Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повреждающий и радиосенсибилизирующий эффектыгипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Повреждающий и радиосенсибилизирующий эффектыгипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия"

|-9 119 8

российская академия медицинских наук

медицинский радиологический научный центр

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

Повреждающий и радносенсибилнзирующий эффекты гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия

03.00.01 — Радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнннск — 1992

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре РАМН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор А. Г. КОНОПЛЯННИКОВ.

Официальные доктор биологических наук,

оппоненты: профессор С. П. ЯРМОНЕНК.О;

доктор биологических наук, профессор Н. И. РЯБЧЕНКО.

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский рентгенорадиол отческий институт Минздрава РФ.

Защита состоится «—1992 р. в часов

на заседании специализированного совета Д 001.11.01 и Медицинском радиологическом научном центре РАМН (249020, г. Обнинск Калужской области, ул. Королева, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Аитореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

в. а. куликов

Лктуал1ность темы исследования. Разработка методов избирательного повышения радиочувстпнтслыюсти опухоли и защиты окружающих ее нормальных тканей, т.е. повышение терапевтического выигрыша, является одной из основных задач медицинской радиологии. В настоящее время имеются убедительные данные экспериментальных и клинических исследований, свидетельствующие о существенном улучшении результатов лучевого лечения опухолей при дополнительном воздействии гипертермии (H.H. Александров и соавт., 1980; П.С. Светицкий, 1984; Э.Л. Жаврид и соавт., 1987; Л.Ф. Цыб, А.Г. Коноплянников, 1989, 1991; А.Г. Коноплянников, 1991; Arcangeli A. el al., 1987).

Наряду с изучением повреждающего действия гипертермии на различные опухоли не менее важным является исследование влияния гипертермии на нормальные ткани и органы. Актуальность этих исследований связана с тем, что при нагревании в поле воздействия попадают и нормальные ткани, состояние которых в конечном счете может предопределить результаты лечения. Основные исследования в этом направлении проведены на суспензиях клеток, приготовленных из различных нормальных тканей. Однако при нагревании in vitro исключается важный фактор - кровоток в тканях. Поэтому особое значение имеет исследование повреждающего действия гипертермии на нормальные ткани in vivo, которые проведены в основном на коже и клетках костного мозга, в то время как сведения о повреждающем и радиосенсибилизирующем эффекте гипертермии на стволовые клетки сперматогениого эпителия практически отсутствуют. Знание таких данных имеет теоретическое и практическое значение. Это обусловлено тем, что сперматогенный эпителий является единственной самообновляющейся тканью, в которой клетки стволового типа охарактеризованы морфологически, что дает возможность прямых наблюдений за их реакцией на различные воздействия. В клинической практике гипертермия начала широко применяться для лечения новообразований, локализованных в области малого таза, при котором в зону воздействия попадают и семенники.

Кроме того, в настоящее время в клинической онкологии внедряется общая гипертермия. Поэтому с точки зрения реабилитации больного в постлучевом периоде немаловажное значение имеет прогнозирование изменений в семенниках при терморадиовоздействии.

Известно, что существуют определенные количественные зависимости повреждающего и радиосенсибилизирующего эффектов гипертермии, например, с ростом температуры нагревания на 1°С время равноэффективного 'действия уменьшается в два раза, величина коэффициента теплового усиления зависит по разному от температуры (степенная функция) и продолжительности нагревания (линейная функция) и. т.д. Однако для семенников эти количественные

зависимости практически не изучены.

Важное значение в повышении терапевтического выигрыша придается индуцированному нагреванием феномену термотолерантности. Эта проблема также до настоящего времени не исследована для стволовых клеток семенников и поэтому тоже является весьма актуальной.

Решение этих вопросов может дать информацию о влиянии повреждающего и радиосенсибилизирующего эффектов гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия и, таким образом, расширить существующие представления по феноменологии термолучевого воздействия на нормальные ткани на уровне стволовых клеток.

Цель работы. Исходя из вышеизложенною, целью работы явилось изучение повреждающего и радиосенсибилизирующего эффектов гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия мышей.

Основные задачи исследования: изучение повреждающего действия гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия в зависимости от температуры и продолжительности нагревания;

- исследование радиосенсибилизирующего действия гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия в зависимости от дозы облучения, температуры и продолжительности нагревания, а также последовательности сочетания облучения и нагревания;

- выявление закономерностей радиосенсибилизирующего эффекта гипертермии при ступенчатом гипертермическом воздействии ("up-down"- гипертермия) и изучение радиосенсибилизирующего эффекта гипертермии при индукции термотолерантности.

Научная новизна. При выполнении настоящей работы получены количественные данные о повреждающем и радиосенсибилизирующем действии гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия. Показано, что по сравнению с другими нормальными тканями семенной эпителий достаточно чувствителен как по проявлениям повреждающего, так и радиосенсибилизирующего действия. Пр!' ступенчатом воздействии гипертермии первое непродолжительное (5 минут) нагревание при более высокой температуре (43.5°С) не увеличивало рлдиосенсибилизирующее действие вторичного нагревания при более низкой температуре (41.5°С).

Научно-практическое значение работы. Результаты работы позволили оценить термочувствительность сперматогенного эпителия. Показано, что

г

нагревание свыше 40°С продолжительностью 30 минут и более выбывает значительное повреждение этой ткани и делает ее чувствительной к действию ионизирующей радиации. Отсутствие значительного дополнительного эффекта гипертермии при использовании схемы ступенчатого нагревания нормальной ткани в отличие от такового, выявленного для клеток опухолей, свидетельствуй о перспективности использования этого способа нагревания для получения дополнительного выигрыша при включении гипертермии в схему лучевого лечения онкологических больных.

Структура Ii объем работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя титературы. В библиографии содержится список 44 работ отечественных и 177 публикаций зарубежных авторов. Работу иллюстрируют 22 рисунка и 2 таблицы.

Апробация работы. Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела лучевой терапии Медицинского радиологического научного Центра РАМН 28 мая 1992г.

ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДИК ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на мышах-гибридах Fl (CBAxC57BL/6). Использовались самцы в возрасте 3-4 месяцев (массой от 24 до ЗОг). Животных содержали на стандартном рационе в обычных условиях .лабораторного вивария. Опыты проводили в условиях нембуталового наркоза, применяемого из расчета 70 мг/кг массы тела.

В качестве экспериментальной модели для изучения эффекта раздельного н сочетанного действия радиации и гипертермии служили семенники мышей. В каждую группу брали по 5 животных, опыты повторяли 2-3 раза.

Локальное нагревание семенников мышеи осуществляли термостатируемой водой в специальных кассетах. Заданная температура воды в термостате поддерживалась с точностью до ± 0Л°С. Предварительно была проведена термометрия и установлено, что для разогревания семенника до температуры экспериментов требуется 4.5 - 5 минут, н различие между температурой воды в термостате и семеннике мыши составляет 0.6°С. Это учитывали при проведен!"* экспериментов. Мыши погружались в термссгатнруемую зоду до уровня середин, брюшной полости.

Локальное радиационное облучение кпвотных производили яз пмча-

)

установке "Луч" (60Со) при мощности дозы около 1 Гр/мин в дозах от 3 до 9 Гр. Во время облучения животных помещали на специальных станках. Облучение мышей проводили одним полем размером 1 х 16 см при расстоянии источник -семенник, равном 15 см.

Облучение и нагревание производили в различной последовательности, интервал между воздействиями составлял от 10 минут до 7 суток.

Гистологическое исследование после раздельного и совместного действия гипертермии и ионизирующей радиации проводили на семенниках мышей. Через 35 суток после последнего воздействия животных убивали цервикальной дислокацией, извлекали семенники, взвешивали, фиксировали в жидкости Буэна и переносили в 70% спирт. Дальнейшая обработка была аналогична описанной в работе Withers Н. et al., (1974). Семенники разрезали пополам в экваториальной зоне и после стандартной гистологической обработки приготавливали поперечные срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином. На 5-10 срезах семенников каждого из пята подопытных животных, составляющих одну группу, подсчитывали долю заполненных за счет пролиферации семенных канальцев (Р). Так как локальная регенерация участка канальца может быть обусловлена выживаемостью после облучения одной или нескольких стволовых клеток, то при анализе дозовых зависимостей клеточной выживаемости использовали Пуассоновское преобразование согласно работе Gilbert G. (1974). Основная идея заключается в том, что независимый и случайный характер инактивации стволовых клеток приводит к Пуассоновскому распределению выживших клоногенных единиц в каждом локальном участке среза канальца. Тогда доля пустых канальцев (Р0), равная (1-Р), может быть вычислена из соотношения PQ= e"N, где е - основание натуральных логарифмов, а N - среднее число выживших стволовых клеток, приходящихся на каждый срез семенного канальца облученного животного. Так как N= NQS, где S - доля выживших клеток после облучения, a NQ - среднее число стволовых клеток, приходящихся на срез семенного канальца интактного животного, то можно записать зависимость 1 - Р = e-NoS, Отсюда после несложных.преобразований получим ln(N0S) « ln[-ln(l-P)].

Для изучения количественных зависимостей радиационной выживаемости стволовых клеток сперматогенного эпителия использовали регрессионный анализ между дозой облучения D и величиной ln(NQS), используя уравнение типа ln(N0S) « aD + b. Величина средней клеточной летальной дозы для сперматогенных стволовых клеток (D0) в этом случае вычисляется из соотношения D0 — 1/а, a b -дает оценку числа стволовых клеток в единице объема ткппи у интактного животного (абсолютное число NQ •= e^), если считать, что Dq равно нулю или систематически завышенную оценку этой величины, если D(, больше нуля.

При обработке экспериментальных результатов использовали обычные . методы вариационной статистики и регрессионного анализа (Урбах В.Ю., 1964). Доверительные интервалы средних значений и достоверность их различий рассчитывали при 95% уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И MX ОБСУЖДЕНИЕ

1. Повреждающий эффект локальной гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия

Изучение самостоятельного действия гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия мышей показало, что ткани семенников мышей обладают выраженной чувствительностью к тепловому воздействию, и повреждающий эффект гипертермии зависит от температуры и продолжительности воздействия. При нагревании семенников при температуре 41.5°С в течение 15 минут, их масса практически не отличалась от контроля, при 30 минутной экспозиции - различие статистически не значимо, но уже при нагревании в течение 60 й особенно 90 минут это падение массы статистически значимо. Уравнение зависимости между продолжительностью нагревания и массой семенников "а 7 сутки позволило вычислить, что уменьшение массы семенников в два раза наблюдается после нагревания при температуре 41.5°С и продолжительностью 49.5 минут.

Масса семенников мышей после локального нагревания при температуре 42.5°С в течение 15 минут близка к массе их при 30 минутном нагревании при температуре 41.5°С. Таким образом, при повышении температуры на 1°С время рапноэффективного повреждающего действия гипертермии в этом диапазоне температур сокращается примерно вдвог. Подобная зависимость была описана н для клеток в культуре (Field S., Pleehend N.. 1979), опухолей (Crile G., 1963) и кожи мышей (O.K. Курпешев, А.Г. Коноплянников, 1984, 1987).

На следующем этапе работы использовали методику, позволяющую судить о реакции именно стволовых клеток на нагревание и облучение по их способности репопулировать опустошенные семенные канальца. Локальное нагревание животных производили при температуре 41.5°С в теченне 15. 30, 60 и 90 минут. При микроскопическом исследовании у контрольных мышей обнаружил« активный сперматогенез во всех семенных канальцах. У животных, подвергшихся гипертермическому воздействию при температуре 41.5°С « течение 15 минут, микроскопическое строение семенников почти не отличалось от такового у

контрольных ннтактных мышей, и каких-либо патологических изменений не наблюдалось, что подтверждается и практически одинаковой средней массой семенников мышей контрольной и опытной групп, 100.6 и 99.8 мг соответственно. У мышей, семенники которых нагревали в течение 30 минут, была выявлена картина легкого повреждения, которая может расцениваться лишь как некоторое усиление физиологической дегенерации сперматогенного эпителия; при сопоставлении средней массы семенников этой группы с контролем данные были 84.6 и 95.8 мг соответственно. При морфологическом изучении семенников животных, которых подвергали гипертермическому воздействию при температуре 41.5°С в течение 60 и 90 минут, обнаружено значительное повреждение сперматогенного эпителия (рис. 1). Полученные данные позволили оценить величину 00 - время нагревания при дайной температуре, уменьшающее выживаемость стволовых клеток на экспоненциальном участке кривой "доза-эффект" со 100 до 37%. При нагревании до 41.5°С величина равна 40 минутам.

1п<£*>2;|

30 60 90

Вреыя нагревании в минутах

Рис. 1. Выживаемость стволовых клеток сперматогенного эпителия мышей после

НаГрСЬйНИз! Прп »смпсршуус

По оси абсцисс- продолжительность нагревания в минутах, Т; по оси ординат-натуральный логарифм вычисленного числа всех выживших стволовых сперматогенных клеток, 1п(8Ы0). Экспериментальные данные соответствуют следующему уравнению регрессии: 1п(8М0) ■» 2.26 - 0.025Т.

Таким образом, удалось установить по тесту изменения массы органа и по тесту выживаемости стволовых клеток, что ткани семенников обладают

выраженной чувствительностью к тепловому воздействию, и наблюдается она начиная с температуры 41°С.

2. Радиосенсибнлизирующий эффект гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия

Изучение закономерностей радиосенсибилизирующсго эффекта гипертермии показало, что эффект зависит от температуры, продолжительности ее воздействия, дозы облучения и последовательности применения нагревания и облучения.

Нагревание семенников проводили при температуре 39, 40 и 41°С в течение 30 минут и сразу же после нагревания осуществляли облучение в дозе 9 Гр. Контролем служила группа мышей, которым проводили только облучение семенников в дозе 9 Гр. При сопоставлении средней массы семенников оказалось, что данные, полученные при нагревании до 39 и 40°С и облучении близки между собой и незначительно отличались от контроля, 29.3, 28.2 и 31.4 мг соответственно. При нагревании семенников до 41°С и облучении масса семенников уменьшалась статистически значимо по отношению к контролю, 24.5 и 31.4 мг соответственно. Результаты экспериментов показали, что увеличение температуры нагревания семенников повышает их радиочувствительность, т.е., как и повреждающее действие, радиосенсибилизация возрастает с повышением температуры, причем эффект ее по тесту изменения массы семенников заметен начиная с температуры нагревания 41°С.

При нагревании до температуры 41.5°С в течение 30 минут и облучении в дозе 9 Гр использовали различную последовательность применения гипертермии и облучения: 1) облучение и через 5 часов нагревание; 2) нагревание и сразу облучение. Контролем служила группа животных, которых только облучали в дозе 9 Гр. Величины средней массы семенников мышей в опытных группах несколько различались между собой и статистически значимо отличались от контрольной группы (23.2, 20.5 и 29.0 мг соответственно).

Для построения кривых "доза-эффект" по тесту, изменения массы семенников проводили локальное облучение в дозах 3, 5, 7 и 9 Гр и нагревание при температуре 41.5°С в течение 30 минут (рис. 2).

При сопоставлении средней массы семенников мышей в разных группах оказалось, что степень повреждения при различной последовательности применения гипертермии и облучения неодинакова, и все опытные группы значительно отличались от контроля. Наибольшее уменьшение массы но отношению к

У

5 ШР

4

.1 2

3

2

7

Э

5

Доза овлучени« а Гр

Рис. 2. Изменение средней массы семенников мышей, подвергшихся нагреванию при температуре 41.5°С и облучению.

По оси абсцисс - доза облучения в Гр; по оси ординат - натуральный логарифм средней массы семенников мышей (1пР). Разными символами обозначены разные опыты:

0 - контроль (только облучение);

В - гипертермия проводилась через 5 часов после облучения; Д - гипертермия проводилась непосредственно перед облучением. Экспериментальные данные соответствуют следующим уравнениям регрессии:

1) 1пР - 4.06 - 0.0730;

2) 1пР - 3.67 - 0.0380;

3) 1пР - 3.57 - 0.0650.

контролю наблюдалось при облучении, проводимом сразу же после нагревания, меньшее - при нагревании, проводимом через 5 часов после облучения, однако, это различие статистически не значимо.

При изучении радиосенсибилизирующего действия гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия семенников мышей удалось установить, что нагревание по 34 и 40°С пе г.рг.гслз к су£;сс-1искп0п радиосенсибилизацчи или габели стволовых клеток семенников, и выход выживших клеток при совместном действии нагревания и облучения в дозе 9 Гр был примерно таким же, как и после одного облучения в дозе 9 Гр. Гипертермия, однако, оказывала выраженное радиосенсибилизирующее действие на стволовые

О

клетки сперматогешюго эпителия при нагревании до 41°С до облучения (рис. 3).

1п(5М} -1.0

-1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -3.5

8 9 9

1 И !!1 Ш.

Группы животных

Рис. 3. Изменение числа выживших стволовых клеток сперматогешюго эпителия в зависимости от температуры нагревания п облучения. Римскими цифрами показаны группы животных: I - 9 Гр; II - 39°С + 9 Гр; III - 40°С + 9 Гр; IV - 41°С + 9 Гр. По оси ординат представлены значения натурального логарифма числа выживших стволовых клеток в участке среза каждого канальца, 1п(ЗЫ0).

Эти данные хорошо согласуются с результатами при тестировании эффекта облучения и гипертермии по изменениям массы семенников. Повреждающий эффект при воздействии только одной гипертермии при температуре 41°С и 30-минутной экспозиции отсутствовал.

Для изучения влияния различной последовательности применения гипертермии и облучения по тесту выживаемости стволовых клеток сперматогенного эпителия использовали температуру нагревания 41.5°С в течение 30 минут и облучение в дозе 9 Гр. Облучение и нагревание проводили по следующей схеме: 1) облучение и через 5 часов нагревание; 2) нагревание и сразу облучение; 3) только облучение (контроль). Было установлено, что показатели клеточной выживаемости не одинаковы, причем наиболее выраженный радиосенсибилизирующий эффект гипертермии наблюдали при нагревании непосредственно перед облучением. Значение натурального логарифма выжившей фракции клеток при" применении гипертермин через 5 часов после облучения

близки к данным, полученным при использовании одного только облучения в дозе 9Гр.

На рис. 4 представлены данные по изучению зависимости "доза-эффект" по выживаемости стволовых клеток сперматогенного эпителия мышей.

Доэа облучения в Гр

Рис. 4. Дозовая зависимость выживаемости стволовых клеток сперматогенного эпителия мышей, подвергшихся воздействию облучения и гипертермии (1); только облученных (2).

По оси абсцисс - доза облучения в Гр; по оси ординат • натуральный логарифм абсолютного числа выживших клеток в участке среза каждого канальца. Экспериментальные данные соответствуют следующим уравнениям регрессии:

1) ln(SN0) = (0.33 ± 0.25) - (0.38 ± 0.04)D;

2) ln(SN0) = (2.40 ±0.52) - (0.52 ± 0.08)D.

Дозовая кривая клеточной выживаемости для интактных животных представляет собой экспоненциальный участок кривой выживаемости клеток, облученных in vive, и по методическим условиям в ней отсутствует начальная часть ("плечо"). Как известно, это характерно и для аналогичных методик определения выживаемости стволовых г.рсгстьорных клеток (КОЕ-С) методом селезеночных эндоколоний и стволовых клеток кишечного эпителия (А.Г. Коноплянников, 1984). Однако, приняв оценку величины "плеча" из опытов по фракционированному облучению (так называемое определение величины D2 - Pj (Fowîer J., Denekamp J., 1977)) можно оценить ход всей кривой и, что является важным, оценить в

последующем выживаемость клеток не только в абсолютном значении выхода колоний (т.е. SNq), а в относительном значении величины S. Если принять, что значение дозы "плеча" для стволовых клеток семенного эпителия составляет 3 Гр, как это сделано в работе Fowler J., Denekamp J. (1977), то исходный уровень InNQ составит 0.84, а величина NQ - 86 стволовых клеток на поперечный срез каждого семенного канальца.

Дозовая кривая клеточной выживаемости для случая облучения в гипертермии также спрямляется в изученном диапазоне доз облучения и для ее характеристики, как и для интлктного контроля, можно использовать значение средней клеточной летальной дозы DQ. Была обнаружена способность гипертермии уменьшать выживаемость облученных стволовых клеток сперматогенного эпителия. При этом наблюдается сдвиг кривой "доза-эффект" влево по оси абсцисс без существенного изменения наклона дозовой кривой, т.е. без значительного изменения величины D0 (1.93 ± 0.31 и 2.63 t 0.27 Гр соответственно; различие статистически не значимо). Подобный характер изменения дозовой кривой выживаемости клеток можно объяснить тем, что за счет действия гипертермии происходит уменьшение "плеча" (или даже его полная элиминация).

Дозовая кривая клеточной выживаемости при нагревании семенников до 4Г.5°С в течение 30 минут через 5 часов после облучения в дозах 3, 5, 7, и 9 Гр также спрямляется в изученном диапазоне доз облучения, но в данном случае обнаруженная способность гипертермии уменьшать выживаемость стволовых клеток сперматогенного эпителия била выражена в меньшей степени, чем при применении гипер ермии непосредственно перед облучением.

Таким образом, при изучении эффекта гипертермии на клоногенную способность стволовых клеток эпителия семенников мышей, подвергнутых облучению, было замечено, что нагревание семенников оказывало выраженное радиосенсибилизирующее действие, несколько снижая величину средней клеточной летальной дозы, причем наиболее выражено радиосенсибилизирующее действие гипертермии было при нагревании семенников непосредственно перед облучением. Это связано с тем, что предварительное нагревание выключает на более длительный срок ферменты репарации и потому приводит к реализации эффекта радносенсибилизации. Снижение радиосенсибилизируюшего эффекта в случае нагревания через S часов после облучения можно объяснить тем, что за это время происходит восстановление части повреждений, способных сгнсргнчесг.им образом взаимодействовать с гипертермическнмн повреждениями.

3. Закономерности радиосенсибилизирующего эффекта гипертермии при ступенчатом гипертермическом воздействии и при индукции термотолерантности

В настоящем исследовании впервые охарактеризован радносенсибилизирующий эффект ступенчатого гипертермического воздействия ("up-down"- гипертермия). Нагревание проводили по схеме: 1-43.5°С(5мин)+41.5°С(25мин);II-41.5°С(ЗОмин);Ш-43.5°С (5мин). Сразу же после нагревания производили облучение в дозах 7 и 9 Гр. Контролем служила группа животных, которым осуществляли облучение семенников в дозах 7 и 9 Гр. Результаты показали, что ступенчатая гипертермия существенно не влияет на изменение массы семенников мышей по сравнению с действием обычного нагревания .при температурах, которые использовали для создания ступенчатой гипертермии.

Для исследования радиосенсибилизирующего эффекта ступенчатой гипертермии на стволовые клетки сперматогенного эпителия мышей использовали ту же схему нагревания и дозы облучения 7 и 9 Гр. При микроскопическом исследовании семенников мышей, которых подвергали действию гипертермии, обнаружили значительное повреждение сперматогенного эпителия по сравнению с контрольными группами (только облучение). При сопоставлении значений, характеризующих число выживших после действия радиации и гипертермии стволовых клеток сперматогенного эпителия, обнаружено, что данные, полученные при ступенчатом нагревании и нагревании до двух разных температур, которые использовали для создания ступенчатой гипертермии, статистически значимо не различаются между собой.

Радиосенсибилизирующее действие ступенчатой гипертермии по выживаемости стволовых клеток сперматогенного эпителия в этом случае было явно меньше чисто аддитивного эффекта, т.е. предварительный непродолжительный нагрев при высокой температуре не усиливал действие относительно низкого температурного воздействия.

Пока невозможно объяснить наблюдаемый эффект. Вряд ли можно говорить о том, что первое непродолжительное нагревание успевает индуцировать термотолерантность к действию последующего птерегз нагревания при относительно низком уровне температуры. Возможно происходит изменение кровотока в нормальных тканях, усиление которого ослабляет повреждающий эффект гипертермии. Если этот эффект специфичен только для нормальных тканей с хорошей физиологической регуляцией кровотока и отсутствует для опухолевых тканей (согласно литературным данным использование схемы "up-down" усиливает лучевое повреждение опухолей), то прием аупенчагой гипертермии может

Таблица 1

Оценка суммарного радиосенсибилизирующего эффекта гипертермии при простои аддитивности двух воздействий (43.5°С (5 мин) и 41.5°С (25 мин), 9 Гр)

Группа Величина In(SN) экспериментальная Расчет Величина суммарного эффекта гипертермии Достоверность различий расчетной и экспериментальной выживаемости

43.5°С (5 мин) + -4.17

41.5°С (25 мин) -> -4.00 -3.66 ± -6.40 ±

("up-down") 9 Гр -4.3S р < 0.05

-4.66 0.36 0.75

-4.2S

41.5°С (30 мин) --> -4.00 -3.21 ±

--> 9 Гр -3.58 0.55 р < 0.05

. -3.76

43.5°С (5 мин) ~> -3.58 -3.19 ±

--> 9 Гр -3.82 р < 0.05

-3.46 0.51

-4.12

оказаться перспективным для применения в клинической терморадиотерашм опухолей для расширения радиотерапевтическсго интервала.

Большое значение в повышении терапевтического выигрыша придается индуцированному нагреванием феномену термотолерантнс^ти. Однако, многие стороны его проявления до настоящего времени остаются не изученными. Проведенные в данной работе исследования термотолерантности дополнили имеющиеся сведения, т.к. до настоящего времени эта проблема не изучена для стволовых клеток семенннков.

В опытах была использована температура нагревания 41.5°С, время первой тепловой дозы составило 10 минут, второй - 30 минут, доза облучения - 7 Гр. Промежуток времени между первым и вторым тепловым воздействием составлял I, 2 и 7 суток. Кроме этого была группа животных, которым производили обычное гипертермическое воздействие и облучение (41.5°С, 30 мин —1» 7 Гр) н контроль с облучением (7 Гр). При сопоставлении значений средней массы семенников оказалось, что данные, полученные при индукции термотолерантностя и обычной гипертермии близки между собой и значительно отличаются от контрольной группы. По изменению средней массы семенников мышей пе иабяюдаетс«

снижение радиосенсибилизирующего эффекта гипертермии за счет индукции термотолерантности.

Дальнейшее изучение этого эффекта проводили на стволовых клетках сперматогенного эпителия по их способности репопулировать опустошенные семенные канальца. Нагревание проводили при температуре 41.5°С в течение 10 и 30 минут и облучали в дозе 7 Гр. Промежуток времени между первым и вторым тепловым воздействием составлял 1, 2 и 7 суток. Контролем служила группа животных, которым производили облучение семенников в дозе 7 Гр. Кроме этого была группа с обычным гипертермическим воздействием и облучением. При морфологическом исследовании семенников мышей обнаружили значительное повреждение сперматогенного эпителия в опытных группах при сравнении с контролем. При сопоставлении значений, характеризующих выживаемость стволовых клеток сперматогенного эпителия групп, где повторное нагревание производили через .2 и 7 суток, а также выживаемость при обычном нагревании, статистически значимых различий не обнаружено. В то же время в группе, где повторное нагревание проводили через 1 сутки, выживаемость стволовых клеток сперматогенного эпителия выше, чем при однократном нагревании.

Таким образом, впервые был выявлен эффект индуцированной термотолерантности для стволовых клеток сперматогенного эпителия, который наблюдается через 1 сутки после первого нагревания, что согласуется с литературными данными. Эффект индуцированной термотолерантности для этой ткани выявлен по уменьшению радиосенсибилизирующего эффекта гипертермии, который, по-видимому, будет коррелировать и с уменьшением повреждающего действия гипертермии на сперматогенный эпителий. Через двое суток после первого нагревания выраженность эффекта индуцированной термотолерантности исчезает.

Таким образом, сперматогенный эпителий оказался удобным объектом для радиобиологических исследований, и приведенные в данной работе сведения являются только первым шагом в изучении радиобиологии и термобиологии стволопых клеток семенников. Работа в этой области будет продолжена и в дальнейшем. Вместе с тем, выводы, полученные в данной работе, уже сейчас позволяют расширить наши предст2Еле;:::я о раздельном и совместном действии гипертермии и радиации на нормальные ткани и использовать некоторые из схем их сочетания для расширения радиотерапевтического интервала.

ВЫВОДЫ

1. Ткани семенников мышей обладают выраженной чувствительностью к тепловому воздействию; при нагревании их до температуры 41.5°С половинное падение массы

через 7 суток наблюдается при воздействии гипертермии продолжительностью около 50 минут. При морфологическом анализе повреждения сперматогенного эпителия нагреванием до температуры 41.5°С величина Do составляет 40 минут. При нагревании до температуры 40°С при продолжительности 60 минут изменение массы семенников не обнаружено.

2. Гипертермия повышает радиочувствительность ткани семенников мышей к действию ионизирующей радиации. При нагревании в течение 30 минут до облучения эффект радиосенсибилизации по тесту изменения массы семенников наблюдается начиная с температуры 41°С.

3. Радиосенсибшшзнрующий эффект гипертермии наблюдается и по тесту выживаемости стволовых клеток сперматогенного эпителия мышей. При нагревании в течение 30 минут до облучения повышение радиочувствительности по этому тесту наблюдается начиная с температуры 41°С.

4. Эффект радиосенсибилизации клеток сперматогенного эпителия при предварительном нагревании до 41.5°С в течение 30 минут проявляется в основном не в изменении величины D0, а в примерно равномерном уменьшении выживаемости клеток в диапазоне доз облучения 3-9 Гр, что можно объяснить уменьшением "дозы плеча" на кривых клеточной выживаемости.

5. Эффект гипертермической радиосенсибилизации наблюдается не только при нагревании, проводимом непосредственно перед облучением, но п при нагревании до температуры 41.5°С, проводимом через 5 часов после облучения, однако выраженность такой радиосенсибилнзации несколько слабее, чем при нагревании перед облучением.

6. Нагревание ткани семенников по схеме "up-down" (непродолжительное нагревание - 5 минут при температуре 43.5°С и затем нагревание при сниженной температуре 41.5°С в течение 25 минут) не повышает эффекта радиосенсибилизации при сравнении с действием одного только нагревания при температуре 41.5°С в течение 30 минут перед облучением. Так как такое воздействие согласно литературным данным усиливает лучевое повреждение опухолей, то использование схемы "up-down" может расширить интервал различий в модифицированной радиочувствительности опухолевых и нормальных тканей.

7. Впервые выявлен эффект индуцированной термотолерантности для клеток сперматогенного эпителия. Максимальное проявление эффекта термотолерантности наблюдается через 1 сутки после нагревания до температуры 41.5°С в течение 10 минут. На 2-е и 7-е сутки после такого нагревания значительного проявления эффекта термотолерантности выявлено не было.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коноплянникова O.A., Лебедева Т.В. Радиосенсибилизирующий эффект гипертермии для стволовых клеток сперматогенного эпителия // 2 Всесоюзный симпозиум с международным участием "Гипертермия в онкологии": Тез. док. -Минск. - 1990. - С.44.

2. Коноплянников А.Г., Коноплянникова O.A., Солонцова Л.В., Герчиков А.Н., Лебедева Т.В. Специфический эффект ультразвуковой гипертермии на тестис мышей // Международный симпозиум "Механизмы аккустических биоэффектов": Тез. док. -Пущино. - 1990. - С.28.

3. Лебедева Т.В., Коноплянникова O.A. Радиосенсибилизирующий эффект гипертермии (41.5°С, 30 мин) для стволовых клеток сперматогенного эпителия мышей // Рукопись депонирована в ВИНИТИ, 1992, N 2384-А4, 6с.

Подписано к печат:; 01.1С. 15321. Формат 60x90 1/16

Усл. п. л. 1. . Уч.-из. л. 0.7. Тираж 100. 2, £•-£<!'

Отпечатано на ротапринте ФЭИ, г. Обнинск Калужской области