости от рН'корма

Препарат Вид насекомого РН корма ЛК5о в % '.> (95% доверят, переделы)

Энтобактсрин Большая ■вощинная моль 4,95—5.0 6.0 -6.5 ; 7,0 —7,3 9,8 ; 0.5 ,(0,4—0,6$!) £ 0,15 (0,07—0,26) . 0.10 (0.05—0,23) ?, 0.08 (0„04—0,11).'!

Дендробациллин Непарный шелкопряд 5.3 -5.5 6,0 —6.17 7,0 —7,5: 7,8 —8,0 0,8 (0.66-0,92) 0,04 (0.028—0;052) 0.04 (0.026—0,05) : 0,01 (0,007—0,018)

Инсектин Непарный шелкопряд 5.3 —51.5 6,0 -6,17 7,0 —7,5 7,8 -8,0 » « 1 0,60 (0.44—0,76) ■ 0.40 (0.30—0.56) 0,45 (0 38—0,58) 0,20 (0;019—0„34)

Таблица 5

Влияние температуры на инсектицидность препарато» ВасШи$ (Ьиплд|'ггьГ&

Температура

17° 22° 28' 33'

Препарат Тест-насекомые 8 * % я з О. я и 3 ЛКу, в % (95% доверит. пределы) к £ * О о> а-з- Л Км в % (95% до' верит, пределы) ж * 1 я 2 О 3 Л К» в % (95% до- вериг, пределы) ¡8 * * * X о й я О 3 Л Км в % (95% доверит, пределы)

Экзотоксин Личинки комнатмой мухи 2-дневното возраста на 28 сутки 0,03 (0.019-0,042) на 14 сутки 0,02 (0,0160,042) на 10 сутки 0.03 (0,019-0,48, ва 20 сутки 0,4 (031-0 62)

Инсектия • Гусеницы непарного шелкопряда второго возраста на 16 сутки 1,0 (0.64-1,60) на 6 сутки 0,4 (0,31-0 62) на 6 сутки 1,0 (0.67-1,58) —

Декдроба-циллин Гусеницы непарного шелкопряда второго возраста на 14 сутки 02 (0,08-0,24) на 6 сутки 0,04 (0.02-0 07) на 6 сутки 1,0 (0,62-1 52) —-

Энтобак-терик Гусеницы большой вощинной моля седьмого возраста на 15 сутки 5,0 (4,0—6.3) на 10 сутки 2.0 (1,2—2,75) на 6 сутки 0,15 (0,08-022) на 3 сутки 0.10 (0,0720,19)

дается заметное ускорение гибели вредителя от токсикоин-фекции (табл. 5). Наиболее наглядно мы наблюдали это явление при повышении температуры с 17 до 33° для гусениц седьмого возраста большой вощинной моли, когда происходило снижение величины летальной концентрации энтобакте-рина в 50 раз. Это позволило разработать метод ускоренной биооценки, позволяющий сократить время определения активности препарата. Лабораторные данные были подтверждены заводскими испытаниями (табл. 6), и метод был внедрен в производство. :

Таблиц а 6

Сравнение инсектицидной активности энтобактерина при различных температурах (Бердский биохимический завод)'

Партии препарата Активность при. температуре 28° (на 6 сутки) Активность при температуре 33° (на 3 сутки) ■

Л.К50 в % К ЛК50 В % К

4G 0,10 1.3 0,13 1,0

38 0,13 1,0 • 0,13 1,0

27 0,12 1,1 . 0,13 1,0

29 0,10 1,3 0.13 1.0

30 0,10 1,3 0,10 1.4.

35 0,10 1,3 0.13 1,0

Эталон 0,13 1,0- 0,14 1.0

На основании изучения влияния различных стадий развития на восприимчивость насекомых, влияния температуры и рН корма нами рекомендованы для биооценки следующие показатели активности эталонных образцов бактериальных препаратов и выпускаемых промышленных партий:

— ЛКбо энтобактерина для гусениц седьмого возраста большой вощинной моли при температуре 33° через 3 суток не более 0,10—0,15%;

— ЛК50 дендробациллина и инсектина для гусениц второго возраста непарного шелкопряда при температуре 22°*через 6 суток не более 0,04 и 0,4 % соответственно;

— ЛК50 экзотоксина через 14 суток (по вылету имаго) при температуре 22° не более 0,02%.

Учитывая индивидуальную и сезонную изменчивость тест-насекомых, нами был введен, по аналогии с американскими исследователями Méchalas и Andreus (1964), коэффициент активности — К, показывающий отношение ЛК50 эталона к ЛКбд изучаемого образца.

* 5»: Изучение антигенных свойств?белка кристаллического

эндотоксина! Bacillus thuringiensis

• -Действующим началом- энтомопатогенных препаратов группы Вас; thuringiensis является комплекс спор и белковых кристаллов, вызывающих^токсикоинфекцию у восприим-

• чивых видов насекомых. • •• . • •■

•• ' Большой* научно-практический интерес представляло изучение антигенных и токсических свойств ' белка кристаллов (6-эндотоксина) Вас. thuringiensis.

Антигенные свойства кристаллического эндотоксина Вас.

• thuringiensis были изучены нами с помощью метода двойной радиальной иммунодиффузии по.Ухтерлони и с помощью им-муноспектрофотометрического анализа. Методом двойной диффузии в агар было установлено, что белки кристаллов различных серотипов Вас. thuringiensis обладают антигенной специфичностью. Перекрестные реакции белка кристаллов с негомологичной антисывороткой показали отсутствие общих антигенов у разновидностей I, IV, V серотипов Вас. thuringiensis. ■ •

Параллельно с иммунологическими исследованиями было проведено изучение . биологической активности испытуемых

. . •. • . • Таблица 7

Результаты оценки активности промышленных партий дендробациллина • . биометодом и иммуноспектрофотометрическим (ИСФ) методом .

№№ партий Биооценка ИСФ метод

титр/млрд/г Кб Ки .

' Эталон 32.0 ' 1.0 1.0

----- 15 • 27.0 1.10 1.4

10 12.0 • 0.024 ■ 0,45 •

384 29,0 1.10. 1,15 . .

389 180 0.10 0.5

' 399 0.33 ' о.о • 0,3

;••. , -.Ш/1 . • . «30.0 ■ 1,0 • . • 1,0 •

116/2 " 32,0 1.5 «• .'.2,0' :.

152/2 34.0 1.5 ' 1.10

•' ' ■ 408/1 ' • • 14,0 • 1.0 ^ ' 0.98

• - • 136/1 • ■ 26.0 1.0 • 1,1

102 30.0 1.0 1,0

142: 24.0 1.0

... 417 . . . " 28.0 ' i*2

......- Р<0,01—0,05; Р<0,01

. г = 0,86; т, = :±0»20; • ■

, г — коэффициент корреляции; . .•

■ m г —стандартная ошибка коэффициента, корреляции;

Р — вероятность различия. р.

препаратов. Нами установлено,'что препапраты,! не имеющие биологической активности, теряют-способность преципитиро-вать с гомологичной антисывороткой (табл. 7). Это указывает на наличие корреляции между токсичностью для насекомых белка кристаллов и его способностью преципитировать.с гомологичной антисывороткой. • - • .

На основании иммунологических исследований ' нами' 'совместно со ст. научн. сотр. лаборатории селекции микроорганизмов ВНИНбакпрепарат Трофименковым В. Н. был разработан иммуноспектрофотометрический (ИСФ) экспресс-метод оценки качества препарата дендробациллина по относительному содержанию в нем кристаллического эндотоксина.-Принцип ИСФ метода заключается в образовании иммунных комплексов при смешивании растворов антигена и моноспецифической антисыворотки, которые обладают способностью рас* сеивать проходящий свет.-Интенсивность рассеивания-проходящего света (экстинкцию) можно -измерить фотометрически. '■

В таблице 7 приведены результаты сравнительной "оценки активности дендробациллина биометодом и иммуноспектрофо-тометрическим (ИСФ).методом.' ' ,'*_* ' ' ,

Показатель коэффициента активности — Ки для ИСФ метода вычисляли по формуле: ;. ' "... *

К_' ^образца ■ •..-.-• . •.; . ■ и —"р >

«-стандарта

где Е'—экстинкция растворов. '

Из данных статистической обработки результатов оценки активности промышленных серий дендробациллина двумя ме* тодами следует, что между ними нет существенной разницы, т. е. вероятность различия недостоверна. Определение коэф? фициента корреляции между коэффициентами активности, вычисленными двумя методами, показало, что между ними существует статистически достоверная прямая зависимость.

Таким образом, для оценки качества дендробациллина можно использовать, наряду с биооценкой, ИСФ метод, который дает возможность получить данные о качестве препарата в течение четырех—пяти часов.

Ввиду высокой специфичности ИСФ метод может быть рекомендован для идентификации культур Bacillus thuringiensis по кристаллическому эндотоксину, а также для оценки качества препаратов Вас., thuringiensis различных серотипов. Составлены методические указания по применению метода.

U3

Исследование влияния температурного режима хранения на изменение инсектицидной активности препаратов Bacillus thuringiensis

На вирулентность крйсталлоносных бактерий значительное влияние оказывают различные температурные условия хранения бактериальных препаратов.

Нами были изучены следующие температурные условия: "+4°, + 22э, +30ö, —15° и неременные температуры ог — 30J до -t-3Q®. Образцы изучаемых препаратов хранили в герметически запаянных сосудах. Титр жизнеспособных спор и вирулентность препаратов оценивали каждые три месяца.

Проведенные исследования, показали, что в процессе хранения энтомопатогенных препаратов наблюдается снижение вирулентности и титра жизнеспособных спор.

Наиболее оптимальной температурой для сохранения активности препаратов энтобактерина, дендобациллина, инсек-тина является пониженная плюсовая температура +4°С, при которой.указанные препараты сохраняют свою активность в течение 18 месяцев.

Как отрицательные (—15°), так и высокие положительные (+30°) температуры неблагоприятно действуют на сохранение инсектицидности бактериальных препаратов.

В условиях этих температур биологическая активность и титр жизнеспособных спор сохраняются не более 3—6 месяцев. При сменных температурах (—30 +30°), близких к условиям неотапливаемого помещения, а также при комнатной температуре ( + 22°) препараты энтобактерин, инсектин и дендробациллин сохраняют вирулентность и титр жизнеспособных спор 6—9 месяцев.

Как. показали наши наблюдения, температурный фактор не оказывает существенного воздействия на изменение биологической активности экзотоксина в течение 24 месяцев хранения.

Выводы

■ 1. Сравнительное изучение инсектицидного действия препаратов Вас. thuringiensis на различных видах вредных насекомых показало различную степень их восприимчивости, которая зависит от вида насекомого, возрастной стадии развития, состава и pH корма, температуры окружающей среды.

Подобраны.тест-насекомые для биооценки препаратов Вас. thuringiensis: энтобактерина — гусеницы большой вощинной моли; дендробациллина и инсектина — гусеницы непарного шелкопряда; экзотоксина — личинки комнатной мухи, характеризующиеся'средней степенью восприимчивости к нрепара-там. _ ■ . ..J

2. В лабораторных и производственных опытах на подобранных тест-насекомых с помощью пробит-метода установлены. величины летальной концентрации (ЛК50) препаратов Вас. thuringiensis как критерии их активности при биооценке: ЛК50 экзотоксина не более 0,02%;'ЛК5о энтобактерина не более 0,10—0,15%; ЛК'о дендробаниллнна не более 0,04%; ЛК;э инсектина ие.более 0,4%. Полученные данные использованы при составлении технических условий и ГОСТ на бактериальные препараты: ТУ на энтобактерин 21.108.75; ТУ на ннсек-тин 59.16.22.76; ТУ на дендробациллин 59.04.07.01.83.,

3. Изучение биологической активности экзотоксина и.эк-зотоксинсодержащего препарата турингин-2 (в форме миазо-ля-2) показало их высокую активность против личиночной стадии комнатной, синей весенней мух и мухи Водьфарта — вредителей человека и .животных, что было подтверждено лабораторными и производственными испытаниями..

4. Исследование эффективности препаратов Вас.'thuringiensis против различных видов хвое-листогрызущих насекомых показало, что наибольшей восприимчивостью к препара; там обладают гусеницы капустной моли и капустной белянки (ЛКад 0,01—0,02%), гусеницы кольчатого шелкопряда были достаточно восприимчивы к бактериальным препаратам (ЛКзоО,1—0,2%), против гусениц златогузки наибольшую эффективность показал дендробациллин (ЛК50 0,05%), а против непарного шелкопряда — дендробациллин (ЛКьо 0,04%) и инсектин (ЛК50 0.4). Для гусениц капустной совки наиболее патогенным был экзотоксин (ЛКьо 0,2%). Низкую активность препараты Вас. thuringiensis показали против имаго рыжих, черных и среднеазиатских тараканов (ЛКбо более 10%).

5. При изучении антигенных свойств белка кристаллов Вас. thuringiensis была установлена антигенная специфичность кристаллического эндотоксина I, IV, V серотипов Вас. thuringiensis, на основе которых производится промышленный выпуск исследуемых препаратов. Выявлена взаимосвязь между токсичностью для насекомых кристаллического эндотоксина и era способностью преципитировать с гомологичной антисывороткой.

Разработан иммуноспектрофотометрнческий (ИСФ) экспресс-метод оценки качества промышленных партий дендро-бациллипа по относительному содержанию в нем кристаллического эндотоксина. . .

6. Установлены оптимальные сроки сохранения инсекти-цидности препаратов Вас. thuringiensis. Показано^ что наиболее оптимальной температурой для сохранения вирулентности и титра жизнеспособных спор энтобактерина, инсектина, ден-дробациллина является пониженная плюсовая - температура (+4°), при которой препараты сохраняют вирулентность в

течение 18 месяцев. На активность Экзотоксина температурный фактор1 не оказывает воздействия в-течение 24 месяцев хранения.-Полученные данные' использованы при составлении1 технических условий.и ГОСТ на бактериальные'препараты. ■■•..••. • • •, ' . •

По теме диссертации опубликованы следующие работы;

1. Смирнова Л; П., Синицына Л. П., Петренко Л. М. К вопросу об'изменении титра и вирулентности энтобактерина при хранении. Тезисы'докладов ВНИИбакпрепарат. М.; "1972, с. 28—29. • . . .....•

2.' Синицына Л. П., Смирнова Л. П., Садовникова Т. П. Некоторые данные об' испытаниях энтомопатогенных препаратов; на" насекомых медицинского значения. Журнал '«Микробиологическая-промышленность». М., 1972, вып. 7, 32—33.

3. Синицына Л. П.; Острогская Н. А.,' Смирнова Л. П., Белова Ш" А. Метод оценки активности экзотоксинного' комплекса. Сборник трудов BFiHII6aKnpenapaT. М., 1973, вып. 2, с. 54—56. •■.•■• -..ч . ..,.•■.

4. Синицына Л. П., Смирнова Л: П., Гвоздева И. В. Энто-мопатогенный эффект бактериальных препаратов • в отношении отдельных видов синантропных насекомых. Сборник трудов ВНИИбакпрепарат. М„ 1973, вып.'2, с. 64^-65.

5. Мельникова А'. И., Синицына Л. П., Смирнова Л. П.'и др. Изучение активности микробных энтомопатогенных. препаратов ■ против вредителей сельскохозяйственных культур. Труды по селекции и семеноводству овощных культур. - М., 1975, т. 3, с. 201—205.

6. Синицына Л. П., Острогская Н. А., Смирнова Л. Ш и др. К методу первичной оценка активности бактериальных энтомопатогенных препаратов. В сб.; «Микробиологические методы защиты растений». Тезисы докладов 1-й Всесоюзной научной конференции. Кишинев, 1976, с. 19—20.

7. Смирнова Л. П. Метод оценки активности экзотоксинного комплекса. Труды ВНИИбакпрепарат. М.,~ 1976; вып. 4, с. 28—31.

. ' 8. Трофименков В. FL, Смирнова Л. П., Файбич М. М: Количественное определение антигенов в спорокристаллических комплексах Bacillus thuringiensis. «Сельскохозяйственная • биология», т. XV, .Ns- 5. М., 1980, с. 785—788. ; 9. Трофименков В. FL, Смирнова Л. П. Иммуноспектрофо-тометрическое определение содержания кристаллического эндотоксина Bacillus thuringiensis. Труды BFIHH6aKnpenapaT. М„ 1983, вып. 5, с. 18—21.

Л-75417 29/1V—85 г. Объем 1 п. л. Заказ 1099. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. Л. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно