Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разделение каталитического цикла цитохром bc1-комплекса в хроматофорах Rhodobacter capsulatus на отдельные стадии с помощью ионов цинка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разделение каталитического цикла цитохром bc1-комплекса в хроматофорах Rhodobacter capsulatus на отдельные стадии с помощью ионов цинка"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Клишин Сергей Сергеевич

РАЗДЕЛЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМ Ь^-КОМПЛЕКСА В ХРОМАТОФОРАХ ШоЛоЪасгег еаряиШт НА ОТДЕЛЬНЫЕ СТАДИИ С ПОМОЩЬЮ ИОНОВ ЦИНКА

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, а также на кафедре биофизики Биологического факультета Оснабрюкского университета (ФРГ).

Научные руководители: академикРАН В .П. Скулачёв

Ведущая организация: Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Зашита состоится «30» мая 2005 года в 14:00 в аудитории ББА на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2005 года

кандидат биологических наук АЛ. Мулкиджанян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.А. Булычев

доктор биологических наук Б.Н. Иванов

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Цитохром ¿с]-комплекс (убихинол: цитохром с оксидоредуктаза, ЕС 1.10.2.2.) является ключевым компонентом энергопреобразующих электрон-транспортных цепей. Этот фермент занимает центральное место в энергетическом обмене как митохондрий (где он ещё известен как комплекс Ш), так и большинства бактерий. Цитохром Ьс\-комплекс представляет собой димер, каждый мономер которого включает в себя один цитохром Ь с двумя темами - высокопотенциальным гемом Ь/, (со среднеточечным окислительно-восстановительным потенциалом при рН 7,0 (Ещ7) равным 50 мВ), и низкопотенциальным гемом Ь/ (Ещ7 = -100 мВ), один [2Ре-28] железносерный белок Риске (Ещ7 около 300 мВ), один цитохром С\ (Ещ7 около 300 мВ) и варьирующее количество субъединиц разной молекулярной массы, не содержащих простетических групп. Цитохром комплекс окисляет молекулы убихинола и восстанавливает цитохром с (в фототрофных бактериях цитохром е.), сопрягая эту редокс-реакцию с генерацией мембранного потенциала (т.е. трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода), использующегося для синтеза АТФ и транспорта метаболитов. В последнее время цитохром -комплекс привлекает к себе интерес ещё и как возможный регулятор образования активных форм кислорода. В цитохром 6с1-комплексе различают два хинон-связывающих каталитических центра (сайта), расположенных по разные стороны мембраны. По современным представлениям убихинол окисляется у положительно заряженой р-стороны мембраны в сайте образующемся на стыковочной поверхности белка Риске с цитохромом Ь . Пути двух электронов, высвобождающихся во время этой реакции, расходятся. Первый электрон восстанавливает железосерный кластер белка Риске. Редокс-активный домен белка Риске (Бе8 домен) подвижен и поворачивается на 60° чтобы передать электрон цитохрому с1 у которого электрон затем забирает мобильный цитохром с. Второй электрон поступает на гем Ьг, откуда он переносится поперек мембраны сперва на тем Ь/,, а затем в хинол-связывающий сайт (}, у противоположной, отрицательно заряженной «-стороны мембраны. Восстановление молекулы убихинона в сайте <1 приводит к образованию аниона семихинона р. Окисление следующего убихинола в сайте дает убихинол в сайте Образование одной молекулы убихинола в сайте (}, в результате окисления двух молекул убихинола в сайте (}о (т.н. Q-цикл П.Митчелла) повышает эффективность преобразования энергии, поскольку образование убихинола в сайте (}, связано с захватом двух протонов с «-стороны

мембраны, а окисление убихинола в сайте (}<, сопровождается выбросом двух протонов с р-стороны мембраны. Механизм электрон-протонного сопряжения и природа электрогенных стадий в цитохром Ьсу комплексе остаются до сих пор неясными и заслуживают изучения.

В 1967 году Скулачёв с соавторами впервые показали, что ионы 2^п2+ ингибируют цитохром ^-комплекс. Добавление микромолярных концентраций ионов ¡?п2+ к митохондриям увеличивало степень восстановленности цитохрома Ъ и уменьшало степень восстановленности цитохрома с. Ингибирующее действие цинка обращалось добавлением ЭДТА.

В настоящей работе исследовалось действие ионов на простейший трех-

субъединичный цитохром Ьс\-комплекс фототрофных бактерий Яко^ЬаЫег еаряШШш. Фермент исследовался в нативных мембранных везикулах (хроматофорах). Наличие фотосинтетических реакционных центров (РЦ) позволяло запускать фермент вспышкой света. То обстоятельство, что каротиноидные пигменты светособирающих комплексов ЯЬ. capsulatus являются природными электрохромными индикаторами трансмембранной разности электрических потенциалов давало возможность

оптическими методами регистрировать стадии трансмембранного переноса электрического заряда и изучать их связь с редокс превращениями цитохромов в микро- и миллисекундной временной шкале измерений.

Обратимость ингибирующего действия цинка позволяла надеяться, что его малые концентрации могут быть использованы для «притормаживания» индуцированных вспышками реакций в цитохром Ьс\- комплексе ЯЬ. capsulatus и выявления отдельных стадий каталитического цикла без нарушения целостности работы фермента. Цель настоящей работы. Цель настоящей работы состояла в изучении механизма сопряжения окислительно-восстановительных (редокс) реакций в цитохром комплексе ЯЬ. capsulatus как друг с другом, так и с генерацией мембранного потенциала. Для этого было изучена работа цитохром Ьс1-комплекса в присутствии малых концентраций ионов Тп2+.

Научная новизна работы. Для цитохром 6с1-комплекса впервые предложена экспериментальная система, позволяющая, в присутствии малых концентраций ионов параллельно следить, используя метод импульсной спектрофотометрии, за редокс реакциями цитохромов Ь и с,, генерацией Ау и переносом протонов. Предложенная методика позволяет изучать цитохром -комплекс в оптимальных для его функционирования окислительно-восстановительных условиях.

В работе показано отсутствие кинетического сопряжения между быстрым окислением убихинола, приводящим к трансмембранныму переносу электрона к тему Ьн, и более медленными восстановлением цитохрома Си генерацией Ду и выбросом протона внутрь хроматофоров. Неэлектрогенность трансмембранного переноса электронов в цитохром комплексе свидетельствует о способности белка электростатически компенсировать перенос заряда на расстояние около Выявленная корреляция

между восстановлением цитохрома С1 генерацией Дуу, выбросом протона внутрь хроматофора и окислением гема позволила предложить модель работы цитохром комплекса, согласующуюся с экспериментальными данными.

Практическое значение работы. Полученные результаты значительно расширяют современные представления о свойствах и механизме функционирования цитохром комплекса ЯЬ. capsulatus, а данные по ингибированию отдельных кинетических стадий ионами могут быть полезны при изучении этого фермента в других организмах. В данной работе предложены новые методические подходы для исследования работы цитохром комплекса в условиях близких к физиологическим. Полученные результаты могут быть использованы при изучении роли цитохром Ьс1-комплекса в регуляции образования активных форм кислорода.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на научном семинаре отдела биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 15 апреля 2004 г., а также на 12-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Брисбен, Австралия, 2001г.), 12-ой Европейской конференции по биоэнергетике (Аркашон, Франция, 2002г.), 11-ом Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Токио, Япония, 2003), 13-ой Европейской конференции по биоэнергетике (Пиза, Италия, 2004), 13-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Монреаль, Канада, 2004), Международной конференции «Российская биоэнергетика: От молекул к клетке» (Москва, 2005).

Публикации. Результаты диссертационной работы изложены в трёх статьях и восьми тезисах.

Структура диссертации. Диссертация, изложенная на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 3-х отечественных и 169 иностранных источников цитирования. Работа содержит 2 таблицы и иллюстрирована 45 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы.

1.1. Культивирование Rhodobacter capsulatus. В настоящей работе использовались пурпурные фототрофные апротеобактерии Rhodobacter capsulatus. Штам В10 (дикий тип) был любезно предоставлен профессором Джексоном (Университет Бирмингем, Великобритания). Клетки выращивались фотогетеротрофно в анаэробных условиях (Lascelles, 1959). Среда культивирования содержала: 0,4% малата, 10 мМ КНгРО^

0.1% [NH4]2S04, 0,2 г/л MgS04 * 7Н20, 0,075 г/л СаС12, 0,012 г/л FeSO„, 0,02 г/л ЭДТА, 1,59 мг/л MnS04, 0,04 мг/л Cu(N03), 0,74 мг/л NaMo04, 2,8 мг/л Н3В03, 0,24 мг/л ZnS04, 0,1 мг/л биотина, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л никотиновой кислоты; рН 6,8. Незадолго до достижения конца логарифмической фазы роста клетки осаждались центрифугированием (7000g, 35 мин., 4 °С).

1.2 Получение хроматофоров. Осажденные клетки ресуспендировали в 500-700 мл буфера 1, содержавшего ЗОмМ HEPES, 2 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, и вновь осаждали центрифугированием (12000g, 35 мин., 4 °С). Затем клетки ресуспензировали в буфере

1, дополненым 10% сахарозой, и добавляли несколько крупинок ДНКазы. С этого момента все процедуры с суспензией выполнялись при 0 °С (на льду) и в темноте. Суспензия пропускалась через Френч-пресс (11000-16000 psi), затем крупные клеточные обломки осаждали центрифугированием (20000g, 30 мин., 4 °С). Супернатант центрифугировался (120000g, 120 мин., 4 °С). Осаждённые хроматофоры ресуспендировались в буфере 1, дополненым сахарозой (200 мг/л). Получение хроматофоры замораживались в жидком азоте и хранились при -80 °С.

1.3 Оборудование для импульсной спектрофотометрии.

Источником мониторного света служила галогеновая лампа мощностью 200 Вт. Мониторный свет с необходимой длиной волны выделялся либо с помощью монохроматора (Amko Metrospek), либо с помощью интерференционных фильтров (SCHOTT), помещаемых непосредственно перед кюветным отделением. Для возбуждения использовалась ксеноновая лампа-вспышка с полувременем 10 мкс, оборудованная оптическим фильтром, отрезающим свет с Х< 780 нм (RG 780, SCHOTT). Для регистрации изменений оптической плотности использовался фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) марки Thorn EMI 9801B, защищенный от возбуждающего света двумя фильтрами BG 39 (SCHOTT). Избыточное возбуждение

пробы мониторным светом предотвращалось шторкой, установленной перед кюветным отделением. Шторка открывалась за 400 мс до вспышки возбуждающего света.

Сигнал с ФЭУ поступал на дифференциальный усилитель Tektronix AM502, усиливался в 100 раз и затем регистрировался осциллографом Nicolet Pro10, совмещенным с компьютером, осуществлявшим накопление и усреднение сигналов.

1.4. Среды и условия измерений.

Эксперименты проводились в стеклянной кювете объёмом 12 мл, оптический путь составлял 2 см. Концентрация бактериохлорофилла в среде измерений составляла 8-12 мкM. Обычно в пробе присутствовали 25 мM рН-буфера HEPES, 5 мM MgCb и 2 мM KCN (для подавления терминальных оксидаз). В качестве высокопотенциального редокс-медиатора добавляли 5 мкМ М',М',М,М-тетраметил-р-фенилендиамина (rMn,0), а в качестве низкопотенциального редокс-медиатора присутствовал метиленовый синий (MG) в концентрации 2-8 мкM. Окислительно-восстановительные условия задавались комбинацией редокс буфера и редокс медиаторов. В качестве редокс-буфера использовали сукцинат-фумаратную систему с различным отношением сукцината/фумарата калия (Каменский и др., 1975). Для создания анаэробиоза добавлялись 0,08 мкг/мл глюкозооксидазы (171,000 единиц/г), 0,08 мкг/мл каталазы (2,350 единиц/г) и 10 мM глюкозы. В работе использовались реактивы фирмы Sigma-Aldrige.

При регистрации изменений рН внутри хроматофоров использовались препараты, отмытые от буфера с помощью ультрацентрифугирования. Изменения рН внутри хроматофора регистрировались с помощью амфифильного красителя нейтрального

Рис.1. Схема установки для импульсной спектрофотометрии.

красного. Присутствие 5 мМ рН-буфера НЕРЕ8 в пробе позволяло селективно регистрировать, при длине волны 545 нм, изменения оптического поглощения красителя внутри хроматофоров в ответ на выброс протонов цитохром комплексом. Измерение Д\|/ регистрировалось по изменению поглощения каротиноидных пигментов при длине волны 522 нм. Редокс превращения гема Ьрегистрировались как разница оптического поглощения при 561 нм - 570 нм и рассчитывались как ДА561-57о= А561-1,08хА57о (учёт вклада окисленного первичного донора РЦ Р870*) - 0,14хДАз52.57о(учёт спектрального вклада цитохрома с1 на 561 нм) — 0,01ХА522 (учёт электрохромного сдвига каротиноидов). Измерение редокс превращений цитохрома сч регистрировалось как разница поглощения при 552 нм - 570 нм и рассчитывалось соответственно как ЛА552-570 = А552-1,34хА57о - 0,05А522. Количество накоплений сигналов с ФЭУ при измерении генерации Д\|/ составляло 8, а при редокс превращений гема Ь/, и цитохрома с\ - 16, в опытах с использованием слабой вспышки оно составляло 16 и 32, соответственно. Концентрация РЦ определялась в присутствии миксотиазола по изменению оптического поглощения Pg7o при X = 604 нм в ответ на 3 вспышки возбуждающего света с интервалом 50 мс (МиШсУ'апап е! а1., 1991). Концентрация цитохром комплекса определялась в ответ на 2 последовательные вспышки возбуждающего света (интервал - 100 мс) по изменению оптического поглощения в присутствии антимицина А.

2. Результаты.

В окислительных условиях, когда весь убихинон в мембране окислен, воостановление гема Ьи происходит быстрее, чем генерация Дху (Оор1а е! а1., 1998). Когда убихинон в мембране наполовину восстановлен, т.е. в условиях, которые близки к нативным, индуцированные вспышкой редокс превращения гема 6/, спектрально не разрешимы, т.к. тем Ь/, окисляется быстрее, чем восстанавливается. Кинетику восстановления гема можно разрешить, заблокировав его окисление антимицином А. Однако, необратимо связавшись с цитохром комплексом, антимицин А позволяет перенести электрон только до гема Ьь, прерывая, таким образом, каталитический цикл. В предварительных экспериментах нами было обнаружено, что ионы замедляли окисление гема делая его редокс превращения видимыми. Таким образом, в присутствие ионов цинка можно было изучать корреляцию между электрогенезом и редокс реакциями цитохрома Ъ. Предварительные эксперименты показали, что ионы 2п3+ образовывали комплексы с ферроцианидом калия. Это делало невозможным использование такого

традиционного редокс буфера как ферроцианид/феррицианид калия. Поэтому в данной работе мы воспользовались отработанной Константиновым и соавторами методикой использования пары сукцинат/фумарат калия в качестве редокс буфера. Варьируя отношение сукцинат/фумарат, можно было моделировать в пробе различные окислительно-восстановительные условия. В данной работе эксперименты производились либо в анаэробной системе при соотношении сукцинат/фумарат 1:20, либо в аэробных условиях при соотношении сукцинат/фумарат 1:1. В ответ на вспышку света цитохром ¿сркомплекс запускался окислением цитохрома с1.

2.1. Индуцируемые вспышкой реакции в цитохром Ь(^-комплексе ЯЬ.еарш1аШх.

На рис. 2А показаны индуцированные вспышкой редокс превращения гема Ьн в различных условиях. В отсутствие специфических ингибиторов, когда убихинон в мембране был наполовину восстановлен, редокс превращения гема Ь/, при 561-570 нм практически не были видны (кривая 1 на рис. 2А). В присутствии антимицина А, блокирующего центр С2„ гем Ьь восстанавливался за 2 мс (кривая 2 на рис. 2А).

Рис.2. Кинетики индуцированных вспышкой редокс-превращений гема А* в

хроматофорах Ш). саряШаШя. На рисунке показаны редокс превращения гема Ь/, в отсутствие ионов цинка (А) и в присутствии 50 мкМ 2п504 (В).

При добавлении поверх антимицина А ингибитора центра миксотиазола регистрировались небольшие абсорбционные изменения отрицательного знака (кривая 3, рис. 2А), обусловленные, как показано Шинкаревым и соавторами,

перераспределением электронов между темами bi, и bi в ответ на вспышку света (Shinkarev et al., 2001).

Индуцируемые вспышкой абсорбционные изменения гема Ь/, при 560-570 нм становились разрешимыми в присутствии ионов цинка (кривая 2 на рис. 2В). Восстановление гема Ь/, в присутствии цинка происходило с характерным полувременем ti а~ 1-2 мс, а его последующее окисление - за 10-20 мс. Восстановление только половины гема ¿д было связано с тем, что другая половина, по литературными данными (Siedow et al., 1978), должна была быть в форме Ьи*° с Ещ7 около 150 мВ и, соответственно, восстановленной уже до вспышки в условиях наших опытов. Антимицин А подавляет форму (Crofts, 2004), поэтому в его присутствии гема на вспышку восстанавливалось больше.

На рис. 3 показана генерация Д\|/ хроматофорами Rb. capsulatus в ответ на вспышку света. Кинетика ответов содержала быструю и медленную компоненты. Быстрая компонента со временем < 1 мс отражала реакции в РЦ, а именно перенос электрона с на первичный хинон последующий перенос электрона с и

восстановление Ps7o+ цитохромомПри этом через мембрану переносился один электрический заряд. Медленная компонента со временем > 1 мс отражала работу цитохром -комплекса. Когда убихинон в мембране был наполовину восстановлен, полувремя (ti/г) этой компоненты было около 3 мс. Эта фаза частично ингибировалась антимицином А (кривая 2 на рис. ЗА) и полностью блокировалась миксотиазолом (кривая 3 на рис. ЗА). Поскольку соотношение РЦ и цитохром комплексов в препарате хроматофоров постоянно, амплитуду генерации в цитохром комплексе можно было нормировать по амплитуде разделения зарядов в РЦ. Добавка ионов Zn2+ замедляла генерацию Ду (кривая 2 на рис. ЗВ). Полувремя tj/a для генерации Ду в присутствии 50 мкМ Zn2+ составляло около 10 мс (кривая 2 на рис. ЗС). При этом амплитуда электрогенной реакции в цитохром -комплексе не отличалась от контрольной, т.е. фермент оставался функционально активным. Добавление 5 мкМ миксотиазола полностью ингибировало генерацию цитохром комплексом, поэтому разностные кривые -/+ 5 мкМ миксотиазол, представленные на рис. ЗС и 3D, отражают вклад цитохром комплекса в генерацию в ответ на вспышку.

Рис.3. Индуцированная вспышкой генерация Д\|/ хроматофорами /{/>. сар*и1а(и*.

На рисунках показаны кривые изменений Ду в отсутствии (А) и присутствии (В) 50 мкМ ХпБС^ Разностные кривые -/+ 5 мкМ миксотиазол, 5 мкм антимицин А представлены на рис(С), а аналогичные кривые для проб, исходно содержащих 5 мкМ антимицин А, приведены на рис (Б)

Данные на рис. 2В и 3Б показывают, что ионы гп2+ замедляли реакции в цитохром Ьс\-комплексе и тогда, когда был заблокирован антимицином А. Вероятнее всего,

цинк влиял на реакции в (20-сайте. Это предположение подтверждается рентгеноструктурными данными Берри и соавторов (2000), показавших, что в митохондриальном цитохром комплексе цинк связывался неподалеку от центра между цитохромами Ь и С\. Лигандамй+при этом служили Б-253, Е-255 и Н-268 цитохрома Ь и Н-121 цитохрома С\ (см. также рис. 11).

2.2. Зависимость редокс реакций гема Ьн и генерации А*|/ цитохром ^-комплексом от концентрации Zní+.

На рис. 4 показаны зависимости амплитуд реакций в цитохром ¿{^-комплексе от концентрации 2п804, изменявшейся в интервале от 0 до 600 мкМ. Относительное количество восстанавливающегося на вспышку гема Ьи увеличивалось в интервале концентраций 0-25 мкМ 2лг+ (кружки на рис. 4) и далее стабилизировалось на уровне, примерно соответствующем половине гема восстанавливающегося в присутствии антимицина А (треугольники на рис. 4). Относительное количество гема Ь/,, восстанавливающегося в присутствии антимицина А, не менялось до 100 мкм Ъп2+, но уменьшалось при больших концентрациях цинка. Относительная амплитуда генерации зависела от концентрации аналогичным образом, падая при концентрациях гпБ04 больших 100 мкМ (квадраты на рис. 4).

Рис. 4. Зависимость относительной амплитуды реакций в цитохром Ь ¿ -комплексе от концентрации ионов Тл?*.

По оси ординат отложены значения относительной амплитуды (+5£п2+/-2п2+). Символы: квадраты, ■ - генерация Д\|/ в цитохром Ьсу комплексе в отсутствие антимицина А; кружки, • - восстановление гема Ьь в отсутствие антимицина А ; треугольники, ▲ -восстановление гема в присутствии антимицина А.

Резкое падение амплитуды реакций в цитохром Ьс\- комплекс при концентрациях цинка более 100 мкМ было, видимо, вызвано неспецифическим связыванием ионов

В силу этого, в данной работе мы сосредоточились на исследовании эффектов, наблюдавшихся при концентрациях менее 100 мкМ.

А В

Время, с Время, с

Рис.5. Зависимость скорости реакций в цитохром bey комплексе от концентрации ZnS04.

На рис. 5 представлены кинетики генерации Ду (А) и редокс-превращений гема b¡, (В) при различных концентрациях цинка. С увеличением концентрации цинка генерация Дц/ замедлялась (рис. 5А). Аналогичное увеличение концентрации цинка практически не влияло на скорость восстановления гема Ьи (рис. 5В), замедляя в то же время его окисление. Окисление гема Ь/, коррелировало при этом с генерацией Ду (ср. скорость спада сигнала на рис. 5В со скоростью нарастания сигнала на рис. 5А). Как следует из рис. 5, индуцированное вспышкой восстановление гема Ьн в присутствии 50-100 мкМ Zn2+ было на порядок быстрее, чем генерация Ду.

2.3 Действие ZnÍT на редокс-реакции цитохромов с.

Редокс-превращения цитохромов с в ответ на вспышку показаны на рис. 6. Поскольку цитохромы ci и сг имеют близкие максимумы поглощения при 552 нм и 550 нм, соответственно, то при 552 нм мог измеряться только общий ответ цитохромов с\ и С2

(сье).

1, контроль

1, контроль

А |

аитищщвн А 4, + Zn1+ + антимнцнн А

-0,8-

0,0 0,1 0,2 Время, с

0,1

0,2

Врема, с

миксотиазол)

0.0 0.0 Время, с

0,1

0,00 0,01 0,02 0,03 Время, с

Рис.6. Индуцированные вспышкой редокс реакции цитохромов с.

На рисунках показаны кинетики восстановления цитохрома Сов в отсутствие (А) и присутствии (В) 50 мкМ ZnSO«. Разностные кривые -/+ 5 мкМ миксотиазол, 5 мкм антимицин А представлены на рис. (С), а аналогичные кривые для проб, исходно содержащих 5 мкМ антимицин А, приведены на рис. (D).

На рис. 6А показаны редокс-превращения цитохромов с, где кинетически не разрешаемое уменьшение оптического поглощения отражает их быстрое окисление в ответ на вспышку, а медленная фаза, в отсутствии ингибиторов имеющая Ьа— 10 мс, соответствует их восстановлению.

В отсутствие ингибиторов цитохром Соб восстанавливался почти полностью (кривая 1 на рис. 6А). В присутствии антимицина А (кривая 2 на рис. 6А) это восстановление было частичным. При добавке миксотиазола после антимицина А (кривая 3 на рис. 6А) восстановление цитохрома Сов в миллисекундной шкале не наблюдалось. Цитохромы Ci и Сг находятся в быстром редокс-равновесии с друг другом (< 100 мкс), поэтому редокс изменения цитохрома в ответ на вспышку отражали три основных реакции: перенос электрона с цитохромов на окисленный вспышкой

(< 200 мкс, Dutton and Prince, 1978), быстрый перенос электрона с восстановленного FeS-домена на цитохром Ci (< 100 мкс, Sadoski et al., 2000) и опосредованный движением FeS-домена от цитохрома CiK цеотру Q0 и обратно перенос электрона от убихинола в центре к цитохрому за миллисекунды (ре-восстановление цитохрома Ci). Миксотиазол не оказывает ингибирующего действия на первые две

реакции, но блокирует окисление убихинола. Поэтому разницы в кинетиках -/+ миксотиазол на рис. 6С отражают кинетику переноса электрона подвижным FeS-доменом белка Риске от убихинола в сайте Q0 к цитохрому Ci. Дифференциальные кинетики -/+ миксотиазол (см рис. 6D), получение при добавлении миксотиазола поверх антимицина А, отражают кинетику переноса электрона от убихинола в сайте Q0 к цитохрому С\ в присутствии антимицина А. Разностные кинетики на рис. 6С и 6D показывают, что ионы Zn2+ замедляли ре-восстановление цитохрома Соб как в отсутствие, так и в присутствии антимицина А. Сравнение кинетик генерации Ду (рис. 3) и восстановления Соб (рис. 6) говорит об их корреляции между собой.

2.4. Действие Zni+ при различных значениях рН.

Действие Zn2+ на генерацию и редокс реакции в цитохром!-комплексе было исследовано в интервале рН от 6,0 до 9,5 (см. рис. 7 и 8). И в кислых, и в щелочных условиях наблюдалось снижение ингибирующего действия Zn2+ по сравнению с обычными условиями измерений при рН 7,5. На рис. 8 показана рН-зависимость выраженности ингибирующего эффекта ионов Zn2+ на генерацию

На рис. 7 А-С представлены кинетики исследованных реакций при рН = 6,0. Цинк в концентрации 50 мкМ практически не оказывал никакого влияния ни на генерацию ни на редокс реакции гема и цитохрома Можно предположить, что группы, ответственные за связывание цинка, были протонированы при низких значениях рН, так что ион Zn2+ не мог связаться с с цитохром&комплексом Исчезновение ингибирующего действия Zn2+ происходило с рК около 7,0 что согласуется с литературными данными для митохондриального цитохром Ъс i-комплекса ингибирующегося Т^* с рК 7,2 (Link and von Jagov, 1995).

Можно предположить, что по аналогии с действием цинка на РЦ Rb. sphaeroides (Paddock et. al. 2003), уменьшение ингибирующей активности ионов Zn2+ при понижении рН связано с протонированием гистидиновых остатков, служащих лигандами Zn2+ в обоих случаях.

Как показано на рис.7 D-F, при увеличении рН до 9,5 ингибирующее действие цинка также уменьшалось. Надо отметить, что кинетики генерации цитохром bey комплексом и восстановления цитохрома Соб замедлялись в щелочных условиях даже без цинка, напоминая кинетики, регистрируемые в присутствии при нейтральных значениях рН. По-видимому, дефицит протонов в щелочных условиях

начинал лимитировать цитохром ¿^-комплекс, и по этой причине ингибирующее действие цинка не проявлялось на фоне общего замедления.

Рис.7. Действие50мкМ Zn + на цитохром ¿Сг-комплекс при рН 6,0 и 9,5.

Генерация Ду цитохром Ьс\-комплексом при рН= 6,0 (А) и рН=9,5 (Б), редокс превращения тема А/, при рН=6,0 (В) и при рН=9,5 (Е), окислительно-восстановительные реакции цитохрома при рН=6,0 (С) и прирИ-9,5(Р)

При рН = 9,5 восстановление гема Ь/, можно было наблюдать в отсутствие как цинка, так и антимицина А (кривая 1 на рис. 7Е). Скорость восстановления гема Ьи была в 5 раз выше скорости генерации Ду и восстановления цитохрома Соб, что сопоставимо с тем, что наблюдалось при нейтральном значении рН, но в присутствии (ср. с рис. 3-6). В щелочных условиях, даже в отсутствии ионов цинка (кривая 1 на рис. 7Е), восстановление гема Ьн в ответ на вспышку происходило наполовину, как при нейтральных значениях рН в присутствии

Рис.8. рН-зависимость выраженности ингибирующего эффекта ионов Zn на время генерации А»|/ цитохром bcv комплексом. Экспериментальные точки апроксимированы кривыми Хилла с рК 7,2 ± 0,2 (п=2) и с рК 8,3 ± 0,3 (п =2), соответственно.

Таким образом, хотя как при кислых, так и при щелочных значениях рН

ингибирующее действие цинка пропадало, причины этого, видммо, были различны.

В кислой области ингибирующее действие цинка пропадало, скорее всего, из-за того,

что цинк-связывающие гистидиновые остатки протонировались и не могли связывать „2+

ионы В щелочных же условиях ингибирующее действие цинка маскировалось

общим торможением фермента, вызванным недостатком протонов и замедлением реакций в центре

2.5. Сравнение действия Хп2+ в условиях насыщающей и слабой индуцирующей вспышки.

Рис. 9. Сравнение действия 75 мкМ Zn + в условиях насыщающей и слабой индуцирующей вспышки.

Насыщающая вспышка представлена на рис.(А, В, С), слабая индуцирующая вспышка - на рис. (Б, Е, Б) Генерация Ду цитохром ¿с,-комплексом представлена на рис. А, Е>, окислительно-восстановительные реакции цитохрома показаны на рис. В, Е, редокс превращения тема 6/, показаны на рис С, Е

Поскольку соотношение РЦ и цитохром ¿Се комплексов в наших препаратах было около 2,5 : 1, каждый цитохром Ьс 1-комплекс срабатывал после вспышки несколько раз, что могло приводить к кажущемуся замедлению генерации Д<(/ и восстановления Соб относительно быстрого восстановления гема Ьь при первом обороте фермента.

Чтобы проверить эту возможность, был поставлен опыт, в котором интенсивность возбуждающей вспышки была уменьшена примерно в 5 раз, таким образом, что возбуждалась только 1/5 РЦ, и, соответственно, только половина мономеров цитохром ¿сркомплекса могла сработать по одному разу. На рис. 9 показан эффект от добавления 75 мкМ Zn2+ в условиях слабой вспышки. В условиях однократного срабатывания цитохром ftci-комплекса генерация Ду (рис. 9D) имела характерное время t]/2 ~ 7 МС и, как и при насыщающей вспышке (рис. 9А), коррелировала с восстановлением Соб■ Восстановление гема ¿дпо-прежнему характеризовалось полувременем Можно заключить, что различие между быстрой кинетикой

восстановления гема Ь/, и медленными кинетиками генерации Ду и восстановления Соб не пропадало и когда цитохром 6С]-комплекс срабатывал только один раз.

2.7. Исследование действия ионов Zn2+ на цитохром ¿Ci-комплекс в тяжелой воде

Генерация Ду, а также редокс реакции гема Ьн и цитохрома Соб были исследованы в условиях, когда вода в пробе была заменена D2O. Генерация Д\|( происходила с ti/2 = 4,4 МС, несколько замедляясь по сравнению с водной средой (tj/2 = 3 МС). Восстановление гема в отсутствии ингибиторов, как и в водной среде, происходило достаточно быстро и неразрешимо. В присутствии 50 мкМ Z11SO4 гем Ь/, восстанавливался с ti/2 — 2,5 МС, т.е. несколько медленнее, чем е н и е

же гема замедлялось с в водной среде до

Восстановление цитохрома Соб без цинка в D2O происходило с tie = 5 мс, а в присутствии В присутствии 50 мкМ генерация

происходила с tin = 17 МС. Таким образом, замена Н2О на D2O слабее влияла на восстановление гема Ьь чем на генерацию Д\у и восстановление цитохрома С&. Поэтому кинетическая разница между «быстрыми» и «медленными» реакциями в цитохром Ьс\-комплексе возрастала в тяжелой воде.

2.8. Индуцируемые вспышкой изменения рН внутри хроматофоров Rb.capsulatus.

Изменения рН внутри хроматофора в ответ на вспышку света регистрировались с помощью амфифильного рН-индикатора нейтрального красного в присутствии 5 мМ рН-буфера HEPES. Этой концентрации HEPES достаточно для подавления рН-ответов нейтрального красного в среде, омывающей хроматофоры, но недостаточно для подавления рН-ответов во внутреннем очень малом объеме хроматофора (Mulkidjanian and Junge, 1994). Добавление к пробе ЗмкМ ICVH* обменника нигерицина снимало ДрН.

Таким образом, разница ответов нейтрального красного -/+ нигерицин отражала изменения рН внутри хроматофоров, связанные с протонным обменом на ^-стороне мембраны.

Время, с

Рис. 10. Влияние 50мкМ ZnS04 на выброс протонов внутрь хроматофора.

Индуцированные вспышкой изменения поглощения при 545 нм в отсутствии ХпБО« (А) и в присутствии 50 мкМ 2пЭ04 (В) Разностные кинетики -/+ ЗмкМ нигерицина в отсутствие и в присутствии 50 мкМ 2п804 (С) Концентрация К* в опыте = 50 мМ, рН снаружи хроматофора = 7,5.

На рис. 10А показаны изменения оптического поглощения нейтрального красного в ответ на вспышку, измеренные при 545 нм. На рис. 10В показаны изменения оптического поглощения нейтрального красною в ответ на вспышку в присутствии 50 мкМ ZnSО4 Разностные кинетики -/+ нигерицин свидетельствуют о том, что цинк замедляет выброс протонов внутрь хроматофоров (рис. 10С).

Таким образом, в настоящей работе показано, что гем Ь/, восстанавливается в ответ на вспышку за 1-2 мс, т.е. значительно быстрее восстановления цитохромов с, генерации и выброса протонов внутрь хроматофоров. Это свидетельствует о том, что каталитический цикл цитохром bei-комплекса включает в себя, по крайней мере, две стадии. На первом этапе, как показано на рисунке НА, молекула убихинола окисляется в центре Q0, приводя к восстановлению и протонированию FeS-домена белка Риске и гема Ь/, соответственно. FeS-домен остается связанным с цитохромом Ъ, как показано на рис. 11 А. С гема bi электрон переносится поперек мембраны на гем Ь),\ неэлектрогенность этой реакции свидетельствует о ее электрической компенсации. На данной стадии высвобождения протонов в водную фазу не происходит.

Перераспределение зарядов при электростатической компенсации внутримембранного переноса электрона ££........

На следующей стадии, которая в присутствии 50 мкм ZnJ+ проходит примерно за 10 мс, происходят окисление гема Ь/,, восстановление цитохрома С), выброс протона внутрь хроматофоров и генерация Д^. Кинетическое сопряжение этих реакций между собой, а также их параллельное замедление с увеличением концентрации цинка могут быть объяснены предположением, что связывающий сайт, идентифицированный в структуре митохондриального цитохром Ьсi-комплекса (Bern et al., 2000), служит местом выхода протонов из центра Q0. Данное предположение основано на структурном сходстве с 2д2+-связывающим входным протонным каналом РЦ Rb. sphaeroides (Paddock et al., 2003) и на известной способности ионов цинка блокировать протонные каналы в разных ферментах (De Coursey, 2003). Как видно из рис.

11 А, Zn

связывающий сайт закрыт FeS-доменом белка Риске, когда последний состыкован с цитохромом Ъ. Сайт, однако, становится доступным для воды после поворота FeS-домена к цитохрому С|. (см. рис. 11В). Известно, что поворачиваясь к цитохрому С\, FeS-домен «отодвигает» петлю ef цитохрома b (петля выделена толстым контуром и обозначена ef на рис. 11 А.). Эта петля, в то же время, участвует в связывании иона

Zn ,

предоставляя один из гистидиновых лигандов (см. Рис. НА). Таким образом, с увеличением концентрации цинка должны одновременно затрудняться и восстановление цитохрома Cj подвижным FeS-доменом белка Риске и электрогенный выход протонов из центра что и наблюдалось в экспериментах. Корреляция этих реакций с окислением гема обусловлена, скорее всего, механическим

(конформационным) сопряжением между центром Qi И FeS-доменом белка Риске. Хотя механизм подобного сопряжения, впервые предложенного Мулкиджаняном и Юнге (1995), остается неясным, свидетельства в его пользу начинают накапливаться (Valkova-Valchanova et al. 2000, Berry & Huang, 2003, Cooley & Daldal, 2005).

выводы

1. Установлено, что ионы Zn2+, добавленные в концентрации менее 100 мкМ, не нарушают целостности работы цитохром Ьсу комплекса, а только замедляют его, делая возможным наблюдение редокс превращений высокопотенциального гема Ьн цитохрома Ъ в ответ на вспышку и их соотнесение с электрогенными реакциями.

2. Выдвинуто предположение о том, что трансмембранный перенос электрона к гему электростатически компенсируется перераспределением протонов и диэлектрической релаксацией белка, поскольку не сопровождается заметной генерацией

3. Обнаружено, что генерация Д\|/ И ДрН цитохром Ьс\- комплексом сопряжены с восстановлением цитохрома убихинолом и коррелируют с окислением гема

4. Сделан вывод, что каталитический цикл цитохром ЙСркомплекса включает в себя, по крайней мере, две стадии. На первом этапе молекула убихинола окисляется в центре приводя, соответственно, к восстановлению и протонированию FeS-домена белка Риске и низкопотенциального гема b¡, с которого электрон переносится на гем На следующей стадии происходят окисление гема восстановление цитохрома выброс протонов внутрь хроматофоров и генерация Ду.

5. На основе имеющихся структурных данных предложена механическая модель сопряжения электрогенного выброса протонов цитохром комплексом (генерации Д\|/) с восстановлением цитохрома С\ подвижным FeS-доменом белка Риске.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Klishin,S.S., D.A.Cherepanov, and AY.MuIkidjanian. 2001. Resolution of proton and electron transfer events in the photosynthetic reaction center and the cytochrome-b^ complex ofphototrophic bacteria. In PS2001. 12th International Congress of Photosynthesis. Brisbane. S12-005 (electronic publication).

2. Klishin, S.S., W. Junge, and A.Y. Mulkidjanian. 2002. Flash-induced turnover of the cytochrome bc\ complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome C\ and the voltage generation. Biochim. Biophys. Ada 1553:177-182.

3. Klishin.S.S. and AY.Mulkidjanian. 2005. Proton transfer paths at the quinone oxidizing site ofthe Rb. capsulatus cytochrome bc complex. In Photosynthesis: Fundamental aspects to global perspectives. (A. van der Est and D.Bruce, editors). Montreal, в печати.

Тезисы коференций

4. Klishin,S.S., W.Junge, and AY.Mulkidjanian. 2002. Flash-induced turnover ofthe cytochrome bcr complex in chromatophores ofRhodobacter capsulatus: The ici-dimer is not able to accumulate more than one electron on its two high-potential hemes. In EBEC Short Reports, Vol.12. Elsevier, Arcachon. p. 222.

5. Cherepanov,D.A., S.S.Klishin, and A.Y.Mulkidjanian. 2003. Relaxation control over biological electron transfer: Some illustrative examples. In Proceedings of the 6th International Symposium of the Volkswagen-Stiftung on Intra- and Intermolecular Electron Transfer. Koln, Germany, p. 50.

6. Klishin,S.S., WJunge, and A.Y.Mulkidjanian. 2003. Cytochrome-bc2 complex of Rhodobacter capsulatus: Separation of the catalytic cycle into partial steps. In Proceedings of 1 lth International Symposium on Phototrophic Prokaryots. Tokio. p. 130.

7. Klishin,S.S. and AY.Mulkidjanian. 2004. Breaking down the flash-induced turnover of the cytochrome bc complex into partial steps. In Proceedings of the 13th European Bioenergetic Conference. Pisa, Italy, p. 169.

8. Klishin,S.S. and A. Y. Mulkidjanian. 2004. Proton transfer paths at the quinone oxidizing site ofthe Rb. capsulatus cytochrome be complex. In Proceedings of the 13th International Congress on Photosynthesis. Montreal, p. 148.

9. Mulkidjanian,A.Y., D.A.Cherepanov, BAFeniouk, OA.Gopta, S.S.Klishin, MAKozlova, DAKnorre, Baciou.L., P.Sebban, and WJunge. 2004. Proton transfer dynamics in photosynthetic membranes. In Proceedings of the 13th European Bioenergetic Conference (Plenary Lecture). Pisa, Italy, p. 37.

10. Klishin, S.S. and A.Y. Mulkidjanian. 2005. Electron/proton coupling in the cytochrome bc\ complex of Rhodobacter capsulatus. 2005 Biophysical Society Annual Meeting, Long Beach, USA, Biophys. J. 88, 326a.

11. Klishin S.S., AY Mulkidjanian AY., 2005, Proton transfer at the quinone oxidizing site ofthe cytochrome bc\ complex of Rhodobacter capsulatus, тезисы международной конференции «Российская биоэнергетика: От молекул к клетке» Москва.

Отпечатано в типографии «Альянс 2002» 117630, Москва, ул. Академика Челомея, 8-3 Тираж 100 экз. Заказ 018.

2014

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клишин, Сергей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общее строение и функции цитохром 6сгкомплекса.

1.2. Структура и функции цитохрома Ъ.

1.3. Структура и функции железносерного белка Риске.

1.4. Структура и функции цитохрома С\.

1.5. Ингибиторы цитохром Ъс\-комплекса.

1.6. Влияние ионов цинка на цитохром Ъс\-комплекс.

1.7. Возможные механизмы функционирования цитохром

Ьс\-комплекса.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Культивирование бактерий Rhodobacter capsulatus.

2.2. Получение хроматофоров.

2.3. Измерение концентрации бактериохлорофилла.

2.4. Оборудование для импульсной спектрофотометрии.

2.5. Среды и условия измерений.

2.6. Измерение зависимостей от рН.

2.7. Регистрация индуцированных вспышкой изменений рН внутри хроматофоров.

2.8 Измерение температурной зависимости.

2.9. Приготовление пробы для изучения влияния тяжёлой воды (D2O) на цитохром Ьс\- комплекс.

2.10. Регистрация изменений A\j/.

2.11. Регистрация окислительно-восстановительных реакций в цитохроме b.

2.12. Регистрация окислительно-восстановительных реакций в цитохромах с\ и с2.

2.13. Расчет корректировочных коэффициентов.

2.14. Измерение концентрации реакционных центров.

2.15 Измерение концентрации Ьс\-комплекса.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Характеристика окислительно-восстановительных условий во время измерений.

3.2. Индуцируемые вспышкой реакции в цитохром Ъс\-комплексе

Rb.capsulatus.

3.3. Ингибируещее действие Zn

3.4. Зависимость редокс реакций гема bh и генерации Д\|/ цитохром Ъс\-комплексом от концентрации Zn

3.5. Сравнение действия Zn2+ на каталитический цикл цитохром be | -комплекса в условиях насыщающей и слабой вспышек, соответственно.

3.6. Каталитический цикл цитохром be\-комплекса при различных значениях рН.

3.7. Индуцируемые вспышкой изменения рН внутри хроматофоров Rb.capsulatus.

3.8. Каталитический цикл цитохром be\-комплекса при разных значениях температуры.

3.9. Влияние D20 на каталитический цикл цитохром бсркомплекса.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разделение каталитического цикла цитохром bc1-комплекса в хроматофорах Rhodobacter capsulatus на отдельные стадии с помощью ионов цинка"

Убихинол: цитохром с оксидоредуктаза, называемая также комплексом III или цитохром be 1 -комплексом, является ключевым компонентом энерго-преобразующих электрон-транспортных цепей. Этот фермент занимает центральное место в энергетическом обмене митохондрий и большинства бактерий. У цианобактерий и зелёных растений фунцию, аналогичную цитохром be 1 -комплексу, выполняет цитохромный /^комплекс. Цитохром be i-комплекс включает в себя один цитохром b с двумя темами -высокопотенциальным bh и низкопотенциальным Ь\, один железосерный центр, один цитохром с, и варьирующее количество субъединиц разной молекулярной массы, не содержащих простетических групп. Убихинол и водорастворимый цитохром с (в фототрофных бактериях цитохром с2) служат соответственно восстановителем и окислителем цитохром be J -комплекса. Цитохром Ъс\ -комплекс осуществляет перенос электрона с убихинола на цитохром с2, создавая электрохимический протонный градиент, использующийся для синтеза АТФ или транспорта метаболитов. По современным представлениям убихинол окисляется в сайте Q0, локализованом между железносерным белком Риске и гемом Ь\, после чего первый электрон переходит на железносерный кластер белка Риске и далее последовательно переносится через цитохром с\ на цитохром с, тогда как второй электрон идёт сквозь мембрану через гем Ь\ и гем bh в другой хинон-связывающий сайт Qj, где образуется семихинон анион Q* .

Окисление второго убихинола в сайте Q0 приводит к образованию QH2 в сайте Qj.Образование убихинола в сайте Qj связано с захватом двух протонов с отрицательно заряженной стороны мембраны, а окисление убихинола в сайте Q0 с выбросом протонов с положительно заряженной стороны мембраны.

Детально механизм электрон-протонного сопряжения в цитохром be\-комплексе не понятен и требует более детального изучения. Одним из наиболее удобных объектов исследования цитохром Ьс\ -комплекса являются хроматофоры фотосинтезирующих бактерий - замкнутые мембранные везикулы, образующиеся в результате инвагинации цитоплазматической мембраны у многих видов этих бактерий и получаемые в виде гомогенного препарата при разрушении этих бактерий. В данной работе использовались хроматофоры из несерных пурпурных фототрофных бактерий Rhodobacter capsulatus, цитохром Ъс\-комплекс которых имеет минимальный 3-х субединичный состав. Наличие реакционных центров в хроматофорах Rhodobacter capsulatus позволяет генерировать трансмембранную разность электрических потенциалов и запускать фермент вспышкой света. Кроме того, каротиноидные пигменты светособирающего комплекса этой бактерии являются природным индикатором Д\|/, что позволяет оптическими методами регистрировать трансмембранный перенос протонов в миллисекундной шкале и изучать его корреляции с редокс превращениями цитохромов. Из литературных источников известно, что в окислительных условиях, когда убихинол в мембране окислен, воостановление гема bh происходит быстрее, чем генерация Д\|/. Аналогичное сравнение кинетик в условиях близких к нативным, т.е. когда убихинон в мембране наполовину восстановлен, провести было затруднительно, поскольку в этом случае окисление гема bh быстрее его восстановления, так что индуцированные вспышкой редокс превращения гема bh спектрально не разрешимы. В силу этого исследования цитохром be 1-комплекса в восстановительных условиях проводились обычно в присутствии такого ингибитора, как антимицин А. Антимицин А блокирует окисление гема Ьь, что позволяет наблюдать его восстановление. Однако необратимо связавшись с цитохром Ьс\-комплексом, антимицин А позволяет перенести электрон только до гема Ь^ нарушая, таким образом цикличность переноса электронов. Скулачёвым с соавторами было впервые показано, что ионы Zn2+ оказывают ингибирующее воздействие на цитохром be у-комплекс. Добавление ионов Zn2+ к митохондриям в микромолярной концентрации увеличивало степень восстановленности цитохрома b и уменьшало степень восстановленности цитохрома с. Действие цинка обращалось добавкой ЭДТА. Обратимость ингибирующего действия цинка позволяла надеяться, что его малые концентрации могут быть использованы для «притормаживания» индуцированных вспышками реакций в цитохром be i-комплексе Rb.capsulatus и выявления отдельных стадий каталитического цикла без нарушения целостности работы фермента. В основную задачу данной работы входило изучение индуцируемых

Л I вспышкой реакций в цитохром be 1-комплексе в присутствии ионов Zn . Цель настоящей работы состояла в изучении механизма сопряжения окислительно-восстановительных (редокс) реакций в цитохром Ьс\-комплексе Rb. capsulatus как друг с другом, так и с генерацией мембранного потенциала.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Клишин, Сергей Сергеевич

5. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ионы Zn2+, добавленные в концентрации менее 100 мкМ, не нарушают целостности работы цитохром be j -комплекса, а только замедляют его, делая возможным наблюдение редокс превращений высокопотенциального гема bh цитохрома b в ответ на вспышку и их соотнесение с электрогенными реакциями.

2. Выдвинуто предположение о том, что трансмембранный перенос электрона к гему bh электростатически компенсируется перераспределением протонов и диэлектрической релаксацией белка, поскольку не сопровождается заметной генерацией А\|/.

3. Обнаружено, что генерация Д\|/ и ДрН цитохром Ьс\-комплексом сопряжены с восстановлением цитохрома с\ убихинолом и коррелируют с окислением гема bh.

4. Сделан вывод, что каталитический цикл цитохром bcv-комплекса включает в себя, по крайней мере, две стадии. На первом этапе молекула убихинола окисляется в центре Q0, приводя, соответственно, к восстановлению и протонированию FeS-домвна белка Риске и восстановлению низкопотенциального гема bi, с которого электрон переносится на гемм b/,. На следующей стадии происходят окисление гема bh, восстановление цитохрома с\, выброс протонов внутрь хроматофоров и генерация Ду.

5. На основе имеющихся структурных данных предложена механическая модель сопряжения электрогенного выброса протонов цитохром Ъс\-комплексом (генерации Д\{/) с восстановлением цитохрома с\ подвижным FeS-доменом белка Риске.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клишин, Сергей Сергеевич, Москва

1. Блюменфельд Л.А. (1977) Проблемы биологической физики, М., Наука

2. Каменский Ю.А., Константинов А.А., Ясайтис А.А. (1975) Исследование цитохромов b в субмитохондриальных частицах сердца быка в присутствии окислительно-восстановительного буфера сукцинат/фумарат, Биохимия 40,1022-1031

3. Самуилов В.Д. (1983) Фотосинтетический аппарат бактерий как преобразователь световой энергии в электрическую, М., ВИНИТИ

4. Скулачёв В.П. (1972) Трансформация энергии в биомембранах, М., Наука

5. Скулачёв В.П. (1988) Энергетика биологических мембран, М., Наука

6. Aagaard A., Namslauer A., Brzezinski Р. (2002) Inhibition of proton transfer in cytochrome с oxidase by zinc ions: delayed proton uptake during oxygen reduction, Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics 1555, 133-139

7. Aagaard J., Sistrom W.R. (1972) Control of synthesis of reaction center bacteriochlorophyll in photosynthetic bacteria, Photochem Photobiol 15, 209-225

8. Ambler R.P., Daniel M., Hermoso J., Meyer Т.Е., Bartsch R.G., Kamen M.D. (1979) Cytochrome c2 sequence variation among the recognised species of purple nonsulphur photosynthetic bacteria, Nature 278, 659-60

9. Ambler R.P. (1991) Sequence variability in bacterial cytochromes c, Biochim Biophys Acta 1058,42-7

10. Andrews K.M., Crofts A.R., Gennis R.B. (1990) Large-scale purification and characterization of a highly active four- subunit cytochrome bcl complex from Rhodobacter sphaeroides, Biochemistry 29, 2645-2651

11. Baccarini-Melandri A., Jones O.T., Hauska G. (1978) Cytochrome c2- an electron carrier shared by the respiratory and photosynthetic electron transport chain of Rhodopseudomonas capsulata, FEBS Lett. 86,151-4

12. Baccarini-Melandri A., Melandri B.A. (1977) A role for ubiquinone-10 in the b~c2 segment of the photosynthetic bacterial electron transport chain, FEBS Lett. 80,459-464

13. Baciou L., Michel H. (1995) Interruption of the water chain in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides reduces the rates of the proton uptake and of the second electron transfer to QB, Biochemistry 34,7969-72

14. Berden J. A., Slater E.C. (1972) The allosteric binding of antimycin to cytochrome b in the mitochondrial membrane, Biochimica et Biophysica Acta 256, 199-215

15. Berry E.A., Guergova-Kuras M., Huang L.S., Crofts A.R. (2000a) Structure and function of cytochrome be complexes, Annual Review of Biochemistry 69,1005-1075

16. Berry E.A., Huang L.S. (2003) Observations concerning the quinol oxidation site of the cytochrome bcl complex, FEBS Lett. 555, 13-20

17. Berry E.A., Zhang Z., Bellamy H.D., Huang L. (2000b) Crystallographic location of two Zn(2+)-binding sites in the avian cytochrome bc(l) complex, Biochim Biophys Acta 1459, 440-448

18. Bowyer J.R., Crofts A.R. (1981) On the mechanism of photosynthetic electron transfer in Rhodopseudomonas capsulata and Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim Biophys Acta 636, 218-233

19. Bowyer J.R., Edwards C.A., Ohnishi Т., Trumpower B.L. (1982) An analogue of ubiquinone which inhibits respiration by binding to the iron-sulfur protein of the cytochrome b-cl segment of the mitochondrial respiratory chain, J Biol Chem 257, 8321-8330

20. Bowyer J.R., Meinhardt S.W., Tierney G.V., Crofts A.R. (1981) Resolved difference spectra of redox centers involved in photosynthetic electron flow in Rhodopseudomonas capsulata and Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim Biophys Acta 635,167-186

21. Brandt U, von Jagow G. (1991) Analysis of inhibitor binding to the mitochondrial cytochrome с reductase by fluorescence quenches titration. Evidence for a 'catalytic switch' at the Qo center, Eur. J. Biochem. 195, 163-70

22. Brandt U., Haase U., Schagger H.,von Jagow G. (1991) Significance of the "Rieske" iron-sulfur protein for formation and function of the ubiquinol-oxidation pocket of mitochondrial cytochrome с reductase (bcl complex), J. Biol. Chem. 266, 19958-19964

23. Brandt U., Schagger H., von Jagow G. (1988) Characterisation of binding of the methoxyacrylate inhibitors to mitochondrial cytochrome с reductase, Eur. J. Biochem. 173,499-506

24. Brandt U. (1998) The chemistry and mechanics of ubihydroquinone oxidation at center P (Q(o)) of the cytochrome bc(l) complex, Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics 1365, 261-268

25. Brasseur G., Saribas A.S., Daldal F. (1996) A compilation of mutations located in the cytochrome b subunit of the bacterial and mitochondrial bcl complex, Biochim Biophys Acta -Bioenergetics 1275, 61-69

26. Broger C., Salardi S., Azzi A. (1983) Interaction between isolated cytochrome cl and cytochrome c, Eur. J. Biochem. 131, 349-52

27. Brugna M., Rodgers S., Schricker A., Montoya G., Kazmeier M., Nitschke W., Sinning I. (2000) A spectroscopic method for observing the domain movement of the Rieske iron-sulfur protein, Proc. Acad. Sci. USA 97, 20692074

28. Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. (1976) Photoinduction kinetics of electrical potential in a single chloroplast as studied with micro-electrode technique, Biochim. Biophys. Acta. 430, 336-51.

29. Clark L.C. (1956) Monitor and control of blood and tissue oxygen tensions, Trans. Am. Soc. Art. Int. Organs 2,41-45

30. Clark A.J., Jackson J.B. (1981) The measurement of membrane potential during photosynthesis and during respiration in intact cells of Rhodopseudomonos capsulata by both electrochromism and by permeant ion redistribution, Biochem. J. 200, 389-397

31. Clayton R.K. (1973) The absolute quantum efficiency of bacteriochlorophyll photooxidation in reaction centers of Rhodopseudomonas spheroids, Biochim Biophys Acta 333, 246-260

32. Cooley W., Daldal F. (2005) Spectroscopic observation of structurally mediated cross-talk between the quinone reduction and hydroquinone oxidation sites of the cytochrome be 1 complex, Biophys. J. 88, 326a

33. Crofts A.R., Berry E.A. (1998) Structure and function of the cytochrome bcl complex of mitochondria and photosynthetic bacteria, Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 501-509

34. Crofts A.R., Hong S., Ugulava N., Barquera В., Gennis R., Guergova-Kuras M., Berry E.A. (1999b) Pathways for proton release during ubihydroquinone oxidation by the bcl complex, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96, 1002110026

35. Crofts A.R., Hong S., Zhang Z., Berry E.A. (1999c) Physicochemical aspects of the movement of the rieske iron sulfur protein during quinol oxidation by the bc(l) complex from mitochondria and photosynthetic bacteria, Biochemistry 38,15827-15839

36. Crofts A.R., Meinhardt S.W., Jones K.R., Snozzi M. (1983) The role of the quinone pool in the cyclic electron transfer chain of Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim Biophys Acta 723, 202-218

37. Crofts A.R., Shinkarev V.P., Kolling D.R., Hong S. (2003) The modified Q-cycle explains the apparent mismatch between the kinetics of reduction of cytochromes cl and bH in the bcl complex, J. Biol. Chem. 278, 3619136201

38. Crofts A.R., Wraight C.A. (1983) The electrochemical domain of photosynthesis, Biochim. Biophys.Acta 726,149-185

39. Daldal F., Cheng S., Applebaum J., Davidson E., Prince R.C. (1986) Cytochrome-c2 is not essential for photosynthetic growth of Rhodopseudomonas capsulata, Proc. Acad. Sci. USA 83, 2012-2016

40. Darrouzet E., Daldal F. (2002) Movement of the iron-sulfur subunit beyond the ef loop of cytochrome b is required for multiple turnovers of the be 1 complex but not for single turnover Q(o) site catalysis, J. Biol. Chem. 277, 3471-3476

41. Darrouzet E., Daldal F. (2003) Protein-Protein Interactions between cytochrome b and the Fe-S protein subunits during QH(2) oxidation and large-scale domain movement in the bc(l) complex, Biochemistry 42,14991507

42. Darrouzet E., Moser C.C., Dutton P.L., Daldal F. (2001) Large scale domain movement in cytochrome bc(l): a new device for electron transfer in proteins, Trends in Biochemical Sciences 26, 445-451

43. Darrouzet E., Valkova-Valchanova M., Daldal F. (2000a) Probing the role of the Fe-S subunit hinge region during Q(o) site catalysis in Rhodobacter capsulatus bc(l) complex, Biochemistry 39,15475-15483

44. Darrouzet E., Valkova-Valchanova M., Daldal F. (2002b) The 2Fe-2S. cluster E-m as an indicator of the iron-sulfur subunit position in the ubihydroquinone oxidation site of the cytochrome bc(l) complex, J. Biol. Chem. 277, 3464-3470

45. Darrouzet E., Valkova-Valchanova M., Moser C.C., Dutton P.L., Daldal F. (2000) Uncovering the 2Fe2S. domain movement in cytochrome bc(l) and its implications for energy conversion, Proc. Acad. Sci. USA 97, 4567-4572

46. Davidson E., Ohnishi Т., Atta-Asafo-Adjei E., Daldal F. (1992) Potential ligands to the 2Fe-2S. Rieske cluster of the cytochrome bcl complex of Rhodobacter capsulatus probed by site-directed mutagenesis, Biochemistry 31,3342-3351

47. De la Rosa F. F., Palmer G. (1983) Reductive titration of CoQ-depleted Complex III from Baker's yeast. Evidence for an exchange-coupled complex between QH . and low-spin ferricytochrome b, FEBS Lett. 163, 140-143.

48. De Vries S., Albracht S.P., Berden J.A., Slater E.C. (1982) The pathway of electrons through OH2:cytochrome с oxidoreductase studied by pre-steady -state kinetics, Biochim Biophys Acta 681, 41-53

49. DeCoursey Т.Е., Cherny V.V. (2000) Common themes and problems of bioenergetics and voltage-gated proton channels, Biochim. Biophys. Acta. 1458, 104-119

50. Deul D.H., Thorn M.B. (1962) Effects of 2,3-dimercaptopropanol and antimycin on absorption spectra of heart-muscle preparations, Biochim. Biophys. Acta. 59,426-36

51. Dickerson R.E., Timkovich R., Almassy R. J. (1976) The cytochrome fold and the evolution of bacterial energy metabolism, J. Mol. Biol. 100, 473-91

52. Ding H., Daldal F., Dutton P.L. (1995) Ion pair formation between basic residues at 144 of the Cyt b polypeptide and the ubiquinones at the Qo site of the Cyt bcl complex, Biochemistry 34, 15997-16003

53. Drachev L.A., Mamedov M.D. (1989) Flash-induced electrogenic events in the photosynthetic reaction center and cytochrome bcl-complex of Rhodobacter sphaeroides chromatophores, Biochim Biophys Acta 973, 189197

54. Dutton P.L., Jackson J.B. (1972) Thermodynamic and kinetic characterization of electron transfer components in situ in Rhodopseudomonas spheroides and Rhodospirillum rubrum, Eur. J. Biochem. 30,495-510

55. Dutton P.L., Prince R.C. (1978) Reaction center driven cytochrome interactions in electron and proton translocation and energy conservation, in: (Eds. Clayton R.K., Sistrom W.R.) The Photosynthetic Bacteria, New York: Academic Press, 525-570

56. Feher G., Okamura M.Y. (1989) Structure and function of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides, Nature 339, 155-164

57. Gennis R.B., Barquera В., Hacker В., Van Doren S.R., Arnaud S., Crofts A.R., Davidson E., Gray K.A., Daldal F. (1993) The bcl complexes of Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter capsulatus, J. Bioenerg. Biomembr. 25, 195-209

58. Glaser E.G., Crofts A.R. (1984) A new electrogenic step in the ubiquinol:cytochrome c2 oxidoreductase complex of Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim. Biophys. Acta.766,322-333

59. Gopta O.A., Feniouk B.A., Junge W., Mulkidjanian A.Y. (1998) The cytochrome bcl complex of Rhodobacter capsulatus: ubiquinol oxidation in a dimeric Q-cycle?, FEBS Lett. 431, 291-296

60. Gray K.A., Dutton P.L., Daldal F. (1994) Requirement of histidine 217 for ubiquinone reductase activity (Qi site) in the cytochrome bcl complex, Biochemistry 33, 723-733

61. Guerrieri F., Nelson B.D. (1975) Studies on the characteristics of a proton pump in phospholipid vesicles inlayed with purified complex III from beef heart mitochondria, FEBS Lett. 54, 339-42

62. Hacker В., Barquera В., Crofts A.R., Gennis R.B. (1993) Characterization of mutations in the cytochrome b subunit of the bcl complex of Rhodobacter sphaeroides that affect the quinone reductase site (Qc), Biochemistry 32, 4403-4410

63. Hansen K.C., Schultz B.E., Wang G., Chan S.I. (2000) Reaction of Escherichia coli cytochrome bo(3) and mitochondrial cytochrome bc(l) with a photoreleasable decylubiquinol, Biochim. Biophys. Acta. 1456, 121-137

64. Harnisch U., Weiss H., Sebald W. (1985) The primary structure of the iron-sulfur subunit of ubiquinol-cytochrome с reductase from Neurospora, determined by cDNA and gene sequencing, Eur. J. Biochem. 149, 95-99

65. Hong S.J., Ugulava N., Guergova-Kuras M., Crofts A.R. (1999) The energy landscape for ubihydroquinone oxidation at the Q(o) site of the bc(l) complex in Rhodobacter sphaeroides, J. Biol. Chem. 274, 33931-33944

66. Hunte С. (2001) Insights from the structure of the yeast cytochrome bc(l) complex: crystallization of membrane proteins with antibody fragments, FEBS Lett. 504, 126-132

67. Hunte C., Koepke J., Lange C., Rossmanith Т., Michel H. (2000) Structure at 2.3 A resolution of the cytochrome bc(l) complex from the yeast Saccharomyces cerevisiae co-crystallized with an antibody Fv fragment, Structure Fold Des 8 , 669-684

68. Jackson J.B. (1988) Bacterial photosynthesis in: (Eds:Anthony C.) Bacterial energy transduction, London: Academic Press, 317-376

69. Jackson J.B., Crofts A.R. (1969) High energy state in chromatophores of Rhodopseudomonas speroides, FEBS Lett. 4,185-189

70. Jackson J.B., Crofts A.R. (1971) The kinetics of light induced carotenoid changes in Rhodopseudomonas spheroides and their relation to electrical field generation across the chromatophore membrane, Eur. J. Biochem. 18, 120-130

71. Jackson J.B., Goodwin M.G. (1993) Electrochromic responses of bacteriochlorophyll absorbance bands in purified light-harvesting complexes of Rhodobacter capsulatus reconstituted into liposomes, Biochim. Biophys. Acta. 1144,199-203

72. Jones M.R., Jackson J.B.(1990) Proton efflux from right-side-out membrane vesicles of Rhodobacter sphaeroides after short flashes, Biochim. Biophys. Acta. 1019,51-58

73. Junemann S., Heathcote P., Rich P.R. (1998) On the mechanism of quinol oxidation in the bcl complex, J. Biol. Chem. 273, 21603-21607

74. Junge W. (1976) Flash kinetic spectrophotometry in the study of plant pigments, in: (Eds: Goodwin T.W.) Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, London: Academic Press, 233-333

75. Junge W., Witt H.T. (1969) Analysis of electrical phenomena in membranes and interfaces by absorption changes, Nature 222, 1062-1065

76. Junge W., Witt H.T. (1968) On the ion transport system of photosynthesis-investigations on a molecular level, Z. Naturforsch. B. 23,244-54

77. Kamensky Y., Konstantinov A.A., Kunz W.S., Surkov S. (1985) Effect of bcl site electron transfer inhibitors on the absorption spectra of mitochondrial cytochromes b, FEBS Lett. 181,95-99

78. Kim H., Xia D., Yu C.A., Xia J.Z., Kachurin A.M., Zhang L., Yu L., Deisenhofer J. (1998) Inhibitor binding changes domain mobility in the iron-sulfur protein of the mitochondrial bcl complex from bovine heart, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95, 8026-8033

79. Klishin S.S., Mulkidjanian A.Y. (2005) Proton transfer paths at the quinone oxidizing site of the Rb. capsulatus cytochrome be complex. In Photosynthesis: Fundamental aspects to global perspectives. (Eds: A. van der Est, Bruce D.), 460-462.

80. Konstantinov A.A. (1990) Vectorial electron and proton transfer in the cytochrome bcl complexes, Biochim. Biophys. Acta. 1018, 138-141

81. Kunz W.S., Konstantinov A.A. (1983) Effect of b-cl site inhibitors on the midpoint potentials of mitochondrial cytochromes b, FEBS Lett. 155, 237-240

82. Kunze В., Kemmer Т., Hofle G., Reichenbach H. (1984) Stigmatellin, a new antibiotic from Stigmatella aurantiaca (Myxobacterales). I. Production, physico-chemical and biological properties, J. Antibiot (Tokyo) 37,454-461

83. Lange C., Hunte C. (2002) Crystal structure of the yeast cytochrome bc(l) complex with its bound substrate cytochrome c, Proc. Acad. Sci. USA 99,2800-2805

84. Lascelles J. (1959) Adaptation to form bacterichlorophyll in Rhodopseudomonas sphaeroides: Changes in activity of enzymes concerned in pyrrole synthesis, Biochem. J. 72, 508-518

85. Leung K.H., Hinkle P.C. (1975) Reconstitution of ion transport and respiratory control in vesicles formed from reduced coenzyme Q-cytochrome с reductase and phospholipids, J. Biol. Chem. 250, 8467-71

86. Link T.A. (1997) The role of the 'Rieske' iron sulfur protein in the hydroquinone oxidation (Q(P)) site of the cytochrome bcl complex. The 'proton-gated affinity change' mechanism, FEBS Lett. 412, 257-264

87. Link T.A., von Jagow G. (1995) Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc\ complex by blocking a protonatable group, J. Biol. Chem. 270, 25001-25006

88. Lorusso M., Cocco Т., Sardanelli A.M., Minuto M., Bonomi F., Papa S. (1991) Interaction of Zn2+ with the bovine-heart mitochondrial bc\ complex, Eur. J. Biochem. 197,555-561

89. Majewski С., Trebst A. (1990) The pet genes of Rhodospirillum rubrum: cloning and sequencing of the genes for the cytochrome bcl-complex, Mol. Gen. Genet. 224, 373-382

90. Matsuura K., O'Keefe D.P., Dutton P.L. (1983) A reevaluation of the events leading to the electrogenic reaction and proton translocation in the ubiquinol-cytochrome с oxidoreductase of Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim. Biophys. Acta. 722, 12-22

91. Meinhardt S., Crofts A.R. (1982) Kinetic and thermodynamic resolution of cytochrome с 1 and cytochrome c2 from Rhodopseudomonas sphaeroides, FEBS Lett. 149,223-227

92. Mills D.A., Schmidt В., Hiser C., Westley E., Ferguson-Miller S. (2002) Membrane potential-controlled inhibition of cytochrome с oxidase by zinc, J. Biol. Chem. 277,14894-14901

93. Mitchell P. (1976) Possible molecular mechanisms of the protonmotive function of cytochrom systems, J. Theor. Biol. 62, 327-367

94. Mitchell P. (1990) The classical mobile carrier function of lipophilic quinones in the osmochemistry of electron-driven proton translocation, in: (Eds: Lenez G.) Highlights in Ubiquinone Research, London: Taylor & Francis, 77-82

95. Moser C.C., Keske J.M., Warncke K., Farid R.S., Dutton P.L. (1992) Nature of biological electron transfer, Nature 355, 796-802

96. Mulkidjanian A.Y., Mamedov M.D., Drachev L.A. (1991) Slow electrogenic events in the cytochrome bcl -complex of Rhodobacter sphaeroides: The electron transfer between cytochrome b hemes can be non-electrogenic, FEBS Lett. 284, 227-231

97. Nett J.H., Hunte C., Trumpower B.L. (2000) Changes to the length of the flexible linker region of the Rieske protein impair the interaction of ubiquinol with the cytochrome be (1) complex, Eur. J. Biochem. 267, 57775782

98. Ohnishi Т., Trumpower B.L. (1980) Differential effects of antimycin on ubisemiquinone bound in different environments in isolated succinate-cytochrome с reductase complex J. Biol. Chem. 255, 3278-84

99. Okamura M.Y., Feher G. (1995) Proton-Coupled Electron Transfer Reactions of QB in Reaction Centers From Photo synthetic Bacteria, (Eds: Blankenship R.E., Madigan M.T., Bauer C.E.) Kluwer Academic Publishers. Printed in The Netherlands, 577-94

100. O'Keefe D.P., Dutton P.L. (1981) Cytochrome b oxidation and reduction reactions in the ubiquinone- cytochrome b/c2 oxidoreductase from Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim. Biophys. Acta. 635, 149-166

101. Osyczka A., Moser C.C., Daldal F., Dutton P.L. (2004) Reversible redox energy coupling in electron transfer chains, Nature 427, 607-612

102. Overfield R.E., Wraight C.A. (1980) Oxidation of cytochromes с and c2 by bacterial photosynthetic reaction centers in phospholipid vesicles. 2. Studies with negative membranes, Biochemistry 19, 3328-3334

103. Paddock M.L., Graige M.S., Feher G., Okamura M.Y. (1999) Identification of the proton pathway in bacterial reaction centers: inhibition of proton transfer by binding of Zn2+ or Cd2+, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,6183-6188

104. Paddock M.L., Rongey S.H., Feher G., Okamura M.Y. (1989) Pathway of proton transfer in bacterial reaction centers: Replacement of Glu 212 in the L subunit inhibits quinone (QB) turnover, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6602-6606

105. Page C.C., Moser C.C., Chen X.X., Dutton P.L. (1999) Natural engineering principles of electron tunnelling in biological oxidation-reduction, Nature 402, 47-52

106. Ponamarev M.V., Cramer W.A. (1998) Perturbation of the internal water chain in cytochrome f of oxygenic photosynthesis: loss of the concerted reduction of cytochromes f and b6, Biochemistry 37, 1719917208

107. Prince R.C., Dutton P.L. (1976) The primary acceptor of bacterial photosynthesis: it's operating midpoint potential? Arch. Biochem. Biophys. 172, 329-334

108. Racher E. (1976) A new look at mechanisms in bioenergetics, N.Y.; San Francisco; L.: Acad. Press

109. Rao B.K., Tyryshkin A.M., Roberts A.G., Bowman M.K., Kramer D.M. (2000) Inhibitory copper binding site on the spinach cytochrome b6f complex: implications for Qo site catalysis, Biochemistry 39, 3285-3296

110. Rich P.R. (1984) Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes, Biochim. Biophys. Acta. 768, 53-79

111. Rich P.R., Madgwick S.A., Brown S., vonJagow G. Brandt U. (1992) MOA-stilbene a new toll for investigation of the reactions of the chloroplast cytochrome-bf complex, Photosynthesis Research 34,465-477

112. Rieske J.S., Baum H., Stoner C.D., Lipton S.H. (1967) On the Antimycin-sensitive Cleavage of Complex III of the Mitochondrial Respiratory Chain, J. Biol. Chem. 242, 4854-66

113. Rieske J.S., Zaugg W.S., Hansen R.E. (1964) Studies on the electron transfer system. Distribution of iron and of the component giving an electron paramagnetic resonance signal at g = 1.90 in subtractions of complex 3, J. Biol. Chem. 239, 3023-30TUDIES

114. Roberts A.G., Bowman M.K., Kramer D.M. (2002) Certain metal ions are inhibitors of cytochrome b6f complex 'Rieske' iron-sulfur protein domain movements, Biochemistry 41,4070-4079

115. Robertson D.E., Dutton P.L. (1988) The nature and magnitude of the charge-separation reactions of ubiquinol cytochrome c2 oxidoreductase, Biochim. Biophys. Acta. 935, 273-91

116. Saraste M. (1984) Location of haem-binding sites in the mitochondrial cytochrome b, FEBS Lett. 166, 367-372

117. Schultz B.E., Chan S.I. (2001) Structures and proton-pumping strategies of mitochondrial respiratory enzymes, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30, 23-65

118. Shinkarev V.P., Crofts A.R., Wraight C.A. (2001) The electric field generated by photosynthetic reaction center induces rapid reversed electron transfer in the bc(l) complex, Biochemistry 40, 12584-12590

119. Shinkarev V.P., Rolling D.R.J., Miller T.J., Crofts A.R. (2002) Modulation of the midpoint potential of the 2Fe-2S. Rieske iron sulfur center by Q(o) occupants in the bc(l) complex, Biochemistry 41, 1437214382

120. Siedow J. N., de la Rosa F.F., Palmer G. (1978) The preparation and characterization of highly purified, enzymically active complex III from baker's yeast, J. Biol. Chem. 253,2392-2399

121. Skulachev V.P., Chistyakov V.V., Jasaitis A.A., Smirnova E.G. (1967) Inhibition of the respiratory chain by zinc ions, Biochem. Biophys. Res. Commun. 26, 1-6

122. Snyder C.H., Trumpower B.L. (1999) Ubiquinone at center N is responsible for triphasic reduction of cytochrome b in the cytochrome bc(l) complex, J. Biol. Chem. 274, 31209-31216

123. Stonehuerner J., O'Brien P., Geren L., Millett F., Steidl J., Yu L., Yu C.A. (1985) Identification of the binding site on cytochrome cl for cytochrome c, J. Biol. Chem. 260, 5392-5398

124. Takahashi E., Wraight C.A. (1990) A crucial role for Asp (L213) in the proton transfer pathway to the secondary quinone of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides, Biochimica et Biophysica Acta 1020,107-11

125. Takamiya K.I., Dutton P.L. (1979) Ubiquinone in Rhodopseudomonas sphaeroides. Some thermodynamic properties, Biochim. Biophys. Acta. 546, 1-16

126. Tian H., White S., Yu L., Yu C.A. (1999) Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bcl complex, J. Biol. Chem. 274,7146-7152

127. Tian H., Yu L., Mather M.W., Yu C.A. (1998) Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bcl complex, J. Biol. Chem. 273, 27953-27959

128. Trumpower B.L., Edwards C.A. (1979) Purification of a reconstitutively active iron-sulfur protein (oxidation factor) from succinate cytochrome с reductase complex of bovine heart mitochondria, J. Biol. Chem. 254, 8697-8706

129. Valkova-Valchanova M., Darrouzet E., Moomaw C.R., Slaughter C.A., Daldal F. (2000) Proteolytic cleavage of the Fe-S subunit hinge region of Rhodobacter capsulatus bc(l) complex: effects of inhibitors and mutations, Biochemistry 39,15484-15492

130. Verbist J., Lang F., Gabellini N., Oesterhelt D. (1989) Cloning and sequencing of the fbcF, В and С genes encoding the cytochrome b/cl complex from Rhodopseudomonas viridis, Mol. Gen. Genet. 219, 445-452

131. Von Jagow G., Engel W.D. (1981) Complete inhibition of electron transfer from ubiquinol to cytochrome b by the combined action of antimycin and myxothiazol, FEBS Lett. 136,19-24

132. Von Jagow G., Link T. A. (1986) Use of specific inhibitors on the mitochondrial bcl complex, in Photosynthesis: Molecular biology of energy capture 126, 253-71

133. Von Jagow G., Ohnishi T. (1985) The chromone inhibitor stigmatellin-binding to the ubiquinol oxidation center at the C-side of the mitochondrial membrane FEBS Lett. 185, 311-15

134. Wakabayashi S., Matsubara H., Kim С. H., Kawai K., King Т.Е. (1980) The complete amino acid sequence of bovine heart cytochrome cl, Biochem. Biophys. Res. Commun. 97, 1548-1554

135. Wikstrom M., Krab K., Saraste M. (1981) Proton-translocating cytochrome complexes, Annu. Rev. Biochem. 50, 623-655

136. Wikstrom M.K., Berden J. A. (1972) Oxidoreduction of cytochrome b in the presence of antimycin, Biochim. Biophys. Acta. 283, 403-420

137. Wikstrom M.K. (1973) The different cytochrome b components in the respiratory chain of animal mitochondria and their role in electron transport and energy conservation, Biochim. Biophys. Acta. 301, 155-193

138. Wood P.M. (1983) Why do c-type cytochrome exist? FEBS Lett. 164, 223-226

139. Xia D., Yu C.A., Kim H., Xia J.Z., Kachurin A.M., Zhang L., Yu L., Deisenhofer J. (1997) Crystal structure of the cytochrome bcl complex from bovine heart mitochondria, Science 277, 60-66

140. Xiao K.H., Chandrasekaran A., Yu L., Yu C.A. (2001) Evidence for the intertwined dimer of the cytochrome bc\ complex in solution, J. Biol. Chem. 276, 46125-46131

141. Yu C.A., Xia J.Z., Kachurin A.M., Yu L., Xia D., Kim H., Deisenhofer J. (1996) Crystallization and preliminary structure of beef heart mitochondrial cytochrome-6ci complex, Biochim. Biophys. Acta. 1275, 4753

142. Yun C.H., Crofts A.R., Gennis R.B. (1991) Assignment of histidine axial ligands to the cytochrome bh and cytochrome Ы components of the be 1 complex from Rhodobacter sphaeroides site directed mutagenesis, Biochemistry 30, 6747-6754

143. Zhang Z., Huang L., Shulmeister V.M., Chi Y.I., Kim K.K., Hung L.W., Crofts A.R., Berry E.A., Kim S.H. (1998) Electron transfer by domain movement in cytochrome bc\, Nature 392, 677-684