Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности поражения и восстановления стволовых клеток проветворной ткани при старении облученных биологических объектов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности поражения и восстановления стволовых клеток проветворной ткани при старении облученных биологических объектов"

ЛШНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ РЕНТГЕНО-РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ВОЛЧКОВ Владимир Андреевич

УДК: 576.3/.—001.28:577.391

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОРАЖЕНИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ ПРИ СТАРЕНИИ ОБЛУЧЕННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Специальность: 03.00.01 — Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ЛЕНИНГРАД 1991

I

!

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте Министерства здравоохранения СССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. Г. Коноплянников; доктор медицинских наук, профессор В. М. Шубин; доктор биологических наук О. В. Малиновский.

Ведущая организация — Институт биофизики Министерства здравоохранения СССР.

Защита диссертации состоится 29 мая 1991 г. в 12.00 часов на заседании Специализированного совета Д 074.23.01 Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института Министерства здравоохранения СССР (189646, Ленинград, п. Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 70/4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНИРРИ Минздрава СССР.

Автореферат разослан « > апреля 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук

Л. И. Корытова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем». До посладшк лег пятарзо я изучению отдаленной лучевой патология определялся, в ооновном, необходимостью оценки риока для здоровья населения применения диагностических и лечебных методов, связанных о использованием ионизирующих излучений (Курпеишв О.К., 1984; Hall B.J..at el. , I98S; Denekamp J. , 1989), a также прогнозирования медициноках по-олвдотвий применения ядерного оружия ( Ehrlich P.P. et al. Д988).

Новое и весьма' значительное увеличение интереса к поздним проявлениям дайатвия излучений связано о событиями на Чарнобыль-окой АЭС в 1906 г. Маоттабы катастрофы позволяют о уверенностью полагать, что в ближайшие десятилетия развитие радиобиологии будет в значительной отепени определяться проблемами, связанными о ма- ■ дицанокими пооледотвияшГаварий. Состоявшийся в 1989 г. 1-й Вое-ооозныД радиобиологический съезд выделил главные направления развитая этой науки, вавлейшиш из которых ялляютоя: изучение законо-мерноотей воздействия на организм малых доз радиации и исследование отдаленной лучевой патологии (Кузин А.М., 1989; Гуаькова А.К., 1990), •

Состоите кроветворной ткани, являющайоя, при лучевых порам-' наях одной из критических систем млекопитающих, во многом определяет оудвбу облученного организма. Это обстоятельство породило обширный раздал радиобиологической ллтаратуры, анализ которой позволил выявить основные закономерности пораквиия и воастановла-шя гзмопоэза в период острой"лучевой болезни, что обусловило, в свою очередь, появление некоторых катодов профилактики и терапии этого заболевания (Владимиров В.Г. и др., 1989; Баранов А.Е. и . др., 1989; Champíin P. , 1988).

-Н-'ШЩ

кла j

Г- я диссертаций I

Гораздо ыаныи сведений о ооотаяния кроветворения в поздние сроки поола облучения. Воли ^акт возникновения лейкемий у кввог-ных а человека, перекиввих ооадю фазу лучевой болаэии, твердо ' установлен и, болаа того, количественно оценен риок появления этого заболевания ори разных дозах 0 видах шаиэарующах излучений, ю оценки чао гот и тякеоги поздних нелейкешачеоких реакций кроветворения на лучевое воздействие весьма противоречивы (Моокалав Ю.И. я др., 1987), Эга противорачинооть сведений, вообще характерная для доследований в облаот отдаленной лучевой патологии, обусловлена не только большой вариабельностью условий поа тановки . экспериментов и клиндчаояих исследовании, но в при-длительных наблюдениях, наадоанааы влняядй, связанных оо старанием биологических объектов, • ,

^Среда вакнейшах предпосылок, обусловивших планирование и , проведений наотоящего исследования, одедует указать на бурное развитие оовреыанвой гематологии, что порождает необходимость на только равизиа имеющихся данных о феноменологии отдаленной паевой паюаогйА кроветворения, но и постановка спащшдышх акоцери-ивнтоь, в той числа учитиваовдх геронтологича окай аопакт проблеьш.

Стволовые кроветворные клетки являются' родоначальника клетками, обаааачивающшш деятельность гамопоагичаакой оиотвш на протяжении вовй жизни кивотных и человека, В период ос1рой лучевой болезни обнаруживается корреляция мажзд состоянием пула предшественников и выаиваамоотью кивотдых, что дало возможность назвать отволовыа кроветворные клетка "детерминантами внживаемооти" облученных биологичеокях объектов (Коношшшияов А .Г., 1984).

В настоящее время уотановлена вайная'роль кроветворного, ми-кроокрухадяя в восстановлении нарушенной функции гамодоэза, в.

том чиола я в оогрий период посла воздействия ионизирующих излучений (Лащшик Н.В. и др., 1979; Груздев Г.П. и др.. 1987,1989). Ни в ковй мара на умаляя значения состояния клепочной оисгемы мик-роокружвния в формировании лучевой патологии, сладуат указать на то, что значительно меньшая радиочувотвительнооть этих платок, а также отоутотвиа. у них опоообнооти к миграции (Фриденштайн А.Я. и др., 1980) позволяют, учитывая малой зученнооть проблемы в целом, очитать ларвоочерадной задачей изучения роли родоначальных кроветворных клеток в формировании отдалаиной лучевой, патология гемопоэза. Получение новых оваданий в згой области радиобиологии ваяно на только о познавательной точки зрения, но и оущвотванно для ооздания базиоа для разработки опоообов профилактики и коррекции поздней радиационной патологии гемопоэза.

Цаль доследования ооогояла в уотановлании общих закономерностей изменения пула клоноганных предшественников кроветворной ткани в поздние ороки посла облучения и в оценке их патогенати-чаокой роли при формировании отдаленной лучавон патологии гемопоэза.

Оояозниа задачи иооладоваиия:

- оценить некоторые показатели состояния кроветворения в отдаленные ороки посла облучения;

- изучать динацику изменения концентрации колониаобразующих единиц (КОБс) в костном мозга на протяжении практически воай жизни животных, переживших острое лучевое воздайотвиа;

- иссладовать некоторые особенности пролиферации и дифферен-цировки КОВо костного мозга при о таранил облученных и интактных !.шшай;

- сравнить радиочувотвительнооть разных суОпопуляций КОВ с у облучапннх и контрольных яивотных разного возраста;

- ооаоогавигь способность КОЕ о к пострадиационному восстановлению у мышей, переживших оотрый период лучевой болвзйл, и одно-возраатник иятактных юшотных;

- оценить возможность модификаций поздних повреждений пула гамопоэтичаоках предшественников о помощью радиозащитных средств.

Научная новизна.

Впервые в рамках одного иооладования на одних л тех же животных проведана оценка состояния пар^ерачеокой крова, костного мозга и пула гемопоэтачеоких предшественников на протяжении воай жизни животных, подвергнутых общаму однократному облучению.

Впервые установлено, что размеры колоний, формируемых НОВ о g ajT nKClojgjjjj костного мозга мышей,-переживших острую фазу, лучевой болезни, уменьшены по оравнанш о контролем.

Впервые показано, что доля экзоКСВод оу1, находящихся в ота-диа синтеза ДНК клеточного цикла, увеличивается о возраотом, особенно у мышей, перевивших острую лучевую болезнь. Также впервые установлено, что способность клоногенных предшественников двух разных уровней коммитированнооти к репарации шотрадяационных повреждений уменьшена у животных, подвергавшихся лучевому воздействию. Впервые показано, что введение радиопротектора меноамина парад облучением в доза Д1д/Зо вызывает в поздние ороки посла луча. вого воздейотвия достоверное увеличение концентрации экзоКОВоц ÜJ J и ораднай продолжительности кизна мышей,, не влияя на число экзсйШа12 QJ5.

Полученные данные позволили сформулировать представление о ' патогенетической рола поздних радиационных поиравденай клопогонных предшественников кроветворной ткани в развитии отдаленной лучевой патологии гамопоэза.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные в работе результата позволили установить накото-

рыа закономерности поражения и вооотановлания атволовых кроветворных клеток поола завершения острой фазы лучевой болезни, а также определить их роль в формирования отдаленной лучавой патологии гамопоэза. Установленные факты и результаты их анализа имеют первостепенное значение для ооздапия теоретических оонов модификации поздних радиационных эффектов в оногама крови.

Практическая значимость работы ооогоит в выявлении и количественной оценке влияния некоторых новых радиомодя$ицирующих орадотв, а такасе новых форм изваотных препаратов, на пул клоноген-ных предшественников в ранние и отдаленные орока поола острого или хронячеояого облучения в коотномозговом диапазоне доз, что вносит определенный вклад в формирование представлений о путях коррекция ранних и поздних проявлений лучевой патологии.

По теме диооертации издано два аннотированных библиографических указателя: "Отдаленные последствия нейтронного облучения у животных" (1982) а "Отдаленные пооледотвия внешнего облучения в кроветворной оиотеме у животных (иоключая гемоблаотозы)" (1983),

Положения, выиоодиыв да защиту.

1. В отдаленные сроки после облучения обнаружено уменьшение-концентрации атволовых кроветворных клеток разного уровня коммити-рованноотл в костном мозге,изменение их пролиферативных овойотв

и уменьшение способности к пострадиационному восстановлению.

2. Частичная компенсация дефектов в дула клоногенных предшественников обеопачиваатоя за счет увеличения доли отволовых ■ ялзток, выходящих в пролиферацию, и усиления деления клаток во воей цепи мевду стволовыми и созревавшими элементами.

3. Дополнительные воздействия позволяют выявить изменения реактивности гемопоэза, одной из причин которых являютоя длительно парсиотирующие в стволовых кроветворных клвтках повреждения, вызванные лучевым воздействием. .

- в -

4. Применение $армакологнчаоких орздатв, увеличивающих вы-киваемоотъ стволовых кроветворных: платок, ыоасе! быть одним из путей профилактики отдаленной лучевой патологии гамопоэза.

Апробация работа.

Основные результат и положения диссертационной работы до-локаны и обоувдвны на УП, УШ а IX Всесоюзных научных конференциях "Восогаяовиталыша в компенсаторные процессы при лучевых поражениях" (Ленинград, 1979,1982,1986), яа Воесошздш научном оиы- . позиуме "Радиобиологические основы лучевой терапии" (Ленинград, 1980), ва Бовооюзно{1 научной конференции "Радиоыодификаюры в лучевой терапии опухолей" (Обнинск, 1982), на Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической рантгено-радиологии" (Ленинград, 1988), на I Всесоюзном радиобиологическом съезда (Москва, 1989), на Всесоюзной научной кон§арая-цаи "Поражение и восстановлена крове хворания при острой лучевой болезни" (Москва, 1990), на I Всесоюзной научно!.; симпозиуме ТДоле-кудяряо-клаточные цеханязмы хронического (внешнего и внутраннаго) действия ионизирующих излучений на биологические оастаны" (Пущн-но, 1990), а такжа на заседаниях Ленинградского научного общества рентгенологов и радиологов (1980, 1981, 1932). . '

Даооаргацяодяая работа апробирована на заоедания ме&отдель-чеокой научной конференции Центрального яаучно-иссладоватвльокого рентгано-радяологичеокого института Минздрава СССР 22 февраля 1991 года.

Структура и объем работы.

'Диссертация оортоит из введения, аналитического обзора литературы, опадания материала и методов исследования, четырех глав результатов ообопшяных экоперииенюв и их обоуадения, заключения, ецводов, указателя цитированной литературы и приложения. '

Диссертационная работа изложена на 22J страницах машшопиояо-го такота, содержит 4 8 таблиц и 39 рисунков. Баблиографичаокий указатель вилпчаат 333 наименования печатных работ (201 отечественных и 132 иностранных). Приложение содержит 23 таблицы.

МАТЕРИАЛ И ОСНОВНЫЕ ШТСЩЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные мвотниа.

Объектами доследований служили оледующие лабораторные животные (войраот и маооа указаны к началу экспериментов):

- оамцн нелинейных белых крыо в возраоте 3 ыео^ маооой 120150 г разводки вивария ЦНИРРИ Минздрава СССР (112 животных);

- самцы нелинейных белых мышей и гибридов I поколения (СБА х С57 BI) в возраоте 3 мае, массой 18-22 г разводки питомника Рап-полово АН СССР (4935 и 3478 животных, соответственно).

ЛД5О/ЗО для нелинейных мышей и гибридов составляла, соответственно 5,5 t 0,47 (Гр) и 6,8 + 1.32 (Гр).

Облучвние животных.

Воздействие рентгановыш лучами проводилось на аппарата РУМ--17 при следующих условиях: напряжение 200 кВ, оила тока 15 мА, фильтры 0,5 мм Си + 1,0 мм AI, фокусное расстояние 50 ом, мощ-нооть дозы (ВД) - 20 мГр/о. •

Гамма-облучение в доза 4 Гр проводилось ила однократно на установка "ИГУР-Г' (137сз , ВД = 30 мГр/с), или хроничеоки на установке, разработанной з ЦНИРРИ Минздрава СССР ( 60Со, ЬЩ =' = 0,625 мкГр/о).

Для дозиметрии использовали иояизациошшй клинический дозиметр " Robotron " модель М2300 (Германия) и тармолюшшесцантный дозиметр " г о lud 0 " модель 640 Фирмы "Pitman " (Великобритания).

Радиомод ясЕика то ры.

В работе иопользованы два препарата из группы галовдирован-ных аналогов пуриновых оснований: 8-брошофаин (ксантобин) - • 1,3,7-трим8Гял-2,6-диокоя-8-бромп5рия и 8-бромаданин (пурамбин) -6-ашшо-6-бромпурян. Иооладования о использованием указанных opaдоib выполнены «а база лаборатория радиационной фармакологии ЦНИРРИ Минздрава СССР (заведующий - ЛЛ.Вартаяян).

В качеотва радиопротектора был использован макоамия (5-мет-окоитриптамияа гидрохлорид) как в свободном ооотоянш, так и заключенный в большие лецитян-холаотериновые одноолойяые дялосомы. Исследования радяомоди$ицирующаго действия инкапсулированного в дипосомы ыекоамина выполнены на базе лаборатории биотехнология препаратов для лучевой диагностики в юрашш 1ЩРРИ Минздрава СОСР^ (заведующий - О.А.Роэенбврг).

Ооновные методы иосдадования.

Иооледование ооотава периферической крови проводила общепринятыми методами. Коогный мозг для анализа его клеточного ооотава получала о помощью пункция бедренной коотя, мазки окрашивали по Лейиша ну, миелограымы составляли после идентификации 500 клеток.

Для ;гиотологячеокого анализа колониеобразования оалазанки помещали' б фикоатор Буэна, а закем, пооле не обходимой подготовки материала'и заливки его в парафиновые блоки, делали продольные V оврийныа срезы органов толщиной 5 ыкм, которые окрашивали гама-тркоилином и эозинш ( Daría M.I. , 1971). Гемопоатячаокяй тип колоняй идентифицировали,' пользуяоь критериями, указанными в работа Carry P. et al. (1967). Размер колоний определялся при помощи окулярмикроматра.как среднае значение максимальных размеров по двум взаимо- перпендикулярным направлениям (Швец В.H., 1975). Ыитотячеокий индекс определяли посла подсчета чиола митозов в

IOOO клеток колоний шелопдного и эритроидпого типов.

Анализ распределения клеток ноотпого мозга по подержанию ДНК проводился на проточном цито^луодометра (Ягуяов A.C. и др., ■ 1986) па база лаборатории отдаленной лучегой патологии ЦШ1РРИ Минздрава СССР (заведующий - А.С Лгунов). Число кол о ни а образующих единиц в селезенке (К®с) определяли о помощью экзо- и эвдоколо-ниаяьной техники (Коноплянников А.Г., I9V5). Определение доли КОЕо, находящихся в фазе синтеза ДНК, проводилось о помощью введения животным фазосяецифипеоког'о цитоотатика - аксимочонины (Буто-мо Н.В. а др., 198Э).

Статистическая обработка результатов исследований.

Для орашшшя средних величии яопользовалоя t -критерий Стьюданта. Определения довератальаих интервалов выборочных долай, а также оценка достоверности различий между ними проводили с использованием f -преобразования Фишера. Наличие или отсутствие связи мзкду показателями устанавливалось о помощью вычисления коэффициента корреляция непосредственно по значения!/, сопряженных признаков, без группировка выборочных данных в вариационные ряды.

Значения летальных доз разного уровня при определении токсичности препаратов и их радиомодмТицирующеП активности еычисля-лиоь из уравнений линейной регрзооии. Рагреоояонный анализ проводило/? методом наименьших КЕадрлтов, Параметры кривых доза-эфЕект, их .омюкя и Щ радиомодификаторов определяли по способам, описанным в работах Кулянского В .И. (1982) я Савяча A.B. (1978).

ОСЬСЙШЙ Гв'йУЛЬТАШ И ИХ ОБСУдаШВ 4

Оценка некоторых показателей состояния кроветворения

ь ранние и отдадашше сроки после общего острого или хронического облучения.

Самцов нелиааишх крш облучали тотально в возраста 3 чао гаша-лучами ила однократно (Щ=30 мГр/о) ила хронически (0,625 икГр/о) в доза 4 Гр. Через 3,6,13 и 18 иео посла оатрого облучв- • дня животных, а танке одаонозрасгшх шпак тих крыс, умерщвляли ооеокровливаниаи под ь^ириш наркозом и проводила анализ гаио- и миелограш. У этих кавоишх. а также врокивших 12 ыеа после окончания хроничвоного о б луче ши, определяла концентрации КОВ о в ноот-аш мозге. В некоторых опытах шиакпшх крно и одновозрастяых животных, нарекавших оотроа ила хроническое облучение. подвергали повторному гаша-облучению в дозе I Гр (1.Щ=30 ыГр/о) и обследовали через 48 чао.

При анализе миелогракм эритробласты, а танка базо^ ильные и полихридатофильние нормоциты Сила отнеоани к проли^ерарувщим клеткам, а оксифильные - к оозраваювдм. Установлено, что в норме доля миелокарпоцитов зригроидного ряда имеет тенденцию к уменьшению о возраотом,, причем в основном га счат .созревающих клеток. В крови вышеуказанные сдвиги вырашотоя £ возрастем уменьшении 'числа эритроцитов. Содержание гемоглобана в крови поддерживав тоя прак- • тичаоки на поотоянном уровне за очет возрастной тенденции к увеличению его о еде ржания в эритроцитах: линейно в период 6-16 мео о последующей стабилизацией до конца срока наблюдения.

'У облученных животных регистрируется тенденция к уменьшению чиола эритроцитов в крови. Несмотря на'то," что на каждый отдельный орок поал б лучевого воздействия различия между опытом и контролем статистически недостоверны, оаствматичеокиа одноваправленные сдви-

гя позволяв! оделать заключение о атомной .тенденции к эритропо-нил у крыо, переливших острый период лучевой болезни.

Нормальное содержания гемоглобина в кг пен у облученных врио обеопячиваатся некоторш увеличением ого концентрации в эритроцитах, причем на арок G мое поолс облучения различия между опытом и контролем статистически достоверны (19.4 ■+' 0,80 и 15,6 + 0.90 пг, соответственно, Р<0,05). В костном мозге через 3 мео поола • облучоння доля эрятроадннх клеток у облученных крыв достоверно (Р< О,СБ) маньпга, чем в контроле. В более поздние ороки субнормальный уровень эритроцитов в крови у облученных животных обеспечивается постоянным увеличением эрагроидяых Лорм аредц миелока-риоцитов, причем в основном за счет проллферируюашх клеток, доля которых яозраотаат линейно в течения периода наблюдения.

Таким образам, анализ ооатояния эригровдного роотиа кроветворения позволяет оделать вывод о то,ч, что воли в период 3-6 мео после лучевого воздействия незначительно выраженная эритро-пания когшенаируется увеличением содержания гемоглобина в эритроцитах, то в более поздние сроки наблюдается конденсаторное усиления пролиферации эритроидных элементов костного мозга.

У интактных животных пабячдаатоя лилейной уменьшение абсолютного числа лиьфоцатол в крови о возрастом: н = S,9-0,I9- -t (Р<0,05). У облученных кнвотних, как правило, на все исследованные сроки, как в костное, мозге, так а в крови, набдюдаетоя тенденция к уманышзиш абсолютного чяола этих клеток. Учитывая, что не обнаружено статистически значимых изменений общего числа миелокариоцитов по маре старения штатных и облученных животных, тенденция к абсолютно:'! лимо.опешш сопровождается и уменьшением относительного числа лимонитов, причем обнаружена положительная корреляция ( г = .+ 0,70 + 0.2.ÍI; Р<0,05) ыавду

долей &тих клаток в крови и косгиоы мозге. Через 3 мео посла облучения процентное оодеркание этих клеток б коотном ^рзга достоверно (Р< 0,05) увеличено по сравнению о контролем, а затем ли-неГшо С Н - 34,6 - 1,09 --ь ; Р< 0,(35) оникаетоя и через 18 мео становится статистически достоверно пеньте (Р<0,С6) контрольного уровня, который на протяжении кизни кивотных практически на изглвпяатоя.

Таким образом, абсолютное часло лимонитов в крови янтактных животных: линейно уменьшается о возрастал, У облученных крыс относительное оодеркание 'этих клеток в костном мозге уже через 3 мео. достоверно вит контрольного уровня, а затем, линейно уменьшаясь, через 18 нас пооле облучения становится отатпстичеока значило меныав, чем у интактиых кивотяых.

Число граиулоцигов в крови в норме имеет тенденцию к увеличению с возрастом как но абсолютному, так й по относительному • оодерадшш. При анализе шилограмм ыиалоблаоты, промиелодаты и иаелоцити очмаля пролиферируащини, а ывтакиелоццти, палочкой овгмвитоядврные формы - непрола!ерпрующами. В кованом мозга тенденция к возрастному увеличению относительного содержания гра-нулоцитов. обусловлена, в основном, линейным (М 35,2 + 0,79 ч , Р<0,05) возрастанием дола созревающих клаток этого ряда. Абсолютное и относительное' содерналие гранулоцатов в крови и костном мозга у животных, пареаившах общее однократное гамма-облучение в доза 4 Гр, не отличается от значении в контроле.

Установлено, что распределения клаток костного мозга по содержанию ДНК у крыс, проживших 18 мео после облучения, и у одно-.возраотних интактних кавоишх достоверно на различаются. Необходимо указать, что среди шелокариоцатов, ответственных за формирование первого пика на таоюграшв (диплоидное содержание ДНК).

приоутотвуют да только клетка в &0 и Фазах митотичеокого цикла, до и оозревавоиа, т.а. наделшнпся глиалокариоциты. Для получения реальной картшш распределения проли1..ернр7юапх клеток па' фазам цикла необходимо вычаоть долю непролиТ.арпрующих клаток костного мозга. Анализ миелограмм показывает, что доля пооладних о оставляет 77,8 + 4,37 {%) в контроле и 72,3 + 4,10 {%) в опыта. После подочата процента клаток, содержащих диплоидное воличаотво ДНК и вычитания доли непроли:|ерирующах элементов можно оцанить раецраделвнив миелокариоцитов по фазам клеточного цикла (табл.1).

Таблица I

Распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла {%) у интактных и облучеших крыо в возраоте 21 мао

Вариант опыта Фаза клеточного цикла

• 0 ОН 3 0 2+М

Контроль без повторного облучения 16,210,14 39 ,2+4,32 44 ,6+2,75

о повторит облучением 22,8+0,34' 21,4+2,49 55,8+4,37

Р <0,001 <0,01 <0,05

Опыт без повторного облучения 27,8+0,66 35 ,0+5 ,66 37,2+2,13

о повторным облучением 24,1+0,49 27,9+3 ,37 48,0+2,66

Р < 0,001 >0,05 <0,01

Р* <0,001 >0,05 <0,05 "

различия мавду варианга.\'л баз повторного облучения

Анализ резульптов показывает, что у крыс, переживших острую лучевую болезнь, наблюдается достоверное увеличение доли клаток, паходя;щхоя в пазах и уменьшение процента шелоиардоцитов

в фазах а иМ. Если считать, что процентное содержание клеток, 2

находящихоя в разных фазах, отражает их относительную продолжите лыюать, можно констатировать, что у облученных животных увеличивав тоя продолжительность фаз, прадюесувувщих синтезу ДНК или/я уменьшается длительность фазы в2 .

В литература имеются о ведения о различиях в реакции cao те мы крови на дополнительные воздействия и нагрузки у животных, перевивших острую лучевую болезнь, и у. одноюзраотных антактных ооо-бай. В лаотоящеы исследовании в качеотве такого воздействия попользовано облученаа в дозе I Тр, через 48 чао посла которого оценивала ооотояяае кроветворения.

Анализ ооозава крови а костного мозга позволил установить, что воли в коотиш мозге антактных крыо ;в воэраота 21 иео облучение в дозе £ Гр вызываю через 48 чао увалачеаие числа клеток . эритроадаото ростка, то у одновоэрастных животшх, проживших 18. uso после лучевого воздействия в доза 4 Гр, чаоло этих клеток не изыенялооь. Отпечено, что еоли в норма общее чаоло лейкоцитов • в крови после облучения в дозе I Гр имеет тенденцию к увеличению, то у животных, пережавших острую лучевую болезнь, отмечается лейкопения. В nqoTHOM мозга у этих животных наблюдается некоторое уменьшение числа ядрооодержаишх клеток" граяулоцитарного ряда,-что связано о достоварным уменьшением количества созревающих клеток. Анализ распределения ыиалокариоцитов по фазан клеточного цикла позволил уотановить, что у интактвых крыо 21-гмеоячного возраста через 48 чао после облучения в доза I Гр.наблюдаатоя достоверное увеличение доли клеток, находящихоя s a q^j (Jaáax и уменьшение -в 3 фазе. При оболедовании крыо, npostoiujáx 18 neo посла облучения в доза 4 Гр, получены иные результаты: воли в отношении процента клеток в s фаза я о 2+Ы фазах реакция была однотипной.о'

контролем, то доля клеток в о фазах, в отличив от нормы, не увеличивалась, а достоверно умепызалаоь.

Такт образом, дополнительная нагрузка на систему гемопоэза-в вида облучения в дозе I Гр позволила выявить изменения реактив-нооти кроветворения у кивотннх, прокивиих 18 мео после лучевого -воздействия. Предполагается, что одна из причин этих изменений ооотоиг в иотощаниа пула предшественников гамопоэтичеоких клеток.

Результаты определения концентрации КОЕ о в коотяом мозге у крыо, перекивших гамма-облучение в доза 4 Гр и одновозрастных ин-тактных животных, предотавленн на рио, I. Установлено, что число НСВо в I«Ю6 клеток коотного мозга линейно уменьшаетоя о возрастом как у иятактннх крыо ( Н = 38,0-1,60 ), так и животных, подвергавшихся в возраота 3 мео острому облучению в дозе 4 Гр ( я = 16,3-0,74 «ъ ), при этом различия в окорооти уменьшения концентрации Ш?с в опыта и контроле не являются отатистичаоки значимыми.

Сопоставление влияния острого и хронического гамма-облучения на число КШо в 1*10^ миелокариоцигов чераз 12-13 мео посла лучевого воздействия позволило установить, что если изучаемый показатель после острого облучения ооставлял 22,3+10,01 (%) от соответствующего контрольного значения, то после хроничаокого лучевого воздействия - 70,7+19,70 (#). В то же время, еоли концентрации КОЕо через 48 чао посла острого облучения в доза I Гр у интактных крыо и у животных, проживших 18 мео после лучевого воздействия в доза 4 Гр на различались (27-34$ от контроля), то чераз 12 мае после окончания хронического облучения этот показатель составлял 10,313,31 (%).

Таким образом, анализ результатов проведенного исследования позволяет сделать заключение о тог/., что один из механизмов поддер-

Pilo. I. Концентрация КОЕ о в коо гном мозге у крыс и у мишай.

По оси абсцисс - возраст животанх (мео).

По оси ордииаг - число КСЕо в I-I05 клеток коотлого мозга.

Крыаы - I - шпактлш;

2 - облученные в возрасте 3 мае. Мыта- 3 - шИактныа; • "

4 - облученные в возраста 3 мао.

твоя нормальных ила субнормальных знача пли числа клеточ/шх элементов в периферической крови у животных, переживших оотрую лучевую болезнь, заклвчаатся в усилении пролиферация миэлокариоцитов-, оопрововдаюидаоя изменением распределения этих клеток по фазам клеточного цикла. Дополнительное воздействие в виде повторного облучения в доза I. Гр дозволяет через 40 чао выявить изменения.реактивности кроветворения у кивотннх, проживших 18 мео после лучевого воздействия. Одной из причин этого можат лвлятьоя умеиьтаниа числа клоноганных предшественников гемопоэтичаснах клеток.

Морф0Л0ГЯЧ8.0К08 исследование салезеночных экзоколонай,

образуемых К®о костного мозга отареющих антактных и облученных доноров.

Самцов мышей (СВАхС57В1)р1 З-мэоячного возраста подвергали однократному тотальному воздействие редтгеяоэиш лучами в доза 4 Гр. Через 3,6,12 а 20 мео после облучения клетки коотного мозга этах животных, а такяа одиовозрастних интактных, вводили внутривенно летально облучаннт реципиентам. Последних умерщвляли на 8 сутки смещением шейных позвонков, извлекала селезенки, взвешивали их, домещали в (Таксатор Буэна я подсчитывала число колония на . повзрхнЬоти органов. На гистологических препаратах определяла лх кроветворный тип, размер ц киготячеокий индекс в зратровдных и миеловдных колониях.

• Взгешиваниа селезенок реципиентов показало, что во все сроки после облучаддя, кроме Г нес, масса этих органов мышей, получавших костный мозг от доноров, переживших лучевое воздействие, достоверно меныва, чем при использовании одновозрао.тяых интактных доноров. .

Поскольку 'равдшаенти для опыта и контроля выбирались случайно ИЗ ОДЯО:; Я той' ЖЕ группы KU'.ей, то очевидно, что различия в

ыаоое оалезанок могут быть обусловлены только различиями в овой-оавах донорояого материала. Чиоао вводимых клеток костного мозга в обоих случаях было одинаковым, поэтому различая в маооа оелеза-нок реципиентов в самом общем вида могут быть обусловлены яда неодинаковый числом колоний, образуемых донороким материалом, или/и их различной массой.

Зависимость концентрации экзсКОВс^ • от возраота контрольных и облученных животных описывается уравнениями S = 5,2-0,09 -t (Р< 0,001) и К = 4,1-0.11 (ï<û,OI), при этом а опыте» начиная в 3 меоячного срока после облучения,число КОЕо достоверно меньше, чем в контроле (Рио, I).

Измерение колоний позволило установить, что во .вое исследованные сроки после облучения указанный показатель достоверно мвн^ ш в опыте, чем в контроле. Одной из причин уменьшения ореднаго размера колоний может быть изменение распределения колоний но гистологический типам в сторону увеличения доли ыиалоидных. Послед* нив, как изваагяо, имеет меньший размер, Однако, было установлено,, что соотношение колоний разных типов не изменявтоя о возрастом, а у мышей, переживших острую лучевую болезнь, ае отличается от од-новозраотных интактшх. Измерение же размеров колоний миалоидяо-го. ератроидного а вмешанного типов показало, что при использовании s качестве доноров мышей, проживших 3-20 мео посла однократ- -яого облучения в доза 4 Гр, размер] колоний воех определявшихся . гяотологячеокях шов уменьшены, причем в одинаковой мере - в 1,15-1,32 раза (табл. 2).

• Оценка митотачеокого индекса в гамопоэтичвоких колониях позволила установить, что .этот показатель.выше для колоний эритроид-яого типа, чем миелоидного. Ни в одном случае не обнаружены различия между интактяныи мышами и животными, пера жив ¡шли острую лучевую болезнь.

Таблица 2

Размеры колоний различных гистологических типов (мм)

Время шшв облучения (нес) Варвая* опыта Эритроадныа Миалоидныа Смешанна

3 контроль опыт • Р 0,42+0,023 0,35+0,018 < 0.0? 0,30+0,014 0,26+0,011 ' ^ 0,05 ' 0,54+0,019 0,46+0.022 < 0,0Г

5 контроль опыт р 0,46+0,022 0,37+0,021 < 0.01 0,2910,012 0,2-1+0.010 <о,ог ' 0,57+0,020 0,48+0,020' < 0,01 '

12 контроль опыт р 0,47+0,021 0,37+0.018 < 0,001 . 0.29+0,014 0,24-Го ,011 " < 0.0Г' • 0,59+0,026 . 0,47+0,024 < 0,001

20- контроль опыт р 0,41+0,019 0,35+0,017 ' < 0,05 0,29+0,013 0,22+0,012 С 0,001 0.53+0,019 0.46+0.022 < 0,05

■ Оценка радиочувотвятельноота а опособнооти к пострадиационной репарации отволовнх кроветворных клеток при ота-рении облученных и ингалтаих мышай.

Прежда чем начать исследования, тема которых указана в заглавии раздала, необходимо было оценить возможности метода анализа кривых доза-э'Шкг для экзсКСЕод ^ С этой целью было проведано изучение влияния 8-бромаданина и 8-бромкофеина (см. раздел: ■ Материал и основные метода исследования") на параметры кривых доза-эффект. ■ •

Мышей (СВА>£57В1) подвергали общему однократному облучению в дозах 1,0; 1,3; 2,0; 2,5 или 3,0 Тр. 8-бромкофеия в доза 30 мг/кг и 8~брома,пения в дозах 30 и 100 мг/кг вводили мытам внутрибрюшнн о за 24 я за I час до лучевого воздействия. Затем

определяли число акэоНОЗСд 0у1 по описанной вшш методика и отроили кривые завиошооти Быашваамооти КО®о от дозы лучевого воздействия.

В Hopi.ia кривая доза-э^акт шала типичный вид кривой о "плечом", при этом Dg осотавляла 0,60+0,046 Гр, а экотраполяциовнов число равнялось 2,24+0,072, что находится в пределах отмеченных в-литературе колебаний. При введении 8-бромкофеина в доза 30 мг/кг,. а также 8-бромаданина в доза 100 мг/кг, наблюдалоя выраженный радиооенсибилазирующий эффект: ФИД соотавдял 1,7-2,1. Сдадуат откатить, что при этом дооювврио яа измзлялаоь величина D q. Радаомодифицирующва влияние обоих препаратов целиком связано о элиминацией "плача" на кривой доза-эйркт. Зто выразилось, в частности, в уыайышйии значений экотраполявдоияого числа и величины D^ , соответственно, до 1,0 и 0,0.

Известно, что наличие "плеча" на кривых доза-эффект овадв- • талъствувт о опоообнооти клеток восстанавливать жизнеспособность путем репарации лучевого поражения. В соответствии о этим, набдюг даамая в опытах элиминация "плача" на дозоаои кривой должна рассматриваться как следствий подавления,репарационных процвооов в клоногеняых предшественниках кроветворной ткани.

Учитывая, что 8-бромк.офвия о доза 30 иг/кг оказывает примерно такое ха действие на КОВ о, как а 8-бромада шш в доза 100 мг/кг, в дальнейших исследованиях был использован только первый из этих двух препаратов в дезах до 50 мг/кг.Пря этом,' как было показано при специальной проверка, 8-брошофаин вффективая и при введе-наднапооредотвеняо яоола лучевого воздействия*

, Для оценки.радиочувствительностиопоообнооти к пострадиационной репарации экзсКОЕа у мышай,' параживщих острый период лучевой болезни, самцов (СВАзС57В1)f З-ивсячного возраота облучала

в дозе 5 Гр. Чэраз 14 мае поола лучевого воздействия у этих мыкай, а также у интактных животных 3- и I?-месячного возраота определяли параметры кривых доза-э^факт для экзйШЗод . Результаты анализа показали (табл. 3), что по критерию и 0 нет достоверных различий мавду вариантами этого наследования.

Таблица 3

Параметры кривых доза-эффект экзоКОЕод оу1 у облученных и интактных швей разного возраота.

Вариант опыта Повторное воздействие 0 0 п вЧ ад .

3' мао обл. 0,87+0,036 2,40+0,024 0,76+0,033 -

обл.+8-ЕС 1,01+0,180 1,00+0,124 0,00+0,129 1,67

I? мео обл. 1,01+0,087 1,45+0,048 0,37+0,044 -

обл.+8-£К 1,0310,081 1.01+0,026 0,01+0,027 1,36

17 мае облуч. обл. 0,96+0,066 1,28+0,029 0,23+0,027 ' -

обл.+8-£К 1,13+0,068 1,10+0,014 0,11+0,01.6 0,97 .

Значения экотраполяционного чиола и величины , характе-. ризующиа размер "плача" на кривой доза-эф$акт, достоверно меньше , у мышей-I?'-месячного возраота, чем у 3-месячных, а у кивотных, проживших 14 мео пооле облучашш в дозе 5 Гр, маяыш, чем у одно-возраотных интактных особей. 8-бромкофеия, вводившийся животным воех групп при облучении в диапазоне доз от 1,0 до 3,0 Гр для построения кривых доза-эфркт, оказывал аналогичное дапотвиа, а именно, уменьшая экс трансляционное число и величину ^ , практически до 1,0 и 0,0. .'•"•■

Однотипные изменения кривых доза-эффект при введении ингибитора пострадиационной репарации, о одной стороны, и при старении интактных и, особенно, облученных шшоншх - о другой, позволяют

о достаточной уверенностью предположить, что о возраотом уменьшается опоообнооть к пострадиационной репарации в Шо, а у мышей, царе жал тих оогрую фазу лучевой болезни, эта опособяооть еще более уменьшена.

Применение экзотеста позволяет оценить овойства КОЗ о, находящихся . пра имуще о тва яно в о0 стадии клеточного цикла. Для более полной характеристики ооотояния пула стволовых кроветворных клеток было важно оценить состояние популяции проли<$врирующих клоно-геиных предшественников. Такую возмоквооть дает использование эн-доколониального таота. Учитывая, что этим методом невозможно экспериментально оценивать выживаемоеть КШо в области малых доз, в наотолщей работа для оценки опоообнооти этой оубпопуляция. клоно-ганных клеток к репарации лучевых повреждений был попользован метод двукратного облучения.

. На первом этапе этого исследования было необходимо выбрать оптимальное соотношение доз 1-го и 2-го облучения, интервал между ними, а также количественно оценить уменьшение объема репарации ' при введении ингибитора пострадиационного восстановления о целью последующего сопоставления этих данных о результатам основных иооладований.

Работа 'выполнена на белых нелинейных мышах З-меоячного возраста. Животных подвергали общему рентгеновскому облучанвю однократно в диапазоне доз от 6,2 до 7,4 Тр или двукратно в .суммарной доза 7 Гр, изменяя соотношения доз 1-го и 2-го облучения, а также интервал между ними от I до 24 чао. 8-бромког|адя вводили однократно в дозе 50 ыг/кг немедленно поолв облучения. В опытах о фракционированием дозы препарат вводили немедленно после 1-го лучевого, воздействия. Одну группу мышей использовала для определения числа апдоКОЕс на 8 оут после облучения. За другой наблюдали в течение

30 аут для ре^трацйи выживаемое ти о целью оопоетавдения этих " данных о результатами опраделвняя числа КОВ а.

Установлено, что зависимость числа эндсКСЙо ох доги лучевого воздействия отшивается уравнением регрессии: 1е н = 4,22-0,622'

.'где я - число эндоКОВо, а в - доза облучения (Гр). Величина орадней клеточной легальной дозы составляла 0,70^.0,075 {Гр). Вваданае ингибитора раоарацаи не модифицировало отатиотн-чеокя значимо коэффициенты уравнения.

Результат изучения зависимости часла КСЙо и выживаеыоота мышей от иятарвала на ад облучениями в дозах 3 и 4 Гр позволили установить. что в обоих случаях наСладастся фазовые колебания показателей, прячем максимум и минимум их приходятся на одна я те же сроки. Показано, что между выживаемостью животных за 30 оут и ■чиолом эндЬКСШс существует полош!тельная корреляция ( 0,&ь + 0,27, Р< 0,05).

Наличие линейной зависимости числа а идей (К о от дозы облучения позволяв« определить аффективную дозу ( Т> при двукратных лучевых воздействиях, а также объем репарация ( ) как разное» мевду поглощенной я-эффвктявной дозами: 1ГН ав пом-

- ®. в« ' '

Накоима льнов значение , равное 1,13 Гр, регвотрируетоя яри 6-чаоозсм интервале между лучавша воздействиями. В соответствия о этим максимальная эффективность применения ингибитора репарации наблюдается в этот же прок - Уа в 0,43 Гр, что составляет 385? от уровня контроля. В доответотвии о этим, при определении , оптимального соотношения доз 1-го я 2-го облучения был выбран интервал меяду ними в 6 чао. Результата этого исследования позволяли вычислять объем репарация. Макоикальлнй 7Й региотрируетоя при варианте 4+3 Гр, однако, учитывая данные а использованием 8-бром-

кофеина, оптимальным следует считать соотношение 3<-4 Тр. т.к. именно в этом случае регистрируется максимальная эффективность препарата - 44$ от исходного уровня.

Таблица 4.

Зависимость объема репарации от соотношения доз 1-го и 2-го облучения и величины интервала макду ними.

Зависимость от соотношения доз Зависимость от интервала величины

Лоза (Гр) , (ГР) Интервал' V я <гр)

1-ое об лучение 2-ое об лучение без 8-БК 0 8-£К (чао) баз 8-БК ' о 8-БК

0 7 0,00 0,00 0 0,00 0,00

• '1 6 а,62 0,3'2 X 0,57 0,27

2 5 0,75 0,68 3 0,98 0,51

3 4 1,13 0,50 6 1,13 0,43

4 3 1,34 0,71 9 0,35 0,31

' 5 2 1,00 0,52 12 0,26 0,25

6. I 1,11 0,52 24 0,32 0,45

Учитывая изложенное, в опытах по оцзннв способности эндаКШс к репараций оублеталышх поврездвний у стареющих интактных и облученных мышей,кивотннх облучали в доза 3 Гр, а через 6' чао подвергали повторному лучевому воздействию в дозе 4 Гр.

Для оценки радиочувствительности и способности к репарации оублетальшх повреждений эедоКСЕс у мше Я, деракившах оатрую лучевую болезнь, белых нелинейных животных в возрасте 3 мео облучали в дозе 4 Гр. Часта нивотннх немедленно после облучения вводили 8-бромкофеия в дозе 50 мг/кг. Спустя 14' ила 18 мео этих мышей, одновозраотннх интактшх и животных в возраста 3 мес подввргали двукроткому. облучении в дозах 3 и 4 Гр о 6-чаоовнм интервалом мекду 1!®и, а через 8 суг определяла число эндсКОЕс. Одиоч группа мхе Л сразу посла 1-го облучения вводная 8-брад^ойоии.

Оценка эааиоимоош числа эидоКОВо от доза однократного облучения у мишвй в возраста 17 а 21 мео, а также одцовозраотных животных, пробивших 14 и 18 мео посла облучения в доза 4 Гр, позволила уотановить, что соответствующие коэффициенты рагреоош на отличаются достоверно друг от друга, а такка от полученных для интактных мышей в возрасте 3 мео. Соответственно не раэличаютоя и величины в д (табл. 5).

Таблица 5.

Радиобиологическая характеристика эядсКСВо интактных я облученных ыышай разного возраста

Возраог (мео) Вариант1 опыта (Гр) Чаало КОЕо посла фракционированного облучения (Гр)

3 не обл. 0,70+0,075 4,910,38 1,33

17 1 необл. . 0,7110,048 3,3+0,32 0,85

обл. 0,73-10,056 2,4+0,25 0,56

.21 на обл. • 0,72+0,066 3,0+0,36 0,96

обл. 0,75+0,070 1,7+0,17 0,44

В'другой серии экспериментов изучалось влияние возраста а . облучения мышей на уровень репарации су б летальных повреждений в эндоКШо, а такта действия ингибитора пострадиационного восота-яовлания. Установлено, что чиоло эндоКШо после однократного облучения в дозе 7 Гр во всех вариантах опыта одинаково, что ооглаоу-етоя с фактом равенства величины 10 о У молодых, старых а старых облученных мышей.

Оценка связи чиола колоши, образующихся на повархнооти оелезанои при двукратном облучении о введением в-бромкофеина а без него, показала наличие высокой половите льно'! корреляции между ётимд признаками:. г ^ + 0,5би0,125 (Р< 0,001). Этот фа к* овида- •

тельствуат, что реакция мышей вовх экспериментальных групп на введение ингибитора репарации однояаоравланна и пропорциональна иоходному числу эвдсКОЕо. Л алее, можно отметить, что введение 8-бромкофеина при облучении мышей в доза 4 Гр в 3-меоячном возрасте отатиотичаоки значимо не влияло на чиоло эндсКСЕ с через 14 и 18 мео после лучевого возд'айотвия, что дало возможность объединить эти данные.

В табл. 5 предотавлаян сводные данные изучения возраотных изменений в пуле, гамопоэтичеоких предтеотв(яни1:ов, тестируемых о помощью э {[доколониальной техники в поздние сроки поола лучевого воздействия и у одновозрастшис интактных мышей.

' Результаты анализа этих данных позволяют сделать два заключения. Во-пврвкх, способность вндсКОЕо к репарации оублатальных повраадений у старых кивотянх снижена по сравнению с молодыми, а, во-вторых, у мыиай, проживших 14 и 13 мео пооле общего однократного облучения в доза 4 Гр, уменьшена по сравнению о одновозраотна-ш нвоблучаняымд оообями.

Изучение влияния радиозапитянх орадств на стволовые ' кроветворные клетки в ранние и отдаленные сроки пооле лучевого воздействия.

В рамках настоящего исследования оценивалось влияние хими-чаокого радиопротектора,'а именно, мексамина, вводимого перед лучевым воздействием, яа состояние пула -гемопоэтических предшаствен-ников в отдаленные орони пооле облучения. Параллельно оценивалось модифицирующее влияние этого препарата -на среднюю продолжительность хизяи (С1Ш) облученных'кавотных.

Недостаток макааьшна, впрочем, как и д'ругих радиопротекторов, состоит, с одной стороны, в проявлении ссешСическоц активности лишь при дозах, близких к г.акои:.:алы;о перенослу.ш, а с дру-

гой.в краткоор&Чвости (до 20 мин) действия. В этой связи была предпринята попытка уменьшить острую токоичнооть мексамина и пролонгировать aro действие путем заключения в микронапоулы из природных липидов - липоооми.

Изучение оотрой токсичности больших однослойных липооом (БОЯ), овободного максамина (МА) и дипосомной формы радиопротектора (МАБОД) показало, что инкапсулирование позволяет уменьшить токоичнооть препарата в 1,4 раза.

Учитывая токоичнооть МА а БОЛ, а также данные о радиозащитном действии этих препаратов, ври введении ыышам инкапсулированной формы ыакоашша животные полу чаля 30 мг/кг радиопротектора 2 900 мг/кг микрокапоул (по лецитину).

Следующим этапом в изучении препаратов была оценкр зависимости радиозащитной активности от продолжительности интервала между введением и лучевым воздействиям. Установлено, что защитное дер-отзие овободного мекоамяна резко уменьшается а течение.30 мин и при интервала в I час препарат уже практически неэффективен. При введении радиопротектора, инкапоулированяого в БОЛ, его эффективность при 15-мвнутном интервале выше, чем у Составляющих его компонентов. В течение 2-х чао выживаемость животных ооотавляат 50$ и больше. При увеличении интербала до б час сохраняется некоторая активность препарата, обеспечивающая 20-40:* выживаемость.

Для определения ЙЩ менсамина и радиопротектора, инкапсулированного в БОЛ, изучена зависимость выживаемости мышей за 30 я 4 оут от доаи лучевого воздействия.

В "коотномозговоМ" диапазона доз при увеличения интервалов наблюдаетоя линейное уменьшение ЗВД: на 0,16+0,018 (отн.ед. в чао) для инкапсулированного мексамина и на 0,55+0,087 (отн.ел. в чао) для овободного, прячем в первом олучае достоверно недле/шее (Р< 0,05). Раочетное время потери радяозащитной активном (ФЩ1=1)

поставляет 1,2+0,27 и 4,3+0,78 (час) для свободного и инкапсулированного макаашша, соответственно. Следует указать, что при облучении в "кишечном" диапазоне доз препарата практически неэффективны - <ВД составляет 1,08-1,16.

Оцреде ладив числа КОЗ о о использованием эядоколониальном техники у. Ш1В0ТЯЫХ, которым за I чао до облучения вводили максамин в инкапсулированной форме, а также у шшай контрольной группы (без мексамина) позволило установить, что зависимость чивла эндо КШо от дозы облучения в обоих олучаях описывается уравнением вида я = а - 1><в . Это дало возшкнооть оценить значения

В д (0,5-0,7 Гр) в контроле и в ошг8, а также расчетным путем определить ФИД по эвдоКОВо.

Экстраполяция кривых доза-эффект для вкяиваемоата и числа эндоКОЕо в области -ВДо/зо а ^100/30 сказала, что эффективность инкапсулированного в липооош ме'ксамина, вводимого за I чао до лучевого воздействия, линейно снижается при ¡/впличешш дозы. Это косвенно подтверждает одаланннй ранэа вывод о преимущественном радиозаздитнон дайотвид.препарата на кроветворную ткань. Следует указать также, что ФЩ по критерию эндсШЗс в области близкой к ^О/ЗО^бО/ЗО больше, чем по критерию выживаемости и уменьшается достоверно Оыстрае. Это обстоятельство позволяет выоказать предполонанде о более сильном влияния препарата на чаотачно ком-митировашше пролпйерярующие родоначальные клат-ка, чем на плюри-потентаце предшественники^

Влияние радиозащитных средств на ореддаю продолжительность жизни (СШ) ¡швотянх и на состояние пула гемопоэгических предшественников изучено на мшах (СВАхС5731) Р., , которых в возрасте 3 мео облучали в дозе 5 Гр. Одной группа киеотшк за 15 шш до облучения вводили внутривенно ляп осоки в цозе 900 мг/кг (по лецитину),

второй - макод-иш в свободном состоянии в дозе 30 мг/кг, третьей - меисамин, инкапсулированный в лшюоопи а указанных шша дозах. Регистрировали гибель облученных животных, а танке интагшшх особей в тачание всей жизни. У мышей воох трах групп по целому ряду критериев оценивали состояние пула геыопоэтичаоких предшественников через 14-19 ыас после лучевого воздействия.

Результаты определения орадней продолжительности казни мышей представлены в табл. 6. Данные показывают, что облучение в

Таблица 6, доза 5 Гр вызывает укороча-Средняя продолжительно о ть жизни [ша оредшй Пр0должи1альноо-мишеи

та жизни мышей на 16,6% (Р<0,001). Введение больших одноолойных липо.сом на изменяет СШ, а мекоамин, как в свободной, так а в инкапсулированной формах, увала-чина ет практически до уровня контроля. В связи о отсутствием достоверных различай как в ореднай продолжительности' жизни, так и в динамика гибели мазду ' вариантами "Облучение" а "Б№облучение", данные по этим двум : группам была объединены. Аналогичная работа проделана о кривыми выживаемости мышей, получавшими мекоамия в овободном а инкапсулированном ооотояиий. Анализ кривых показывает, что укорочение орад-. ней продолжительности казни облученных мышей связано как о более ранним началом отмарания этих животных, так и о большей его око-роотыэ е. первую половину казни.

Следующим-этапом работы яойлаоь оценка состояния пула гемо-поэтичеоких предшественников, Чиоло 8- и 12-ау точных КОВ о определялась у интактннх мышай 3-х и 22-меоячвого возраота и у животных.

Вариант Число СШ (оут)

опыта мышей

Контроль 70 588,8+14,80

Облучение 1Г0 491,0ь16,57

Е0Д+облучение 60' 484 ,26

8Ш-оолучениа 60 54? ,7+21.65

МАБОЛ+ облучение 60 ' 568 ,2+18,1?

прожавших: 19 мяо' после облучения в дозе 5 Гр без радиопротектора или в условиях защита меквашиом в авоОсдяой или инкапсулированной формах (pao. 2).

Анализ этих данных показывает, что имеютоя различил в изме-нении концентрации двух указанных.оуопопуляций КОВс как при естественном отареиии, так и в реакции на введение радиопротектора. Так, наблюдается достоверное уменьшение чиола KCSog ау1 у старых еивотннх по сравнению с молодыми, В то кз время число КШо^ 0jS на изменяется с возрастом в пределах периода наблюдения, что, естественно, приводит к некоторому уменьшения соотношения 8- и 12-оуточнкх КОТо. У штей, проживших 19. мае поалс лучевого воздействия, набдадасгоя достоверное уменьшение концентрации КС®о обоих типов, однако в большей степени 8-сугочнн'х колоний, что в итоге выракаетоя в еще болеа значительном уменьшили соотношения' KCffiOg gyj/KCÍBOjg 0jj. Введения мекоамяна в обеих формах уваличава-81 концентрации КСЖсд ао не отражается на чиола КОВо12 0уГ» На рио. 2 представлены оредяие величины, полученные при постановке опытов со свободным и инкапсулированным в липосомы мексаманом. Концентрация 8-оуточных КСШо в варианте о хишчбокой защитой не достигает валачин, характаршх для одаовозрастного контроля.

•Анализ оопряяенной изменчивости числа 12-оуточных колоний я средней массы оелезенок позволил установить их высокую положительную коррелят® ( г = +0,97+0,140, Р<0,01). Для КОЕ с 8 0JI

такая корреляция отсутствует ( г = +0,45+0,516, Р?0,Ш). В этой овязи била предпринята попытка расчетного определения сродней мао-оы кроветворной ткани, приходящейся на одну 12-оу точную колонию

»«>' . М - М ^

1ГФ

Рио. 2,'Чиоло 8» й 12-оуточных КСЖо и их соотношения "через 19 мео посла облучения и в контроле,

А - чиолоКШс в 1-ХО5 клеток яоотного мозга, Б - отношение чиола КСВо а я чиолу Шо 12 351 (отя.ед.) . Столбики; чиотыа - КСЕо^

заштрихованные - КШо^ 0уТ.

Кружки а доверительными интервалами - отношение чиола ' 8- к 12-суточным КШо. ' -

1 - 3-мвоячяиа на облученные;

2 - 22-меоячные необлучвнные;

3 - 22-меоячяыв, 19 мво поолв облучения;

4 - 22- месячные, 19 ива после облучения а защитой

макоамином.

где: М - средняя'масса ойлазаяок в данном варианте опыта; М^ -средняя масса селезенок мышей, но получавших костного мозга (41,0+2,47 мг)! И - число колония в данном варианте опыта;

к ф - число колоний эндогенного проиохоздения (0,1+0,08). Бид-■ но (рис. 3), что наблюдается тенденция к возрастному уменьшению Ык у интакишх кивотяых а отатиотячаокв значимое понижение этого показателя у мышей-, шрвюштх острый цвряод лучевой болазнл. Введение радиопротектора эффекта не модифицирует. Эти результаты хорошо коррелируют ( х = +0,99+0,100; Р<'0,01) о даннши,. полученными при прямом измерении колоний. '

Результаты опредэлония доли экзоКСЕсд находящихся в <$азЗ оиятезаДНК, о использованием $азоопецп]/ичаокого цдгоотати-ка - окошочевшш, представлены на рис. 4, Видно, что еола у 3-месячных интактнык животных доля КШсд оуг, находящихся в з -фазе составляет 11+1.0 {%}, у 17-месячных - 27+2,0 {%), то у мышей» проюшгах 14 мае поолв облучения в доза ДДд/зу (5 Гр) - 42+5,2 {%). Введение макоамииа за 15 мая до лучевого воздействия ш модифицировало этот показатель. Поскольку вов указанные значения отатио-тичеокп значимо отличаются друг от друга, мокно сделать заключение, что доля КСЕсд 0у1, находящихся в фазе оиятаза ДНК,'увеличивается о -возрастом мышей, а у еявотиых, переживших острую фазу лучевой болезни, достоверно больша-, чем у одновозрастных интакт-ных. ■

1

О I

I I

...I...,».., 1.

12 8 4

12 14

)0

Рио, 3. Размеры и средняя маоаа одной 12-оу точной колония.

А - оредняя иаооа Оиг), Б - средний размер (мы).

1 - Знивоячныв на облученные;

2 - 22-маоячяыв не облученные;

3. -22-4*6 оячныв, 19 мво поола облучения; 4 22-ывоячныа, 19 мео поола облучения о защитой мвяоамияом. .■■'■.

г

о I i

Р

0

0 ф

$ й

Рид. 4. Вляяниа введения окоимочевшш на число KOEog т

и доля КОВ о в фазе оинтеза ДНК. А - чиоло KOS о в ЫО5 клеток яоотного мозга. Б - доля (5?) КШо в 8 -$ase клеточного цикла. Столбики: чяогые - без околдшчевшш;

заштрихованные - о окоимочевиной. Крукки о доверительными интервалами - доля КОЕ а в. з-^азе

1 - 3-месячные на облученные; '•

2 - 17-меоячные наоблученные;

3 -17-меоячные, 14 мес после облучения;

4 - 17-меоячныа, 14 мео посла облучения о зашитой

макоамином.

Результаты проведанных исследований, а танка анализ данных литературы позволяют, ь оамом общем виде, представить последовательность развития поздних реакций кроветворения на лучевое воздействие:

-•облучение вызывает гибель некоторой доли стволовых кроветворных клеток; Другая чаоть, неаушая палатальные ганатическиа повреждения, на препятствующие делению клеток, обеспечивает регенерацию кроветворной ткани в период острой лучавой болезни;

- некоторые остаточные дефекты геыопоэза, такие как уменьшение терапавтичеокой активности постного мозга при его трансплантации летально облученным реципиентам, уменьшение концентрации воех определяемых in yíyo оубпопуляций колоше образующих единиц (КОВо) в кроветворной ткани, уменьшение размеров колоний и, соответственно, масоы гемопоэтичеокой.ткана, увеличение времена удвоения КОВ с а некоторые другие, редко выражаютоя в уменьшении выхода клеток в периферическую кровь;

- нормальная картина крова в этот период обеопачивается усилением деления клеток ш всей цепи неаду стволовыми а зрелыми, •а также увеличением доли родоначальных платой, выходящих в пролиферацию и диффаранцировку;

т в дальнейшем по мере истощения пула стволовых кроветворных клаток, а также'из-за дефектов в оистаме, обеспечивающих их микроокружениа, компенсация утраченной гемопоэтичеокой функции достигается расширением плацдарма кроветворения за счет неактивных костномозговых облаогей и появлением очагов экотрамвдуллярного ге-мопоэза. В этот пострадиационны!! период в ряда олучаав удаетоя обнаружить соответствующие изыаналия в костном мозге, а в крови ' зарегистрировать уменьшение числа форменных элбмвнтсв;

- наиболее отчетливо признаки декомпенсации гамопоээа выяв-

ляютоя при дополнительных нагрузках на оаатаму и, оообаяно, при повторных лучевых воздействиях, т.к. у животных-, переживших острый период лучевой болезни, снижена способность отволовых кроветворных клеток к поотрадйациоаной репарации,

ВЫВОДЫ

I. Концентрация отволовых кроветворных клеток в костном мозге у мышей и укрыс линейно уменьшается о возраотом животных, при этом у оообей, пережавших общее однократное воздействие рентгеновых или гамма-лучей в дозе ВДо-Ю/ЗО' ^иодо клоногенннх предшественников на протяжении практически всей жизни достоверно меньше, чем у одновозрастных интактннх животных. . ' 2. Доля отволовых кроветворных клеток, сохранивших способность к колоше образованию через I год посла облучения крыс в доев 4 Гр, больше в олучаа хроничаокого воздействия, чем однократного. В то же время, реакция дула предшественников на повторное облучение более выражена у животных, подвергавшихся хроническому ' воздействию гамма-лучей.

3, Эффективность пролиферации стволовых кроветворных клеток, оцененная по колонна образованию в оалезанках летально облученных реципиентов, достоверно снижена в поздние сроки после лучевого воздействия. Это снижение на связано о изменением распределения колоний по гамопоэтичеоким типам,-которое на протяжении всей казна оотаетоя постоянным у облученных и'антактных доноров. •

4. Чао л о форменных элементов в периферической крови у крыс на протяхенаи практически всей жизни по'ола общего однократного облученая в доза 4 Гр находится в пределах нормальных значений о тенденцией к цитопаяаи. Дополнительное воздействие в виде повторного облучения позволяет зарегистрировать у этих животных изменение реактавнооти геыопоэза.

5. Поддержание чиола форменных элементов в периферической крови на уровне нормальных или оубнормальных значений у животных, пережавших острый париод лучевой болэзни, обеопечиваатоя, наряду в другими механизмами рефляции, уоиланиам пролиферации во вовй цепи не иду стволовыми и созревающими клетками.

6. Компенсация возрастного и поатрадиционного истощения дула гамопоэтаческих предшественников и уменьшения эрекмвнооти их пролиферация, по крайней мере частично, обусловлена увеличением доли делящихоя отволовых клеток.

7. Радиочувотвитальнооть эодо- и экзсКОКо, опрадаланная по кривым доза-эффект, одинакова у интактных шшай и у перакивших оотрый париод лучевой болезни и на изменяется о возрастом. Возрастное ограниченна способности этих двух оубпопуляций. стволовых кроветворных клеток к репарации поотрадиционных повреждений более выражено у облученных животных.

8. Введение радиопротектора мекоамияа перед облучением мышей в доза ВДо-Ю/ЗО увеличиваем концентрацию экзсКШсд 0у1 в коотном мозге'в отдалаиные сроки посла лучевого воздействия, что, в свою очередь, являетоя одной из причин достоверного увеличения средней 'продолжительности жизни животных, переживших оотрый период лучевой болезни. ' -

ОСНОВНЫЕ ПЕЧАТНЫЕ ТРУДИ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТШ

дассврщш

1. Волчков ВД. Особенности возраотных изменений кроватворе- ' ния облученных биологичеоках объектов // Проблемы радиационной геронтологии,-под рад.проф, СЛ.Александрова. -М., Лтомиэдат, 1978.- 0, 112-123. . ..

2. Волчков Б .А. Изучение овойагв стволовых кроветворных клеток в отдаленные срока после облучения //Вооотановителъиыа я компенсаторные процессы при дучевих поражениях: УП Воео.иаучн.вопф., Ленинград, '21-23 ноябрь,1979: Теэ.докл.- Л., 1979. - С. 58-69.

3. Волчков В.А., Вартанян I.D., Михайлова Н.Я. Оцанка ра-дии>моди:|ицирую1аего дайотвия 8-<3poMKocJaaaa маюдом экзогенных селезеночных колонвй //Радисбаологичвокиа основы лучевой терапии:

П Всео.науч.симп., Обнияок, ноябрь,1980: Таз.докл. ч.2. - Обнинск, 1980. - С. 23-84.

4. Волчков В А. Изучение колонна образующей способности кроветворных клаюк мшай, поражавших острое лучевое воздейотвиа// Радиобиология. - 1980. - 1.20 - Вып. 6. - С. 924-826.

5. Волчков В.А., Вартанян Л.П., Михайлова Н.Я. Радиосенои-билизирующае дейотвие 8-бромкофеяна на стволовые кроветворные клетки мышей // Радиобиология. - IS8I.-T.2I. - Вып. I. - С .131-133.

6. Волчков В Л., Вартанян Я.П., Михайлова Н, Я. Изучение" радиооенсибилязирующего-действия 8-бромаденина на стволовые кроветворные клетки костного мозга // Радиобиология. - 1982. - Т.22 . -Вып. I. -С. П7-И9.

J 7. Волчков В.А., Михайлова Я .Я.'Репарация оублетальяих'повреждений в стволовых кроветворных платках-и еа модификация при помощи коаятобина //Восстановите льиые и компадоаторнна процаоаы при лучавых поражениях: ЛИ Всес.науч.конф. Ленинград, ноябрь, 1982: Тез.докл. -Д., 1982, - С.45-46.

8. Волчков В Д. Стволовые кроветворные клетка при старении облученных биологических объектов //Йооотанозмельнда и компеноа-торные продаосы при лучевых поражениях: УШ Воас.назч.конф., Ленинград, ноябрь, 1982: Тез.докл. - Л., 1982. - С. 46.

-9. Вартанян Л.П., Волчков В .А,, Михайлова" Н.Я. Влияние 8-бромкофеина на репарации оублегальннх повреждений отволовнх кроветворных клеток мышей при фракционированном облучения //Радиобиология. - 1982.' - Т.22. - Вып. 5. - С. 685-686. '

10. Волчков В.А., Вартанян Л.П., Михайлова Н.Я. Радиооанси-билизаруюшаа влияние некоторых галоидированных аналогов пурина на нормальные и опухолевые клетки кроветворной системы //РадиомодиХш-каторы в лучевой терапии опухолей: Воео.науч.конф., Обшшок, 8-10 декабря, 1982: Таз.докл.-Обнинск,1982. г С. IIG-II7. •

11. Волчков В.А.. Отдаленные последствия нейтронного облучения. Аннотированный библиографический указатель. - Л., 1982. -

61 о.

12. Волчков В.А., Вартанян Л.П., Михайлова Н.Я. Использование метода эндогенных селезеночных колоняЛ для оценки радисиодиТици-руюаего двлствяя 8-бромкофелпа при однократном и повторном луча-

вом воздействии-// РадиоОиология. - 1983. - Т.23. - Вып. I. -"С. 98-100.

13.'Волчков В .А. Отдаленные последствия внешнего облучения в кроветворной оистема у животных (исключая гемобластозы). Аннотированный библиографический указатель. - I., 1983. - 63 о.

14. Волчков В.А., Михайлова Н.Я. Радио»одихициру ющев действие 8-азапшоксантийа //Радиобиология. - 1984. - Т.24. - Вып. I - С. 90-62. •

15. Волчков В .А., Михайлова Н.Я. Сравнение модифицирующего действия актаномицина Д а коантобина на выживаемость мытай при . двукратном облучений/ Радиобиология. - 1984. - Т. 24. - Вып, 4. -С. 555-657.

16. Волчков В.А. Оценка способности стволовых кроветворных клаток'к репарации лучевых повравдений у мышвй в отдаленные сроки пооле облучения// Воостановительнш и комяеноаторныа процаосн при лучевых поражениях: IX Всео.науч.конф. .Ленинград, октябрь, 1986: Таз.докл. - Л., 1986. - р. 106-108.

17. Вартанян JI.II., Волчков В Д., Горнаава Г.Ф., Руданко И.Я. Некоторые итоги экспериментального изучения радиосеноибилизирую-щах овойотв производных пуриновых оснований //Восстановительные

и комиеноаторныа процессы при лучевых поражениях: IX Воес.науч. конф., Ленинград, октябрь, 1986: Тоз.докл. - Л., I98S,-С.176-177.

18. Волчков В.А. Поотрадва'ционпая репарация'и аа моди^ика-цая в отдаленные сроки пооле облучения //Радиобиология стволовых и клоноганных шагоя: Сборник науч.работ.-Обнинок, 1986. - С. 57-

■-60. - • ' • ■' ' I9-. Волчков В.А. Пострадиационное вооотановлвние и отдаленная лучевая патология крова твореная //Актуальные вопроон экспериментальной и клиничеокой рантгенорадиологии: Воас.науч.конф., Ленинград, ноябрь, 1988,: Тез.докл.-.Т., 1988. - С. 233-235.

20. Волчков В.А., Михайлова Н.Я., Розенберг О.А, Применение лапосомной <|ормы максамина пра оотром лучевом поражении // I Воао. радиобиологический съезд, Москва, 21-27 августа, 1989: Таз.докл. Т.З. -Яущияо, 1989. - С. 697-698,

21. Волчков В.А. Нестохастичеокае отдаленные эффекты лучевого воздействия в кроветворной оиотама // I Всео.радиобиологд-чапций оъвзд, Мооква,. 21-27 августа, 1989: Тез»докл. Т".4. - Пущено, 1969,-С. 815-816.• * '

22. Волчков'В.А., Михайлова Н.Я., Розенберг O.A., Лошакова Л.В., Макарьева Н.В., Ханоон К.П. Радиозащатнна свойства лапооом-ной форш макс амина //^Радиобиология. - 1990. - Т.ЗО. -Вып. 2.

- С. 263-266.

23. Волчков В Л., Михайлова Н.Я., Розенберг O.A., Лошакова Л.В., Макарьева Н.В. Сопоставление радиозащитного действия свободного и инкапсулированного в липосомы макоамина в ранниа и отдаленные ороки поолв облучения //Поражение и вооотановленаа кроветворения при оотрой лучевой болезни: Воео.науч.конф., Мооква, 27-29 ноября, 1990: Тез.Докл. - M., - 1990. - С. 16-17.

24. Волчков BJL, Ягунов A.C., Клест'ова О.В., Токалов C.B.» Михайлова Н.Я., Геер Л.И., Кованько Е,Г. Оценка ооотояния крова-творения в поздние сроки после однократного лучевого воздействия /ДТораайние и воостановление кроветворения при острой лучевой болезни: Воео.науч.конф., Москва, 27-29 ноября, 1990: Тез.докл.-Ы.-, 1990. -С. 97-98.

25. Язонов A.C., Волчков ВЛ., Клеотова О.В., Михайлова Н.Я., Чухловин A.B., Еарбан S.A., Ыасарокий Л.Й., Николаевская Л.В., Токалов C.B., Геер Л.И., Лубоыкая Л.С. Изменения состояния крова- ■ творной системы у крыо в отдаленные ороки посла острого и хрони-чаокого (внешнего и внутреннего) действия ионизирующих излучений на' биологичеокие оястамы: I Воао.оимп., Пущшо, 3^6 декабря, 1990: Тез.докл. - Пушило, 1990. - С. 142-143. " '

Р^Л.Тип .ВНР.Зак.22 В,Тир.150. 5.01.91.Ее сплатно.