Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиобиологическая характеристика двух субпопуляций стволовых кроветворных клеток (КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12) при воздействии гамма-облучения

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиобиологическая характеристика двух субпопуляций стволовых кроветворных клеток (КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12) при воздействии гамма-облучения"

РОССИЙСКАЯ АКАДОШ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ЩЩИНОШ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ-. ЩИТР

На правах рукегшси

ТРИШЮНААНТОНИНА ИВАНОВНА

РАДИОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДВУХ СУБПОНУЛЯЦИЙ СТВОЛОВЫХ КРОВЕТВОРНЫХ1КЛЕТОК ( КОЕ-С-8 к К9Е-С-12) ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ГАММА-ОБЛУЧЕН ¿Я

03.00.01 - радиебнелегхя

Авт«реферат диссертации на сеисхахие ученей степени кандидата биелегяческкх наук

ОБНИНСК - 1993

Рабата выполнена в Медицинами радиелвгичесхаы научней центре РАМН

Научный дохавадатель - д«кт«р бмлегичесхюс наук, префесоер: А.Г. Кенапляшткев. '

•фицмалыше оппененты: Дектер-биелегкчесхих наух, прафесеар С.Я. Яр*1ененхе. Дехтер биехегичесхнх на/к ii.il. Рождественские

Ведущая ерганмвацид: Центральные научне-исследввательохиа ренгенврадивлвгический институт ИЗ РФ

Защита оаотештся: "■А"" Мй/ЦТУ 1994т на ааседании Специалюиреваннеге севета Д OOi.II.01 в Медкцинскем радие-хегичесхам научна* центре РАМН ( 249020, г. вбнхнсх Калужская еблаоти, уж. Каредава, 4)

С диосертацмеЖ махна евнавашться в библиатеке Медицинсхага радхалагичесхега научнеге центра РАМН.

УчешА секретарь Соециыхамреваннеге се вата дехтер мдоцмнскмх наух

В.А. Цулихаа

ОЕЩДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ■

" ; '' Актуальность проблемы. В настоящее- время одной из'актуальных задач радиационной биологии остается.¡изучение Лрадару ■ ..чувствительности стволовых кроветворных клеток... В связи с,аш^ роким применением источников ионизирующей радиации à народной; .'хозяйстве при диагностике я лечении злокачественных нсвообра^; эований необходимы данные по радиобиологической ' характеристику реакции костного мозга человека на действие и&луч9ния._как"нз-';' вестно, прч действии радиации на организм.животного и челорекз . з первую счередь повреждаются две клеточные. ..саыообнбвляюв^е^. системьГ-костный мозг игэпителий кишечника'(Вонд''В. /\;®вшднер' Т., Аршамбо Д., 1971). Кроветворная система представляет собо^ ^совокупность разнообразных -клеток, поддерживающих себя -и Vau-i. ! : полнящих' узкоспециализированные функции, т ' последние имеют' ог'-.-

• раниченньй жизненный цикл. Исходным алемйтрм всей ' системы : 'кроветворения является плюрилотентная ртволовая клетка, даппзд: начало всем дифференцирувдам рядам и способная к' самоподдерад-

1 нию всего пула. В экспериментальной 'гематологии ц. радиобисида-; ' ' гни в качестве представителя стволовых кроветворных клеток.'бо-г ' лее 30-ти ' лет иепользуч® кмрнкеобраэ упаде единицу; формирующие в облученной организме селезеночные • колонии ■ С ЖЕ-С), как зтэ впервые было показано Тг'ллом а ИакКуллохои . СТi 11 J.E.,» McCullcch Е. А., 1961). . ..«.. ..-,,'".".

Относительно недавно было показано, что В; популяции "ЙОЕ-с;, имеется возрастная иерархия .- одни яэ клеток образуют селе- ■ ..-веночные колонии более быстро', причем часть из них имеет тран; , зиторный характер, а другие образуют эти колбнии в более поад-; ние сроки (Magli Мй, Iscove N.H., Odartchériko.N., 1982. ^видимому, можно рассматривать эти субпопуляций как различны? ; зтапы диффэренцироЕки стволовых кроветворных клеток, возможно, даже из их предшественников, так'называемых npe-KOF-С (Чертков И. Л., 1986; Kfeijne Е. I., Floemacher R. £., Vos 0., Huiskai-pR. | 1990). Принято разделять КОЕ-С яа более коммитирозанные, да'Ь-щие селезеночные колонии через ? - 8 суток после трансплантации кстнсго мозга летально облученным казам.( часто "сссгначаьт мые как КОЕ-С-5), и менее ксммитирсванные, ■ цающк колонии в

• ctzizeKKiюж. на îï -li-c сдткж (ta. пр*;;;таз;:?5Л1 чгсго

»,

0Ссена':'_1ттся г.ч". кое с-12}. Дшшых По йриыип-ъльноА xspa;-tte -

ристике КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 относительно немного.

Для радиационной биологии в настоящее время особый интерес представляет сравнительное изучение радиочувствительности КОЕ-С-8 и ШЕ-С-12 . При этом необходимо получить сведения, количественно характеризующие их выживаемость при однократном облучении, способность к репарации сублеташ'ных повреждений и динамику, пострадиационной репопуляции зтих двух субклассов . КОЕ-С. Эти сведения, в первую очередь, необходимы для создания обшей концепции, оаисыващэй эффек? радиационного воздействия на системы клеточного обновления организма. Эти ж сведения : также важны для оптимизации пересадок костного мозга, тем более, что в последние годы пытаются вместо цельного костного моага пересаживать только некоторые выделяемые субпопуляции стволовых клеток. ..

Цель и задачи исследования. Цельо данной работы являлось экспериментальное исследование' радиочувствительности КОЕ-С, .формирующих селегецочяые колонии через 8 (КОЕ-С-8) и 12 (КОЕ-С-12) суток после трансплантации летально облученным мышам костного мозга, закономерности восстановления их от внутриклеточных радиационных повреждений и динамики пострадиационной репопуляции. . !

фи выполнении этой работы были поставлены сле^уювдае задачи:

- получить дозовые кривые выживаемости' КОЕ-С-8 и К02-С-12 поел» облучения клеток костного мозга мышей ин витро и ин вдао;

- морфологически охарактеризовать колонии, . формируемые разными субпопуляциями КОЕ-С в селезенке облученных мышей;

- сравнить способность к пострадиационной репарации КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 методами фракционирования и изменения мощности дозы;

- изучить динамику репопуляции КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 в костном мозге сублеталъно облученных мышей.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые на одном и том же объекте были получены данные, количественно характеризуй®» радиочувствительность КОЕ-С-8' и КОЕ-С-12, их способность к репарации и пострадиационной репопуляции. Показано, что величины средней клеточной дозы для ХОЕ-С-3 и КОЕ-С-12 близки, причем эти показатели мало различаются в условиях ин витро-и ин виво. Наряду с этим была охарактеризована радиочувствительность каждого из дифференцирующихся кроветворных юсткое, дагаих колонии различного морфологическою типа. Былм и'.-кшимо. что при '¿ршцигниревмном облучении

при использовании метода "микросчета" КОЕ-С-8 Солее эффективно репарируют радиационные повреждения, чем КОЕ-С-12. При использовании метода снижения мощности дозы как, по тесту ''макроколоний", так и по тесту "микроколоний" способность к пострадиационной репарации достоверно более выражена; для КОЕ-С-8 при сравнении с КОЕ-С-12. Нэ найдено значительных различий в пострадиационной репопуляции пулов • КОЕ-С-Э и| КОЕ-С-12 в ранние сроки после облучения .(первые две недели),. но в более поздние' сроки выявляется меньшая полнота восстановления у КОЕ-С-12.

Практическая значимость. Шлученные в; работе данные б» сравнительной радиобиологической характеристике двух различаю-' с51хсл по сх^Лй-кй «и34брекциров>ш ростков стволовых кроветворных клеток важны для понимания природы острого лучевого пора-линия такой "критической" системы, какой является кроветворение. Данные о большей способности к репарации КОЕ-С-8 свидетельствуют о том, что для ослабления лучевого поражения организма в острый период более перспективно пытаться воздействовать на уже коммитированные субпопуляции стволовых клеток. Возможно, что защитное и лечебное действие многих генноинжэ-нерных цктокинов и ростовых факторов (таких как' ИЛ-1, ИЛ-З, КСФ-ГМ и др.) в основном реализуются в отношении ускорения ге-мопоэтического восстановления и выживания сублегально и летально облученного организма именно путем активизации репара-тивных и пролиферативных процессов в стволовых клетках, которые уже вступили на путь диффгренцировки. Поэтому полученные в данной диссертационной работе радиобиологические характеристики популяции КОЕ-С демонстрируют пути наиболее успешной стратегии лечения острой лучевой болезни с применением стимуляторов, имеющих приложение к репарации и пролиферации стволовых клеток, а также при решении практических проблем трансплантации костного мозга и применении в этом случае дополнительных стимуляторов пролиферации для клеток стволового типа.

Апробация работы и публикации. 1Ь материалам диссертации ■ опубликованы две статьи и одни тезисы доклада; данные были представлены на конференции НИИ медицинской радиологии (в настоящее время И5дицинский радиобиологический научный центр Российской АМН).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 38 страницах-машинописного текста и состоит из введения, • обзора литературы, раздела "Материалы и методы исследований", трех гДав, излагающих результаты собственных исследований, разделов

обсуждения и выводов. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками,

7 тай лицами. Список цитированной литературы насчитывает 160 публикаций, из них 48 работ отечественных 'к 112 - зарубежных авторов. !..''■■'■■

МАТЕРИАЛ И ЖГОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

i -

Исследования проводились на мышах СБА, | самцах в возрасте'

3-4 месяцев, находившаяся в обычных условиях содержания и питания лабораторного вивария. Кормовой рацион составлялся- наг* основании общепринятых норм, • утвержденных ранее МЗ . СССР- для1 экспериментальных животных. Всего в опытах!израсходовано 2800 мышей СБА, самцов массой 19-20 г, проанализировано более 9000 гистологических препаратов серийных срезов ¿елезенок с гемопо-зтическими колониями.

Использовали классический метод-Тилла и МакКулоха (Till J.E., VfcCulloch Е.А., 1901) с облучением суспензии сингенного • костного мозга от 3-4'мышей, которых забивали путем смешения позвонков шейного отдела спинного мозга. ■ Выделенные бедренные кости тщательно очищали от мягких тканей и обрезали концы эпифизов. Костный мозг из бедренного канала вымывали стерильным солевым физиологическим раствором (0,97. р-р NaCl) с помощью шприца в стерильный бккс. Затем в полученной суспензии подсчитывали концентрацию ядросодержащих клеток и разводили стерильным физиологическим раствором. Приготовленные суспензии костного мозга с концентрацией 10^-10® кл/мл содержали при температуре тавдэго льда. Гамма-облучение суспензии костного мезга и мышей-реципиентов проводили на аппарате "Луч" при мощности дозы около 0,4 Гр/мин. ' ,

Суспензии костного мозга облучали в -стеклянных боссах в дозах 0,5; 1,0; 3,0; 4,5 и Б,0 Гр. Сразу после облучения клетки вводили мышам в хвостовую вену в объеме!о,5 мл. Реципиентами служили сингенные мыши, подвергнутые гамма-облучению в дозе '

8 Гр за два часа до трансплантации костного мозга. Илией-реципиентов забивали через 8 и 12 суток (каждая группа по 12-15 животных), селезенки фиксировали в жидкости Еуэна, подсчитывали число макроскопически видимых колоний. Затем эти селезенки после стандартной гистологической обработки использовали для приготовления серийных срезов (толиуиой 7 уикрон с интервалом между срезами 70 микрон), окрапенньи гематоксилин-эозином для микроскопического изучения (при увеличении- 10 х 10 х 1,5 и

10 х 20 х 1,5).

При подсчете общего числа колоний и при'оценке их распределения по типам дифференцирования различали следующие типы колоний: зритроидные, гранулоцитарные, недифференцированные, мегакариоцитарные и смешанные, согласно рекомендациям ра0рты . (Wolf N. S., 1970). Для характеристики радиочувствительности КОЕ-С использовали метод регрессионного анализа соотношения между дозой облучения (D) и логарифмом доли выживших клеток ' (1е 5), согласно "многомипкнной одноударной модели" по уравнению: - у le S - a D + Ь. ' Параметры, характеризующие радиочувствительность КОЕ-С, вычисляли из следующих соотношений: ;

□ = lg е/а = 0,4343/а; n »i antiloz^b Для оценки значимости различий в частрте встречаемости различных форм "микроколоний" использовали метод "хи-квадрат" (УрСах Ей, 1964). •

Для изучения методами фракционирования и изменения мощности дозы облучения-способности к пострадиационной репарации КОЕ-С, формирующих селезеночные колонии через 8 и 12 суток после трансплантации клеток костного мозга, также использовали метод Тилла и МакКулоха (Till J. Е., McCulloch Е. А., 1964) с облучением трансплантированного сингенного костного мозга в донорах и в организме реципиентов, суммарная доза облучения которых составляет 8 Гр. При облучении КОЕ-0 в организме ijopo-'. ра использовали только большую мопдаость до^и (0,835 Гр/мин), и животные получали 4 Гр однократно или фракционированно (2 Гр + 2 Гр) с интервалом между облучениями в 4 часа. Затем доноров костного мозга забивали, пулировали клетки ;от 3 -6 животных, готовили суспензию на физиологическом растворе (NaCl 0,97.) и вьодили ее внутривенно предварительно (за 2 часа) облученным в дозе '8 Гр реципиентам. •

3 опытах с облучением КОЕ-С в организме реципиентов использовали методы как фракционированного, так и пролонгированного воздействия ионизирующей радиации, а.каждая группа включала 15-20 животных. При этом реципиентов костного мозга, полученного из бедренных костей необлученных мышей-доноров, за 2 часа до трансплантации костного мозга (около 10 клеток) J36—" лучали в дезе 4 Гр. Через 4 часа после трансплантации костного мезга мьшш-реципиенты подвергались дополнительному облучению в дозе 4 Гр, проведенному однократно при высокой или низкой мощ-

ности дозы (0,835 или 0,0334 Гр/мин) или фракционирование 2 Гр + 2 Гр с интервалом между облучениями 4 часа (мощность дозы 0,835 Гр/мин). На 8-е и . на 12-е сутки после трансплантации костного мозга мышей во всех сериях экспериментов забивали, селезенки фиксировали в жидкости Еуэна и подсчитывали колонии, видимые микроскопически. Затем селезенки проводили через спирты, валивали в парафин и готовили- срезы толщиной 7 мхи и интервалом между срезами 70 мкм. Препараты, окрашенные гематоксилин-эозином, микроскопировали, регистрируя число колонии и направление их дифференцирования. . Цри обработке результатов* опытов использовали обычные методы вариационной статистики, согласно опубликованным методическим рекомендациям (Коноплян-ников А. Г., 1975) для данных по выживаемости КОЕ-С. 'В качестве количественного показателя интенсивности восстановления сублетальных повреждений в ЮЕ-С двух типов использовали разность между логарифмами выживания клеток (1г S) при однократном и фракционированном облучении* или при облучении при низкой и высокой мощности дозы. В последнем случае также вычисляли величину константы восстановления Ту, согласно методам, описанным в работе (Акоев И.Г., 1970). Для этого при обработке экспериментальных данных использовали модель, описанную впервые Ai (Lee, 1973) и примененную в ряде следующих работ (Акоев И. Г., 1970; Коноплянников А. Г., 1975; Elkind 1967). Согласно этой модели D = ^ (1 - , где аффективная доза пролонгированного облучения, разноэф$ективная по выживаемости однократному острому облучению в этой дозе, ш - мощность дозы облучения, t - продолжительность облучения, константа восстановления. Для расчетов использовали таблицу, приведенную в монографии (Акоев И. Г., 1970).

Для изучения радиочувствительности и динамики репопуляции КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 в костном мозге сублетадьно облученных мышей доноров облучали в дозе 4 Гр за 42, 28, 21, 14, 7, 3, 1 и О суток до тестирования их содержания в костном мозге. Реципиентов облучали в доэе 8 Гр за 2 часа до трансплантации клеток костного мозга на аппарате "Луч" гамма-лучами б$-Со. Реципиентов забивали через 8 и 12 суток после трансплантации клеток костного мозга, селезенки фиксировали в жидкости Еуэна, подсчитывали колонии, видимые' макроскопически. Шсле гистологической обработки проводили микроскопический анализ колоний, регистрируя их число и направления диффференцировки. ■ Шлученные данные о выходе КОЕ-С использовали для определения их выживае-

мости.

Средние величины,■ их ошибки и значимость различий оценивали, используя общепринятые методы вариационной статистики-Коэффициенты уравнений линий регрессий, характеризующих соотношение различных изучаемых показателей, вычисляли с помощью метода наименьших квадратов (Стрелков Е.С., 1986; Урбах RIOL, 1954). Большинство расчетов проведено на ЭВМ "Раздан".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ '

1. Сравнительная радиочувствительность облученных ин вит- ■ ро КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 при применении методов селезеночных макро и микроколоний

Еольгое количество исследований выполнено с целью изучения сравнительной радиочувствительности КОЕ-С, формирующих селезеночные колонии через 8 (КОЕ-С-8) и 12 (К0Е-С-12) суток после трансплантации детально облученным мышам костного мезга, закономерности восстановления их от внутриклеточных повреждений и динамики пострадиационной репопуляции. Результаты проведенных исследований по сравнительной радиочувствительности облученных ин витро КОЕ-С-3 и КОЕ-С-12 ' при применении метода "макроколоний" представлены на рисунке 1 и в таблице 1. Они свидетельствуют о том, что обе дозовьге кривые близки к экспоненте (величины экстраполяционного числа значимо не отличаются от единицы), а значение среднеклеточной летальной дозы составляют 1,03 и 1,13 Гр для КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, соответственно. На рисунке 2 и в таблице 1 приведены также оценки этих параметров для КОЕ-С двух типов, полученные методом "микроко-локий". D0 составляют для КОЕ-С-8 0,99 Гр, а для КОЕ-С-12 -1,16 Гр. Эти результаты свидетельствуют о том, что радиочувствительность КОЕ-С, облученных ин витро и формирующих "ранние" и "поздние" колонии в селезенке, существенно не различается. Данные нашей работы согласуются с немногочисленными литературными данными (Ган 0. И. Додрия Т. Е , 1989; Тодрия Т. а , 1988; Meijne Е. J., Davids J. А.,- 1989; Wright E.G., Lord B."j., 1979).

Определенный интерес представляет оценка радиочувствительности субпопуляций КОЕ-С, формирующих колонии различного морфологического типа. В контроле необлученные КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 несколько различаются по соотношению различных типое колони:! г табл. 2).' Так, среди "ранних" колоний достоверно* выше

- в -

1д Б

ОгО-ч.

Гр

Доэовые зависимости выживаемости КОЕ-С-8 (1) и КОЕ-С-12 (2), оцененные по выходу "макроколоний" при облучении костного мозга мышей в условиях ин витро. Ш оси абсцисс - доза облучения (0) в Гр, по оси ординат - логарифм доли. выживших клеток (18 Б).

Экспериментальные.точки удовлетворяет следующш уравнениям регрессии:

1. Б= -(0,09 + 0,12) - (0,422 + 0,044) И

2. 1г -(0,11 + 0,10) - (0,383 ± 0,033) Р

- В -

Таблица 1.

Параметры, характеризуйте радиочувствительность облученных ин витро КОЕ-С, формирующих колонии в селезенке через 8 и 12 суток после трансплантации кЬстного мозга детально облученным реципиентам.

N Тест-система 8 суток ' 12 суток

- Ьо П Т>о п

Гр Гр

1. Иакроколонии ' 1,03 0,82 1,13 0,78

2. Микроколонии 0,09 0,81 1,16 0,74

3. Ыикроколонии,

эритроидные 0,97 0,68 1,22 0,89

4. Микроколонии,

гранудоцитарнш 0,98 0,69 1,15 0,66

5. Микроколонии,

недифференцированные 1,04 0,89 1,1В 0,81

б. Микроколонии,

мегакариоцитарные 1,20 0,85 1,45 0,72

7. Мйкроколониии,

смешанные 1,06 1.17 1,72 0,18 •

- ю -

Рис. 2. Дозовые зависимости выживаемости КОЕ-С-8 (1) и КОЕ-С-12 (2), оцененные по выходу "микроколоний" при общении костного мозга мышей в условиях ин витро. Ш оси абсцисс - доза облучения в Гр" СО), по оси ординат - логарифм доли выживших клеток (1г Б).

Экспериментальные точки удовлетворяют следующем уравнениям регрессии:

1. 1е э = -(0,09 + 0,11) - (0,433 + 0,038) Б

2. • 1е 5 = -(0,13 + 0,09) - (0,376 + 0,030) -0

Таблица 2.

Соотношение различных морфологических типов селезеночных колоний, формируемых необлученными КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 а селезенке летально облученных мышей-реципиентов.

Типы колоний Частота встречаемости в %, М + т • 9-суточные колонии 12-суточнве колонии

Эритроидкае 51,1 + 2,3 39,7+3,1 *

Гранулоцитариые 18,0 + 3,0 . 23,5 + 3,5

Недиффэ ренцированные 26,7 + 2,8 20,4 + 3,8

Мегакариоцитарные ' 3,5 + 3,2 4,3 + 3,9

Смешанные 0,7 + 3,4 12,1 + 3,8 *

Общее число проанализированных микроколоний 921 622

* - значимое (р < 0,05) различие между группами по критерию^?1

содержание колоний эритровдного типа (51,IX по сравнению с 39,71 для "поздних"), а среди "поздних" наблюдается большое число смешанных форм (12,11» по сравнению с 0,7% для "ранних"). 1Ь остальным типам колоний различие статистически не значимо. Данные о распределении морфологических типов колоний, образованных облученными КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, -позволили оценил» параметры их радиочувствительности, представленные в табл. 1. Как можно видеть, для большинства предшественников какой-либо' конкретной линии нет существенных отличий от суммарной популяции КОЕ-С, за двумя исключениями. Первое из них касается мега-* кариоцитарных колоний, для которых значение Оо повышается до' 1,20 Гр для "ранних" колоний и до 1,45 Гр - для "поздних" колоний. Такие сведения о большей радиорезистентности ■предшественников мегакариоцитарного ростка уже описаны в литературе (Швец В.Н., Чэртков КС., Сеславина Л.С., 1975) и объясняются с позиции предположения о том, что эти колонии формируются достаточно коммутированными' предшественниками. В этом случае не должно быть существенных различий в радиочувствительности предшественников мегакариоцитарных клонов, формирующих "ранние" и "поздние" колонии. Полученные в данной работе оценки не противоречат такому предположению. Второе исключение связано с весьма большим значением Овдля КОЕ-С-12, формирующих смешанные шкроколонии (при низком значении экстраполяционного числа). По-видимому, это может быть объяснено слиянием в "поздние" сроки части колоний,, что не позволяет отличить истинно смешанные колонии от колоний при пространственном их слиянии от двух и более. Поэтому следует также с осторожностью относиться к данным таблицы 2 о значительно большей частоте образования "смешанных" колоний КОЕ-С-12. Вместе с тем, их общее число а контроле невелико и неточность оценки радиочувствительности возможна только для этой субпопуляции КОЕ-С.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что по своей радиочувствительности КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 при од-никрахном относительно кратковременном гамма-облучении ин вит-ро существенно не различаются. Это может указывать на то, что, вне зависимости от коммитированности стволовой клетки, она обладает одной и той же радиочувствительностью или что формирование "ранних" и "поздних" колоний есть проявление не только возможностей стволоеой-клетки, но и результатом влияния на стволовые клетки гешшэтического микроокруяуения/ Согласно гипотезе "нищ" (Скофилд ?., Декстер Т. М.„ 1982), "пролифера-

тивная карьера" стволовой клетки определяется не ее свойствами и степенью коммитированности, а пребыванием в определенной зоне или вне ее. Эти соображения были подкреплены в работе (Sharp J.S. , Grouse D. A., Jackson J. D. et al., 1986), где в условиях Декстеровской.культуры было показано, что КОЕ-С-12 с большей частотой встречаются в контакте с элементами подслоя, чем КОЕ-С-8. В таком случае и не следует ожидать больших различий в радиочувствительности КОЕ-С-8 и НОЕ-С-12.

2. Оценка способности КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 к пострадиационному восстановлению, оцененная методами фракционированного и пролонгированного облучения

При использовании классической схемы оценки способности клеток восстанавливаться от сублетальных повреждений, по Эл-кинду (Элкинд М., 1972), путем сопоставления эффекта однократного и двукратного фракционированного облучения мышей суммарной дозой 4 Гр, рагделенногб интервалом времени в 4 часа-между фракциями, была изучена способность КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 репари-ровать радиационные повреждения ин виво. Результаты опытов по изучению эффектов фракционирования для КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, подвергнутых облучению в организме донора, представлены в таб-™üo Я Как видно из таблицы, различие в эффективности репарации эа 4 часа, разделяющих первую и вторую фракции облучения, для КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 при использовании метода "макросчета" не выявлено. Различие в эффективности пострадиационной репарации наблюдается только при "микросчете" колоний. В этом случае КОЕ-С-8 статистически значимо превосходят по способности к пострадиационной репарации КОЕ-С-12.- Причина расхождения данных "макро-" и "микросчета" остается неясной, однако несомненно, что "микросчет", при котором учитываются все формирующие колонии в селезенке, более адекватно характеризует суммарную популяцию стволовых клеток. Аналогичные результаты опытов rio изучению эффектов фракционирования для КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, подвергнутых облучению в организме реципиента, • приведены в таблице 4. Они свидетельствуют о том, что КОЕ-С-12 penapupjr-ет радиационные повреждения статистически значимо хуже, чем КОЕ-С-8, как при "макро-", так и при "микросчете". .

Следующая серия опытов была посвящена сравнительному, изучению способности .КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 к пострадиационной репарации методом снижения мощности дозы с 0,835 До 0,0334 Гр/мкн '(и, соответственно, при возрастании времени облучения с 4,8 мин

Таблица 3.

Выживаемость (й и 1еБ) КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 при однократном и фракционированном облучении мышей-доноров костного моэга в суммарной дозе 4 Гр, изученная методами "макро-" и "микросчета", и оценка на этой основе эффективности пострадиационной репарации этих клеток.

Группа ! Показатели выживаемости КОЕ-С, М + ш

! 8 суток I 12 суток

¡ 3 ! 1г5 ! 5 I 1еБ

"Шкросчет"

4 Гр 0,014+0,001 -(1,85+0,04) 0,014+0,003 -(1,86+0,10)

2 Гр+2 Гр- 0,034+0,005 -(1,47+0,06) 0,033+0,006 -(1,48+0,07) Показатель

эффективности ' '

репарации

А 1вэ фр. -1е5 одн. 0,38+0,07 0,38+0,12

(Р > 0,05)

"Шкросчет"

4 Гр 0,015+0,002 -(,1,82+0,04) 0,016+0,004 -(1,79+0,01)

2 Гр+2 Гр 0,030+0,004 -(,1,52+0,05) 0,026+0,006 -(1,58+0,02) Показатель эффективности

репарации А . 0,38+0,06 0,21+0,02

(р < 0,05)

Таблица 4.

Выживаемость (Б и 1дБ) КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 при однократном и фракционированном облучении клеток в суммарной дозе 4 Гр в мышах-реципиентах Устного мозга, изученная методами "макро-" и "микросчета", и оценка на этой основе эффективности пострадиационной репарации этих клеток.

Группа Показатели выживаемости КОЕ-С, М + т 8 суток К 12 суток Э ! ! 5 '. ...--------------------------------—

"Ыакросчет"

4 Гр 0,001+0,000 -(3,00+0,10) 0,013+0,003 -(1,88+0,09)

2 Гр+2 Гр 0,01841,005 -(1,74+0,11) 0,020+0,004 -(1,69+0,08) Шказатель ' • " •

эффективности. • •

репарации А . 1,26+0,15 0,19+0,12

(р < 0,05)

"Микросчет" -

4 Гр 0,008+0,001 -(2,10+0,06) 0,029+0,004 -(1,57+0,06)

2 Гр+2 Гр 0,016+0,002 -(1,79+0,06) 0,036+0,004 -(1,44+0,05)

Показатель эффективности

репарации А 0,31+0,08 ■ . : 0,13+0,07

(р < 0,05)

до Z час). Результата, приведенные в таблице 5, свидетеле ствуиг о том, что эффект мощности дозы достоверно более выражен для КОЁ-С-8, чем для КОЕ-С-12, как по показатели эффективности репарации, так и при расчете , характеризуются скорость экспоненциального убывания накопленной "эффективной" дозы облучения при пролонгированном действии радиации. Полученные наш результаты согласуются сх данными работ (Тодрия Т.Е.' 1685; Ган 0. И., Тодрия Т.Е , 1989), в которых также методом фракционирования дозы облучения изучена способность к пострадиационной репарации КОЕ-С, дающих селезеночные колонии на 8-е и 11-е сутки. Данные об эффективности мощности дозы получены нами впервые. Кроме того, впервые получены данные о восстановлении одновременно методом "макро-" и "микросчета". Можно считать, что, несмотря на все вариации опытов (облучение в организме донора • или реципиента; подсчет селезеночных колоний методом "макро-и "микросчета"), меньшая способность КОЕ-С-12 к репарации сублетальных радиационных повреждений является неоспоримым фактом. Как можно объяснить это свойство наиболее примитивных стволовых кроветворных клеток? Можно предположить, что для этих клеток в интактном организме наиболее устойчивым к радиации является пребывание в Gp -периоде клеточного цикла, так как известно, что для стационарной фазы репарация радиационных сублеталей ослаблена или даже.полностью отсутствует.

Полученные данные укладываются также в ранее предложенную схему (Коноплянников А. Г. „, 1984), согласно которой в процессе коммутирования стволовых клеток они становятся более способными к репарации сублетальных радиационных повреждений. Это соображение также хорошо согласуется с данными о том, что значительная часть КОЕ-С-8 является в достаточной мере коммитированной популяцией, особенно среди эритровдного ростка, даюшэго большую часть селезеночных колоний (Magli М.С., Iscove N.M., Odartchenko N.. 1982; Ploemacher R.E., Brüzs N. H., 1988). На основании изучения различий в способности удерживать витальную окраску (родамин-123) различными фракциями КОЕ-С высказано мнение, что в нефракционированнм костном мозге большинство предшественников 7-8 суточных селезеночных 7).-:олоний относятся к стволовым клеткам с ограниченным пролифе-ративным потенциалом, способным давать по преимуществу транзитные колонии (Ploemacher R. Е., Brozs N. Н., 1988). Как показывает радиобиологические, данные, другим "маркером" для "ранних" КОЕ-С может быть их больяая спсобн-зсгь к репарации

Таблица Б.

Выживаемость (5 и 1е5) Я0Е-С-8 и КОЕ-С-12. при облучении их в организме реципиента в дозе 4 Гр при высокой и низкой мощностях дозы, изученная методами "макро-" и "микросчет^", и оценка на этой основе показателя эффективности пострадиационной репарации А и величины • .

__ I_ '_

Мощность Показатели выживаемости КОЕ-С, М + т

дозы 8 суток I 12 суток

облучения 3 ! ИгБ • •! Б I

»"Ийкросчег"

0,835 •

Гр/мин 0,001+0,000 -(3,00+0,10) 0,013+0,003 -(1,88+0,09) 0,0334 '

Гр/мин 0,014+0,003 -(1,85+0,08) 0,027+0,009 -(1,57+0,13) ' Показатель ■ эффективности

репарации А 1,15 + 0,13 0,31+0,16

V (р < 0,05)

час" 0,137 + 0,015 0,065 + 0,03

(Р < 0,05)

"Ыикросчет**

" 0,835

Гр/мин 0,008+0,001 -(2,10+0,05) 0,029+0,004 -{1,57+0,06) 0,0334

Гр/мин 0,015+0,002 -(1,82+0,06) 0,030+0,003 -(1,52+0,04)

Показатель .

эфффективности

репарации А 0,28 + 0,08 ' 0,05 + 0,04

-1 (Р < 0,05)

чао 0,053 + 0,015 0,013 + 0,010

(Р < 0,05)

- 18 - , сублетальных повреждений, чем они отличаются от популяции ЮЕ-С, формирующее селезеночные колонии после 11-12 суток от момента трансплантации, костного мозга. Конечно, могут быть высказаны и другие гипотезы о природе радиобиологических различий между КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, например, о том, что они оседает после трансплантации в разных органах гемопоэтической системы реципиента (КОЕ-С-8 - сразу в селезенке, а КОЕ-С-12 -' сначала в костном моэге, а затем перемещаются в селезенку). Эта идея уже ' проверялась в работе (Lord В. I., Мэ line их Q., Schofield R et al. , 1989).и была отвергнута; косвенно против кее свидетельствуют также и наши результаты о том, что данные в различии КОЕ-С-9 и КОЕ-С-12 в репарации сублеталей справедливы как для случаев облучения костного мозга в организме донора, так и в организме реципиента. Следует отметить, что различия в способности к репараций сублетальных повреждений в данной работе подучены при облучении костного мозга в организме донора или реципиента, и они не коррелируют с отсутствием различий в значениях экстраполяционного числа для КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, при облучении суспензии костного мозга ин витро.

3. Динамика восстановления численности КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 в костном мозге сублетальнооблученных мышей

Следуюшдм этапом исследований было получение данных о динамике пострадиационной регенерации пула КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 в сравнительном плане в течение достаточно длительного периода после действия сублетальной дозы облучения (4 Гр). Предполагалось проследить не только восстановление численности популяции этих клеток в течение острого периода лучевого поражения (т.е. в течение первого месяца после облучения), но и тогда, когда их численность, достигнув контроля, могла бы вновь измениться в результате активности регулирующих систем, а, возможно, и из -за более медленно восстанавливающихся:повреждение гемопоэти-ческого микроокрумения. Суммарные данные этих опытов представлены в таблицах 6 и 7 и на рисунках 3 и 4. Как можно видеть, облучение в дозе 4 Гр приводит в начальный период к примерно одинаковому сниджению выживаемости КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 по тесту '"макросчета",.а по тесту, "микросчета" выживаемость КОЕ-С-12 несколько ниже,; чем для КОЕ-С-8. Динамика пострадиационного Восстановления для двух популяций КОЕ-С в течение 42 суток после облучения была апроксимирована многочленами третьей сте-

!-д 5 0.50

0,00

-0.50

-1.00

— 1.50 _

• —2.00 -I—I—н—1 I ! 1 ; I ' I—I-0 5 10 1 5 20 25 30 35'40 45

Рис. 'З:. Динамика изменения выживаемости ЮЕ-С-8 (1) и КОЕ-С-12 (2) по тесту "макроколоний".в различные сроки после облучения мышей, доноров костного мозга, в дозе 4 Гр. По оси абсцисс -время после облучения, сутки (Т). По оси ординатлогарифм доли выживших КОЕ-С (1г'5).

Экспериментальные точки удовлетворяет следующим уравнениям регрессии: . „ г

1. 5 = (1,29 + 0,25) 10 Г+ (-9,80 + 1,56) Ю Т +

+ (2,20 + 0,25) 10 Т°+ (-1,61.+ 0,08) .

2. 1е Б ' = (1,27 + 0,04) 10Т*+ (-9,34 + 0,29) ю" Т%

'+ (2,04 +■ 0,05) 10 т°+ (-1,581+ 0,01)

а

п

-•з

Рис. д . Динамика изменения выживаемости КОЕ-С-8 (1) . и

. КОЕ-С-12 (2) по тесту "микроколоний" г различные сроки после облучения мышей, доноров костного мозга, в дозе 4 Гр. По оси абсцисс - время после облучения мышей-доноров костного мозга, сутки (Т). 1Ъ беи ординат - логарифм выживших КОЕ-С (1в Б). Экспериментальные точки удовлетворят следующим уравнениям регрессии: . т I -За"'

1. 1? Б - (1,15 + 0,16) 10 Т + (-9,10 + 1,04) 10 Т +

+ (2,12 + 0,16) 10 А (-1,49 +0,05) г

2. 1В 3 = (0,47 + 0,11) 10 Г+ (-4,84 + 0,71) 10 Т +

+ (1,51 +0,11) 1о'т°+ (г1,49 + 0,04)

Таблица в

Доля выживших в разные сроки облучения в дозе 4 Гр КОЕ-С-8 (оценка методом селезеночного зкзотеста) и соотношение различных морфологических типов формируемых селезеночных колоний

Группы Доля выживших К0Е-д-8 Частота 1 встречаемости разных типов колоний, X

5 эр гр недиф. си мег

Контроль 0,0 0,00 47,0 ' '' 14,6 18,2 16,5 3,7

0 суток 0,03 (-1,52)' 45,3 12,3 22,8 8,2 11,4

1 сутки 0,05 (-1,30) 46,7 7,0 20, В 6,5 19,2

3 суток 0,13 (-0,88)' 50,2 9,2 22,2 7,8 10,6

7 суток 0,45 (-0,34) 52,5 10,2 17,1 7,7 12,Б

14 суток 1,17 ( 0,07) 43,4 28,0 18,3 7,2 3.1

21 сутки 1,18 ( 0,07) 45,2 • 13,8 25,0 6.1 .10,9

28 суток 0,69 (-0,17) 69,8 7,8 4,3 2,5 15,4

42 суток 0,54 (-0,13) 47,2 14,1 27,1 10,5 1.1

Общее число проанализированных колоний - 998

Таблица 7.

Доля выживших в разные сроки после облучения в дозе 4 Гр КОЕ-С-12 (оценка методом селезеночного экзотеста)' и соотношение различных морфологических типов формируемых селезеночных колоний

Типы колоний Лола выживших КОЕ-С-12 Частота встречаемости разных типов колоний, X

Б . 1еБ эр гр недиф. см мег

Контроль 0,0 0,0 45,1 22,1 18,4 7,6 6,8

0 суток 0,03 (-1,52) 40,4 21,1 16,4 15,1 7,0

1 сутки 0,04 „ (-1,34) 35,9 20,1 18,2 13,0 12,8

3 суток 0,09 (-1,04) 37,0 17,4 30,6 11,5 8,5

7 суток 0,25 (-0,60) 43,4 20,2 12,4 12,3 1.7

14 суток 0,60 (-0,22) 38,5 22,3 16,1 18,1 5,0

21 сутки 0,97 (-0,01) 42,1 12,8 18,4 22,6 4,1

28 суток 0,96 (-0,01) 74,7 .2,1 4,3 6,3 12,6

42 суток 0,59 (-0,22) 58,2 13,2 9.4 19,2 0,0

Сба*эе число проанализированных :.. MJtкpcкoлэний - 815

пени, коэффициенты которых даны в подписях к рисункам 3 и 4.

Как можно видеть, для "макросчета" нет значимых различий во всех коэффициентах многочленов для КОЕ-С-8 и КОЁ-С-12, начиная от Т3 до Т° . Таким образом, динамика пострадиационной пролиферации КОЕ-С'двух субпопуляций очень близка При оценке по выходу "микроколоний" динамика этого восстановления немного различалась. Это можно проследить' ва рис. 4, где ход кривой для КОЕ-С-12, начиная с 15 суток, ниже, чем для КОЕ-С-8, т. е. более примитивные стволовые клетки восстанавливаются медленнее и их выживаемость во все сроки ниже. По-видимому, это отражает специфику действия радиации и последуюиэго восстановления более зрелых стволовых клеток и их более "ранних" предшественников. В литературе описано (Harrison D.E., Rüssel E.S., 1972), что для самых молодых клеток характерно своеобразное "постарение", связанное с уменьшением величины пролиферативного потенциала В то же время более зрелый пул клеток-предшественников, начиная с 15 суток после облучения, почти полностью восстанавливается. Интересно отметить, что такое расхождение в поведении двух популяций выявляется только при микроскопическом анализе селезеночных зкзоколоний.

Анализ соотношения разных форм микроколокий, формированных клетками пересаженного костного мозга в разные сроки после облучения (табл. 3 и 4), показал, что они мало варьируют в. разные сроки после облучения. По-видимому, это связано с те:/, что в экзотесте преобразование экзогенных колоний определявшую роль в формировании колоний разного типа играют изменения "микроокружения" в селезенке мышей-реципиентов, которое в данных опытах оставалось стабильным.

Таким образом, заканчивая рассмотрение результатов экспериментов этой серии, можно заключить, что КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 только несколько отличаются по степени их полного восстановления популяции, которое наступает через две недели после облучения и позже. Более примитивные КОЕ-С-12 отстают в полноте восстановления (или, может быть, частично теряют свой "проли-феративньй потенциал") от более дифференцированных КОЕ-С-8. Природа этого феномена требует дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительное изучение радиочувствительности КОЕ-С, формирующих экзогенные селезеночные колонии через 8 и 12 суток после трансплантации сингенного костного мозга летально облученным мышам, с использованием(классического метода учета поверхностных селезеночных "макроколоний," а также метода учета "микроколоний" селезенки во всей ее паренхиме, показало, что радиочувствительность КОЕ-С-12 и К0Е-С-8, облученных ин витро, существенно не различается. •

2. Микроскопический метод учета всех колоний в паренхиме селезенки (микротест) позволил выявить при фракционировании дозы облучения при воздействии на стволовые клетки в организме донора, что . в этом случае R0E-C-8 статистически значимо превосходят КОЕ-12 по способности к репарации.

3. Щри подобном' сравнительном изучении способности двух типов КОЕ-С к пострадиационной репарации при фракционированном 'облучении в организме реципиента показано,что КОЕ-С-12 репари-руют радиационные повреждения статистически значимо хуже, чем КОЕ-С -8, как при "макро-", так и при "микросчете" колоний в селезенке.

4. Щри снижении мощности доаы облучения также подтвержден вывод о более выраженной способности КОЕ;С-8 к пострадиационной репарации. Получены количественные параметры, характеризующие скорость восстановления радиационных повреждений, которые составили 0,137 + 0,015 И 0,065 + 0,030 ч"Va КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, соответственно.

5. Выявлена динамика пострадиационной пролиферации пулов КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 после сублетального облучения в дозе 4 Гр.; в течение первых двух недель после облучения наблюдается сходное, .быстрое восстановление численности пулов КОЕ-С-8 -и КСЕ-С-12, которые учитывались методами "макро-" и "микроко-лон'.иУ. Выявлено неполное восстановление ■ и более выраженное г.свтсрное снижение численности КОЕ-С-12 через 1,5 месяца после облучения. *

6. Таким образом, более коимитированные и формирующие "рак.ч;:,-" селггеночные экгоколоиии КОЕ-С-8 обладают примерно гдк.чакогсй ;ацжчувствителъкостью с КОЕ-С-12, которые являются vene? кскал:т;;;о2анкой популяцией, что показал анализ дозовых за»игиыостег. выживаемости при однократном остром облучении in

vitro. Однако,, использование фракционированного или пролонги- -рованного облучения показало - различие между двумя этими популяциями клеток, связанное с большей выраженностью способности к пострадиационному восстановлению у КОЕ-С-8. Можно заключить, что процесс вхождения стволовых кроветворных клеток 9 днффе-ренцировку приводит, к повышению их способности к" раннему пост- ' радиационному восстановлении.

Описок работ, опубликованных по теме диссертации

1. А. К ТриЕКИна, А. Г..Коноплчнячков. Рвдаочуветяитвтноот»

стволовых кроветворных клеток мыией, формирующих селезеночные колонии через 8 и 12 суток после трансплантации клеток костного мозга (КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12). // Радиобиология.-. 1992. т.32, вып. 2, с. 207-210.

. 2. к. it Тришкина, А.Т.-Конопляннйков. Изучение, методами фракционирования и изменения' мощности дозы облучения способности, к пострадиационной репарации КОЕ-С, формирующих селезеночные колонии через 8 и 12 суток после трансплантации клеток костного мозга //Радиобиология. - 1992. 'т.32, вып.2, с. 312-316. . . • .

3. Тришкина А. И. Изучение радиочувствительности КОЕ-С костного мозга мышей, формирующих селезеночные колонии через 8 и 12 суток после трансплантации кяеток реципиентам. //Радиобиология стволовых и клоногенных клеток: Тез. докл. • конф. НИИ медицинской радиологии, -Обнинск, -1986. с. 54-56.

Вся экспериментальная. часть' опубликованных результатов зыполнена лично диссертантом.

Формат 60x90 I/I6 0{)сетн. печ. Уч.-изд.л. 1,6 Тира* 100 экз. Зак. тш. .'« 323

Отпечатано в типографии государственного предприятия "Бшшнг". 249020, г.Оонинск Калужской ойл., ул. Курчатова, 21