Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распространение и функциональная активность сульфатредуцирующих бактерий в гидротермах Западного Забайкалья

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Распространение и функциональная активность сульфатредуцирующих бактерий в гидротермах Западного Забайкалья"

005014633

ТУДУПОВ Аламжи Владимирович

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ГИДРОТЕРМАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03- микробиология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ . диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5'1 13 2012

Улан-Удэ-2012

005014633

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (ФГБУН ИОЭБ СО РАН)

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Бархутова Дарима Дондоковна

кандидат биологических наук

Намсараев Баир Бадмабазарович

доктор биологических наук, профессор

Данчинова Галина Анатольевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗС РЧ СО РАМН

Ведущая организация:

Дмитриева Ольга Михайловна

кандидат биологических наук, старший преподаватель ФГБОУ ВПО БГУ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт природных ресурсов, экологии и криологии СО РАН

Защита диссертации состоится «26» марта 2012 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а, биолого-географический факультет, конференц-зал.

Факс: (3012)210588

E-mail: d21202203(5>mail.ru talamzhi(a),yandex, ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государственного университета.

Автореферат разослан «_» февраля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, _

кандидат биологических наук ' Шорноева Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактериальное восстановление сульфатов является одним из значимых биогеохимических процессов, играющим существенную роль на терминальных этапах анаэробной деструкции органического вещества (OB). Бактерии и археи, восстанавливающие сульфат, широко распространены в природе, в том числе и в гидротермах (Burggaf S. et.al., 1990; Hugenholtz et.al., 1998; Pikuta et.al., 2000; Friedrich, 2002; Fishbain et.al., 2003; Соколова, 2010; Герасимчук и др., 2010). Их способность использовать сульфат как акцептор электрона для получения энергии в процессе анаэробного роста является ключевым звеном в глобальном биогеохимическом цикле серы и углерода (Иванов, 1983; Заварзин, 2003; Бонч-Осмоловская, 2011).

В Забайкалье насчитывается большое количество горячих минеральных источников с различными физическими, химическими и газовыми свойствами (Борисенко, Замана, 1978). Многие источники характеризуются как слабоминерализованные горячие воды с температурой от 41 до 90°С и pH от 7,5 до 10. Щелочные азотные термальные воды являются наиболее известными среди них.

Ранее приведенные исследования структуры микробного сообщества и интенсивности биогеохимических процессов в гидротермах Забайкалья показали, что сульфатредукция является одним из доминирующих процессов на терминальных этапах деструкции OB (Намсараев и др., 2006). Поэтому представляется важным поиск и идентификация сульфатредуци-рующих бактерий (СРБ), обитающих в щелочных гидротермах, изучение их функциональной активности в микробном сообществе.

Микробные сообщества щелочных гидротерм относятся к наиболее древним биоценозам Земли. Их изучение играет важную роль в формировании представлений об эволюции биосферы (Kelley et.al., 2001; Marteins-son et.al., 2001; Lowe, Tice, 2004). Исследование распространения и активности СРБ при высоких значениях температуры и щелочных значений pH актуально для расширения знаний о многообразии микробного мира и понимания их роли в круговороте веществ и энергии в экстремальных местообитаниях.

Цель исследования - изучение распространения, разнообразия и активности сульфатредуцирующих бактерий в донных отложениях и микробных матах гидротерм Западного Забайкалья.

В задачи исследования входило:

1. Изучить физико-химические условия щелочных гидротерм как среды обитания СРБ.

2. Определить численность СРБ в донных отложениях и микробных матах гидротерм.

3. Определить интенсивность сульфатредукции в донных отложениях и микробных матах гидротерм.

4. Получить активные накопительные культуры СРВ из донных отложений и микробных матов гидротерм и изучить их экофизиологические характеристики.

5. Определить филогенетическое разнообразие сульфатредуцирующих бактерий в микробном сообществе гидротермы Алла.

6. Выявить геохимическую роль сульфатредукторов в микробных сообществах гидротерм.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые исследовано разнообразие и численность термофильных СРБ в гидротермах Забайкалья с помощью микробиологических методов и методов, основанных на анализе последовательностей 16Б рРНК.

Процесс сульфатредукции с наибольшей скоростью протекал в микробных матах. Установлено, что в гидротермах Забайкалья развиваются как термофильные, так и мезофильные СРБ. Это говорит о том, что экологические условия, созданные в термальных источниках, не препятствуют развитию разных температурных групп бактерий.

Впервые исследовано разнообразие прокариот в высокотемпературном микробном мате гидротермы Алла (Забайкалье) с помощью метода пиро-секвенирования. Разнообразие сульфатредуцирующих бактерий представлено культивируемыми и некультивируемыми бактериями рода ТИегтос1е-зЫ^'гЪг'ю.

Из гидротерм Забайкалья получены и описаны активные накопительные культуры мезофильных и термофильных алкапофильных сульфатредуцирующих бактерий, способных к окислению лактата и ацетата. Количественные данные о численности и активности СРБ дают возможность оценить их значение в процессах анаэробного распада ОВ и синтеза сероводорода.

Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о разнообразии алкалотермофильных сульфатредукторов в природе и могут быть использованы в биотехнологии, бальнеологических исследованиях. Выделенные накопительные культуры СРБ представляют интерес для биотехнологии как продуценты термо- и алкало-устойчивых ферментов. Сульфатредуцирующие бактерии играют важную роль в формировании лечебного фактора иловых вод, в связи с чем изучение процесса сульфатредукции в гидротермах имеет значение для оценки бальнеологического потенциала источников.

Полученный экспериментальный материал может быть использован при чтении курса лекций по предметам «Микробиология», «Экология».

Апробация работы. Результаты исследований были доложены автором на Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии», Улан-Удэ, 2006; Всероссийской конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий», Абакан, 2008; V международной конференции по криопедологии «Разнообразие мерзлотных и сезонно-промерзающих почв и их роль в экосистемах», Улан-Удэ, 2009; Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2008; Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улайн-Баатар, 2011); Российской конференции «Эволюция биогеохимических систем (факторы, процессы, закономерности) и проблемы природопользования», Чита, 2011.

Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликованы 14 работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на ¿^страницах, включая таблиц и ^Урисунков. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть» (включающая главы «Объекты и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение»), «Выводы», «Список литературы», «Приложение».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования служили термальные азотные источники Западного Забайкалья, в которых в рамках комплексных микробиологических исследований в 2007-2010 гг. производился ежегодный отбор проб: Алла, Баунтовский, Гарга, Горячинск, Гусиха, Кучигер, Сею я, Уро, Сухая, Умхей.

Методы исследования. В полевых условиях определение физико-химических параметров воды в местах отбора проб проводили с помощью портативных приборов. Кислотность среды (pH) измеряли рН-метром рНер2 (Португалия), значения общей минерализации - тестер-кондуктометром TDS-4 (Сингапур), окислительно-восстановительный потенциал (Eh) - измерителем редокс-потенциала ORP (Португалия). Температуру воды и осадков определяли ртутным или сенсорным электротермометром Prima (Португалия). Концентрацию карбонат- и гидрокарбонат-ионов определяли титриметрическим методом (Резников и др., 1970).

В лабораторных условиях определяли: сульфаты - турбидиметрически с BaS04, хлориды - аргентометрическим методом Мора (Аринушкина, 1970), сульфиды - фотометрически с Ы'Ы"-диметил-пара-фенилендиамн-ном (ДМП) (Trüper, Schlegel, 1989). Концентрации ионов Na+ и К+ определены с помощью атомно-абсорбционного спектрометра SOLAAR Мб (США), Са2+ был определен комплексонометрическим методом с Трило-ном Б в присутствии мурексида, Mg2+ - по разнице между результатами

титрования суммы Са2+ и Mg2+ в присутствии эриохрома и результатов определения Са2+ (Резников и др., 1970).

Органический углерод в осадках анализировали методом мокрого сжигания по Тюрину (Аринушкина, 1961). Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL-СЕ1021 (Великобритания). Содержание белка определяли по методу JIo-ури с использованием реактива Фолина (Практикум по микробиологии, 2005).

Учет численности жизнеспособных клеток микроорганизмов проводили методом предельных разведений на элективной среде следующего состава (г/л): КН2Р04 - 0,2; MgCl2"6H20- 0,1; NH4CI - 0,5; KCl - 0,2; Na2SO4xl0H2O - 3,0; натриевые соли молочной или уксусной кислот- 2,0; Na2S><9H20 - 0,05; дрожжевой экстракт - 0,1; раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1 мл/л (Пушева и др., 1999). В качестве индикатора процесса добавляли 1/3 металлической скрепки или 0,01% раствор FeS04 в 1% HCl.

Среду перед посевом кипятили и продували азотом для удаления растворенного кислорода.

Культивирование сульфатредукторов проводили во флаконах, наполненных средой доверху, и закрытых резиновыми пробками. Численность сульфатредукторов оценивали через 14 суток. О росте бактерий судили по почернению скрепки и образованию осадка сульфида железа. Посевы выполняли в 3-х повторностях. Культивирование осуществляли в термостате при 30°С и 55°С. Параллельно ставили химический контроль.

Температурную зависимость роста изучали в области от 10 до 90°С. При исследовании pH-зависимости в диапазоне pH 8,0-8,5 использовали раствор по Кларку-Лабсу, для pH 7,0 - фосфатный буфер, а для приготовления высокощелочных сред (pH 9,0-11,0) применяли карбонатные буферные растворы (Справочник по биохимии, 1996).

При определении возможных доноров электронов их вносили в конечной концентрации 0,12%. Способность к автотрофному росту наблюдали с молекулярным водородом (100% газовой фазы).

Рост бактерий фиксировали по изменению оптической плотности среды при длине волны 560 нм на спектрофотометре CECIL-CE1021 (Великобритания) и по образованию конечного продукта реакции - сульфида.

Морфологию клеток бактерий изучали с использованием светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) с фазово-контрастным устройством и цифровой фотокамерой с увеличением 1300 раз.

Для изучения отложения минералов микробные маты упаковывались с сохранением структуры, а в лабораторных условиях разделялись на слои и сушились. Изучение качественного состава минеральных фаз проводилось при помощи сканирующего электронного микроскопа Leo Oxford 1430VP (Германия) и светового микроскопа Axioskop 2 Plus (Германия). Видовую

принадлежность цианобактерий определяли по отечественным определителям (Еленкин, 1949; Голлербах и др., 1953).

Для определения световой и темновой продукции использовали NaHI4C03 (Иванов, 1956; Кузнецов, Романенко, 1963). В пробы вносили радиометку с активностью 25 мкК. Пробы фиксировали 10N раствором NaOH. Диурон (3-(3,4-дихлорофенил)-1,1-Диметилмочевина) в конечной концентрации 7 цМ применяли для ингибирования оксигенного фотосинтеза. В ряде экспериментов проводилось стимулирование продукционных процессов цитратом железа в конечной концентрации 0,5 г/л железа. Пробы обрабатывали на установке УЗДН-2 с частотой 22 МГц и мощностью 0,4 мА в течение 2 минут. Фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтры промывали тремя объемами воды с рН 2-3, высушивали и измеряли радиоактивность.

При определении интенсивности сульфатредукции использовали метод Иванова (1956). Для этого в пробу вносили 0,1-0,2 мл Na235S04 с активностью 0,1-1 мкК и инкубировали в течение 0,4-2 суток. Фиксацию пробы производили путем введения 10-25% раствора ацетата Cd. Радиоактивность определяли на жидкостном сцинтнлляционном счетчике Rackbetta (Швеция).

Измерение содержания стабильных изотопов углерода )2С и ПС в виде газообразной формы С02 проводили на масс-спектрометре МИ-1201 (СССР). Результаты приведены в виде величин 513С в промилле по отношению к общепринятым стандартам PDB (Зякун, 2010). Работа выполнена к.б.н Дамбаевым В.Б. в ИБФМ, г. Пущино.

Пиросеквенирование проведено в ChunLab, Inc. (Сеул, Южная Корея) на секвенаторе Roche 454 GS-FLX Titanium. Оценку таксономического разнообразия микробного сообщества анализировали с помощью пакета программ CLcommunity (ver. 2.58).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода главных компонент (Gelady, 1989; Gorban, Zinovyev, 2010), с использованием пакета программ MathLab 2010а и Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Экологическая характеристика исследованных гидротерм

Физико-химическая характеристика гидротерм

Максимальное значение температуры воды (79°С) зафиксировано в источнике Алла (табл. 1). Наиболее горячими на выходе были воды гидротерм Гарга (74°С) Гусиха (71,5°С), Уро (69,1°С). Температура воды источников Горячинск, Баунтовский и Сеюя была приблизительно одинаковой и составила от 53°С до 55°С. Максимальная температура воды источника

Горячинск (53,5°С) зафиксирована зимой. В летнее время температура воды снижается до 44° С.

По содержанию сероводорода исследуемые гидротермы подразделяются на сульфидные и бессульфидные, в которых концентрация Н28 варьировала в пределах от 0 до 31,0 мг/дм3.

Таблица 1

Физико-химическая характеристика гидротерм Забайкалья_

Источник Тип воды Т,°С (на изливе) рН Eh, мВ М, г/дм1 H2S, мг/дм3

Алла сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 79,0 9,9 -150 0,30 16,5

Баунтовс-кий гидрокарбонатно-сульфатиый натриевый 53,0 8,4 -56 0,20 7,8

Гарга сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 74,0 8,2 +230 0,30 <0,1

Горячинск сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 53,0 9,0 -23 0,53 5,9

Гусиха сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 72,0 8,2 +340 0,93 <0,1

Сеюя сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 49,0 9,7 -94 0,29 1,8

Уро гидрокарбонатно-сульфатный натриевый 69,1 9,0 -33 0,50 <0,1

Кучигер сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 41,0 9,8 -43 0,30 25,6

Умхей сульфатно-гидрокарбонатный натриевый 51,0 9,0 -340 0,42 31,0

Сухая гидрокарбонатный натриевый 49,0 9,1 -10 0,63 27,2

Eh - окислительно-восстановительный потенциал; М - минерализация.

Изучение минерального состава вод гидротерм показало преобладание щелочных металлов. Содержание ионов магния колеблется от 0,25 до 15,25 мг/дм3. Содержание ионов кальция в водах источников варьирует в пределах 0,37-32,06 мг/дм3. Максимальное содержание кальция отмечено в термальном источнике Алла, наименьшее количество этого катиона определено в гидротерме Сеюя. В воде большинства гидротерм сульфатные ионы преобладают над другими анионами. Их концентрация в воде находилась в пределах 64-480 мг/дм3.

В целях визуализации мест отбора проб проведен анализ методом главных компонент (Gelady, 1989; Gorban, Zinovyev, 2010). Были использованы такие параметры, как температура, рН, окислительно-восстановительный потенциал, содержание сульфатов, гидрокарбонатов и сульфидных ионов. В результате анализа были получены кластеры образцов со сходными физико-химическими условиями (рис. 1).

В первой главной компоненте (РС1), которая объясняет 77% наблюдаемых изменений в среде образцов, входят содержание сульфатов и сульфидов, а также значения окислительно-восстановительного потенциала. Влияние других факторов на РС1 незначительно. На вторую главную

компоненту (РС2) основное влияние оказывают такие параметры, как рН и содержание гидрокарбонатов. Основной вклад в третью компоненту вно-

Количественный и качественный состав органического вещества По содержанию органического углерода (Сорг) циано-бактериальные маты исследованных термальных источников различались (табл. 2). Максимальное количество Сорг определено в матах гидротермы Гусиха (30,34%), минимальное - в мате источника Гарга (10,04%).

Высокое содержание белка среди исследованных гидротерм было определено в составе матов гидротерм Сеюя (15,79%) и Уро (14,60%)., Наименьшее содержание белка отмечено в микробных матах источника Гусиха (4,03%).

Таблица 2

Содержание органического углерода, белка и зольных элементов _в термальных источниках (в % от сухого веса) _

Источник Сорг Зольность Белок

Гусиха 16,38-30,34 30,3475-10 4,03-9,05

Уро 16,35-25,58 42,04-68,73 7,48-14,60

Гарга 10,04-30,30 60,08-67,12 4,23-11,12

Сеюя 15,37-25,15 51,02-64,31 9,00-9,58

Алла 16,10 64,22 6,72

Максимальное количество зольных элементов обнаружено в матах, развивающихся в ручьях гидротерм Гусиха (75,10%) и Уро (68,73%). Наименьшее количество зольных элементов отмечено в матах, развивающихся у излива источника Гусиха (30,34%).

Исследованные донные осадки характеризовались высоким содержанием золы (81,45-99,98%), что свидетельствует о накоплении неорганических соединений.

Сравнительный анализ содержания Сорг микробных матов и донных осадков термальных источников показал, что содержание ОВ выше в микробных матах, что может быть объяснено высокой интенсивностью продукционных процессов в матах в отличие от донных осадков (Горленко и др., 1987; Jorgensen, Nelson, 1988; Navarrete et al., 2000; Намсараев и др., 2000).

Микробные маты как продуценты органического вещества Ведущая роль в формировании микробных сообществ гидротерм принадлежит оксигенным и аноксигенным фототрофным микроорганизмам, среди которых доминируют цианобактерии. В гидротермах формировались микробные маты при значениях температуры от 24 до 65°С и рН от 8,2 до 9,0. Каждому температурному интервалу соответствовал определенный тип сообщества. Матообразующими организмами в циано-бактериальных матах являются нитчатые цианобактерии рода РИогт^Нит. Анаэробные фототрофы располагаются под цианобактериями, трофически связанные с сульфатредуцирующими бактериями и приспособленные к использованию водорода и сероводорода. В аноксигенных матах доминировали зеленые бактерии рода СМогфехиз, в серных матах -ТЪШЬга.

Интенсивность бактериальной продукции органического вещества Скорости микробных процессов продукции органического вещества в высокотемпературных выходах гидротерм Западного Забайкалья были определены радиоизотопным методом. Результаты экспериментов с использованием 14С-бикарбоната показали, что скорость продукции органического вещества в микробных матах за счет фотосинтеза варьирует от 0,6 до 98 мгС/(дм3-сут), при этом вклад аноксигенных фототрофов может достигать 100% от общего фотосинтеза. Интегральный показатель активности микробного сообщества, определяемый скоростью темновой фиксацией С02, достигает 51,67 мгС/(дм3-сут) (табл. 3).

Таблица 3

Источник Температура, °С Фотосинтез Хемосинтез Темповая фиксация

д. ос м.м. д. ос м.м. д.ос м.м.

Алла 70 8,81 45,74 5,04 6,61 5,58 10,51

Уро 56 7,07 32,01 3,81 17,13 6,00 24,10

Гарга 50-74 8,73 98,58 5,04 5,90 6,03 51,67

Интенсивность сульфатредукцин в гидротермах

Процесс бактериальной сульфатредукция является доминирующим процессом в терминальной деструкции ОВ щелочных гидротермах. Через сульфатредукцию в сутки может минерализоваться до 30-61% органического вещества.

Радиоизотопным методом были изучены скорости сульфатредукции в гидротермах при температуре 55-74°С (табл. 4). В микробных матах и донных осадках образование сероводорода протекает со скоростью 0,01415,340 и 0,009-0,052 мг8/(дм3-сут) соответственно/Процессы восстановления сульфата осуществляются, по-видимому, за счет доноров электронов (Н2, органическое вещество), поступающих с водой и синтезируемое в процессе бактериальной продукции.

Таблица 4

Источник Тип пробы Температура, °С Скорость, MrS/CaM1 сут) Расход углерода, мгС/( дм3 сут)

Уро Д.ОС. 55 0,05 0,039

Уро м.м. 67 1,33 0,099

Уро д.ос. 67 0,02 0,016

Гарга Д.ОС. 74 4,18 3,135

Гарга м.м. 57 15,34 11,505

Алла д.ос. 74 0,01 0,009

Алла м.м. 65 0,01 0,010

Распространение сульфатредукторов в гидротермах

В осадках исследуемых источников численность СРБ достигала максимальных значений (10б-108 кл/см3 ила) при использовании лактата в качестве единственного источника углерода и донора электронов и инкубации проб при температуре 30°С и 55°С. Высокие численности СРБ, растущих как на лактате, так и на ацетате (107 и 108 кл/см3), выявлены в донных осадках гидротерм Кучигер и Горячинск соответственно. Численность СРБ в осадках из Гарги, Сеюи, Гусихи и Аллы не превышала 106 кл/см3.

Численность мезофильных СРБ в источнике Баунтовский, растущих на лактате, достигала 107 кл/см3, тогда как на ацетате - лишь 105 кл/см3. В то же время численность СРБ, растущих при 55°С, достигала 10 кл/см , при использовании в качестве источника углерода как лактата, так и ацетата.

Было изучено вертикальное распределение СРБ в донных осадках гидротерм Сухая, Горячинск и Умхей. Максимальная численность (10-10е кл/см3) выявлены в подповерхностных слоях (3-8 см).

Характеристика накопительных, культур СРБ

Из микробных матов гидротерм Гусиха, Горячинск и Сеюя выделены 3 накопительные культуры СРБ, а из донных осадков гидротерм Уро, Гарга, Горячинск и Умхей получены 13 накопительных культур СРБ.

Накопительные культуры СРБ были получены с использованием лакта-та в качестве единственного источника углерода. Конечная концентрация субстрата в среде составляла 0,4%. Шесть из шестнадцати накопительных культур были получены при температуре 30°С, рН 9,0-9,5. Остальные десять накопительных культур СРБ получены при тех же условиях, однако инкубацию проводили при 55°С. Все накопительные культуры получены после 4-6 пересевов.

Полученные накопительные культуры СРБ представлены тонкими неподвижными палочками разной длины, тонкими слегка изогнутыми палочками и подвижными вибрионами. Клетки одиночные, реже встречаются сцепленные в цепочки (рис. 2). Все накопительные культуры морфологически однотипны.

а) б)

Рисунок 2. Накопительные культуры Оа-1 (а), $е-08-1 -2 (б) I 1

Накопительные культуры СРБ, представленные вибрионами, выделены из гидротерм Уро, Горячинск и Гарга. В основном все СРБ, представленные вибрионами, являются мезофилами, за исключением накопительных культур Оа-1, Уро-10-ручей, Уро-10-2, у которых максимальный прирост биомассы наблюдался при температуре выше 53°С.

СРБ, представленные палочковидными формами, встречаются в гидротермах Горячинск, Гарга, Гусиха, Сеюя. Среди них выявлены как мезофи-лы (Горячинск), так и термофилы (Гусиха).

Температурные интервалы развития мезофильных накопительных культур СРБ (инкубация при 30°С), составляют 27-55°С, максимальный прирост биомассы зафиксирован при температуре 36°С. Для накопительной культуры Гор-10-1 максимальный прирост биомассы наблюдался при температуре 45°С. Рост выше 55°С не наблюдался.

Наибольший прирост биомассы накопительных культур Уро-10-ручей и Га-1 зафиксирован при температуре 62°С, для накопительной культуры Уро-10-2 - 53°С. Для накопительных культур Бе-08-1-2 и 8е-08-2 максимальный прирост биомассы клеток наблюдался при двух значениях температуры - 52°С и 65°С. Температурные интервалы, при которых развивались накопительные культуры СРБ, составляет 40-70°С (рис. 3).

Уро-10-ручей —*—Уро-10-2 ---56-08-1-2 — Эе-08-2

Рисунок 3. Зависимость роста термофильных накопительных

культур СРВ от температуры

Все полученные накопительные культуры СРБ являются облигатными алкалофи-лами, окисляющими источник углерода в пределах рН от 8,0 до 10,0 с оптимумом рН 9,1 (рис. 4).

Культуры сульфатредукторов активно используют в качестве источника углерода и донора электронов пируват, сукцинат, цистеин, а также ацетат. Некоторые СРБ для роста также используют сахара. Метанол, глюкозу,

рамнозу используют лишь немногие накопительные культуры (табл. 5). Накопительные культуры СРБ проявили способность к автотрофному росту.

Рисунок 4. Зависимость роста термофильные накопительных культур СРБ от рН

-»-Уро-10-2 -*-Уро-10-ручей —Гор-10-1 — Га-10-3

В качестве акцепторов электронов СРБ используют сульфит, тиосульфат и нитрат. Диметилсуль-фоксид используют лишь некоторые культуры СРБ. (рис. 5).

Рисунок 5. Рост термофильных накопительных культур СРБ на акцепторах электронов

Для двух накопительных культур СРБ (мезофильной иг51Ь и термофильной Га-10-3) была изучена зависимость роста в градиенте температура-рН (рис. 6). Эти два параметра являются одними из основных характеристик исследуемых гидротерм. Установлено, что при одновременном воздействии двух факторов пределы и оптимум развития мезофильного сульфатредуктора сужаются и смещаются в сторону более низких температур.

льфат

Є Га-07-2 В Га-10-3 О Гор-09 щГор-10-1 О Уро-10-ручеі В Уро-10-2 й Гус-1-45

Рост СРБ при использовании различных доноров электронов

Таблица 5

лактат | ацетат фумаралг бутират | пропионаг сі СІ этанол ' глюкоза 1 1 | фруктоза ! I манноза 1 рамноза формиат серии цистенн метанол сукцинат пируват

Эе-08-1-2 ++ + - ++ - ++ + + - ++ + - н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

8е-08-2 ++ ++ + - ++ ++ + + ++ ++ ++ -н- н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

За-1 ++ + - ++ - ++ + ' - - - + - н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

ит-09-1 ++ - - - + ++ + - + - - - - н.о. - н.о. н.о.

ит-09-2 + - - - - - + - + + - - - - н.о. н.о.

иш-09-3 ++ + - - - - + - + - - - - н.о. - н.о. н.о.

№51Ь ++ - - н.о. + + - ++ - - - н.о. - ++ + + +

иг5ЗЬ ++ - + И.О. + - - - + - и.о. - + - + ++

Уро-10-ручей (30) ++ + + и.о. + - + ++ + - н.о. ++ ++ - + +

Гор-10-1 (30) ++ + + Н.о. + + + - - - - н.о. ++ ++ - + ++

Гор-10-3 (30) ++ + - н.о. + - + - - - н.о. - ++ и.о. н.о.

Уро-10-2 (55) ++ + + н.о. + + + - ++ + + н.о. ++ + - + ++

Уро-10-ручей (55) ++ + + н.о. + + + - + + + н.о. - ++ - + +

Га-10-3 (55) ++ + + н.о. + + - - + - - н.о. ++ ++ - + +

Гор-10-1 (55) ++ + + н.о. + ++ + + ++ - + н.о. - ++ - + +

Примечания: «++»- активный рост; «+» - слабый рост;«-»- нет роста; «н.о.» - рост не определялся.

50 60

Рисунок 6. Рост культуры Ur5lL (а) и Га-10-3 (б) в градиенте темперагура-рН

Аналогичная картина наблюдается для термофильного сульфатредук-тора Га-10-3.

Таким образом, согласно полученным экофизиологическим характеристикам, накопительные культуры являются облигатными алкалофилами. По отношению к температуре накопительные культуры Ur5lL, Ur53L, Гор-10-1, Гор-10-3 являются мезофилами, остальные накопительные культуры (Уро-10-2, Уро-10-ручей, Га-1, Se-08-1-2, Se-08-2) - термофилами.

Разнообразие сульфатредукторов

Из пробь! мата высокотемпературной зоны (73-65°С) гидротермы Алла была выделена суммарная ДНК. В результате пиросеквенирования было определено 2402 нуклеотидные последовательности. Наибольшее число полученных последовательностей принадлежит филотипам Deinococcus-Thermus (1084; 45,13%) и Nitrospirae (869; 36,18%). Нуклеотидные последовательности сульфатредуцирующих бактерий, способных к диссимиля-ционной сульфатредукции, выявлены только в филотипе Nitrospirae, который представлен последовательностями, родственными Thermodesulfovibrio spp. В популяции микробного сообщества сульфатре-дукторы занимают значительную долю и составляют более трети микробного сообщества.

Полученные последовательности образуют два кластера: 1 кластер -Thermodesulfovibrio о (642) и 2 кластер - Thermodesulfovibrio оцс (227). В первом кластере выявлено четыре последовательности, близкородственные к культивируемым бактериям Thermodesulfovibrio yellowstonii (98-99% гомологии). Остальные последовательности относятся к некультивируе-мым представителям Thermodesulfovibrio (83-99% гомологии)

Геохимическая роль сульфатредуцирующих бактерий

Геохимическая деятельность сульфатредуцирующих бактерий связана с их участием в минерализации органического вещества в анаэробных условиях с образованием углекислоты и сероводорода. Образующийся серо-

водород является активным биогеохимическим агентом и участвует в процессах хемолитотрофии, изменении физико-химических условий среды, а также влияет на процессы биогенного образования минералов (Лазарева и др. 2010). За счет окисления сероводорода на границе аэробных и анаэробных зон происходит синтез ОВ в процессе хемосинтеза и накоплении биомассы автотрофных микроорганизмов.

Синтезированный сульфатредукторами сероводород вступает в дальнейший круговорот серы, в котором участвуют аноксигенные фототрофы и хемолитотрофные серобактерии, выявленные в исследованных гидротермах. Бактериальный синтез сероводорода происходит в широком диапазоне температур - от 27 до 70°С.

Микробная продукция С02 за счет потребления ОВ приводит к осаждению карбонатных минералов (Лазарева и др., 2011). Этот процесс интенсивно происходит в анаэробных условиях, характеризующимся развитым процессом сульфатредукции, которая сопровождается заметным подщелачиваем воды за счет изъятия иона водорода при образовании сероводорода.

С геохимической деятельностью СРБ связано образование сульфидных минералов, таких как пирит, пирротин, куприт, сфалерит и других (Гамя-гин, 2010). В природных микробных матах гидротерм было обнаружено образование следующих минералов: пирита, кремнезема, кальцита, барита.

В микробных матах гидротермы Горячинск обнаружено отложение пирита внутри водорослевой клетки, размер которого не превышает 1 мкм (рис. 8). Также среди микробных сообществ обнаружено накопление сфе-ролитов пирита, размер которых не более 5 мкм в поперечнике (рис. 9).

В результате деятельности микробного сообщества гидротерм происходит фракционирование изотопов углерода и серы. Образование изотопно-легких карбонатов происходит в процессе анаэробного окисления ОВ, протекающем с участием сульфатредуцирующих бактерий (Иванов, 1964). Изотопный состав 8|3С карбонатов в микробных матах исследуемых гидротерм изменялся от -4,83 до -12,37%о.

Изотопный состав углерода (513С) органического вещества микробных матов щелочных гидротерм варьировал от -7,17%о до -32,79%о. Наиболее легкие значения 813С имело органическое вещество мата из гидротермы Ку-чигер, где температура воды достигала на выходе 41°С. Данные показывают, что для продукции органического вещества оксигенные и аноксигенные фототрофы фиксируют вулканогенную и биогенную углекислоту.

Таким образом, в процессе деятельности микробного сообщества в гидротермах идет процесс разделения изотопов углерода. Карбонат кальция, формирующийся в микробном мате, содержит изотопно-легкий 5|3С, в микробном мате происходит утяжеление 513С органического вещества.

Рисунок 9. Кристаллы сферолита пирита (а)в микробном мате и его элементный состав (б).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование комплексных микробиологических, молекулярно-биологических, радиоизотопных и стабильно-изотопных данных позволило количественно оценить распространение СРБ в наземных гидротермах и их деятельность в микробном сообществе.

Исследованные источники характеризуются высоким содержанием сульфатов, лабильного органического вещества, а также низкими значениями ОВП, что является благоприятным для развития СРБ. На конечных этапах деструкции органического вещества в гидротермах Забайкалья сульфагредукторы являются основными деструкторами органического вещества в микробных сообществах гидротерм, в том числе и в бессульфидных. Образованный сероводород создает особые экологические условия для функционирования бактерий круговорота серы - аноксигенных фототрофных и хемотрофных серных и тионовых бактерий.

Анализ генов 168 рРНК из пробы источника Алла, полученных методом пиросеквенирования, позволил обнаружить последовательности, родственные генам 16Б рРНК сульфатредупирующих бактерий рода ТИег-тойе$и1/о\'1Ьгк>. В популяции микробного сообщества гидротерм, микроорганизмы, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфатов, могут составлять более 1/3 микробного сообщества, что показывает

существенную роль этой группы прокариот в функционировании микробного сообщества. Термофильные и мезофильные сульфатредуцирующие бактерии, могут участвовать в восстановительной фазе цикла серы в щелочных условиях термальных источников в диапазоне рН от 8,5 до 10 и температуре от 27 до 709С.

Сульфидогенное микробное сообщество играет важную геохимическую роль, участвуя в процессе окисления органических веществ в анаэробных условиях и синтезе углекислоты и сероводорода. В результате деятельности в гидротермальных системах сульфатредукторы участвуют в формировании геохимических барьеров, на которых создаются градиенты по концентрациям, растворимости компонентов, рН. Образование геохимических барьеров в микробном мате ведет к осаждению ряда минералов, таких как кальциты и пириты.

ВЫВОДЫ

1. Сульфатредуцирующие бактерии широко распространены в донных осадках и микробных матах гидротерм Западного Забайкалья. Максимальная численность термофильных СРБ достигает 108 кл/см3, мезофиль-ных- 104 кл/см3.

2. В сероводородных и бессульфидных гидротермах Западного Забайкалья создаются условия для активной деятельности сульфатредуци-рующих бактерий, которые играют важную роль в анаэробном окислении ОВ. Скорость сульфатредукции при температуре 57-70°С составляет 0,01215,340 мг8-дм"3'сут"'. При этом максимальные скорости выявлены в микробных матах.

3. Получены десять активных накопительных культур алкалотермо-фильных СРБ, способных к росту при рН 8,5-10 и температуре 40-70°С, и шесть (каломезофильных СРБ, способных росту при рН 8,5-10 и температуре 27-55°С.

4. Анализ микробного сообщества гидротермы Алла методом пиро-секвенирования показал присутствие организмов, родственных Ткегтос1е-5и1/оу1Ьпо. По полученным результатам пиросеквенирования сульфатредуцирующие бактерии составляют третью часть от микробного сообщества.

5. Геохимическая роль сульфатредуцирующих бактерий в микробных матах и донных осадках гидротерм связана с их участием в минерализации органического вещества с образованием углекислоты и сероводорода, участием в синтезе сульфидных и карбонатных минералов, а также в создании лечебных свойств воды и илов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи, опубликованные в рецензируемых изданиях

1. Бархутова Д.Д., Данилова Э.В., Тудупов A.B.. Дармаева Б.В. Гидрохимические показатели гидротермы Горячинск // Вестник Бурятского государственного университета. 2008. Вып. 3. С. 14-17.

2. Данилова Э.В., Дагурова О.П., Гаранкина В.П., Тудупов A.B.. Ульзетуева А.Д. Гидрохимическая и микробиологическая характеристика некоторых источников Тункинской долины // Вестник Бурятского государственного университета. 2008. Вып. 3. С. 52-54.

3. Тудупов A.B., Потапова З.М., Дашиева Э.П., Бабасанова О.Б. Гидрохимические показатели щелочных гидротерм Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2008. Вып. 3. С. 42-44.

4. Потапова З.М., Тудупов A.B., Цыренова Д.Д., Бархутова Д.Д. Влияние температуры на содержание хлорофилла «а» в термальных источниках Уро и Горячинск // Вестник Бурятского государственного университета. 2009. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С. 27-31.

5. Тудупов A.B., Дамбаев В.Б., Бархутова Д.Д. Изотопный состав углерода микробных матов щелочных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2009. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С. 33-35.

6. Тудупов A.B., Калашников A.M., Бархутова Д.Д. Распространение сульфатвосстанавливающих бактерий в щелочных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2009. Вып. 4. серия «Биология, География». С. 102-105.

7. Калашников A.M., Тудупов A.B., Зайцева C.B., Бархутова Д.Д., Намсараев Б.Б. Разнообразие сульфатредуцирующих бактерий в щелочных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2010. Вып. 4. Серия «Биология, География». С.93-96.

8. Бархутова Д.Д., Тудупов A.B., Намсараев Б.Б. Содержание основных неорганических соединений серы в минеральных источниках Бурятии и Монголии // Вестник Бурятского государственного университета. 2011. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С.74-80.

Р. Тудупов A.B., Бархутова Д.Д., Намсараев З.Б., Намсараев Б.Б. Бактериальный синтез сероводорода в азотных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2011. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С.129-134.

Тезисы

10. Калашников A.M., Тудупов A.B. Сульфатредуцирующие бактерии термального источника Горячинск (Бурятия) // Материалы XII Международной научной школы-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий». Выпуск 12. Абакан:

изд-во Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова, 1922 ноября 2008. С. 128-129.

11. Тудупов A.B., Бархутова Д.Д. Распространение сульфатредуци-рующих бактерий в щелочных гидротермах Прибайкалья // Материалы IV Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва: ООО «МАКС Пресс», 20-22 октября 2008. С. 46-47.

12. Бархутова Д.Д., Тудупов A.B., Данилова Э.В. Процессы сульфат-редукции в холодных сероводородных минеральных источниках Байкальской рифтовой зоны // Материалы V Международной конференции по криопедологии «Разнообразие мерзлотных и сезонно-промерзающих почв и их роль в экосистемах». Москва: Институт географии РАН, 14-20 сентября 2009. С. 109-110.

13. Тудупов A.B. Распространение и экофизиологические характеристики сульфатредуцирующих бактерий в бессульфидных гидротермах Уро и Гарга (Прибайкалье) Ч Материалы Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний». Улан-Удэ: изд-во Бурятского государственного университета, 5-16 сентября 2011. С. 167-168.

14. Бархутова Д.Д., Тудупов A.B. Роль сульфатредуцирующих бактерий в биогеохимических процессах гидротерм // Материалы российской научной конференции и симпозиума, посвященных 30-летию ИПРЭК СО РАН «Эволюция биогеохимических систем (факторы, процессы, закономерности) и проблемы природопользования». Чита: Забайкальский государственный гуманитарно-педагогический университет, 27-30 сентября 2011.С. 67-69.

Подписано в печать 20.02.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,3 печ. л. Тираж 100. Заказ № 33.

Отпечатано в типографии Изд-ва Федерального государственного бюджетного учреждения науки БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.