Изучение механизма сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта АТФ-синтазой из бактерии RHODOBACTER CAPSULATUS

Фенюк, Борис Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизма сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта АТФ-синтазой из бактерии RHODOBACTER CAPSULATUS
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта АТФ-синтазой из бактерии RHODOBACTER CAPSULATUS"

/Б Ой , ц ДЕН «38

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ФЕНЮК Борис Александрович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА СОПРЯЖЕНИЯ СИНТЕЗА АТФ И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА АТФ-СИНТАЗОЙ ИЗ БАКТЕРИИ ШНОООВА СТЕЯ САРБиЬАТиБ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1998.

Работа выполнена в отделе фотобиохимии НИИ физико-химической био логии им. А.Н. Белозерского МГУ и на кафедре биофизики биологическо го факультета Университета г. Оснабрюка, Германия.

доктор биологических наук, зав. отделом фотобиохимии А.Д. Каулен

доктор биологических наук, Мальян А.Н.

кандидат биологических наук, Фитин А.Ф.

Институт Электрохимии РАН

Защита состоится "Д/ " 1998 года в (£1 часов

на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Воробьевы горы, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического фа культета МГУ.

Автореферат разослан "20 " года.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук, старший научный соотрудник

/—М.В. Ивано

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В процессе синтеза АТФ энергия разности электрохимических потенциалов ионов водорода (А/¿н+) переводится в форму энергии фосфо-дпэфирных связей. Мембранный фермент, ответственный за взаимопревращение этих двух форм энергии, Н+-АТФ-спнтаза, называемая также Н+-АТФазой пли FoFi-комплексом (КФ 3.6.1.34), играет ключевую роль в энергообмене клетки, осуществляя сопряжение реакции синтеза/ гидролиза АТФ с трансмембранным переносом протонов. Н+-АТФаза обнаружена во внутренней мембране митохондрий, в тилакоидной мембране хлоропластов и в цитоплазматической мембране бактерий; ферменты из столь различных объектов удивительно близки по строению и каталитическим свойствам.

Н+-АТФаза состоит из интегрированной в мембрану части Fo, участвующей в транслокации понов, и каталитической части Fi, называемой Fi-АТФазой из-за ее АТФазной активности (Рис. 1). Многие данные указывают на то, что Н+-АТФаза — фермент, работающий по принципу молекулярной машины: ток понов через мембранную часть Н+-АТФазы предположительно приводит к механическому движению субъединиц Fo, которое в свою очередь приводит во вращение субъ-едишщы 7 и б Fi(Sabbert, 1996; Noji, 1997); последние, вероятно, механически изменяют конформацию Fi, высвобождая синтезированный АТФ.

Механизм протонного транспорта Н+-АТФазой на сегодняшний день остается предметом споров. Разработано несколько моделей работы Н+-АТФазы, предполагающих вращение кольцевого олпгомера из 12ти с-субъединиц Fq в процессе протонного транспорта как движущую силу вращения 7-субъединицы внутри Fi (Junge et al., 1997; Eiston et al., 1998; Dimroth et al., 1998). В основе механизма функционирования Fo в этих моделях лежит идея двух некоаксиальных протонных полуканалов, выдвинутая В.П. Скулачевым для объяснения механизма работы бактериального жгутика (Glagolev et al., 1978). Предположение о захвате протона через один полуканал и выбросе через второй, смещенный относительно первого, объясняет генерацию вращательного момента за счет трансмембранного переноса протонов. Одна из моделей (Junge et al., 1997) схематично представлена на Рис. 1.

Рисунок 1: Слева — схема строения Н+-АТФазы Е. coli. Субъединицы Fi окрашены, субъединицы Fo белые. Справа — модель функционирования Fo по Юнге.

Но описанные модели не объясняют механизм сопряжения ионного транспорта с синтезом/гидролизом АТФ. Без ответа остается фундаментальный вопрос в понимании механизма работы Н+-АТФазы: как запасается энергия нескольких последовательно транспортируемых протонов для акта синтеза?

В настоящей работе для исследования протонного транспорта была выбрана Н+-АТФаза фотосинтетической бактерии Rhodobacter capsulatus, имеющая минимальный субъединичный состав, близкая эволюционно к Н+-АТФазе митохондрий и функционально к хлоропластному ферменту. Наличие в мембране хроматофоров этой бактерии реакционных центров и Ьс\-комплекса позволяет генерировать Д ф и запускать Н+-АТФазу вспышкой возбуждающего света; наличие каротиноидных пигментов, поглощение которых линейно зависит от Аф, позволяет оптическими методами регистрировать протоннй транспорт в микросекундной шкале. Метод импульсной спектрофотометрии оказался чрезвычайно продуктивен для изучения ряда аспектов протонного транспорта через Н+-АТФазу, в частности для выяснения стехиометрии Н+/АТФ.

Цель работы

Целью настоящей работы являлось выяснение механизма сопряжения синтеза АТФ и транспорта протонов Н+-АТФазой. Для этого были поставлены следующие задачи:

Исследовать характеристики протонного транспорта Н+-АТФазой и их зависимость от присутствия субстратов фосфорилирования, ингибиторов Бь а также характеристики протонного транспорта через Го в отсутствие Гь

Исследовать зависимость синтеза АТФ от ДДН+, от концентрации субстратов фосфорилирования и ингибиторов протонного транспорта и

Количественно связать уровень синтеза АТФ с протонным транспортом через Н+-АТФазу.

Разработать модель функционирования фермента.

Научная новизна работы

Показано, что в отсутствие субстратов фосфорилирования Н+-АТФаза КЬ. capsv.la.tus осуществляет протонный транспорт, не сопряженный с синтезом АТФ. Подобный феномен, известный под названием протонного слипа, до этого был зарегистрирован только на хлоропластном ферменте. Полученные данные позволяют предполагать явление слипа прпсупцш Н+-АТФазам в целом.

Исследовано влияние ингибиторов Г] на протонный транспорт через Н+-АТФазу. Обнаружено, что в условиях синтеза АТФ инибпторы Г[ блокируют протонный транспорт лишь до некоторого предела. Этот предел соответствовал уровню протонного транспорта в условиях слипа. Полученные данные указызают на отсутствие жесткого сопряжения между протонным транспортом и катализом.

Обнаружено явление протонного транспорта, не сопряженного с синтезом АТФ в присутствии субстратов фосфорилирования при низких значениях Факт существования порогового значения ДДд+, необходимого для синтеза АТФ, известен давно. В настоящей работе показано, что при подпороговых значениях ДДН+ происходит несопряженный протонный транспорт через Н+-АТФазу.

Предложена модель, объясняющая явление протонного транспорта, не сопряженного с синтезом АТФ в присутствии субстратов фосфорилирования при низких значениях ДД}[+, и явление слипа. В основе модели

лежит принцип запасания энергии, получаемой при транспорте протонов, в виде энергии эластичной деформации фермента. Это предполагает. что для каждого следующего из последовательно транспортируемых протонов пороговое значение Д/2Н+ будет выше, чем для предыдущего. Пороговый ДДН+ для транспорта последнего протона, перенос которого ведет к освобождению АТФ из Г], определяет общий пороговый для синтеза АТФ. При ДДц+ ниже этого общего порога может происходить транспорт первых протонов, не ведущий к синтезу АТФ. Энергия этих протонов запасается в виде эластичного напряжения фермента. В последствии, когда снизится, эти первые протоны, вероятно, переносятся обратно за счет все той же запасенной энергии.

В случае отсутствия субстратов фосфорилированпя или в присутствии ингибиторов Г] (условия слипа) запасаемая в виде эластичной деформации энергия не может разрядиться через нормальный каталитический акт. Вероятно, в этом случае при высоких значениях Д/2Н+ происходит разрыв связи между Г; и Го- Затем фермент восстанавливается, но уже в релаксированном состоянии.

Практическое значение работы

Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и механизме функционирования АТФ-синтазы и могут оказаться полезными при изучении других Н+-транслоцирующих АТФаз. В частности, развиваемая в работе гипотеза эластичного сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта может способствовать прояснению многих аспектов работы других макромолекулярных систем. Кроме того, в работе было выдвинуто предположение о роли явления слипа, то есть несопряженного протонного транспорта через Н+-АТФазу, в регуляции мембранного потенциала. Подобный регуляторный механизм может оказаться принципиально важным для объяснения многих явлений на уровне органелл, клетки и организма в целом.

Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована на городском семинаре по биоэнергетике в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (Москва, 1998). Результаты также были представлены на II Международной Конференции по Г-АТФ-синтазам и АТФазам V типа (Оснабрюк, Германия, 1998), на X Европейской Биоэнергетической

конференции (Гётеборг, Швеция, 1998) и на XI Всемирном Конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, Венгрия, 1998).

Публикации

По материалам исследований было опубликовано 3 печатные работы.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована тремя таблицами и двадцатью четырьмя рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование Rhodobacter capsulatus

В настоящей работе использовался штамм В10 (дикий тип) Rhodobacter capsulatus, любезно предоставленный доктором А. Мулкиджаняном (Университет г. Оснабрюка, Германия).

Клетки выращивались фотогетеротрофно в анаэробных условиях. Среда культивирования содержала: 0.4% малат, 10 мМ КН2Р04, 0.1% [NH4]2S04, 0.2 г/л MgS04-7H20, 0.075 г/л СаС12-2Н20, 0.02 г/л ЭДТА, 0.012 г/л FeS04-7H20 (0.0059 г/л FeS04 безводн.), 1.59 мг/л MnS04, 2.8 мг/л Н3ВО3, 0.04 мг/л Cu(N03)2-8H20, 0.75 мг/л NaMo04-2H20, 0.1 мг/л биотипа, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л никотиновой кислоты; рН 6.8.

Получение хроматофоров

Осажденные клетки ресуспендировали в буфере, содержавшем 10% сахарозы, 2 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, 30 мМ HEPES, рН 7.4, и вновь осаждали центрифугированием (7000g, 35 мин, 4°С). Затем клетки ресуспендировали в буфере того же состава, содержавшем еще 0.5 мМ ДТТ и 100 мкМ АДФ, рН 7.4, и добавляли несколько крупинок ДНКазы. С этого момента все процедуры с суспензией выполнялись при 0°С (на льду) и в темноте. Суспензия пропускалась через Френч-пресс (11000-16000 psi), затем крупные клеточные обломки осаждались центрифугированием (30000g 30 мин, 4°С). Супернатант центрифугировался (140000g 120 мин, 4°С). Осажденные хроматофоры ресуспендировалпсь в буфере того же состава,

но без АДФ, и к суспензии добавлялся равный объем глицерина. Полученные хроматофоры хранились при -80°.

Измерение АТФазной активности и синтеза АТФ

АТФазная активность хроматофоров измерялась по методу Фиске-С'убарроу (Fiske et al, 1925).

Для регистрации синтеза АТФ в ответ на отдельные вспышки использовалась система люциферин-люцифераза. В среде присутствовали 100 мМ глицил глицин, 0.14 мМ люциферин, 3 мкг/мл люциферазы, 10 мМ MgCl2, 0.1% БСА, 2 мМ аскорбат натрия и 5 мкМ дМФ; pH 8.0. Свечение люциферазы регистрировалось 12-ти динодным фотоэлектронным умножителем, защищенным от возбуждающего света вспышки фильтрами BG39 и SP600 (Schott). Перед измерением в кювету добавлялись фосфат натрия и АДФ до желаемой концентрации.

Импульсная спектрофотометрия

Схема установки для импульсных спектрофотометрических измерений представлена на Рис. 2.

Источником монпторного света служила галогенная лампа мощностью 100 Вт. Требуемая в эксперименте длина волны мониторного света выставлялась с помощью интерференционного оптического фильтра, находящегося перед кюветным отделением. Как возбуждающий свет использовалась вспышка ксеноновой лампы FX 249 (EG&G Electro-Optics; 4 мкс), с оптическим фильтром Schott. Для регистрации изменений оптической плотности использовался фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) 9817GB (Thorn EMI, Великобритания), защищенный от возбуждающего света фильтрами BG39 и SP600 (Schott). Так как возбуждение пробы мониторным светом было нежелательно, перед кюветным отделением находилась шторка, открывавшаяся за 200-300 мс до вспышки возбуждающего света. Сигнал с умножителя поступал на дифференциальный усилитель и регистрировался осциллографом Nicolett Pro 10 (США), совмещеным с компьютером, осуществлявшим накопление и усреднение сигналов.

Изменения Аф на хроматофорах регистрировались по изменению поглощения каротиноидов (Junge et al, 1968; Jackson et al., 1969; Jackson et al.. 1971).

Изменения поглощения определялись при длине волны мониторного

Лампа

Кюветное отделение

Вспышка

Фильтр 780нм ФЭУ

Линзы

Шторка

Интерференционный фильтр

Усилитель'

Осциллограф Nicolett Pro 10

Рисунок 2: Схема импульсного спектрофотометра.

света 524 нм. Эксперименты проводились в кювете объемом 12 мл, оптический путь составлял 2 см. Во всех опытах в пробе присутствовали 50 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 2 мМ KCN для подавления терминальной ок-сидазы, 200 мМ K4Fe[CN]g как редокс-буфер, 5 мкМ дМФ как редокс-медиатор. Редокс-потенциал в пробе составлял около 250-280 мВ. Кроме того, обычно присутствовали 0.3% БСА и 5-10 мМ глпцил-глицин или MOPS, в зависимости от требуемого рН. Хроматофоры добавляли до конечной концентрации бактернохлорофилла 10 мкМ.

Для опытов по регистрации изменений рН использовались хроматофоры, отмытые от буфера с помощью ультрацентрпфугирования. Остаточная концентрация буфера в отмытых хроматофорах составляла менее 100 мкМ. Изменения рН внутри хроматофоров регистрировались с помощью проникающего красителя нейтрального красного (Mulkidjanian et al, 1994). Регистрация изменений рН снаружи проводилась с помощью красителя бромкрезолового фиолетового (Jackson&Crofts, 1969)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Протонный транспорт через Н+-АТФазу в отсутствие нуклеотидов (слип)

В ответ на вспышку возбуждающего света на мембране хроматофоров возникал Аф. Изменения Агр можно было регистрировать по сдвигу поглощения каротиноидов при А=524 нм. Кривая роста мембранного потенциала содержала две компоненты. Первая, быстрая компонента, отражала разделение зарядов в реакционных центрах, и имела характерное время менее 1 мкс, то есть лимитировалась постоянной времени регистрирующей аппаратуры. Вторая компонента имела характерное время ¿1 около 10 мс и отражала работу Ьсркомплекса.

Кинетика спада Д;/' также содержала две компоненты: быструю, с характерным ¿1=20-30 мс, и медленную, с характерным ¿х«180 мс. В присутствии ингибиторов Р0 (олигомицин, вентурицидин, ДЦКД) быстрая компонента практически исчезала (Рис. 3). Был сделан вывод, что быстрая компонента спада Аф обусловлена трасмембранным переносом зарядов через Го-сектор Н+-АТФазы.

Для изучения протонной транслокации через Н+-АТФазу необходимо было в явном виде вычленить из общего спада мембранного потенциала соответствующую компоненту. Для этого из кривой, полученной в присутствии вентурицидина, вычиталась исходная кривая (Рис. 4). Если рассматривать мембрану хроматофора как конденсатор, то напряжение на его пластинах есть Д{7 = где С — емкость конденсатора, Ад — перенесенный заряд. Предполагая емкость мембраны постоянной, можно утверждать, что величина падения разностп потенциалов прямо пропорциональна количеству зарядов, перенесенных через ГоРь Таким образом, кривая +/—вентурицидин на Рис. 4 отражает протонный транспорт через Н+-АТФазу.

В отсутствие АДФ и фосфата (условия слипа) после появления мембранного потенциала наблюдался транспорт протонов через Н+-АТФазу. Разложение кривой протонного транспорта на две экспоненты представлено на Рис. 4, Б.

Рисунок 3: Картина изменений Аф в ответ на вспышки света. Изменения Д ф регистрировались по сдвигу поглощения каротиноидов при А=524 нМ. А — общая картина. Б — разложение спада Аф на две экспоненты.

В условиях слипа можно было проследить захват протона изнутри хроматофора с помощью рН-пндикатора нейтрального красного, электрогенный перенос протона через мембрану по сдвигу поглощения каротиноидов, и выход протона в среду с помощью рН-индпкатора бром-крезолового фиолетового. Оказалось, что кинетики захвата протона, его трансмембранного переноса и выброса после первых двух вспышек практически совпадали.

В случае выброса протонов наружу можно было откалибровать величину ответа в нМ Н+ по стандартным добавкам кислоты или щелочи. С другой стороны, можно было расчитать количество перенесенных через Н+-АТФазу протонов из концентрации реакционных центров (РЦ) и концентрации фермента. Предполагая, что в ответ на вспышку каждый РЦ переносит через мембрану один электрон, можно было откалибро-

0.006-

< 0 004-

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0.10

Д +/- Вентурицидин

Время, с

0.15 0.20

Время, с

0 008

Рисунок 4: Протонный транспорт через Н+-АТФазу в отсутствие АДФ и фосфата. А — вычленение из спада Дф компоненты, обусловленной работой Н+-АТФазы. Б — разложение компоненты, обусловленной работой Н+-АТФазы после первой вспышки, на две экспоненты.

вать наблюдаемые изменения Аф но величине быстрой фазы генерации потенциала РЦ. Из полученной калибровки и отношения концентраций Н+-АТФазы и РЦ вычислялось количество зарядов, перенесенное через Н+-АТФазу. Оба метода дали близкие результаты; полученные кривые представлены на Рис. 5.

Приведенные результаты позволяют утверждать, что полученные кривые достоверно отражают транспорт протонов через Н+-АТФазу. Кроме того, близкие абсолютные значения амплитуд ответов-, расчита-ных по изменениям рН и Дф еще раз подтверждают линейность зависимости изменения поглощения каротиноидов от изменения Дф.

Рисунок 5: Калибровка протонного транспорта через Н+-АТФазу в отсутствие АДФ и фосфата.

Транспорт протонов через Рд

При выделении хроматофоров без ДТТ и без АДФ ("грубое" приготовление) некоторая часть Н+-АТФаз теряла Р[. Сходная картина наблюдалась при обработке хроматофоров ЭДТА. В таких хроматофорах при добавлении к ним очищенного ?! наблюдалось замедление спада Аф. Кривые изменений Атр на хроматофорах "грубого" приготовления представлены на Рис. 6, А.

При вычитании из кривой с ?! исходной кривой получалась кривая, отражающая транспорт протонов через Го. Характерное время для Го оказалось на порядок меньше, чем для интактного Ь «2.5 мс (Рис. 6, Б).

По абсолютной величине Р}-чувствительный протонный транспорт составлял около 10% от вентурицидин-чувствительного. То есть, 90% регистрируемого протонного транспорта шло через интактный РоРь и лишь 10% — через Ро, лишенный Рь Так как Ро-транспорт на порядок быстрее и насыщается уже через 10 мс после вспышки, остается предположить, что лишь 10% хроматофоров суспензии несет хотя бы один Ро, лишенный Рь Считая, что Ро, лишенные Рь распределены по хромато-

Рисунок 6: Кривые изменения Аф на хроматофорах "грубого" приготовления. Эффект Г[ и вентурпцидиыа. А — общая картина изменений А ф. Б — кинетика протонного транспорта через Го (после первой вспышки).

форам случайно, можно предположить, что вероятность присутствия в хроматофоре двух и более Го составляет 0.1x0.1=0.01. Это означает, что регистрируемая кинетика в первом приближении соответствует протонному транспорту через единичный Го, так как около 90% Го-содержащих хроматофоров несет только один Го-

Транспорт протонов через РоР1 в условиях синтеза АТФ

При добавлении к суспензии хроматофоров фосфата в концентрациях до 10 мМ не наблюдалось заметных изменений ГоГ|-кривой. При добавлении АДФ без фосфата в концентрациях до 2 мМ наблюдалось слабое замедление спада Дф. При добавлении фосфата на фоне АДФ или наоборот, АДФ на фоне фосфата, наблюдался больший спад Дф. Описанные эффекты приведены на Рис. 7.

О.ОЮл

< <

+ Вентурицидин о.оо«-

. +АДФ 'Контроль

< 0.004-

0.002-

0.008-

Х^^Крнтроль

+ Вентурицидин

0.002-

+АДФ + Р(

+Р+АДФ

0.000

0.000--

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

1. ,1. ,1

Время, с

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Время, с

Рисунок 7: Эффекты АДФ и фосфата на Дф. А — сначала добавлен АДФ до 1 мМ, затем фосфат (Р,- до 2 мМ); Б — обратная последовательность добавок.

Пятпдесятипроцентный эффект наблюдался при концентрациях фосфата около 35 мкМ (в присутствии 400 мкМ АДФ) и АДФ около 3 мкМ (в присутствии 2 мМ фосфата).

Кинетические характеристики ГоГркривых синтеза и слипа несколько различались. В обоих случаях в кривой обнаруживались 2 компоненты с характерными временами ¿1 около 5 и 25 мс. В условиях слипа вклад компонент был приблизительно одинаков, а в условиях синтеза вклад компоненты 25 мс составлял около 70%. Таким образом, увеличение протонного транспорта при синтезе происходило засчет увеличения вклада компоненты 25 мс, в то время как вклад компоненты 5 мс не менялся.

Обнаружилось, что пороговый уровень Дф для синтеза ниже, нежели для слипа. Если рассматривать кинетику спада Дф, то оказывается, что в условиях синтеза быстрая компонента спада (¿1=20-30 мс) исчезает при более низких значениях Дф, то есть пороговая разность электрических

0.0

0.002-1

чНЗентурицндин

;КЭфралептин «• <

Слип Синтез

Синтез: 2 мМ АДФ; г(=б шз (30%);

х=24 тя (70%)

о.ооо- ымщит!

/ /

/х;

I у Сли /

Слип: нет АДФ; // г, =6 пк (50%) г =21 т$ (50%

0.2 0.4

Время, с

0.6

0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 Время, с

ООО -

Рисунок 8: А — Влияния эфрапептина на протонный транспорт. Слип — нет АДФ, Синтез — 2 мМ АДФ, 2 мМ фосфата. Б — разложение на экспоненты кривой протонного транспорта через Н+-АТФазу после первой вспышки в условиях слипа и синтеза.

потенциалов, ниже которой Н+-АТФаза переставала пропускать протоны. была меньше в условиях синтеза (Рис. 7).

Эффект ингибиторов на протонный транспорт

Для изучения механизма сопряжения протонного транспорта и катализа Н+-АТФазой были исследованы эффекты различных ингибиторов р! (эфрапептин, ауровертин) на протонный транспорт. В отсутствие АДФ пли фосфата ингибиторы Р) не оказывали заметного влияния на протонный транспорт. Эффекты проявлялись только в условиях синтеза АТФ, то есть в присутствии и фосфата, и АДФ. В таких условиях ингибиторы р! уменьшали уровень протонного транспорта до уровня слипа — несопряженной протонной транслокации. Описанные эффекты представлены на Рис. 8, А.

Видимо, состояние Г[ лишь до некоторой степени влияет на протонный транспорт Н+-АТФазой. Это указывает на отсутствие жесткого сопряжения между катализом и протонным транспортом.

Синтез АТФ и расчет отношения Н+/АТФ

С помощью люциферин-люииферазной системы можно было регистрировать количество синтезированного хроматофорамп АТФ практически в тех же условиях, в каких проводились импульсно-спектро-фотометрическпе опыты.

Добавка разобщителя (валиномицин+К+ или ГССР) полностью блокировала наблюдаемый синтез. Вентурицидин, олигомпцин и эфрапе-птин также полностью ингпбировали синтез.

В отсутствие АДФ и/или фосфата синтез АТФ не наблюдался. При добавлении АДФ на фоне 2 мМ фосфата наблюдалось постепенное увеличение синтеза; эффект насыщался при 20-25 мкМ АДФ; [АДФ^уо «3 мкМ. Это значение хорошо совпадает со значением [АДФ] 1/2 эффекта АДФ на спад Аф (Рис. 9).

Уровень синтеза АТФ зависел от значения Аф. Из данных, представленных на Рис. 3 видно, что после каждой следующей вспышки вплоть до третьей Аф выше, чем после предыдущей. После третьей вспышкп этот эффект насыщается. Давая единичную вспышку и серии из двух, трех и более вспышек, можно было расчптать количество АТФ, синтезированного на определенную по счету вспышку. После первой вспышки синтезировалось относптельно немного АТФ; после второй и третьей вспышки это количество увеличивалось. После четвертой и последующих вспышек роста синтеза не наблюдалось.

Большой интерес представляло расчптать из полученных данных отношение Н+/АТФ при синтезе. Для расчета было сделано допущение, что весь хинол, образованный РЦ в ответ на вспышку, окисляется Ьс\-комплексом. Соответственно, при этом внутрь хроматофора переносится количество протонов, равное количеству сработавших РЦ. Необходимость в подобном допущении возникает по двум причинам. Во-первых, если Н+-АТФаза заингибирована, ¿^-комплекс запирается потенциалом, и при вычитании из кривой с вентурицидином контрольной кривой большая доля перенесенных протонов остается неучтенной. Во-вторых, нельзя отрицать возможность динамического равновесия между закачкой

Н+ ¿»^-комплексом и выходом Н+ через Н+-АТФазу: если одновременно происходит транспорт 1 Н+ внутрь хроматофора и выход 1 Н+ наружу, это не влияет на Аф и поэтому не регистрируется.

Калибровка изменений Аф, как и в случае слипа, делалась по быстрой компоненте генерации потенциала реакционными центрами. Результаты расчетов, сделанных с указанной поправкой, сведены в таблицу 1.

Полученные данные можно объяснить по-разному: переменной стехиометрией Н+/АТФ фермента, активацией — переходом Н+-АТФазы в рабочее состояние за счет энергии переноса нескольких протонов, или несопряженным переносом части протонов. Мы объясняем эти результаты

А Б

Время, с Концентрация АДФ, мкМ

Рисунок 9: А — синтез АТФ, регистрируемый люциферин-люциферазной системой. Концентрация Н+-АТФазы составляла 58 нМ. Стрелкой обозначен момент первой вспышки. Интервал между вспышками составлял 100 мс. Б — зависимость синтеза АТФ и увеличения спада Аф от концентрации АДФ. Синтез АТФ и изменения Аф регистрировались после трех вспышек.

Таблица 1: Расчет отношения Н+/АТФ. Все значения приведены в расчете на 1 молекулу Н+-АТФазы.

Номер Кол-во синтези- Кол-во пере- Отношение

вспышки рованного АТФ несенных Н+ Н+/АТФ

1 0.48 6.9 14.3

2 1.50 8.0 5.4

3 1.72 7.8 4.5

и ряд других данных в рамках предлагаемой ниже модели функционирования Н+-АТФазы.

Эластичная модель Н+-АТФазы

За структурную основу была взята модель Юнге (Junge et al., 1997; Рис. 1 на стр. 2). Предполагалось, что с^-олигомер представляет собой кольцо, вращающееся относительно субъединпц а и 6; при синтезе АТФ протоны захватываются через полуканал с положительно заряженной стороны мембраны (П-стороны), а освобождаются с отрицательно заряженной (О-стороны).

На основании полученных данных об отношении Н+/АТФ, а также ряда литературных данных (vanWalraven et al., 1996; Pitard et al., 1996), предполагалось, что синтез одной молекулы АТФ сопряжен с переносом четырех протонов. При этом перенос одного протона сопряжен с поворотом с12-олигомера на 30°, а один полный каталитический акт — с поворотом на 120°.

В основу модели положен принцип накопления ферментом энергии в форме эластичного напряжения. Сама структура фермента — длинная 7-субъединица, образующая внутри Fi стержень из двух антипараллель-но закрученных а-спиралей, наводит на мысль о возможности функционирования такой системы как торсионной пружины. Было предположено, что в условиях синтеза АТФ при переносе очередного протона "пружина" 7-субъединицы закручивается все сильнее, и следующий протон должен идти против возрастающей нагрузки. При переносе четвертого протона накопленная энергия достигает некоего порогового значения,

7-субъединица совершает перемещение внутри Г], что вызывает изменение афпнности каталитических сайтов и освобождение синтезированного АТФ. При этом фермент возвращается в исходное, релаксированное состояние.

В классической механике энергия АГ, накапливаемая при вращательной деформации эластичного стержня, есть

ДГ = **Е "

81(1 +<т) '

где R — радиус стержня, L — его длина, Е — модуль эластичности Юнга, а — коэффициент Пуассона, в — угол вращательной деформации стержня. Радиус и длина для 7-субъединицы по данным рентгеноструктурного анализа (Abrahams et al., 1994) составляют 0.8 и 6 нм, соответственно. Коэффициент Пуассона составляет около 0.4 для большинства известных эластичных материалов. Модуль Юнга для а-сппралей неизвестен, но в первом приближении можно воспользоваться значением, полученным для актиновых филаментов, 1.8х109 Н-м-2 (Tsuda et al, 1996). Из приведенных значений можно расчитать энергию, запасаемую 7-субъединццей при закручивании ее на определенный угол. Оказалось, что поворот 7-субъединицы на 30° приводит к накоплению AF\=b кДж/М. При дальнейшей деформации запасаемая энергия растет линейно: каждые следующие 30°дают Д.?2=10 кДж/М, ДГз=15 кДж/М и Д/4=20кДж/М, соответственно. Получается, что для поворота 7-субъединицы па 120°, что происходит при единичном каталитическом акте F;, нужно 5+10+15+20=50 кДж/М — вполне достаточная для синтеза АТФ велпчпна. Таким образом, с термодинамической точки зрения нет причин, делающих такой механизм невозможным.

В рамках предлагаемой модели хорошо объясняется полученное переменное отношение Н+/АТФ и его уменьшение при увеличении Аф. Эластичная модель предполагает несопряженный перенос всех протонов, кроме последнего. Более того, так как последний протон переносится против максимальной "нагрузки", именно эта последняя стадия будет определять пороговое значение потенциала для синтеза. В результате, если значение ДДН+ окажется ниже этого порогового значения (ситуация после первой вспышки), в ответ на вспышку будет наблюдаться транспорт первых протонов, но не будет синтеза АТФ. Затем, когда Д/1Н+ упадет, эти протоны могут быть перенесены обратно за счет энергии, запасенной в

виде неполной эластичной деформации фермента. Таким образом, при постоянной стехиометрии 4 Н+/АТФ регистрируемое отношение Н+/АТФ получается разное.

Иной механизм должен иметь протонный транспорт при высоких значениях ДД;{+ в отсутствие субстратов фосфорилированпя (слип). Эксперименты показали, что в условиях слипа пороговое значение потенциала для протонного транспорта через Н+-АТФазу выше, чем в условиях синтеза. Из эластичной модели следует, что при блокированном Fj пороговый потенциал будет возрастать только для транспорта последнего протона. Действительно, сравнение кинетических характеристик протонного транспорта (Рис. 8, Б) показало, что при переходе от слипа к синтезу возрастает именно вклад медленной (25 мс) компоненты, предположительно соответствующей "последним" протонам.

При прохождении последнего протона при слипе, как и при синтезе, Н+-АТФаза должна возвращаться в исходное положение. При этом может происходить поворот 7-субъеднницы, как при нормальном каталитическом акте. Альтернативным объяснением может быть разрыв части контактов субъединиц Fi и Fo и восстановление этих контактов уже в релаксированном исходном состоянии. Последний вариант кажется более вероятным, так как между Fi и Fo нет ковалентных связей и энергия взаимодействия вряд ли значительно превышает 50 кДж/М. Кроме того, экспериментально показано, что в отсутсвии нуклеотидов энергнзацпя мембраны приводит к облегчению диссоциации Fi (Fiedler et al., 1994), что также говорит в пользу второго варианта.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одним из фундаментальных вопросов в понимании механизма работы Н+-АТФазы является: как запасается энергия нескольких последовательно транспортируемых протонов для акта синтеза? Привлекательной является гипотеза накопления этой энергии в виде структурного напряжения фермента. В классической механике энергия эластичного напряжения растет при увеличении степени деформации. Приложение принципов механики к работе макромолекулы вполне может оказаться неправомочным. Тем не менее, в настоящей работе предлагается модель работы фермента, построенная на принципе эластичной деформации.

Грубый расчет с использованием модуля эластичности Юнга для ак-тпновых филаментов вместо неизвестного модуля Н+-АТФазы показал, что с термодинамической точки зрения такой механизм возможен. Кроме того, ряд полученных в настоящей работе данных о протонном транспорте через Н+-АТФазу хорошо согласуется с предлагаемой моделью. В рамках модели объясняются переменное отношение Н+/АТФ п явление слипа.

Явление протонного слипа, ранее описанное только для хлоропласт-ной Н+-АТФазы, до настоящего времени не привлекало пристального внимания исследователей. В ряде работ наблюдаемый на хроматофорах феномен слипа был объяснен не как несопряженный протонный транспорт через Н+-АТФазу, но как транспорт через фракцию "поврежденных" ферментов (Jackson 1975, Jackson 1979). В настоящей работе четко показано, что это объяснение неверно. Слип не является утечкой протонов через Fo-сектор Н+-АТФазы, потерявшей Fi. Это очевидно из сравнения кинетик протонного транспорта для обоих случаев и из факта наличия порогового потенциала для слипа.

Большой интерес представляет выяснение роли явления слипа в физиологических условиях работы Н+-АТФазы. Одним из важных следствий феномена слипа является "мягкое разобщающее действие" Н+-АТФазы. Возможно, что при низких концентрациях АДФ и высоком A/iH+ фермент начинает пропускать протоны и тем самым понижать выступая как регулятор мембранного потенциала.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы три различных режима протонного транспорта через Н+-АТФ-синтазу Rhodobacter capsulatus: утечка через Fo, транспорт, сопряженный с синтезом АТФ и несопряженный транспорт (слип). Для всех трех режимов измерены характерные полувремена.

2. Расчитано отношение Н+/АТФ при различных значениях ДДн+.

3. Разработана модель функционирования фермента, согласующаяся с полученными экспериментальными данными и данными литературы.

Список печатных работ

1. Feniouk, B.A., Bloch, D.A., Junge, W., and Mulkidjanian, A. Tracking of partial protonic reactions in the ATP-synthase of Rhodobacter capsulatus pulsed by flashes of light. Proceedings of the 2nd International Workshop on ATP Synthase and V-ATPase (Osnabrück): FI-4, 1998.

2. Feniouk, B.A., Junge, W., and Mulkidjanian, A. Tracking of proton flow across the active ATP-synthase of Rhodobacter capsulatus in response to a series of light flashes. EBEC Reports, Volume 10, p.112, 1998.

3. Feniouk, B.A., Junge, W., and Mulkidjanian, A. Tracking of proton flow across the active ATP-synthase of Rhodobacter capsulatus in response to a series of light flashes. Book of Abstracts of the XI International Congress on Photosynthesis, p. 88, 1998.

4. Feniouk, B.A., Junge, W. Mulkidjanian, A.Y. 1998. ATP-synthase of Rhodobacter capsulatus: proton flow and ATP synthesis in response to light flashes. Photosynthesis: Mechanisms and Effects (G.Garab, ed.), Klüver Academic Publishers, Dordrecht, in press.

Д/2Н+

Д ф дМФ

ДЦКД -АТФ АДФ Р;

БСА ДТТ

ЭДТА -РЦ

HEPES -MOPS -

Список используемых сокращений трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода

трансмембранная разность электрических потенциалов

1,1'-диметилферроцен

М,№-д1щиклогексилкарбодинмид

аденозинтрпфосфат

аденозиндпфосфат