Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распределение миозинподобных белков в функциональноно различных участках хроматина экспрессируемых генов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Распределение миозинподобных белков в функциональноно различных участках хроматина экспрессируемых генов"

пп^р^у р^^рпг?<?!*

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИ03ИШ10Д0БШХ БЕЛКОВ В ФУНКЦИОНАЛЫ» РАЗЛИЧНЫХ УЧАСТКАХ ХРОМАТИНА ЗКСПРЕССИРУЕМЫХ ГЕНОВ

специальность 03.00.04 - Биохимия

диссертации га сороки««» учений степени кандидата биологических паук

СЛ1:!(Т-ПЕТЕГНУР[' 1593

Работа виполнена на кафедре биохимии Биолого-почвенпого факультета Санкт-Петербургского Государствешшго Университета.

ШучниГ: руководитель: кандидат биологических паук Т.Н.Прияткнна.

Официальные оппоненты: доктор биологических паук М.И. Мосевицкий, доктор биологических наук И. М.Константинова

Ведущее учреждение - Центральный иаучно-исследовательо-кий рентгенологический институт Минздрава К.

Защита состоится " / " й-НАс* 1993 г. в У<? час. на заседании Специализированного ученого совета К 063.57.09 по приоукдению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9, иуд. № 90).

С диссертацией 'можно ознакомиться в библиотеке имени: Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " /у " _1993 г.

Учения секретарь Специализированного совета

Л.Г.Марков

ОБЩАЯ ХА PAKTE РИСТИКА РАБОТЫ

- Актуальность проблемы. Составной частью различите (¡ункч.ио -нальннх систем хроматина являются биодинамические процесс!!, мо-халияш и деЯствустцме компонента когорте нсиш'О'гпш. В эте5 силой, решение вопроса о ядерной локализации аналогов белков ахто-миозиновоЛ системы, специалпзярогсашгоЯ на нглтольтнио различиях механо-химпчср.ких функций, представляется пту&пыплл irsJt с точки зрения проблемы иоче'.суллрио» оргпнязшгт генетических про -цзссов, так и явлений биологичсскоП подитогсегк. Первке стрр-ния об актшю- и миояиноподобюое белках пнт ".^(.езнчх ядер поя -г,п::сг, л па-иле ao-v i-опол (cimishi at.ai., 19^3¡1564).В насго-!П",ао «ремя присутствие» в них диалогов лягал?. убедительно документировано ( Галактионов и др., 1935). Ряд данных позволяет предполагать внутриядврпую локализацию и миозиношх комлонеп -тов. Так, в препаратах хроматина из различных источников, на -ряду с актиноподобными белками, выявляются полипептиди, соответствующие по элоктрофоротпческок /Э5/ подвижности и некоторым чертям первичной структуры тяжёлым цепям ¡млечного миозина /ТЛИ/. Обогащенные чми экстракта обнаруживают свойства актимиозииа (Lcatourecnon et.nl.,1975; 3errioa et.al. ,1У8б). Далее, из хроматина печени был поделен белок о высокой АТРазкоЯ активность» к совпадающий по ."ЭТ-подвикности в неденатурируидих условиях с мняечнш инозином. Методой дпумерного олекгрофороза показано присутствие в нём тяжелых, асмигркруюсцга: с ТЦМ, "Л лёгких компонентов (Прияткина и др., 1988) . Однако степень структурно-','>ун:;'Ч;ональнол гомологии итого белка с миозином, его взаимосвязь с ядерным актином, локализация и функции л хроматине остаются неизвестными.

Цель и задачл исследования. Цель работы состояла в исследовании локализации шозиноподобных белкой /ШБ/ в хроматине па ивдивццуалышх генах с иг,пользованиемгибркдизации ДНК из фракция, ассоциирсванннх с МПБ, с кодирующими и фланкирующими участками трпптофаноксигопааного /ТО/ и тирозннаышютрансфераз-novo /ТАТ/ генов. В работе были использованы плазмиди рТ0(Е-3,й) рТО( Е-3, 7) , рТОС Н/Р-0,6) , полученные и любезно предоотав -лечкче нам Г.И. Чихиряиной, а такяо шаэкеда, содержания ТАТ-геи, предоставленная доктором Г.Шутцем { Sohüti G.r ФРГ).

Для вшюлнзиия поставленной цели решались следующие ссда-

чи:

- Получение и рострикциоьное картирование ДНК рекомбикантных плазмид, содержащих фрагмент ТО- и ТАТ-генов.

- Получение отдельных фрагментов рестрикции ТО-- и ТАТ-генов с использованием препаративного электрофореза и элюции иг агарозных гелей, -^р_мечеш1е дщ по КОщан и Б реакции пик-трансляции.

- Исследование гибридизузмости ДНК фракций хроматина печени и мозга с кодирующими и фланкирующими участками генов ТО и TAT.

- Исследование связи миозинолодобных белков с фрагментами хроматина, содержащими кодирующие области экспрессируемых генов, с использованием метода электрофореза ДШ и гибридизации ДМ в агароаных гелях с радиоактивными ДНК-зондами.

- Определение длины ДНК, содержащей кодирующие области гена ТО, в составе фрагментов хроматина, соэкстрагируемых с МПБ ПФ-о'уфером.

Научная новизна. Впервые показано, что ядерный миозино-подобкый белок является компонентом активного хроматина, прочно связанным с кодирующими областями экспрессируемых генов. Получена высоко обогащенная фракция фрагментов транск-рипцконно-активного хроматина, в которой кодирующие области представлены протяженными отрезками ДНК (2000-11000 н.п.). Показано, что фрагменты транскрибируемых генов представлены в препаратах хроматина в двух формах, в каждой из которых преобладают Э*-аналоги одного из двух главных компонентов актомиозинового комплекса - актина или миозина.

Научно-практическое значение. Разрайотанный доступный способ получения фракции хроматина, обогащенной в 20 раз протяженными фрагментами эксяресоируемых генов, в сравнении с 'суммарным хроматином, может быть использован, при клонировании эукариотичбских генов, исследовании различных аспектов структурно-функциональной организации хроматина и механизмов транскрипции.

Апробация работы. Материалы диссертации были предотав-лены в докладах на научных семинарах лаборатории химии бел-

ка я кафедри биохикки Санкт-Петербургского государствеmiora университета, на Х-м Всесоюзном симпозиуме ''Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990 г.).

Публикации. По тема диссертации en/блик osauo рабоп..

Объем и структура рэботч. Диссертация состоит из яв?ло~ кия, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, :бс"""дс:птт, и <»п«»е~ ;;а тггнрокятся Лйтекиурз. ?г.6отя .тие.-о/л г? oipaj-r цах мешинописнм'о текста, содеркит £2 раиужа. I тг.б:;::цу1 Г.писок литературы включает 167 работ.

МАТЕРИАЛУ '.I МЕТОДЫ H£X»j)KÄÖ!"»№iri

Работу проводили на ядрах печени- и мозга беспородных белых крыс. Фракции растворимого (ЛИр и нерастворимого (остаточного, ÄHHqj) хроматина получали как описано ранее (При-яткина и др., 1983) с применением ультразвуковой фрагмента-^ ции клеточных ядер в растворе безыонной изотонической сахарозы. Миозиноподобные белки (МЛБ) получали из фракции ДНТ^. Фрагменты хроматина осаждали из раствора добавлением HsCl2 до 5 м" и осадок экстрагировали 0,005 " тряс- HCl -<5уфе-ром с pH 0.0, содержащим 0.15 М NaCl , 0,020 М тетрапиро-фосфат К0 (п§) и 0,005 М l%Ci2 (П$ - буфер). Далънейиу» очистку проводили в соответствии с оанее иредлокенной схемок (Прияткина и др., 1988).

Ллазмидныо ДНК и ДНК фракций хроматина депротсииизиро-зали в стандартных условиях (Маниатис и др., I98'f). Диск-одектрофорез белков в системе с додецилсульфатом На проводили по Томас и Корнбергу ( Thuoas, Kornberg, 1975); электрофорез ДНК - в горизонтальных 0,8-2,0? агарозных гелях (Маииатис и др., 1984).

В работе были использованы методы оестрикционного кар-

ЗР

тирования, Р-мечения ДНК в реакции ник-транолячии и по концам с использованием фрагмента Клекова ДЫ'-полимеразы, капиллярного переноса ДНК с агарозных гелей на нитроцеллу-лозные фильтры ( з-ргоЪе, "Bio-Rad" ), блет- и дот-

гибридизации ДНК фракция хроматина с рестриктами генов ТО и TAT, радиоавтография и др., которые выполняли в соответствии о руководством (Мэниатис и др., 198*0 •

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ ДНК и белкового состава фракции хроматина,

экстрагируемой П§-буфером

При ультразвуковой фрагментации клеточных ядер в растворе О,25 М сахарозы и лоследуэщен центрифугировании хроматин разделяется на растворимую (ДШ|) и нерастворимую (JHTIqj) фракции. На дола растворимого хроматина е клетках печени приходится около 9С$ ДНК и 9С$ №Б исходных ядер. В таблице I представлены данные по распределению компонентов фракции ДНГ^ при осаждении в растворе 0,005 М MgCig и последующей экстракции осадка П£-буфером. В обеих растворах - содержащих MgCi2 и n$-figCi2) обнаруживается фрагмента ДНГ1 (около I и 12% суммарного хроматина по ДНК соответственно). Около 7С% ШБ (по К+-ЭДТА-АТРаяной активности) сосредоточено во фракции, экстрагируемой ПФ-буфо-ром - ДШд2» Как видно из рис,4, АТРазкья активность экстракта, по-видимому, обусловлена присутствием компонентой, совпа- ■ дающих по ЗФ-подвияности при неденатурирующих условиях с мышечным миозином. В составе фракций ДШд| к представлено более 60$ РНК исходного растворимого хроматина.

В ДНПд2 13 значительном количестве представлены компоненты, соответствующие по электрофоретической подвижности тяжелым цепям мышечного миозина (ТЦ) и актина (рис.1). В Mg ^-растворимой фракции (ДШд^-) превалирует один компонент с электрофорети-ческой подвижностью мышечного актина.

На рис.2 приведены данные по гибридизуемости ДНК фракций хроматина с центральным фрагментом кодирующей области зкепрео-

Рио.1. Электрофорез белков фракций хроматина почени крыс в системе с додеци.чеульфатом чатрия. Внизу указаны индексы Фракций ДНП. Аст - актин из скелетных мышц кролика; ТЦ - тяжелые цепи миозина; HI - гистон HI; Н - гистоны Н2А, Н2В, НЗ, т.

"гц -

Ar -m с

И с

fÄ

г* г *,t

Ш >!>}»■

Ж

A2, 1,02, Л-

I А? 02 Ах Пл

1-ис.2. Гьйрндизация Д(ГК вз Фракии,! хрокьтшн печени лрмо с зонд,ом ТО-1.

Б каждой плтпи (Л) содержа сд 0 '«г ;и<Д; гэртикилымз ¡'.-и,! в Б - серия разведения л да роза Д!К, з пят'их ¡<ерхи<гго р!1да содержится ДШ} ^ о 2~ нкг, - 3 икг, Ил -

0,32 миг. Внизу указаны индекоы фракций ДШ. Нл - плазиида рТО (Е-3,3).

- б -

Таблица I. Распределение компонентов суммарного растворимого хроматина при осаждении в 0,005 М растворе MgCi2 и экстракции осадка ПФ~буфером.

Условия получения 1ШЗ§ЛЬЗУ~ Распределение %

^значе- днк РНК Белок АТР-

аза

Суммарный растворимый хроматин iKIj 100 100 100 100

Осаждение 0,005 М Mgci2, супернатант днп А1 I II 13 3

Экстракция ПФ-буфером, супернатант *Н1А2 12 55 25 68

Осадок после двух экстракций днп02 87 34 62 29

х Приведены средние значения из трех опытов.

сируем&го в печени гена ТО (от >5000 до +6300 и.п., зонд ТО-1) в составе плавмиды рТО (Е-3,3). МЛБ-содержащая Фракция хроматина печени (ДШдд) обогащена примерно в 20 раз кодирующей ДНК этого гена в сравнении о суммарным хроматином. ДНПд^ также обнаружила эффективную гибридизуемооть с зондом ТО-1.

ДНК из фракции ДНПдд при электрофорезе разделялаоь на два пика компонентов - 2-11 тыо.н.п. и около 0,5 тио.н.п. Чтобы установить фрагментами какой длины представлен ген ТО, ДНК после электрофореза переносили на нитроцеллулозные фильтры и

t,"i,a2*a2,m

645 ti 5686 3675 2323

700

Рио.З. Автограф пооле гибридизации ДНК из фракций хроматина печени о зондом ТО-1. Внизу указаны индексы фракций ДН1.

х - фракция, обработанная рес-триктазой ХЬо I ; М — фрагменты рестрикации БсоН 91 днк. Цифры обозначают длину фрагментов в н.п.

гнбрглпгнровалк с зондом ?0~1, Как эилно из рчо.З, чодиру.аюч область г^нч ТО р составе Фракции Д(11 д9 нреди'ГМйле^а дрогл*.;^^"

1ш:'И фрогчентаки (10-1Г тыс.н.п,,), Пне обрчбот/м р'^о%-•>.-зои лг.о I, для которой ¡'.местоя один сайт с дп.ч.чо'Ч иоП последовательноотц гона ( .7(500), с<$р9зож«*я гибридов наблюдается в двух сериях фрагментов - 2503-^0^.^ п 551'.)~7%0 ii.ii Таким обвазом, ПФ-буфером избирательно эвсхрахидоптся из суп-¡'»оного /:рО!'атин:л зметгь л м^и'-инорчло^нцуи баками про?.1.,- С!:-низ фрагкентц кодиру.омлх сб;;яптс".:. ^¡'.сьресонругзнов.

Исследование взаимосвязи мисзиноподобаых белков С "1*1 Г С"Э?•?».•?«* гипмкполюатпш и

Для решения вопроса о том, связаны ли М11Б с фрагминтаии хроматина, содержащими кодирующую ДНК в состава ДНПда, проводили электрофоретическое разделение комлонентов пирофосфатно-го экстракта печени в 0,5% агарозном геле и исследовали распределение МПБ к ДШ, а также гибрщшзуекость ДНК о зоняо« •■ ТО-1 непосредственно в геле. В качестве контроля использовали ДШд2 мозгового хроматина.

Как пидно из рис.<'|, ШБ, очищенный из препаратов ДНП/з с ионопьй осолдения сульфатом аммония 50,1! наслоения в рлсгворе низкой ионной силы, кохигрирус? з 0,5;? агарозпом геле с цц-зечш?» Мкоэинок. Е состава фрикции ДШ^ он обнаруживал значительно меныв/а одектрофоретическул подвижность.

Прк окраске на ДНК выявлялись дне субфракцпи ДШ ( и Ау2) (рис.5). Только одна из них (/^-Г) содержала МПБ (окра-вязалась аа ЛТРязу) и обнарукидала пвбридизуекосто с ромом Ю-1. йэ этих данных следует, что ИЗБ находится в комплексе с фрагментами хроматина, обогащенными кодирующими последовательностями ДЩ экспрессируемых генов. Связь между ДНЛ и ШБ сохранялась в растворе I М ДаСХ.

Анализ ШБ содержащей фракции хроматина на присутствие ^¿-фланкирующих участков гена ТО

В следующей серии опытов исследовали фракции хроматина на содержание 5^фланкирующих участков гета ТО. На рис.б представлены данные по гибридизуеиости ДНК фракций хроматина печени и мозга с фрагментами ТО-гека - от -292 до +326 н.п. (зонд ТО--П) и от -Чбб до -292 н.п, (зонд ТО-Ш). Эффективность

- б -

Рис.*). 'Электрофорез препаратов МПБ, выделенного из фракции ДШд2 11 исходных ДНПД2 (Б) в 0,5% агарозном геле

I и 2 - мозг и печень соответственно: М - миозин из

скелетных мышц кролика. Окраска на АТРазу

А 2-1. А2-2

I

I 2

Рис.5. Электрофорез в педематурирукщих условиях фракции

ДНПд2 1,3 печени и мозга крыо в 0,5% агарозном геле. А - окраска на ДНК; Б - окраска на АТРазу; В - автограф после гибридизации ДНК в геле с зондом ТО-1 I и 2 - мозг и печень соответственно; к^ электрофоретические субфракции фрагментов ДНПд2

и А2-2 -

Рно.б. Гибридизация ДНК из фракций хроматина печени и мозга крыс с зондами ТО-П (А) и ТО-И (Б).

Указаны индексу фракций Д!:!К

гибридизации ДШдр с зондом ТО-П многократно превшая» r'iöpwui--эуекооть всех остаяышх фракций. С зондоч ТО-Л гибридизнчич tuo~ лтдалаоь только для ДНК иа ЛШда хроматина печени. Аналогичная фракция хроматина мозга, где ген ГО находится в репрессированном состоянии, не обнаружила обогащения этими элементами /Iii. Таким образом, 5' -фяанвирулкая ДНК, начало кодирующей последовательно сти, таюке как и центральный участок гена ТО (рис.2), сосрсдсто-чены ьо фракции хроматина, содержащей МПБ (ДШ^).

Распределение функционально различных участков

гена TAT во фракциях хроматина печена и лонга

Клонированные в плаамидах участки fü-гена не иклычаыт пторуо половину кодирующей последовательности и 3' -фланкирующую ДНК. Для

исследования распределения во фракциях хроматина атих областей

б',и ылп.ль аонаи г-'нлшнл пггг T'T-I ~ п-асм-д" pM'J "v:

V 'ShiüP^Ly;, О'., I , , IriVi;. с о д е j ■' и «ем колирун'-.;"" о.о-.' i...,

а также э~ и зЦдшигр* ТАГ ка.-, и i'0-i'ou алтшиш

Sp Sc Si So 2 I! £c' ap Sc Sc Sc л I-i So + + + + * *

В Sp в' В Sp B'

Рис.7. Электрофореграмма фрагментов рестрикции плазииди рИС 19х(р)С (А) и автограф (Б) ее реплики после гибридизации с ДНК из фракций хроматина ДШ^ печени крыс, sc, sp, В, Е - рестриктазы зас I, Sph I, В» Н I, EcoR I; М - ЕсоК X - Hind Щ pSc-трикты ДНК. Ванесено 2-9 мкг ДНК смеси рестриктов; ( so+Б) и ( sc+B) - нанесено 3 и 9 маг скеси реотриктов соответственно; ХЕ - гибридизация с плазмидой рИС 19.

+1

Рио.В. Схема расположения участков гена TAT» гибридизиругз--щихся о ДНК фракций хроматина ДШд£ +1 и Т - точки инициации и терминации транскрипции; темные кружки ~ грапщц геномhör вставки TAT Пунктирной линией обозначены области гибридизации.

в клетках печени. Плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазами, реотрикты разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нитроцеллулозные фильтры и гибридизовали о ДШдз $Рак~ ции хроматина, меченой о сиотемз ник-траисляции при подобранных нами уоловиях. D качестве контроля использовали ДНК из фракции ДШо2- Данный подход позволяет в одном опыте оценить относительное содержание во фракции всех оегноптов клонированной последовательности гена.

При гибридизации серии рестриктов гена TAT о меченой ДНК Фракции ДНП^2 образование гибридов наблюдалось только с фрагментами из первой половины кодирующей области гена. Из 3~флан-га гибридизовался только сегмент его центральной части, отстоящий примерно на 1000 н.п. от области терминации (рис.7 и рис. 8). В этом участке картирована повторяющаяся ДНК и он обнаружил гибридизуемость с контрольной пробой - ДНК из фракции /UFiyg. Возможно, что его приоутотвиа во фракции ДШ^ не связано о 3-фланкирующей ДНК ооботвенно ТАТ-гена.

ДНК из фракции ДДОдз не обнаружила гибрндиауемости с сегментами из второй половины структурной области и 5'-фланга гена TAT. Мы провели дот-гибридизацию ДШ фракций хроматина о индивидуальными мечеными фрагментами из этих облаотеГ,. Учаоток 5 -фланга (от -1300 до +1 н,п.) равномерно гибридизовался с ДНК всех анализируемых фракций хроматина печени и мозга. Для

Фрагмента из второй половики кодирующей области ТАТ-гена (от +5000 до +9500 н.п.) наблюдалось незначительное (не более чем в дви раза) преимущество н гибридизуемости ДНКда в сравнении с ДНК других фракций. Таким образом, по-видимому, фракция ДНПдз не обогащена или незначительно обогащена 3'-фланкирующей ДНК и второй половиной кодирующей области гена TAT. Сходный анализ был проведен для фракции ДНП^р она обнаружила аналогичный ДШд2 характер гибридизации с участками ТАТ-гена.

Избирательная обогащзнность фракций отдельны« участками генов свидетельствует, что в процессе получения хроматина разрывы ДНК в специфических участках, вероятно гиперчувствительных сайтах, преобладают над случайными. Мы использовали ультразвуковую фрагментация, но анализ длины ДНК на различных стадиях очистки хроматина показал, что разрывы ДНК в интервале 2-20 тыс,н.п. наблюдались до ультразвукового воздействия.

Различное распределение 5'-фланкирующей ДНК ТО и ТАТ-генов во фракциях хроматина не вполне ясно. Возможно, что оно может быть связано с характербм расположения и силой гшерчуЕстзите-лышх сайтов вблизи старта транскрипции. Сниженное содержаЕШ» фрагментов из второй половины структурной области может быть связано с тем, что область термикации не отделена от У-фланга пперчувствителышми сайтами, и сразу же за областью терми-нации хроматин имеет типичную нуклеосомную cipyKTypy. Если разрывы хроматина происходят во второй половине структурной области ТАТ-гена, то образующиеся фрагменты будуч' распределяться пс типу участков, организованных в нуклеосомы.

Таким образок, по-видимому, ШЬ' связаны с фрагментами ДНП, обогащенными кодирующими областями окспрзссируемах в печени генов ТО и TAT. В дистолыщх протяженных учазтках 5'-фланга jtot белок, вероятно, отсутствует. Относительно коротких 5 -фланкирующих проксимальных фрагментов нельзя сделать окончательный вывод. Полученные данные свидетельствуют о связи МЛБ с процессом транскрипции. МПБ могут входить в систему белков PIiK-полимеразы или участвовать в формировании внутреннего межхроматинового матрикса, с которым контактируют участки активной транскрипции. В литературе имеются данные с связи актина с транскрипционным аппаратом. Так, было показано, что актин является фактором транскрипции, который взаимодействуя . с ТЛТА-боксом обеспечивал точность ее инициации (Ев1? е*

If 34). Актин 6'íi i: л е н г и Ф и 11! гр о n a 11 в rpyo'ux препаратах PütC-no-„имеразы ( Bgly' ей «i.; I90'0, а тгктте в составе «терного мат~ p.íKoa в acoosjuwii»". « РМ-чаот^цам»« и учас-исаии активном транскрипции (Karservci, «оигюк, I97Q, iÜSJ; l.ato>jre»u, Veda, I9ij5), Ло конкргпш рояь этих белкоя в лрто газации процесса трлногф)«-mom ocraerot сю:мьз<ш;сЯ. Тр^умгея дополнительные исследоля» ч:п для стоте"« структурно-функциональной гомологии

л^'рнчх ии?j¡khjíx 6e:-xo-¡ с чзлестн-.'п фор.-<эт м'юзннолчх KoiinoueiwoL.

ВЫВОДЫ

1. Пси рг.ст^ог^мого yr»oweT"He- пуфнппм, litjiícü.Tiu— щим пирофосфат натрия, извлекается около 10$ ДНК и 70$ ядерных КПК. ДНК этой фракции (ДМ^) MtI0r0i!PaTfI0 обогащена фрагмента)« из кодирующей и проксимальной 5'-фланкирующей области экспрес-сируемого в печени тркптофаноксигеназнсго (ТО) гена в сравнении с суммарным хроматином.

2. Гибридизация с фрагментами рестрикции гена тирозинамино-трансферазы (TAT), также экспрессируемого в клетках пзчени, показа^ что подергайте го фракции ДНП-~ фрагментов иа первой половины кодлруввой последовательности выше, чем из зтороП ее половины. В отли-ше от ТО-гынл, Д!?'»? ,;0 обогащена Ъ1 -Фланки.« руошеГ) TAT-ДНК, ил З1 -обласп! гибриди с ДНлд£ образует толы;о центральной ее фрагмент, одернаи.ин чоътсряащуюск ДШС.

3. ДШ Фракии» Д!Пд- при электрофорезе разделяется на два пика фрагментов 2-II тыо.н.п. и около 500 и.п. Центра ль нчй учаоток гена ТО (+5000 до +Ö30Ü и.it.) гкйридизуетоя с внсоко-

молвкулярними фрагментами (10-11 тыс.н.п.). С использованием рестрикции Xho I показано, что эти фрагменты ДНК, по-видимому, не вк/ичают проксимальная 5' -флачкнрующие области гена ТО, также присутствующие в этой фракции,

4. При использовании электрофореза ДШ в неденатурирупщих условиях и исследовании распределения ЧПс и ДНК, a ъ-Акже гиб-ридизуемости ДНК в геле с фрагментом кодирующей области гена ТО, показано, что 1'ЛЗ находится в комплексе с Д'П, содеркппгЯ кодируодае облает:: экопреосируечих гоноз, МПБ нь диссоциирует от ДШ ъ рчстворе I Ч NaCi.

5. Получена минорная Фракция фрагментов активного хроматина

(около 1% ДНК), растворимая в присутствии ионов ¡%, главным белковым компонентом которой является глектрофоретический аналог актина. Эта фракция обнаружила сходний с ДНПд£ характер гибридизуемости о различными участками генов ТО и TAT.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Прияткина Т.Н., Кузнецова С.Г., Зарембокая О.Р. Взаимодействие ядерных.миозиноподобных белков с функционально различными участками аукариотического гена триптсфаноксигенаэы// Тез. докл. 10 Воесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра", Гродно, 1990. С.64.

2. Кузнецова С.Г., Прияткина Т.Н. Ассоциации миозиноподобных белков с фрагментами активного хроматина//Вэстник ЛГУ, 1991, сер.З, вып.4. С.50-55.

3. Кузнецова С.Г., Прияткина Т.Н. Аналоги сократительных белков в составе клеточных ядер//Веспшк СПбГУ, 1992, сер.З, вш.З. С.59-66.

4. Прияткина Т.Н., -Кузнецова С.Г. Распределение функционально различных участков экспрессируемых генов при фракционировании фрагментов хроматина ь солевцх -растворах//Бестник СПбГУ, 1992, сер.З, вып.4. C.5I-65.

M'i/S-Udtf^fe

I/