Процессы нормального и античного сперматогенеза у животных

Захидов, Сабир Тишаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Процессы нормального и античного сперматогенеза у животных
ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Процессы нормального и античного сперматогенеза у животных"

РГ6 од

1 шшозсшй' гсшдрстшпЕгг! УПЗЕРСЯЕТ IZ3.IL О. ДОШКХВД

ЕГОДЗГПЧЕСТЯ татшлгг

На правах рукописи УДК 575: 591

злхвдв С&бир Тишаевич

ПРСЦЩЕЗ 1ГС?!1\ГЫ23ГО Г1 ЛШИГЧПОГО СПК'ЛТСГПЕЗА ¥ ПШОГЕК (03.00.11 - гкбргяшшг!, геттоетгая и цптагзтта)

АБТСЕЗЛТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1ШШЛ - 1533 ГОД

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Е К Кольцова РАН (Директор - академик РАН КГ.Хрущов) и на Биологическом факультете Московского Государственного Университета им. М. К Ломоносова (Декан - профессор 11 К Гусев).

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Е&КзчгзЕа доктор биологических наук, профессор II £. Захаров доктор медицинских наук, профессор С. Г. Цаакяш

Бедупре учреждение - Петербургский Государственный Университет

Ё§2^та диссертации состоится «.¿г-Д^ 1993 г. в

на заседании специализированного совета Д. 053.05.68 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Шсковском Государственном Университете им. ЕВ.Ломоносова по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им . М. В. Ломоносова

Автореферат разослан п1Л " 1893 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Е. Е Калистратова

os-лл хлрастек;сп!пд рае37п

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Сперматогенез - сложный процесс клеточной дифференцировки, включающий в себя периоды размножения, роста и созревания мужских половых клеток. С теоретической точки зрения сперматогенез представляет собой удобную модель для изучения ряда ключевых проблем клеточной биологии, генетики,, радиобиологии. Фундаментальные знания различных сторон сперматогенного процесса необходимы и потому» что служат надежной основой ■ для получения стабильных результатов в области искусственного оплодотворения, криоконсервадии,. регуляции плодовитости животных, планирования семьи. За последние 2-3 десятилетия в исследованиях проблем сперматогенеза достигнут значительный прогресс. Благодаря применению современных методов исследования получен огромный экспериментальный материал, проливающий свет на процессы самообновления и ком-митации стволовых клеток в норме и после радиационных повреждений, метаболизм нуклеиновых кислот и белков, роль спермиоспецифи-ческих белков , структурную и биохимическую организацию мейоти-ческих хромосом, гаметического ДНП- комплекса,. ряда органелл, зходшдих в состав развивающихся сперматогенных клеток или временно участвующих в их морфогенезе ( Богданов, 1975, Данилова, 1978, Huckins.1971,1978; Huckins, Oakberg, 1978а, b; Bellve, 1979; Костомарова, Князева, 1982; Kfeistrich, 1986,1987; Poccia, 1987).

Практическая значимость исследований . сперматогенеза/ также очевидна. Во многих случаях•мужская стерильность или слабая; плодовитость тесно•связаны с - дефектами оплодотворяющей ■ способности зрелых спермиев, либо с-нарушениями нормального функционирования сперматогенного эпителия,- ведущх к массивной клеточной гибели и,. ' как следствие,, олиго- или. азооспермии. В этой связи большое значение приобретают всесторонние исследования атипичного сперматогенеза, который нередко'сопровождает нормальное развитие'мужских половых клеток. Исследования* проводившиеся до недавнего времени, сводились, главным образом, к морфологическим описаниям клеток с признаками глубоких дегенеративных изменений-и простому установлению фактов полиморфизма спермиев • у разнообразных организмов (Fain-Mure1,1966, Roozen -Runge, 1973, 1977, Данилова,1977,1978). Другие аспекты этого явления(в том числе Цитохимические и цитоге-нетические) оставались слабо изученными, как впрочем вопросы и р

том, какие стадии сперматогенеза наиболее чувствительны к разнообразным воздействиям, какие механизмы лекат в основе событий, ответственных за отклонения от нормального течения сперматогенеза и можно ли ими управлять, существуют ли видовые особенности в характере аномальных процессов, идущих в сперматагенном эпителии, каковы возможности защиты генетических структур половых клеток от воздействия вредных факторов. Решение этих вопросов чрезвычайно актуально, тем более сейчас, когда в общей стратегии биологи» размножения на первый план, выдвинулись проблемы загрязнения окружающей среды химическими соединениями, многие из которых способны поражать генетический аппарат и процессы дифференцировки еперма-тогенных клеток.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ И БЕ ЗАДАЧЕ Основная цель настоящей работы состояла в изучении сперматогенеза у млекопитающих и насекомых в норме и при различных экспериментальных воздействиях, позволяющих целенаправленно изменять типичный ход сперматогенного процесса и тем самым вскрывать те его стороны и закономерности, которые ранее были недоступны для наблюдений. Конкретные задачи работы были следующими:

1. Изучить цитологические и цитогенетические последствия действия химического мутагена дипина на первичные половые клетки мышей.

2. Изучить динамику количественных изменений различных типов сперматогенных клеток и клеток Сертоли у двух видов грызунов, подвергшихся воздействию химических мутагенов дипина и нитрозоме-тилмочевины.

3. Установить критические стадии сперматогенеза, степень обратимости цито- и генотоксических эффектов, длительность сохранения генетических повреждений в стволовых сперматогониальных клетках млекопитающих.

4. Изучить в сравнительном плане цитохимические аспекты сперматогенеза у хорошо плодовитых диплоидов и слабо плодовитых аллотетраплоидов тутового шелкопряда.

5. Изучить цитохимические особенности ДНП-комплекса в сперматогенных клетках у млекопитающих после воздействия мутагенов и в условиях естественного и экспериментального гиповитаминоза А.

6. Определить, способен ли природный регулятор фертильности госсшюл (полифенол хлопчатника) задащать хромосомы половых клеток от индуцированного мутагенеза.

?. Изучить влияние длительных сроков кркогансервацин ка со-дерггзкне и осяовиьп: ядзркьс: белков аперизтоэоютоя 6к>я-;.

НАУЧНАЯ ЮВЙЗНД РАБОТЫ Влервьгэ проведено кокплексноэ иссте-довзяк? деструктивных и восстановите ль ки: щюцессов, ппоисуодяетгг: в сперматогештом эпителии шгеколитагос: ups индуцированном гж"':-. ческой цутагенвзз. Уотанозхэвн различия з реакция развивагщшгзл сперьгатогеннкх клеток грызунов на цитотоксические эффекты дипгеет и нктрозэгатклетчэвинн. Еодтгчэствзшпй анализ сперттогекеза у илекопитахстс: позволил таюпэ установить вщгавыз различия в хзп~::-тэгх: измэнэнег; сперкатогонкального кэушаотмента на дэйотвйэ использованнкг в работе ¡гутзгексп,.

Ваеозы? о помощью методов учета спергетогониальны, ¡.кйотп-чэоют: иккроядер, аномалий форм головок сперииев изучена чувстЕЕ-тельность генэт:!чеокого материала раз лги;.с: типов сперьзтогенкп: клеток ка действие мутагенов к длительность сохранения индуцированных кутаний: в стволовых сперматогонкк:.

Впервые показано, что изменение числа клеток Сертоли етгзт? видовыз особенности и зависят от типа использованного мутагена к его доз.

Показано, что у половозрелых ¡.клей, подвергпяхся действию химического мутагена дипина на эмбриональных стадиях развития, индуцированные в первичных половых клетках генетические повреждения полностью реализуется на стадиях профазы I мейоза и в спермя-огенезе, о чем свидетельствует значительное уменьшение спершто-цитов I порядка, сперматид и спермиев. На всех стадиях сперматогенеза обнаружен высокий процент клеток с различными ядерными . аномалиями.

Впервые установлено, что госсипол- эффективный экзогенный регулятор гаметогенеза- оказывает модифицирутецю цитогенетическиа эффекты на клетки сперматогенного эпителия ' млекопитающих.. Цри выбранных условиях эксперимента этот- полифенол и некоторые его. производные, обнаружили способность эффективно защищать хромосомы профазных сперматоцитов от кластогенных. эффектов супёрыутагена нитрозометилыочевины, но значительно усиливать выход клеток со следами хромосомных поломок при сочетанном действии с другим аи-килирукцим агентом - фотрином.

• Бпервыэ методами количественной цитохимии показано, что эпидидикальные сперши с нарушенной структурой ядер содержат такое гв количество ДНК и основных' ядерных белков, что и морфологи-

чзски нормальные гаметы, однако отличаются от последних большей вариабельностью этих веществ и чувствительностью к действию ДНКа-оЫ I. Гетерогенность по содержанию ДНК, дефицит основных ядерных белков, характеризуют морфологически нормальные спермин, лроизо-седшне от клеток, которые в момент воздействия мутагенов находилась на стадиях ранней профазы I з«гейоза, либо промежуточных стадах опермиогенеза, т. е. соответственно яа одной из генетически Езиболее поражаемых стадий и стадии активного синтеза лротамино-подобньпс белков, необходимых для конденсации и стабилизации хро-ьагина галгет. Применение ДНКазы I в сочетании с реакцией Зельгена позволило получить новые данные о цитохимических свойствах хрош-танав других типах сперыатогенных клеток у мьвей после действия химических мутагенов.

Изучен ряд цитологических особенностей сперматогенных клеток хорошо плодовитых диплоидов тутового шелкопряда Показано, что по щгохимическим свойствам ДНП-комплекс сформировавшихся спермиев Б. ¡тюп подобен г апатическому хроматину плацентарных млекопитающие. На примере тутового пелкопряда установлена гозмолность тчастия соматических клеток в регуляции спермиогенеза.

2лервые обнаружено, что в гонадах слабо плодовитых аллотет-раплоидов Bombyx allotetraploidus Astaurov в результате выпадения одного из мейотических делений формируется целый класс морфологически нормальных^ 4С- сперматид и спермиев. Предложена гипотеза о возможной причине стерильности или слабой плодовитости полиплоидных форм тутового шелкопряда.

цитохимический подход к исследованию ДНК и гистонов впервые использован при изучении сперматогенеза у животных, страдающих гиповитаминозом А. В популяциях тестикулярных и эйякулированных спермиев обнаружен большой процент клеток с аномалиями структуры хроматина и уменьшенным содержанием основных ядерных белков.

Показано, что длительная криоконсервация семени быков не сказывает существенного влияния на количество ДНК и гистонов в подавляющей части гамет. Впервые обнаружено, что процесс декон-денсации in vitro плотно упакованного хроматина спермиев млекопитающих сопровождается необычными количественными изменениями основных ядерных белков: по сравнению с хроматином интактных спермиев в частично деконденсированных ядрах количество гистонов увеличивается примерно на 25%, a s полностью деконденсированных ядрах, морфологически напоминающие музской пронуклеус, наоборот,

уменыпзется на 5411 При одинаковых.условиях искусственной дексгг-дексапзп? число сперьмег, с' полностью распакованный хроматинок з 1. ? раза болшиэ и сввг.вазкоролэнкш: зДякудатах, чек в образцам, , гранившихся в течение, 1, С или 14 лет при -19о°С. Сделан: вывод а связи понияэнно'й оертильностп криоконеервированнкх гаме? а и; квепоеобноотьв поолэ проникновегаст в яйцеклетку нормальна траяефэрмкроваться в муязкой проиуклеуз из-за сверхстаЭшюзацк-: ДЫЬкоиплекгси

Езй совокупность собственных к имеющихся в литературе да;;-так к ю: анализ в значительной степени углубляв* ншге представ.;:,-ккя об общкз: закономерностях: сперматогенеза 7 животные, мегаш::;-как, левзекЕ е основе атипичного развития половых клеток, а такзд позволяет1 по- ковоку взглянуть на причины мупзкой етерялькоот.1 1Ш1 слабой плодовитость - Результаты проведенных исследований: ю квогом принципиально вовш кдш: получены кезавксиет от другк; исследователе^'

ПРАКТИЧЕСКАЯ ПЕШССТЬ РАБОТЫ ' Результаты работы включены: 2 курс лекций длк студентов кафедры эмбриологии,Биологического Факультета и стагэров-слуиателей Биотехнологического-центра КГ/.

Разработаны к , усовершенствованы [¿етоды учета изйотичесгов:, сперматогонкалыпк: и соматических швсроядер, позволяющие с большой точностью выявлять химические соединения с кластогенными анеугенными свойствами. Эти микроядерные тесты нашли широкое применение при скрининге фармакологических агентов, аятиоксидантов, пестицидов, а такие при цитогенетическом мониторинге окружающей среды Юкного Цриаралья, Вольского и Нэрильского .регионов.

Результаты исследований мутагенных и -антимутагенных свойств госсипола,.обладающего широким спектром биологического действия, долины в полной- мере учитываться в области фармакологии, . мужской контрацепции,' химиотерапии опухолей, а также, стимулировать поиски и. разработки новых биоантимутагенов на основе веществ, природного происхождения.' •

Комплекс цитохимических методов, использованный в настоящей работе, технически прост, надежен и"может быть с успехом применен при диагностики, мужской, стерильности и оценки оплодотворяющей способности гамет перед их передачей в спермобанк и во время длительное хранения. .

АПРОБАЦИЯ РАБОТЕ Озковньв материалы диссертации докладывались на X Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Таг-

• - б -

кзнт, 1378), III Съезде Всесоюзного Общества генетиков и селекционеров нм. Е й.Вавилова (.1энияград,1977), II Всесоюзном сишгоаиуме "Цитологические механизмы гистогенезов"( Ташкент, 1880), II всесоюзном совещании по госсяполу (Ташкент, 1985), II Всесоюзном симпозиуме "Научные основы витаминного обеспечения сельскохозяйственных ззивотных (Рига, 1987), Всесоюзных совещаниях "Стволовые клетки в развитии и дифференцировке" (Мзсква, 1990),"Экологические аспекты онтогенеза" (Ыэсква, 1992). Результаты работы так;,-а докладывались па заседаниях Шсковского обп^ства испытателей природы (1585), Пяститута биологии развития им. Е К. Кольцова АН СССР, Центра охра-г.и здоровья матери и ребенка ¡¿шздрава РС4СР, Института биоорга-гаческой химии и Института зоологии и паразитологии АН УзССР, Еи-отехнологического и Экологического центров МГУ.

Сй'ьем работы. Диссертация изложена по обп^принятой научной схеме и представлена на 203 страницах машинописного текста, ¡включая 20 таблиц и 50 рисунков. Список литературы состоит из 492 наз-Еаний, из которых 47 отечественных.

¡ЛТЕРЗДЛ Ш Е2Г053 ч^гяутоАТПЗ

Объекты исследований и постановка экспериментов. В работе использованы половозрелые самцы мышей-гибридов Р1 (СВАхВ157/Сб) и крыс Вястар.

В первой серии опытов животных подвергали однократному воздействию химических мутагенов дипина и нитрозометилмочевины (КУМ). Мышам инъецировали внутрибрюшнно 30 иди 60 мг/кг дипина, либо 50 или 100 мг/кг НШ. Крысам вводили дипин из расчета 10 или 80 мг/кг, либо НШ в дозах 50 или 100 мг/кг. Мутагены разбавляли в 3-5%-ном ДМСО. Контролем слузяили швотные, получавшие однократную и внутрибрюшинную инъекцию ДШО в объеме 0.2-0.4 мл. Животных забивали путем дислокации сейных позвонков, либо под эфирным нар-тозом. Ёиксацию материала проводили через различные интервалы времени после начала эксперимента, исходя из данных по кинетике их сперматогенеза.

£о второй серии опытов самкам мышей на 13 (активная пролиферация первичных половых клеток) и 17 (гоиоциты вне цикла репродукции) дни их беременности делали однократную внутрибрюшинную инъекцию дипина е дозе 33 мг/кг. Самцов забивали через два месяца после рождения.

.В третьей - с эрш опытов кдасач егэднэвка в течение трех дней вводили коли?*яошшз еЬэдинеяшг госоипол из расчета 5„ 10, £0 кг/)^, его дяокзводкыя мвгрскн или батрвдск- по 10 иди 20 мт/п-'. Чзр?в 1 л! посла последней гаяьекцик зткх вег^етз одной группе кркэ зводкж однократно в дозе 25 кг/кг, другой - багрян (ашик-р,Ш5й'г агент га класса зтилзшиянов) в доае 20 ю7кг. Позитивна:-.; контролем слугая? живот-наг., получавши? только одво'тратвуэ икъе'с-1шр одного кв этих мутагенов у той ж? дозе. Секевникя фиксировал--: черев 1Р' дней после последних введений, когда в семенниках кЬыз появлялась округла*? опэриатидн, прокзовэддаз от клеток, 'коток«.с к>здвке?вкя ьгутагенов находились, соответстваинз, на е«:---двгх прйлет-отены-лептогеиа, „г. е. на став»? активного еинтегь

ян:. . ■

В червзртоГх серки опытов искусствен!*:»' вдаывгш* гкповятакгп:г''3 /1, л,к чег» >гпвк ю б-веделького- возраста содеряаск кз обгэи • га-пвэяз вивапк.;, а затек переводила на спевиазьнув диету на С5 дгоеЛ. Ксятраташг ямвотаьс (группа К) содержались кв. диете с езс— вгдрлько!'. добавко? 500 мга- р&тшпмацэтата на крысу, гиповитамг:-нозкы^ еашг (гротпг 0) поручали только к ес*& одна грузен

крыз (группа Ш подучзла диету с ежедневной добавкой 103 ит ыь-тилового эфира ретиноевой кислоты на крысу. Известно, что реткно-евая кислота способна восстанавливать многие соматические функции. Состояние животных оценивали по скорости роста (взвешивание), плодовитости (число пометов и: крысят, получаемых после 7-дневной.ссадки каждого самца с 4-5 нормальными самками) и содержаний витамина А в печени и плазме крови. Все этапы настоящего эксперимента выполнены С. П.'Позняковым (Институт, биохимии им. А. К Баха РАН). . ' . . \

Опыты по естественному гиповитаминозу А проведены на баранах -производителях каракульской порода . Всего изучено 16 животных, которые :были разделены на две равные группы: опытную,. в .рацион . которой; включался -витамин А (ШпфЬвит, СССР).из расчета 120000 и. е. на животное 1 раз в неделю и контрольную - гиповитаминозную. Отбор эйякулятов начинали через 1" нед после начала опыта и продолжали в течение последующих 2 нед, ■ получая по 2-3 эйякулята б день/ Сбор материала и определение содержания, витамина к в плазме крови проводились С. Ц. Позняковым к а М. Фактор.

При цитохимическом изучении причин снижения оплодотворяшей ' способности кроконсерзированкнзг гаизт экспериментальным.материи-

лом служили образцы семени быков черно-пестрой породы. Эти образцы были зашроиэны в форме открытых гранул и хранились в ждком агюте в течение 1, .'5, 8, 11 лет (Институт зоологии и физиологии АН ШСР). В качестве контроля использованы свежие и кратковременно (4 дня) замэрожзнные эйякуляты фертильных быков.

Б экспериментах по изучению нормального и атипичного сперматогенеза у насекомых использованы самцы хорош плодовитых диплои-дсв(85 животных) и слабо плодовитых аллотетраплоидов( 68 .-штатных) тутового шелкопряда.

у'жеахщя материала и приготавление препаратов. Для. определена числа сперматогенных меток различных типов в норме и после экспериментальных воздействий один из парных семенников от каждого животного целиком фиксировали з уксусно-глицериновой смеси (1:1) в течение 2- 3 кед. Еатем гонады механически разрушали и оуспендирсьалй; полученную суспензию сперматогенных клеток анали-сировали в камере Горяева с помощью фаэово-контрастного устройства ("Cpton", Германия).

цитогенетичесгаи и цитохимических исследований готовили отпечатки сперматогенных клеток и мазки эпидидешальных и эйякули-рованных еперыиев млекопитающее. Препараты.высушивали на воздухе и фиксировали в 10%-ном забуференном формалине (pH 7.0- 7.2) или в 96°этиловом спирте в течение 15- 20 мин.

Семенники, семявыводящие канальцы,, семенные пузырьки шелковичного червя фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине в течение 3-6 ч, после чего материал промывали в проточной воде в течение 18- 20 ч. Затем готовили давленые препараты.

В радиоавтографических исследованиях семенники шелковичного червя через 2 ч после введения им меченых предшественников фиксировали в смеси Карнуа, заливали в парафин и приготавливали срезы толщиной 5 мкм.

Окрашивание препаратов. В настоящей работе для окрашивания £НК были выбраны следующие условия реакции Фельгена: гидролиз в 5N HCl при t-37°C в течение 12-16 минут. Время окрашивания в реактиве Шиффа -1ч при комнатной температуре.

Часть препаратов перед окрашиванием по Фельгену обрабатывал! ДНКазой I (Koch Light, Швейцария) - 100 ед/мл, 10 мМ трис-НС1, 10 ыМ ifeCI (pH 7.4) при 37°С в течение 45 мин. В случае тутового еелкопряда нуклеазную обработку препаратов сперматогенных клеток проводили а течение 10, 60 и 120 мин. йуклеазный гидролиз оста-

вавжвади путем откывкгс препаратов в тркс-ЖЛ буферэ.

ДеI кшкчзоизэнных исследований содержания основных ядерных белков использован цитохимический метод, разработанный в своз время Олферток к Гзквикдои (А1ГегЪ, &5зс1-шп:!, 1953) с некоторыми кодификациями (Антропова, Богданов, 1970): 15- минутный гшгрожз в 5%-ко& трихлорукзусной кислоте прк Ь- 95 С с последующим окрз.-виваниеи препаратов в 0. IX- ком растворе щелочного прочного зе,ге-ного1 приготовленного на трио-В31 буфере (рНЗ. 2) в течэнкз 1 ч прк гаинатной температура.

Иштоспестро^дтометрк?:. Количественное определение содергг,-яе~ ДНИ. к освовкыг ядерных белков в ядра:: сперматогенкых клэтог: пхвотныг проводила методами прямой или бетэгрзЗяческо-* сканирующей девситонэгшй». Е первой случае использован сканирующий микро-дэнсктометр Взккерс-И35 (Англия), во-втором - отечественны}'? двуг-лучевой регкстркрушкй кикроденситоиетр ЙФО-4Б1.

Д&конденсацкй ядерного хроматина зрелых спермкев 1п у1Ьго. Ксслздоваж сперматозоиды 12 фертильных быков. Оттаивание? свезте-закороженкьс: эйякулятов и зйякулятов, хранившихся в течение 11 лет в зшдкои азота прк -19б°С, проводили в 1 мл физиологического раствора прк 40°С. Чтобы удалить семенную плазму, образцы семени дважды осаждали низкоскоростным центрифугированием. Осади: ресуспендировалк в том тгв растворе и полученную суспензию разделяли на две равные части; из первой части готовили контрольные мазки, а другую повторно центрифугировали. Осадок сперматозоидов разбавляли в 1 мл 1%-ного раствора додецилсульфата натрия (БОБ). Через 30 мин добавляли О. 3 мл 0.01 М дитиотрзитола (ДТТ), приготовленного на трис-Ш1 буфере ( рН 8.0), и продолжали инкубацию в течение 2.5 ч при комнатной температуре.

Содержимое семявыводявдх канальцев и семенных пузырьков дип-лоидов тутового, шелкопряда разбавляли в 2 мл 0.01 М трис-НС1 буфера (рН 7.5), механически разрушали пучки спермиев. Суспензию изолированных гамет переносили с помощью пастеровской пипетки в пробирку, содержащую смесь 1%- ного раствора БББ и 1 мМ ДТТ ( в объемном отношении 1:1), и инкубировали в течение 15, 30, 60 мин и 12 ч при комнатной температуре.

Приготовление препаратов, окрашивание и количественный анализ веществ проводили по вышеописанны},! методикам.

Электронная микроскопия. Материал для злектронномикроскопи-ческих наблюдений приготавливали по общеизвестным методам. Препа-

• •/ - ic - ;

раты просматривали в электронных микроскопах JEM-?A a JBf-lOOß.

Разиоавтография.' Самцам гусениц диплоидов тутового . аелкопряда в полость тела инъецировали3!! -,уридин . (удельная активность 29 . Ей/мМ, СССР) нз расчета 15 жКн/г, . другой группе зашотных, инъецировали С'К - лизин, (удельная .активность 88 Ни/мМ, Amersham) из расчета 15 шйи/г.. Препараты покрывали эмульсией типа (М) и Експонировали при 4°С з течение 30 дней. Полученные автографы окрашивали гематоксилином.

¿Зэтод учета ' микроядер. В цитогенетических. исследованиях сперматогенеза у ¡.шекопиташйх частоту встречаемости клеток со следами хромосомных аномалий определяли на стадиях округлых спер-матид и сперматогониев через различные интервалы времени после действия мутагенов, • что позволяло устанавливать степень чувствительности хрошсом различных типов клеток. Hs менее "1000 округлых сперматид и 300 сперматогониальных клеток подсчитывали от каждого животного, и число клеток с микроядрами выражали в промилле.

Мэтод учета аномалий форм головок • спермиев. Известно, что формообразование. ядер мужских гамет контролируется многими генами, причем Há диплоидном уровне. Увеличение доли аберрантных форм з популяции зрелых спермиев рассматривается как результат индуцированных, генных, мутаций или мшфоделеций в сперматогониальных клетках, и сперматоцитах . I порядка (прелептотена -лептотена). фактически все изученные мутагены и примерно 50% канцерогенов . дали положительные результаты в -этой тест-системе (Wyrobek et. al., 1983). . - 4 ■ . ' . .

' 3 наших экспериментах определение частоты встречаемости спермиев с морфологически аномальными головками в репродуктивных органах шнгей проводили, начиная с 35 дня после воздействия дипи-. на или ЩЫ. " Просматривали не менее. 500 клеток ¡от каэдого животного. Чясло морфологически атипичных газгет выразили 'з процентах.

Статистическая обработка данных. . Вариационно-статистичесгай глализ цифрового :«даериала проводили по алгоритмам, .представленном в книге В.JQ.Урбаха (1964) и по компьютерным программам' ' á. К Кулаичева (МГУ). .

- 11 -п аззгг^ггч':

ь петологкчвскис и 1щ0пшетичкзкие исследования сперкато-

ГЕН5П'. У ЖИВОТНЫХ ПРК ИВДУЦКРОВАНгЖ ХКЫИЧЕШЖ )07АГЕНЕ5.~.

Ы. Сперматогенез £ кздгей, подвергшихся воздействи.-л химического мутагена дипина на эмбриональных стадия:: развгггк:..

Результаты количественного анализа сперматогенеза у ммзеЛ представлены на рис. 1. В гонадах подопытных животных обдее число сперматогониев не. скюяается к дажв превышает контрольны?; уровень. Однако пахитенных еперматоцитов значительно меньпэ. На постмзй:»-тических стадиях дифферендировгаг в зависимости от времени введения дипина число округлых сперматид и спермиев такхе сильно снижено по сравнению с нормой. Число клеток Сертоли не отличалось от такового в семенниках контрольных животных. с

А"

140

120 100 во

ВО 40

Рис. I. Число различных типов клеток в семенниках мышей, подвергшихся воздействию химического мутагена дипина в дозе ЗС мг/кг на эмбриональных стадиях развития. Ш горизонтали: 1 -сперматогонии, 2 - пахитенные сперматоциты, 3 - округлые сперма-тиды, А - спермии, 5 - клетки Сертоли. По вертикали - число клеток в 7.. Сплошная, параллельная горизонтали линия - контрольные значения, принятые за 100%. П- 13 день,- ЕЯ-17 день беременности

воздействуя на первичные половые клетки, находившиеся как на стадии высокой митотической активности, так и после их выхода ив цикла клеточной репродукции, дипин вызывал значительное увеличение частоты встречаемости морфологически аномальных гамет в репродуктивных органах половозрелых подопытных животных (12.2 и 20.3% против 1.8% в контроле). Крое того, практически на всех стадиях сперматогенеза наблюдалось большое число клеток с ядерными аномалиями.

1.2. Сперматогенез £ половозрелых мышей после действия химических мутагенов дипина и нитрозометилмочевины (НШ).

Результаты, характеризующие изменения числа различных типов сперматогенных клеток и клеток Сертоли в ответ на действие дипина, приведены в табл. 2.

Б семенниках мышей, подвергшихся однократному воздействию дипина в дозе 30 мг/кг, обшэе число ранних половых клеток (стволовые + дифференцирующиеся сперматогонии) оставалось в пределах нормы в первые 14 дней эксперимента Однако на 21 и 28 дни фиксации пул сперматогониальных клеток сильно увеличивался и составлял, соответственно, 176 и 180% от контроля. На 35 день фиксации число сперматогониев вновь достигало контрольных значений и в дальнейшем заметно не варьировало. Семенники подопытных мышей практически были свободны от сперматоцитов I порядка (стадия па-хитены) через 14 и 21 дней после воздействия. Затем число пахи-тенных сперматоцитов постепенно нарастало и к 56 дню эксперимента соответствовало нормальному уровню. Фактически полное отсутствие округлых и удлиняющихся сперматид отмечено на 21- 35 дни фиксации; па 56 день калдая ira этих клеточных популяций составляла примерно 75% от контрольного уровня. Но если далее число округлых сперматид оставалось сравнительно стабильным, то удлиняющихся -резко снижалось к 100 дню фиксации (до 16% от контроля). Восстановление пула этих клеток видно на 180 день после начала эксперимента. К этому же времени нормализовался пул тестикулярных спер-ыиев, который в интервале между 28 и 100 днями эксперимента был вначительно ниже нормы. Число клеток Сертоли на 14 и 21 дни фиксации увеличивалось по сравнению с контролем на 80 и 130 %, соответственно.

Дяпин в дозе 60 мг/кг в общем давал сходную картину измене-

Таблица 1. Количественный состав сперматогенных клеток и клеток Сертодш у шеэй , подвергшихся действию химического мутагена дштина (х106 ).

1 |Группы Дни - —.............1

|животных фиксации 1 Типы клеток, 3 + гпх

1 1 1 1 СГ ПС ОС УС с КС |

1 1 1 1 2 3 4 5 6 7 8 I

1 |Контроль 3 2. 6+0.1 5. 4+0. 6 9. 8+0. 6 3. 3+0. 2 11. 0+р. 8 1. 3+0.2 |

7 2. 0+0.1 4. 6+0. 2 13.0+1.2 3. 2+0. 3 11. 0+0. 9 1. о+р. 1 |

1 14 2. 9+0. 5 5. 4+р. 9 11.0+1.7 3. 7+0. 3 9.0+2. 0 1.2+0.3 |

1 21 2. 5+0. 2 5. 2+0. 3 13.0+1.2 3.1+0. 4 11.0+р. 6 1. 0+р. 1 |

1 28 2.1+0. 4 3. 6+0. 2 11. о+р. 6 а 0+0. 2 10. 0+0. 9 0. 8+0.2 |

1 35 2. 0+0. 3 4. 5+0. 6 9. 0+1. 4 2. 5+0. 5 9.0+1.6 1. о+р. 1 |

1 56 2.1+0. 3 6. 3+0.7 16. 0+1. 3 3. 0+р. 2 15. 0+1. 4 1.0+0.1 |

1 100 2. 5+0. 3 4. 0+0. 4 10. 0+0. 5 а 1+о. з 8. 5+0. 4 1. 0+р. 2 |

1 180 2. 8+0. 2 а 6+0. 3 11. 0+0. 7 3. 9+0. 3 12. 0+0. 9 1. 2+р. 1 |

|Дйпин,

|30 мг/кг 3 2. 5+0. 4 6.0+1.2 10. 0+1. 0 2.4+0. г 12. 0+0. 0 1.0+0.2 |

1 7 1. 7+0. 2 2. 8+0. 2А 11.0+1.2 2. 5+0. 4 9. 0+0. 5 0. 9+р. 1 |

1 14 2. 4+0. 3 0. 2+0. 01 л 7. 0+0. 8 а 2+0. 2 12. 0+1. 2 2. 2+0. 2 |

продолжение табл. 1.

1 2 3 4 5 6 7 8

21 4. 4+0. 2* 0 0 0. 08+0, 02 л 0. 5+0, 6л 2,3+0, ЕЛ

28 3. 8+0. 3* 1. 8Ю. 2* 0. Об+О, 05 <•- 0. 06+0. Об* 0, 2+0. 2* 0. 6-Ю. 2

35 2. 0+0. 3 1. 5+0. 3* 0. 6+0. 2* 0. 0+0, 0 0. 2+0. 2* 0. 8+0. 2

56 2. 7+0.1 6. 0+0. 8 12. 0+0. 9 2. 3+0. 4 3.9+1.5* 1. 3+0. 3

100 2. Б+0. 2 3.0+0.2 6. 7+0. 3 0, Б+0.1« 1. 0+0. 2А 1.1+0. 2

180 2. 5+0. 7 5. 0+0. 8 9. 0+0.6 5.0+0.4 9.0+0.8 1. 0+0.1

Д.гтшп,

60 иг/кг 3 2. 0+0.1 4. 4+0. 2 10. 0(_0. 8 2. 9+0. 3 13.0+0,8 0. 9+0.1

7 1. 9+0.1 2. 2+0. ЗА 11. 0+0. 8 3. 7+0. 3 10.0+0, 7 1.3+0,2

14 6. 0+0, 6* 0.0 1.1+0. 6А 2. 8+0. 3 11.0+0.8 0. 2+0,1,.

21 7. 0+0. 4* 0.0 0,0 1.2+0. 3* 17.0+2. ОА 0.7+0.1

28 5. 2+0. 4* 0.0 0.0 0.0 0. 01+0. 04 •л П. 5+0.1

35 2. 6+0. 3 2. 8+0.1* 1. 2+0. Зл 0.0 0.0 0. 3 +0.1*

56 2. 4+0.2 4. 8+0, 5 9. 0+0. 3* 1.7+0,2* 6. 0+0. 4 А 0.9+0. 2

100 2. 7+0. 2 1. 5+0. и 5. ОН). 4* 0. 2+0.1* 0.5+0.1* 1.110.2

180 1. 6+0. 3 3. 2+0.1 11. 0+0. 9 2. 5+0. 3 10.0+1. 2 1. 0+0.1

(0.3+0.3) (0.8+0. 2) (1.0+0.6) (0. 4+0.4) (0.5+0.5) (0. 8+0.6)

Пришчание: СГ- сперыатогонии, 1Ю- пахитешше спериатоцити, ОС- округлые спериа-тиды, УС - удлиняющиеся спермагиды, С - сперши, КС- клетки Сертож; е скобках указано число клеток у двух самцов с атрофией семенников,* -различия достоверны при р< 0,05.

ний. Еместе с тем выявлены некоторые количественные отличия, причем зависящие не только от дозы мутагена. Во-первых, общее число сперматогониев увеличивалось на 100Х унз на 14 день после начала эксперимента. Во-вторых, в это же время наблюдалось вневапноэ укеныпени пула клеток Сертоли, его восстановлен:« шло медленнее чем в семенниках мышей, получавших дипин в дозе 30 мг/кг. В-третьих, у 2 из 8 изученных животных через 180 дней после введения алкилирувдэго агента семенники были атрофированы, и все типы сперматогенных клеток встречались в небольшом числе, хотя процент клеток Сертоли соответствовал норме.

На окрашенных по Фельгену препаратах семенников подопытных мышей наблюдался широких спектр хромосомных и ядерных аномалий во всех типах сперматогенных клеток, а также клетках Сертолк.

Онтогенетический анализ показал, что поражение дипином (30 к 50 мг/кг) клеток, находящихся на стадиях поздней пахитены-диаки-неза, либо прелептотены-лептотены приводит к статистически достоверному увеличению числа округлых сперматвд с микроядраш на 3 к 14 дни фиксации, соответственно. При более отдаленных сроках фиксации ( 100 и 180 дни) число генетически неполноценных клеток значимо не превышало уровень, характерный для спонтанного мутагенеза (рис. 2а).

О степени и продолжительности действия дипина на генетический материал стволовых клеток судили по частоте встречаемости аберрантных сперматогониев, начиная с 35 дня эксперимента. Как видно из рис.2б, число сперматогониальных клеток со следами хромосомных поломок в несколько раз превосходит число таких клеток, спонтанно возникающих в семенниках контрольных животых. На 35, 56 и 180 дни фиксации было существенно больше сперматогониев с микроядрами при действии дипина В дозе 30 мг/кг.

Процент морфологически аномальных форм в популяции эпидиди-мальных спермиев на 35 день фиксации увеличивался по сравнению с контролем в 4.5 и 1.8 раза при дозах дипина в 30 и 60 мг/кг, соответственно. Высокий уровень гамет с морфологически аномальными ядрами сохранялся и спустя 180 дней после воздействия (9.7 и 14.9Ж против 2. 4% в контроле).

Итак, наши наблюдения свидетельствуют о длительности сохранения индуцированных дипином генетических повреждений в стволовых клетках мышей.

10-Г1

3 14 100 1В0

Рис. 2. Число округлых сперматид (а) и сперматогониев (б) с микроядрами в семенниках мышей через различные интервалы времени после действия дипина. По горизонтали - дни фиксации, ШШ - контроль, И - 30 мг/кг и ЕППЗ - 60 мг/кг.

Результаты количественного анализа сперматогенеза у мышей,

подвергшихся действию НММ в дозах 60 или 100 мг/кг, приведены в табл. 2. Как и в случае дипина, в ответ на действие ШМ на 21 день фиксации общее число сперматогониальных клеток существенно возрастало, составляя при изученных дозах, соответственно, 190 и 240%. Сравнительно высокий процент сперматогониев сохранялся на 28- 56 дни фиксации. Пул пахитенных клеток значительно снимался на 14 и 21 дни после воздействия, причем при дозе 100 мг/кг - до 1 и 4 % от контроля. При действии высокой дозы ШМ на 21 день фиксации из семенников животных практически полностью исчезали округлые сперматиды, хотя и при дозе вдвое меньшей число ранних постмейотических клеток составляло всего лишь 16% от контроля. При дозе 100 мг/кг супермутаген вызывал сильное обеднение сперма-тогенного эпителия мышей удлиняющимися сперматидами и сформировавшимися сперминми на 28 и 35 дни фиксации. Последующая нормализация гонад сопровождалась постепенным нарастанием, а затем и полным восстановлением всех изученных типов сперматогенных клеток. В ряде случаев (100 день фиксации) число клеток заметно превышало исходные, контрольные значения.

Шпуляция клеток Сертоли после действия НММ не подвергалась сильным количественным изменениям, как это наблюдалось после действия дипина.

Подсчеты показали зависимое от дозы, статистически достоверное увеличение числа округлых сперматид с микроядрами на 3 и 14 дни после начала эксперимента И, наоборот, на 35 и 100 дни фиксации выход аберрантных клеток этого типа значимо не превышал уровень спонтанного мутагенеза (рис. За). Через 35 дней после воздействия НММ в дозах 50 или 100 мг/кг, обнаружено также большое число сперматогониев с микроядрами. Однако уже на 56 день фиксации частота встречаемости ранних половых клеток с хромосомными аномалиями .уменьшалось приблизительно в два раза, а на 100 день фиксации уровень аберрантных сперматогониев соответствовал уровню, наблюдаемому в семенниках контрольных животных (36).

Через 35 дней после введения мышам НММ в дозах 50 или 100 мг /кг частота встречаемости морфологически аномальных форм в популяции зпидидимальных гамет возрастала в несколько раз (соответственно, 8.22и 9.4% против 1.4% в контроле); на 100 день фиксации число атипичных спермиев в эпидидимисе подопытных мышей статистически достоверно не отличалось от нормы.

8 СП Ol M I-i-. lb. S! со 8 В5 й M оэ re lb. S! 4 со

г° р M p p Р го р pro р ¡b. Г° Г3 p

о S2 S3 о h* СО Ib. м. со CO со S3 ib. O со

1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1 + |+, 1+1+ 1+ 1+ 1 + ! + 1+

р р О о P О о р о р о р p p р p

05 Ji- M ¥ * lb- H* M M ib. го * со to * M M M

Р pi jb. M- p о M jfv p p en. р> i"* ?" p

СО сл O) en M 8 1+ 00 ib- м. го M lb. Ib. сл c»

1+ 1+ 1+ 1+ Í+ 1+ 1+ 1+ !+ 1 + 1+ 1+ 1+ 1+ 1+

о р о о p P о р p p p р p p p о

lb. hi >0-р M-p ("к * § s * *- О СО M *• Ю lb. hi p M со M ■ *• lb. p SJ t-i pi M p M M M- M> p tt M p

о о СО сл О м* lb. M о СО о со S3 ib. O 00

1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1 + ! + 1+ 1+ 1+ 1+

bJ. р о р о H. о о ООО p о p p ^

О СО со со * о н» M S3 CO * - ОО Ol ib. lb. * ? sj oo M

р г° H* р Î- p p р p p M м. M- p p p

(О -ÑÍ H* lb. СО еэт о о О СЛ M S! 00 H» A. СЛ

1 + 1+ 1 + 1+ 1+ 1+ 1+ ! + 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+

Р р О р о p p о pop о о p p о

ltv СО * * со Jr M VJ- M и- со со M KS з^ СО M M

Н*-?" р i-4- р н» р I-*. го l-b о р S3 M N! p jb. H* (-»■ M- p p

О о CO о О о о о ООО Ol о о о о

1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+1 + 1+ ! + 1+ 1+ 1+

I-* о p р о p о м> poo p о p t-*" M-

о со * сл * СО to * СО СП *• СО СП ib. СЛ * сл Ol со NI

р о p р о p о р Г* Р Р p р p p

оэ со -a lb. lb. 00 со со о да оз SI S3 00 >-»■ СО

1 + 1 + 1+ 1+ 1+ 1 + 1+ 1+ 1+ 1+1+ 1+ 1+ 1+1+ 1+

р О о о о о о р pop о о p p о

м. t-b ь »-к X- H» >-»■ о о сл сю о сл о lb. g

сл о

10»

•-3

-а s а с

H ф

►3

о я

XI 1+ 3

- 8Г< -

/о

Рис. 3. Число округлых сперматид (а) и сперматогониев (б) с микроядрами в семенниках мышей через различные интервалы времени после действия HMM. Ib горизонтали - дни фиксация. О- контроль, и- 50 мг/кг, ШЗ,- 100 мг/кг.

- so -

Если исходить.из данных по кинетике сперматогенеза у мышей, то обнаруженное нами в экспериментах с использованием дипина и НММ сильное снижение или полное отсутствие пахитенных сперматоци-тов и округлых сперматид, соответственно, на 14 и 21 дни фиксации, следует рассматривать как результат губительного действия этих веществ на активно пролиферирующие сперматогонии типов Aj -A4 и так называемые сперматогонии типов А-спаренные и А-группо-вые. Сильное снижение или полное отсутствие пахитенных спермато-цитов на 21 день после введения мышам мутагенов мозвэт свидетельствовать об уязвимости стволовых клеток. Однако сравнительно быстрая репопуляция семенных канальцев дифференцирующимися спер-матогенными клетками указывает на то, что цитотоксический эффект дипина и НШ на компартмент стволовых сперматогониев ограничен.

Показано (Oakberg, Huckins, 1976; Huckins, Oakberg, 1978; van Keulen, de Rooij, 1985), что при некоторых воздействиях (рентгеновское облучение, введение алкилирующих веществ) происходило изменение кинетики пролиферации стволовых сперматогониев -они раньше времени вступали в фазу синтеза ДНК и число вновь образованных, меченых^-тимидином клеток заметно возрастало. Скорее и в нашем случае в ответ на действие дипина или НММ пролифератив-ная активность стволовых клеток усиливается. Только этим, вероятно, можно объяснить, почему общее число сперматогониев практически не отличается от нормы в первые 7-14 дней, а спустя 21 день после начала эксперимента увеличивается в 1. 8-2.5 раза. Однако тот факт, что на 28 и 35 дни после воздействия дипина ( 30 и 60 ыг/кг) или НММ (100 мг/кг) пул пахитенных сперматоцитов еще далек от нормы, говорит о том, что и как после действия ионизирующих излучений (Oakberg, 1969; Lu et al., 1980), значительная часть клеток-предшественников подвергается дегенерации, причиной которой является скорее всего возникающие в сперматогониях мутации. Не исключено,. что часть генетически поврежденных клеток элиминируется на стадиях ранней профазы I мейоза.

Другой тип индуцированных мутаций, не препятствующий диффе-ренцировке сперматогониев и сперматоцитов I порядка, может оказаться одной из возможных причин прекращения развития округлых сперматид, о чем свидетельствует внезапное и резкое снижение числа удлиняющихся сперматид и спермиев. Генетические изменения, возникающие в стволовых клетках, могут на постмейотических стадиях привносить существенные нарушения в процессы транскрипции и

синтеза уникальных белков, необходимых для построения нормальных гамет. Наблюдавшееся через 6 мес после воздействия дипина восстановление исходного уровня спермиев может идти за счет пополнения сперматогенного эпителия генетически более полноценными клетками. Такая интерпретация, однако, видится справедливой в случае, если дифференцировка и созревание спермиогенных клеток всецело контролируется их собственным геномом, а не зависит, например, от структурно-функциональной целостности клеток Сертоли.

Результаты, полученные при изучении действия дипина и НММ на сперматогенез крыс во многом аналогичны тем, что были описаны для мышей. Однако деструктивные и восстановительные процессы в семенниках крыс протекали менее драматично. Обращает на себя внимание отсутствие сильных гонадотоксических эффектов: клеточные потери в сперматогенном эпителии этого вида грызунов практически не сопровождались снижением веса семенников. Другой отличительной особенностью следует считать почти 3-х кратное уменьшение числа сперма-тогониальных клеток спустя 19 дней после введения крысам мутагенов, причем особенно резкое снижение числа сперматогониев вызывал дипин. После действия НИМ процесс восстановления популяции ранних половых клеток шел постепенно, без "демографического взрыва", как это происходило у подопытных мышей и крыс, получавших дипин. Оба мутагена вообще не влияли на процессы дифференцировки мейоти-ческих и постмейотических клеток, а характер количественных изменений клеток Сертоли больше напоминал таковой в семенниках подопытных мышей после введения НММ, но не дипина.

У животных, которым инъецировали дипин в доз 10 или 30 мг/кг наблюдалось статистически значимое увеличение числа округлых сперматид с микроядрами на 3, 8, 19 и 25 дни фиксации, что свидетельствует о высокой чувствительности хромосом профазных сперматоцитов, соответственно, на стадиях поздней пахитены - диа-кинеза, средней пахитены, прелептотены - лептотены и дифференцирующихся сперматогониев. На 50 и 100 дни фиксации дипин в дозе 30 мг/кг индуцировал появление округлых сперматид с микроядрами, число которых, хотя и было ниже, чем в предшествующие дни, тем не менее значимо превышало уровень спонтанного мутагенеза При дозе 10 мг/кг частота аберрантных клеток на 60 день фиксации совершенно не отличалась от контроля, но вновь увеличивалась на 100 день фиксации,- что указывает на поврежедние дипином хромосом стволовых клеток (рис. 4).

Рис. 4. Число округлых сперматид с микроядрами в семенниках крыс через различные интервалы времени после действия дипина. По горизонтали-дни фиксации, ИВ-контроль, КЗ- 10 мг/кг, ЕЗ- 30 мг/кг

Рис. 5. Число округлых сперматид с микроядрами в семенниках крыс через различные интервалы времени после действия НЫМ. По горизонтали - дни фиксации, Ш-контроль, и М- 100 мг/кг.

50-

40-

20-

10-

НММ, как и дипин, индуцировал формирование большого числа округлых сперматид с микроядрами на 3- 25 дни фиксации; наибольший их выход обнаруживался после действия НШ в дове 100 мг/кг на хромосомы дифференцирующихся сперматогониев (25 день фиксации). О степени влияния НММ на генетический материал стволовых сперматогониев судили по частоте встречаемости округлых сперматид с микроядрами на отдаленных этапах эксперимента. Так, на 50 день после введения супермутагена уровень аберрантных клеток достоверно превышал фоновые значения, тогда как на 100 день фиксации число этих клеток соответствовало исходному, контрольному уровню (рис. 5).

Ятак, опыты на крысах не только подтверждают уязвимость хро->жэсом сперматоцитов I порядка, но убедительно показывают, что как дифференцирующиеся, так и стволовые сперматогониальные клет-;си, получившие грубые хромосомные повреждения, жгут нормально развиваться и "доживать" до стадии округлых сперматид.

1.3. Экзогенный регулятор сперматогенеза госсипол я его производные как модификаторы индуцированных мутаций в мейоцитах.

Результаты цитогенетического анализа сперматогенеза у животных из контрольных и подопытных групп суммированы в таблице 3 . Госсипол, и его производные мегасин и батриден при выбранных условиях эксперимента не вызывали увеличения частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами, в то время как в семенниках крыс, подвергшихся однократному воздействию НЫМ или фотрина, ' выход клеток с хромосомными аномалиями возрастал более чем в 3 раза по сравнению с отрицательным контролем. У животных, которым до введения НММ инъецировали госсипол в суммарных дозах 15, 30, 90 мг/кг, число округлых сперматид с микроядрами уменьшалось, соответственно, на 42, 59, 72.5%. Мегасин в суммарных дозах 30 или 60 мг/кг снижал кластогенную активность НММ, соответственно, на 32.5 и 42. 5% ; батриден при тех яв дозах - только на 13. 5 я 25%.

Результаты противоположного характера были получены при соче-танных эффектах высоких доз полифенольных веществ с другим алки-лирущим агентом- фотрином. По сравнению с позитивным контролем у самцов, получавших до введения фотрина в течение трех дней госси-

Таблица 3. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках контрольных и подопытных крыс через 19 дней после введения им химических веществ (в %с ).

Варианты Дозы Число изученных X + т._

опыта (мг/кг) животных X

Контроль - 11 3.6 + 0.3

Госсипол 5 X 3 6 3.4 + 0.4

10 X 3 5 3.2 + 0.7

30 X 3 5 2.4 + 0.5

Мегасин 10 X 3 7 3.7 + 0.7

20 X 3 11 4.0 + 0.7

Батриден 10 X 3 б 3.4 + 0.4

20 X 3 5 3.2 + 0.5

НШ 25 X 1 12 12.0 + 0.9

Фотрин 20 X 1 9 13.0 + 1.1

Госсипол + НШ 5 X 3 + 25 12 7.0 + 0.7*

10 X 3 + 25 6 5.3 + 0.6*

30 X 3 + 25 4 3.3 + 0. 6*

Мэгасин + НММ 10 X 3 + 25 6 8.1 + 0.9*

20 X 3 + 25 13 6.9 + 0.8*

Батриден + НММ 10 X 3 + 25 6 10.4 + 0.7

20 X 3 + 25 6 9.0 + 1.1

Госсипол +

фотрин 30 X 3 + 20 6 20.0 + 2.0*

Мегасин +

фотрин 20 X 3 + 20 7 31.4 + 2.4*

Батриден +

фотрин 20 X 3 + 20 11 18.0 + 2.0

* - в сравнении с позитивными контролями различия статистически достоверны при р < 0.05.

пол, частота встречаемости округлых сперматид с. микроядрами увеличивалась на 54%; предварительное введение животным мегасина также приводило к усилению кластогенной активности фотрина - уровень хромосомных мутаций возрастал на 141%. Батриден, в свою очередь, хотя и способствовал увеличению числа генетически аберрант-

ных клеток на 38%, различия между средними значениями и в этом случае были статистически не значимы.

Исследования убедительно показывают, что госсипол способен защищать реплицирующиеся хромосомы половых клеток от кластогенных эффектов НММ. Уэханизм антимутагенного эффекта госсипола, обладающего широким спектром биологического действия,может быть связан либо с усилением активности ферментов репарации или детоксикации, либо с обезвреживанием генетически активных свободных радикалов (см. Ваше! еЬ а1. , 1986; Порощенко, Абилев,1988). С другой стороны, амбивалентность госсипола отражает его способность стимулировать активность микросомальных многоцелевых оксидаа, функция которых сводится не только к обезвреживанию ксенобиотиков, но и к метаболической активации промутагенов, что обычно приводит к образованию потенциальных генотоксических факторов.

II. ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У ЖИВОТНЫХ.

11.1. Дитофотометрический анализ количества ДНК и основных ядерных белков в развивающихся сперматогенных клетках £ дип-доидов тутового шелкопряда

Сопоставление средних значений содержания ДНК-фуксина в сперматоцитах I порядка (зиготена + пахитена), телофазах II, ранних, округлых сперматидах, сперматидах на стадии удлинения и в морфологически сформировавшихся спермиях указывает на их близость к теоретически ожидаемым классам плоидности -4:1 (рис.6 ). Спер-матоциты I порядка содержат также тетраплоидные количества гисто-нов; это следует из сравнения результатов измерений количества основных ядерных белков в них и телофазах II (рис. б ). Отношение, как и для ДНК, близко к 4:1. Однако уже на стадии ранних, округлых сперматид содержание гистонов резко уменьшается, как минимум з 3 раза; часть ядер на этой стадии дифферениировки сперматид так слабо окрашивались ТХУ-щелочным прочным зеленым, что ци-тофотометрическое определение белков становилось невозможным. Затем количество основных ядерных белков постепенно увеличивалось и в спермиях вновь достигало гаплоидного уровня.

Цитохимический качественный анализ и электронношкроскопи-ческие наблюдения показали, что количественные модификации основных ядерных белков з спермиогенезе тутового шелкопряда отражают

о 2

190-

170-

150

20Н

• ' I \\

сц

Рис. 31. Динамика изменений содержания ДНК (1) и гистонов (2) в ядрах сперматогенных клеток диплоидов тутового шелкопряда. По горизонтали - стадии сперматогенеза: СЦ - сперматоциты I порядка, Т - телофазы II, I -1У - стадии созревания сперматид, С -спермии. По вертикали - содержание вещества в отн. ед. Метод фотографической сканирующей денситометрии.

смену.типа гистонов. Высокая устойчивость ДНК поздних сперматид и спермиев к действию ДНКазы I, споеобноать хроматина вредых гамет к деконденсации после обработки тиоловым реагентом также дают важные доказательства в пользу появления в спермиогенезе В. шоп новых, протаминоподобных белков, богатых аргинином и цистеином. Бее это вместе взятое говорит о том, что гаметический хроматин тутового шелкопряда по цитохимическим свойствам подобен ДНИ-комплексу зрелых спермиев плацентарных млекопитающих.

II. 2. Транскрипционная активность хроматина и синтез бежов в сперматогеь, ах клетках тутового шелкопряда

В семенниках В. шоп сперматогоииальнью и мейотическке клетки активно синтезируют РНК Включения 3Н-уридина не наблюдалось яа стадиях митотических и мейотических делений, а тэккэ во время созревания сперматид. Однако на этих стадиях интенсивно метятся •'Iî-уридином ядра питающих клеток цист.

включение 3Н-лизина как з цитоплазму, так и в ядра наблюдалось на стадиях размголвния и роста спергатогеяяых клеток, тогда :сак so время :.®йотических делений и спершогенеза Jlï-лизин включался только з шггсплазму. Практически :ге обнаружено включения меченого предшественника 2 питзюше клетга щст.

Наши наблюдения означают, что дифференцировка спермиогенянх :слеток у тутового Еелкопряда идет за счет реализации генетической лнфорнзцт, запасенной з виде РКП-частил з профазе I майсза. Однако не исключена возможность, - что и транскрипщгонно агегивниэ метки цист участвуют в регуляции спершогенеза, по крайней .\:ере. обеспечивают синтез белков, необходимых для сборки некоторых ор-ганелл сперматид и спермиев.

II. 3. Сперматогенез слабо плодовитых аллотетраплоидов тутового шелкопряда (Bombyx allotetraploidus Astaurov).

На рис. 7 представлены результаты измерений содержания ДНК з мейоцитах и постмейотических клетках. Видно, что в подавляющей части сперматоцитов I порядка содержание ДНК-фуксина соответство-зует 8С уровню плоидности. Отношение количеств ДНК в анафазах I и телофазах II отвечало теоретически ожидаемому 4:2. Однако яа постмейотических стадиях были, главным образом, выявлены зуплоид-яые (20 и 40) сперкатиды и спермии. В крайне редких случаях встречались гетероплоидные клетки.

Ранее было обнаружено (Захидов,1979), что з пахитенных спер-:.атощггах, анафазах I и телофазах II содержание основных ядерных белков сильно варьирует я не соответствует теоретически ояздаемо-лу. Популяция сфорьв*ровавшихся спермкев такт® оказалась весьма гетерогенной по содержанию основных ядерных белков. 3 то время ::ыт было высказано предположение, что дефицит гкстонов на стадии роста сперматогенных клеток приводит к зыпаденш одного из ¿зэйо-ггаесяих -елеяий, а ларусзяия автабодизма осяошя ядерных бежоз

I ' . I ' Г

I 1 I

' ! , ' I

I 1 СШШТОЦИТК I

1 г

I • ' I.

I ^Г

1 • I -' I—

АНАФАЗЫ I

"1 г_!-'

ТЕЛОФАза и

РАННИЕ СПЕ1ШШЫ

1 Г—Г

СПЕРМИН

'.{■¿о ЕсЦз Е^'з^а'^Л^'вга'вЛо' 2с 4с ' ¿с

. Рис. 7.. Гистограммы содержания ДНК ( в отн. ед. и кл. пло-идностй) в ядрах различных. типов сперматогенных клеток.слабо плодовитых аллотётраплоидов тутового шелкопряда.. Каждая точка - отдельное, измеренное ядро. .Метод прямой сканирующей денситометрии. Эталонами классов плоидности служили средние значения ' содержания ДНК в. сперматоцитах I порядка' и. спермиях 2п- самцов, соответственно, 286 + 4, 74 + 1,

в спермиогеневе ответственны ва образование гамет с нарушенной структурой хроматина у полиплоидных животных тутового. шелкопряда.

Эксперименты, продолженные в настоящей работе, подтверждают это предположение. А именно - хроматин профазных сперматоцитов .и спермиогенных клеток аллотетраплоидных животных, в отличие от

- I

диплоидов, обнаружил повышенную чувствительность к ДНКазе I. Причем интересно отметить, что реакция 2С- и 4С- спермиев на действие нуклеазы была различной: 2С-клетки оставались устойчивыми к нуклеазному гидролизу в течение 10 и 60 мин, и только через 120 мин содержание ДНК-фуксина в них снижалось на 21%, тогда как потери ДНК-фуксина в 4С-клетках при выбранных сроках гидролиза составили, соответственно, 17, 16 и 27%.

Дзвестно, что образование полиплоидных гамет может быть связано либо с делением полиплоидных сперматоцитов I порядка, либо с выпадением одного или двух мейотических делений. В принципе пер-зая возможность не исключалась для тутового шелкопряда. Например, з популяции триплоидных самок изредка встречаются миксоплоидные ссоби с генетической структурой Зп + бп, и такие самки могут продуцировать триплоидные яйцеклетки, поскольку в мейозе становится возможным правильная конъюгация шести гомологичных хромосом и их равномерное расхождение к полюсам; именно при оплодотворении Зп-яйцеклеток гаплоидными спермиями были получены 4п-самцы и самки тутового шелкопряда. Однако отсутствие в популяции сперматоцитов I порядка 16С-клеток делает этот способ образования тетрапло-идных гамет маловероятным. Следовательно, у Eombyx alllotetraploidus Astaurov единственным механизмом образования 4С-сперматид и спермиев является выпадение одного из делений ме-йоза. В пользу такого утверждения свидетельствуют цитофотометри-ческие исследования сперматогенеза у триплоидов тутового шелкоп-ряда(Захидов, 1980),а тага® у бесплодных быков и мужчин, в семенниках которых диплоидные спермии возникали в результате прямой трансформации сперматоцитов II порядка з сперматиды (Esnault, Ortavant, 1987; Silvestroni et al., 1976).

II. 4. Состояние ДНП-комплекса в сперматогенных клетках :ллекопитающих при экспериментальном и естественном гиповитаминозе А.

На рис. 8а показана динамика изменений содержания ДНК в сперматогенных клетках крыс из К-, О-'и РК- групп. Профазные сперма-тоциты•(стадия пахитены) контрольных и подопытных животных содержали одинаковое тетраплоидное количество ДНК. Однако в отличие от контроля в популяции пахитенных сперматоцитов подопытных крыс " встречались также и морфологически атипичные, гипотетраплоидные

Рио. 8а. Содержание ДНК в сперматогенных клетках крыо из К-0- и РК-групп. По горизонтали - типы клеток 1 - пахитенные спер-матоциты, 2 - атипичные сперматоциты, 3 - округлые сперматиды, 4- удлиняющиеся сперматиды, 5 - тестикулярные спермии, 6 - зпиди-димальные спермии. По вертикали - количество ДЩ-фуксина в отн. ед. Вертикальные линии - ±6. Высота столбца соответствует среднему арифметическому значению. Метод фотографической сканирующей денеитометрии. В- К, И- О,. ШЗ- РК.

клетки. Число таких атипичных сперматоцитов составляло примерно 11% от общего числа изученных клеток данного типа. В семенниках всех исследованных животных.содержание ДНК в округлых и удлиняющихся сперматидах соответствовало 1С, что видно из сопоставления средних значений содержания ДНК в сперматоцитах и сперматидах. Цитофотометрические измерения содержания ДНК-фукоши в тестику-лярных и зпидидимальных спермиях крыс всех трех групп дали совпа-

Гчс. 86. Содержание гистонов в сперматогенных клетках 1срыс :;з К-, О- я РК- групп. По горизонтали - типы клеток: 1 - яахитенг ные сперматогшты , 2 - округлые сперматиды, 3 - удлиняющиеся сперматиды, 4 - тестикулярные спермин, 5 - атипичные тестикуляр-:те спермаи, 6 - зпидидишльные спермии. Ш вертикали - количест-20 гистонов в отн. ед. Вертикальные линии - + 6. йжота столбца - соответствует среднему арифметическому значению. Цзтод фотографической сканирующей денситометрии. О- й, 23-0, СЗ-РК.

даетцие результаты. Как в контроле, так и в опыте в популяции зрели гамет клетки с аномальной структурой ядер не обнаруживались.

"жамика количественных изменений основных ядерных белков з сперматогенных ¡слетках крыс из К-, О- и РК- групп показана на рж. 86. Контрольные и подопытные самцы не отличались друг от дру-г*3; по содержанию тастснов з пахитекных сперматоцитах а округлых сперматвдах. У всех изученных животных в удлинявшихся сперматидах

наблюдалось резкое снижение содержания основных ядерных белков,

вплоть до уровней, лежащих за пределами чувствительности цитофо-тометрического метода. Морфологически нормальные и часть атипичных ядер тестикулярных спермиев интенсивно окрашивались щелочным прочный зеленые и количество гистонов в них возрастало примерно вдвое.. Содержание же гистонов в большинстве ядер с нормальной к нарушенной структурой хроматина оставалось на уровне, характерные для удлиняющихся сперматид. Такие атипичные спермин в семенниках подопытных крыс составляли примерно 25% от общего числа изученных клеток данного типа; в контроле они встречались крайне редко. Спермии, взятые из эпидидимисов, были морфологически нормальны и содержали одинаковые количества основных ядерных белков.

Ьыявленный в части гамет дефицит спермиоспецифических, богатых аргинином гистонов, хорошо согласуется с результатами измерений концентрации свободного аргинина в плазме крови у исследованных животных. У самцов О- и РК-групп количество свободного аргинина в плазме крови было снижено в 5-10 раз по сравнению с контролем.

Итак, при легком продолжительном гиповитаминозе А у крыс на терминальных стадиях спермиогенеза формируются спермии с аномалиями хроматина, что связано скорее всего с нарушениями синтеза га-метических белков. Ретиноевая кислота, восстанавливающая все соматические функции при гиповитаминозе А, не обеспечивает процессов, ответственных за формирование спермиев с нормальным ДНИ-комплексом.

Цитофотометрический анализ не выявил статистически значимых различий между средними значениями количества ДНК-фукоина в эйя-кулированных спермиях опытных и страдающих гиповитаминозом А баранов. В обоих "Случаях, однако, наблюдалась значительная гетерогенность гамет как по морфологии хроматина, так и по содержанию основных ядерных белков. Тем не менее число атипичных сперматозоидов было в 1.7 раза выше в эйякулятах гиповитаминозных животных.

Таким образом, если предположить, что шансы достигнуть точек оплодотворения и внедриться в яйцеклетку у спермиев с нормальным и атипичным ДНП-комплексом одинаковы, то тогда эмбриональная смертность будет выше у тех овцематок, которые спаривались с ги-повитаминозными самцами.

- S3 -

11.5. Влияние химических мутагенов на ДНП-комплекс сперматогенных

."•леток мышей

Результаты цитохимического изучения хроматина в зрелых половых клетках мышей суммированы на рис. 9. Через 14 дней после действия дипина эпидидимальные спермии отличались от контроля существенной гетерогенностью по содержанию ДНК-фуксина и примерно 25%-яым меньшенкем количества основных ядерных белков, высокая вариабельность з содержании ДНК-фуксина, снижение интенсивности окрашивания ядер по !3ельгену я ТЗУ-иелочнкм прочным зеленым, соответственно, на 19 я 30Z характеризуют эпидидимальные спермии гашей через 35 дней после воздействия. Установленный дефицит

сановных ядерных белков могвт быть следствием индуцированных генетических изменений з ранних профазных сперматоцитах, как это

40-

20 -

14%

СЯБ

I- !

1 /Ь

15%?

L Ж

17%

15%

18%

13%

i i

.J-.

15%

В5

EMM 14

НММ

д 14

Д 35

EMM

Рне. 9. Содержание ДНК и

основных ядерных белков (ОЯВ) з пидидимальных спермиях контрольных (К) я подопытных мышей через 4 и £5 дней после действия !.г/тагенов дипина (Л) я нитрозометял-очевины (Н5зМ). Еысота столбцов - средние значения, цифровые бозначеякя з % - коэффициенты вариации, 'йтсд прямой сканирующей енситокетрии.

предполагалось по результатам цитогенетических исследований. Существенно, что и в некоторых других типах спер&атогенньк клеток мышей, подвергшихся воздействию дипина, выявлены заметны:; измег:?--ния в содержании ДНК-фуксика, а также в реакции ва действие ДШ£-зы I в сравнении с нормой

Шь не оказывала влияния на содержание к характер варьирования количества ДНК-фуксина в эпидидимальных гаметах: мышей как к;. 14., та1: и на 35 дни фиксации. Сильное снижение (примерно на 257.) содержания спермиоспецифических белков наблюдалось только на 35 день после начала эксперимента, Отсюда следует, что действие Ж! ограничивается генетическими эффектами на сперматоцкты I поряди К это еще раз подтверждает предположение о роли генетических нарушений в этих клетках для синтеза спермиоспецифических белков. Иначе говор?., полученные нами'данные убедительно свидетельствуй: в пользу возможности регуляции спермиогенеза-диплоидным геномов (мейотический контроль) половых клеток.

11.6. Цитохимическая характеристика сперматозоидов быков после различных сроков криоконсервации.

При криоконсервации семени в генетическом и репродуктивном отношениях лучших производителей или исчезающих видов животных необходимы систематические и комплексные исследования качества гамет. При этом наиболее важным представляется оценка степени воздействия низких температур и различных компонентов защитных сред на структурно-функциональную целостность ДНП-комплекса гамет. Наши цитохимические исследования убедительно показывают, что негависмо от длительности хранения сперматозоидов быков при -196°d количества ДНК и основных ядерных белков в подавляющей части клеток существенно не варьируют и соответствуют содержанию этих веществ в сперматозоидах из свежих зйякулятов (см. табл. 4 и 5)..

Использование метода искусственной деконденсации ядерного материала показало, что сопутствующие процессу распаковки хроматина количественные изменения основных ядерных белков в кратковременно замороженных сперматозоидах (4 ч) и сперматозоидах, хранившихся при - 196°С в течение 14 лет носят одинаковый характер. Однако если в ходе имитации мужского пронуклеуса in vitro в первом случае полной дисперсности хроматина достигала примерно 30"

Тайдша 4. Содерлаякэ ДНК з ядрах сперматозоидов быков roi различных сроках хранения сенепя з пэ-чооо ¿энном состоянии.

Продолжительность ~"сло жученных + 1?оз!%!ц::еит

гфиоконсервации сперматозоидов гзтааш^!, в i

0 (контроль) 95 108 + 1

■ -А' дня 75 1Е5 + 1 9

,1 год . ; 129 127 + 1

5 лет 1S5 . 129 + 1 G

3 лет 125 + 1 u

11 лет 127 140 ± 1

'-.бляга 5. Содержанке гмстояов з ядрах спсрттозсядоз быков при различных сроках хранения семени в замороженном состоянии.

Продолготельность ';ж.чо изученных S f а_ ' Бозффшшеит .фиоконсервацшт сперматозоидов ^ вариации,. з Д

0 (контроль) 144 39 + 1 •' 12

4 дня 123 98 + 2 . ■16

1 год 173 100 + 1 10

5 гет 177 96 + 1 . 12

3 дет 136 90 + 2 13

И лет 171 93 + 1 12

?шлет, то зо-зтором - лишь 18%. Увеличение хранящихся in vitro сперматозоидах резистентности ганэтического хроматина к действию тюлевых реагентов могэт быть обусловлено его сверхконденсацией, ггрисбретае?жй ' -за счет ' окисления свободных тколоз и образования Л2С0лтте,а>яых дксульфидных сшивок.

• 111..' змгжшгз

'¿учения отклонений от г:ср:/ального хода сперматогенеза открывают ряд заяных сторон этого явления. liapyrsmra сперматогенеза л, как следствие, наступление стерильности шгут быть вызваны сажает различными факторами," з том числе хгшичесхина.соеднненжня!, которые i:o способу действия делятся на -три основных класса- алтл-

митотическиэ, антимейотические к аятшюстмейотические агенты. Эти вещзетва способны поражать сперматогенный процесс лкоа путей прямого воздействия ка развивающиеся половые клетки, лкЗо опосредовало, через нарушения функций клеток Сертолк, кгращю: еушотвек-куо роль б процессах дифференцировкк к созревания мэйогическкз: е сперьаогенных клеток ( Kíann, Lutvak-tóann, 1S3Í).

Действие химических мутагенов, как явствует кз нашп: наблхз-деш::'., ка пролиферкрукаще первичные половы® клзткк к ка гоноцитк, вышедшие кз цикла клеточной репродукции, в дальнейшее отрицательно не отражается ка количественное состава споркатогонкальЕш; клетей ь семенниках половозрелых мышей. Ысаоте с тем оирткы^о клеточные потери наблюдались ка стадии пролазь: I кз^оза к б спер-ииогенеае. Тот факт, что в популяции округлы}: сперхгатид клеткк с кифоядракк пракгкчэскк отсутствовал^ из нзЗлхаалай значительней выход сперкмеЕ с морфологически аноьвльншк головкаж, говорит о токе, что клетки-предшественники с тяяэлы&к хромосомными поврехда-нкямк не преодолевают сложные барьеры сперматогенеза к, наоборот, клетки-предшественники, несущие генные мутации к/кж микроделе-цик, сохраняли шансы достигать терминальных стадий созреваний мужских половых клеток

Установление факта гибели сперматогониев под влиянием дипк-на или НШ подтверждает, что алкилирущие агенты поражают преимущественно митотически активные клетки.. Стволовые сперматогониаль-ные клетки обладают низкой пролиферативной активностью, что, вероятно, обеспечивает им большую устойчивость к цитотоксическим агентам, мишенью которых в основном является S-фаза клеточного цикла (Oakberg, 1978; Maistrich, 1986а; Schwartz, 1989), тогда как 62- клетки не блокируются и нормально проходят через митозы. Клетки, находящиеся в длительном Gl- периоде вообщем имеют достаточно времени для того чтобы восстановить хотя бы часть индуцированных повреждений (Maistrich,1986а,Ь). Определенно существуют механизмы, оберегающие. Gl-клетки от влияний повреждающих факторов и в то же время обеспечивающие им способность быстро реагировать на любые изменения, затрагивающие компартмент.сперматогониальных клеток (Huckins, Oakberg, 1978b; Bootsma, Davids, 1988). При обеднении семенников дифференцирующимися половыми клетками стволовые сперматогонии могут переходить в состояние высокой митоти-ческой активности, ведущэй к сравнительно быстрому восстановлению сперматогенного эпителия в большинстве семенных канальцев; по ме-

- С7 -

Г * завершения зтого процесса стволовые сперматогснии могут гяозь приобретать статус медленно циклируящпс клеток.

т??зетзительность ыейотических и постаейотических клеток к цзтототеичеекям эффектам химических шатенов дипина н 351 ■ не установлена: сервые сохраняет способность сравнительно легко преодолевать оба .'«йотяческих делений, вторые - достигать терминальная стадий диф^еренцировки.

Гспрос о генетической чувствительности различных т"псз спер-ттогенных клеток ч длительности сохранения индуцированных :,<ута-::тл на вполне асе и. Противоречивый характер результатов, получаемых з ряде случае?,, скорее Есего обусловлен .-^пользованием различных линий и видов животных, :пс возрастом, применением яеадек-гатных }«тояяческях подходов для обнаружения мутаций, ■ количест-хзгаш н :<ачестзеяяая спенка которых может зависеть ст степени порашяия геяска стволовых клеток я репаративннх. систем, -о, «?дав с г лоз ч вигов <*азятаских я химических агентов,, -грименявшихея з сксперименте.

Непосредственно с этой проблемой стоит задача гагаты генети-'•эс1сого дагериала половых клеток. Изученные нами с этой точки грения'госсипсл я некоторые его производные проявили способность защищать хромосомы профазных сперматсцитов от мутагенных З'лфектов

Однако подобно многим растительным и синтетическим фенольныы соединениям обнаружили амбивалентную активность, выступив как сенсибилизаторы мутагенных эффектов фотрина. Тем не менее открытие нами антимутагенных свойств госсипола указывает на принципиальную возможность получить аналогичные и, быть мотет, более на- ' лежные результаты при изучении других веществ природного про-газхождения.

'3 норме з семенниках млекопитающих зысокодиф$еренцированныэ метки Сертоли не пролиферируют. Однако после действия вредных факторов резервные клетки-предшественники приобретают способность делениям, благодаря чему я идет скорое восстановление пула клеток Сертоли и, возможно, пх функций.

Сравнительные цитохимические исследования нор>ального л атипичного сперматогенеза позволили не только получить ряд принципиально ясных данных, но и по-новому взглянуть на причины мужской стерильности я слабой плодовитости. Стало ясно, что эти явления ::е обязательно бывают связаны с анеуплоидией галет, а такгв о лито - лли азооспермией. Существенная вариабельность содержания ДНК з

iCfxsiaz соловых клетказ:, выявляемая при щгюботомг^ркчаста: кзкз-рэккю:, ,ю*эт Ишь вызвана ко .генетической кесб&лакаЬфованностъа, .во .аткпвчваь: характеров .крмахквз, что обусловлено •нарлззншпг*-. ироцессоъ скктег-а к ьакопления епер^оспещ^йчесгаат белков у. ке вэаиюдействкг.е ЯШ- йкэнно-варувшвк ДНК-белэк-взаимадейстюй: явдав'х'сж-тек обпдек,- -что-'южно выыестк es ревуаъмягоб выводвеннк;: .Eaabi кооледованкЛ, • цэль которых: сосотояла 1- пэвишата: -

ПрИЧЙК ОНЮЗНИЯ ОПЛОДОТЮрЯШ£л СПСЮОбИСЮТК СПЗрЙКЭЬ ilocii цвлогэ

'ряде'воадейетвкГ:, ..':.'■'.' . ' ■.

• S опыта: е. экгперкшюгальных: к естеетинш: гкповк?шшоао.л L. .быхэ ойкадпэЕс, что в:сеизнниках к эё&ку&гт&х млэкопктакцю: присутствует сравнительно ■ большой процент. гаш* с • нарушении.:: о:*-деркшкзь:' осйовеш: гдернш: -бэлког. к скрыта авокаэта«®? структур:;!: яд®;-» вкауалиаада которых становится' возюжгкй, только пэслг ок-ракшаакг: 'ШЧвзгочшь прочкш: гелекььс йефицк? бедкон ¡йкарух;.:;. г-аюрг е морфологически нормально ядрах эпидэдыгальньа: сперме:; kSsEai., пэдвергаихес • до&стве» хкм/гческга: мутагенов; к .иманао с тег. . клетка;:которые-- в воздействий находились не старик ачтк'--

ного екктееа спер^эспзцкфггчэшжз: белков, либо ks одно»-; иг. наиболее гекетичеекк чувствительной стадии, т.е. ранней профазы I мз-йоза.

Цитохимическая оценка качества криоконсервированных гамет на уровне ДНГЬ комплекса с. целью прогнозирования их оплодотворяющэй способности с большой очевидностью показала, что. ни . длительное . сохранение эйякулятов (от нескольких дней до 11 лет) в глубокоза-мороженном состоянии, .ни последуювря процедура оттаивания не вызывает сколько-нибудь заметных количественных отклонений в содер1 жании двух основных компонентов хроматина - ДНК и спермиоспецифи-ческих белков, в подавляющей-части сперматозоидов быков. Длительная криоконсервация не. влияет также на .характер 'количественных изменений, основных, ядерных белков;, сопутствующих формированию имитированного в условиях, in vitro мужского .пронуклеуса. Тем не менее процент крйбконсервированнызс сперматозоидов с полностью.де-конденсированными ядрами был в 1.5 раз ниже, чем среди сперматозоидов, . взятых из свежих эйякулятов. Применение.метода декон-денсации делает доступным.изучения биохимического состава к ток-, кой Структуры хроматина сперматозоидов многих видов животных г человека, а в сочетании с цитохимическими приемами исследований лергпеютгвнш для оценки степени влияния химических и физическс:

- С9 -

агентов на стабильность ДНП-комплекса, анализа кариотипа гамет я Еьзявления скрытых дефектов генома ( Rudak at al., 1978; Yours? et ci. , 1S79; Huret, 1S83).

У хорошо плодовитых диплоидов тутового пелкопряда ДНК з v:cp-Сояогячески сформировавшихся спермиях устойчива к действия I. ста наблюдения з соединении с результатами исследований количественных я качественных изменений основных ядерных белков з сгерипсгенеге д способности ядер зрелых спер»гиев к декснденсадии после обработки тиолсвыми реагентами служат важными доказательст-s?i« сходства, по крайней мере, по цитохимическим свойствам гаме-т:?ческсго хрстатияа В. .-таг! с ДНП-кошлекссм сперматозоидов плацентарных млекопитаюзих. У этих .тивотных, зрелые гагаты содетоат Согатке аргинином я цистеином протанннсподсбяке белки, сбеспечи-аащке за счет ^сульфидных саивок неуязвимость зрогакша для i-яогях ххоетческих агентов, в том числе яуклеаз. 'йяту тем цитофо-тожтричес:с?й анализ показал, что в отличие от члекопитакшх J тутового пелкопряда ДНК з скруглых и удлгагаш^тхсп сперматилах проявляет большую устсйчиессть к действия яуклеазы. Зта устойчивость хорошо коррелирует с отсутствием транскрипционной агсглв-пости в епермиогенных клетках (у крыс, как известно, з днффэрея-пирукигися спериатидах, синтез РНК возобновляется, л сильнее аце-тилирсванке гжтонов приводит к ослаблению связей :<эяду яикя ~л ДНК), хотя синтез белков, судя по результатам радиоавтсграфя-'-"зских исследований, идет, но, вероятно, на патрицах, синтезируа-ми соматическими клетками цист.

У слабо плодовитых аллотетраплоидов тутового пелхопряда, з сэшнниках которых ранее были обнаружены несоответствие количества гкстснсв количеству ДНК в еперматоцитах I порядка и значительная гетерогенность r&\ST по содержанию основных ядерных Селксв (Еахидов, 1979), ДНК во всех изученных типах сперттогеняых клеток сказалась гораздо чувствительней к действию ДНКазы I, чем з клетках 2п- сгжсв; даже з сформировавшихся гаметах потеря количества ДНК-<$укс:ша были весьма ощутимыми, з особенности 2 тетрап-гсидкых но соггер.таштю ДНК спермиях. Судьба 4С-га*?зт, Лоркиру»-гахся в результате вшапепия одного из делений мзйсза, неизвестна. Однако неспособность этих сперуиев участвовать э оплозотЕоре-::ди очевидна; з популяции аллотетраплоидов гексаплсиднне :л-вотяш из гетречал«сь. Счень вероятно, что функциональная пеполнскэн-cson 4C-rsfssr вшвава на /фагаяя уг&хячеивем геякз, а де^экгагст

. - 40 -. '

структурно® организации ДНП-комплекса. Гаметы с аксиальным хрока-тивг5 если дажз к приникают участие в процессах оплодотворения, неспособны поддерживать нормальное развитие зкгот к эмбрионов.

ВавзрЕая кзложэнкэ к обсуждение результатов настоящей работ та, иу приход®,; к убеждение! о необходимости развертываний болйэ широки: с^яж^а-гл^к*^ исследований процесеоь сперматогенеза у разка: видов мйвотэыг, • в той.' числа к из щщя&як популяций. Та- _ .кв£ ксслгдэвакюх с применением комплексны?: ьытодкчасгая: подходоа , пролизжв, свез? на шогие теоретические аспекты клеточной биологии к способствую? реЕзнии ряда практических проблем репродуктивной н генетической токсккологке; - 'новых областей анашь!

' .'ЕЩ2

1., Нарушены:» возникавши в первичные полови: клеткаг мышей ь результате действия химического мутагена дипкка, ь дальнейшее .не оказыывакс влияния на пул сперкатогонкальньк клато»:, но -выай-вахп' резкое уменьшение общего числа сперматогмтоь I поряди, спзрматвд к спермиев. ГЬрвичныэ половыз клзткк с кндуцированньая генетическими изменениями сохраняют способность преодолевать сперматогониальные и ыейотические деление к достигать терминальных. стадий сперматогенеза.

£. Реакция различных типов сперматогенных клеток половозрелых животных на цитотоксические эффекты дипина или НШ неодинакова: . основными мишенями для этих веществ были сперматогониальный компартмент, состоящий из активно размножающихся половых клеток. Продвинутые в развитии сперматоциты Т порядка ( стадии средней, и ■ поздней пахитены), . сперматиды и спермии оказались менее уязвимыми. ■ ' 4 ' '

■ Установлены видовые различия в характере деструктивных .и восстановительных процессов сперматогенеза. ■

З.С помощью критериев микроядер и аномалий форм головок спермиев показано, что сперматогониальные и мейотические клетки млекопитающих: обладает высокой генетической чувствительностью к . действию дипина . и. НШ. При этом у крыс в отличие от мышей дифференцирующиеся сперматогонии, несущие тяжелые хромосомные повреждения, не элиминируются « нормально проходят через все фазы мейоза.

. Цитогенетические наблюдения таюкэ указывают на длительность

- 'Л -

сохранения индуцированных дипином, по не мутаций з стволовых сперштогоякаяьных клетках как мкшей, так ж крыс.

-1. йфагсгер количественных изменений клеток Сортоли в ответ на действие дипина или 1201 имеет вядовые особенности зависит от даз и природы мутагена. .Выявление' з данной ¡глеточнсй популяции нятотических ;;артин, дзуядерных клеток, клеток со следами хро-иосо!яшх поломок или гигантскими ядрами слупят убедительным доказательством з пользу перехода резервного материала из - состояния митотической инертности к активной пролиферации. 3 перш среди гжекодиффереяцироваяных клеток Сертоли митозы,. а такте .«•.тетки с хромосомными з ядерными аномалиями практически не наблюдались..

2. Экзогенный регулятор сперматогенеза госсипол'я зго лреиз-шдные защищает хромосомы профазных сперматоиитоз от кластогеяньпс. эффектов НУМ, по еутзестзенно увеличивает зыход клеток ? хромссс«-еыми аномалиями при сочетанном дейетзии с другим мутагеном - страной.

о. В сперматогенезе плодовиты:; диплсидов тутового пегкопряда структурным перестройкам хроматина сопутствуют количественные -л качественные изменения основных ядерных белков. Злектронномак-рсскспичесгсте наблюдения показали, что з днф$ереш!ирующйхся спер-матидах лжденсашга хроматина происходит одновременно с сегрегацией !1 элиминацией нуклеоплазш, возможно,' содерлятай гистояы соматического типа.

цитохимическим свойствам .хроматин зрелых.спермкев В. поп сходен с гаметическим ДНИ-комплексом плацентарных млеюопита-

.'озих.

7. 3 семенниках гусениц тутового селкопряда сперкатогониаль-яые клетки и профазные сперматоцигн транскрипционно активны, но аа постмейотяческих стадиях синтез РНК идет только з клетках цист. Синтез белков обнаружен во зсех изученных типах спесмато-генных клеток, з том числе зо время мейотических делений, и на стадии сформировавшихся спермиев. 3 спермиогенезе активного синтеза ¿елков клеткаки цист зе выявлено.

-3, 3 семенниках слабо плодовитых аалотетраплоидеа ЗогсЬух а11о1а1гар1о1с!из Дэйзигоу з результате выпадения одного из деле-":гА ьяйоза наряду с 2С-сперттида»ля и сперметкя ¡формируется пелнй класс морфологически нормальных тетраплоидных по содержанию .ЦНК спершсгеннкх клеток. 3 отличие от гамет фертильных дипгсядсв 1С-•л отчасти 2С спермии 4п-сш<цов обнаружили повышенную чувствитель-

ность к действию ДНКазы I.

Одна из наиболее вероятных причин слабой плодовитости алло-тетраплоидов тутового шелкопряда - образованна большого числа ■спермизв с нарушенной структурой хроматика, или таг: называешь незрелы»: ДНП-комплексов, а не анеуплокдия клк полкморфкзк газет.

8. При легком продолжительном ггаювиташкозе А в еешшнккг:: ?фыз формируется больше число спермиев (25 Z от общего числа изученных гамет) с нарушенной структурой хро&гатнка к дефицитов спермиоспецифически:: белкоЕ. Ретиноевая кислота нз обеспечивгэ?: . нормализацию процессов сперматогенеза у гиповктамкнозньп: крыз.

В зйякулятах баранов, страдающих естественны»! гиговктамкЕ;*-зои L, выявлен высогай процент спершев с морфологический-: ачолт-лнямя хроматика к сильно несбалансированный содержанием белках;; число таких клеток бьио в 1.7 раза болы», че* в эйакуяггах баранов, получавших с рационом витамин L

.10. Дефицит основных ядерных белкоЕ я вариабельность ДЕК, вьстляешз е эпидидкмальных спермияя мшей черег 33 дней после воздействия химических мутагенов подтверждай?, что процессы спер-миогенеза находятся под контролем диплоидного генома сперматогек-ных клеток.

11. Цитохимический анализ показал, что длительная криоконсер-вация (1-10 лет) сперматозоидов быков не вызывает существенных отклонений в содержании ДНК и основных ядерных белков.

Имитация мужского пронуклеуса in vitro также не выявила различий в характере количественных изменений спермиоспецифи-ческих белков между сцермиями из свежезамороженных эйякулятов и айякулятов хранившихся в течении. 14 лет при -196°С. Однако число гамет с полностью деконденсированным хроматином, оказалось в 1.5 . раза меньше в зйякулятах,.: хранившихся в течение длительного вре-• мени. -' '.'■■.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Данилова JL В., Захидов С. Т. 1975. Ультраструктура олиго-пиренных сперматид у диплоидов тутового шелкопряда// Бгалл. Моск. об-Еа испыт. природы, т. 80, с. 41-49.

2. Данилова JL R , Захидов С. Т., Лебедев а А. 1976. Цитофото-метрическое исследование . содержания ДНК в ядрах сперматогенных клеток диплоидов и полиплоидов тутового шелкопряда// Цитология, т. 18, с. 430-437. • ' ' :

3. Данилова JL R , Захидов С. Т. 1976. Конденсация хроматина в спермиогенезе тутового шелкопряда//Тезисы докладов X Всесоюзной конференции по электронной микроскопии, с. 145-146.

4. Захидов С. Т., 1&ршак Т.Л , Бродский R Я 1976. Количественный анализ гистонов в сперматогенезе ди-и полиплоидных форм тутового шелкопряда (Bombyx mori L.)// Тезисы докладов III Съезда ВОГиС им а И. Вавилова, JL , "Наука", с. 177.

Б. Захидов С.т., Маршак T.JL 1978. Основные ядерные белки в сперматогенезе у диплоидных.и.полиплоидных форм тутового шелкопряда. I. Количественный • и качественный анализ гистонов в ядрах сперматогенных клеток диплоидных животных// Цитология, т. 20, с. 298-306.

6. Захидов С. Т., Маршак Т. JL , Данилова JL R 1978. Основные ядерные белки в сперматогенезе у диплоидных и полиплоидных форм тутового шелкопряда II. Содержание ДНК и гистонов в ядрах сперматогенных клеток триплоидных животных// Цитология, т. 20, с. 657-664.

7. Захидов С. Т. 1979. Цитохимическое исследование сперматогенеза у диплоидов и полиплоидов тутового шелкопряда// Дксс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук.

8. захидов с. т. 1980. Основные ядернше белки в нормальном-И' атипичном сперматогенезе у зукариотов// Усп. . совр. биол. 6 т. 90, с. 339-350.

9. Захидов С. Т. 1980а Сперматогенез аллотетраплоидов тутового шелкопряда 16 и 18 генераций// ДАН СССР, т. 252, с. 469-471.

10. Захидов С. Т. 19806. Обнаружение ЗС-гамет в эйякуляте стерильных триплоидов тутового шелкопряда, В. morí.// ДАН СССР, Т. 253, с. 1241-1243.

- 4411. Захидов С. Т. 1982. Способность к деконденсации in vitro хроматина спермиев тутового шелкопряда// ДАН СССР, т. 262, с. 1495-1497.

12. Захидов С. Т., Маршак Т. JL , Бродский В. Я. 198а ДНК и основные ядерные белки в сперматогенезе аллотетраплоидов тутового •шелкопряда//Цитол. механизмы гистогенезов, Ташкент, "Фан", с. 66-67.

13. Захидов С. Т., Маршак Т. Л , Лебедев Э. А. 1983. Гетерогенность гамет в эйякуляте// там жэ, с. 67-69.

14. Захидов С. Т., Ворончук Г. R , Наук Е А., Бродский В. Я.

1984. Цитохимическая характеристика бычьих сперматозоидов после различных сроков криоконсервации// Изв. АН СССР, сер. биол., К 2, с. 242-248.

15. Поздняков С. К, -Захидов С. Т. 1984. Состояние ДНП-КОЮ1-лекса сперматогенных клеток крыс при гиповитаминозе А// Онтогенез, т. 15, с. 81-87.

16. Захидов С. Т. 1984. Цитология сперматогенеза шелковичного червя// Усп. совр. биол., т. 98, с. 246-355.

17. Захидов С. Т., Борончук Г. Е., Наук Е А., Бродский Б. Я.

1985. Количественные изменения гистонов при образовании в сперматозоидах млекопитающих in vitro структур, свойственных мужскому .

. пронуклеусу// Онтогенез, т. 16, с. 73-75.

18. Захидов С. Т. , Позняков С. П., Фактор Rli и др. 1985. Ци-тофотометрический анализ ДНК и гистонов в сперматозоидах бара- ■ нов-производителей при естественном гиповитаминозе. А//Изв.' АН СССР, сер. биол., N 5, с. 742-747.

: 19. Садыков А. С.,; Исмаилов А. И., Захидов С. Т., Барам Н.И. 1985; Действие госсипола на сперматогенез и фертильность человека . и млекопитающих животных// Онтогенез, .т. 16, е., 346-357.

20. Захидов С. Т.,. . Маршак Т. JI 1985. Транскрипционная.актив-ность х{Х)матина и синтез белков в сперматогенных клетках тутового

■ шелкопряда Bombyx mori L. // Онтогенез, т. 16,.с. 406-411.

21. Захидов С. Т., ■ Позняков С. П., Урываева И. Е , Хамидов Д. X

1986. Мзтод учета мейотических микроядер при изучении мутагенных свойств пестицидов// У. биол. ?typ-. N 4, с. 52-54.

22. Захидов С. Т., Поздняков С. Е , Урываева И. R и др. 1987. Цитогенетическое исследование действия госсипола на мужские половые клетки мышей// Генетика, т. 23, с. 922-924.

2а Захидов С. Т.. Урываева KR , Лэзняков C.R , и др. 1988.

Исследование кгастогеяного дзйствея госсшша на сперштогеянаэ клетки крыс с гтошщьп гятода учета гшфоядер// 1'зв. АН СССР, N 3, с. 471-475.

24. Захидов С. Т., Смирнова О. Б., Голгаенков К А. 1990. Исследование антимутагенных свойств гсссипола и его производных// Вэст. 1±ск. Унив., сер 16, Биология, N 2, с. 24-26.

25. Захидов С. Т., Читанава- Л О., ;йфяи X ¿V » Голнченков В. А. 1991. Ано^галии сперматогенеза у мышей, подвергпшся воздействию химического мутагена дипина на эмбриональных стадиях развития// Сообщения АНТ, N 2, с. 397-400.

25. Захидов С. Т., Шршак Т. Л. 1992. Чувствительность хрома-тша дифференцирующихся сперматогенных клеток диплоидов и алло-тетрапхоидов тутового шелкопряда к действию ДНКазы I. Цитохимическое исследование// Вэст. Мзск. Унив.., Биология, N 3, с. 65-68.

27. Захидов С. Т. , Голиченков а А., Хода А. 15ахран. 1893. Влияние химических соединений на развивающиеся сперматогенные клетки животных// Материалы У научной конференции РНАН (з печати).

Информация о работе

Захидов, Сабир Тишаевич
доктора биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.11

Автореферат

Похожие работы