Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние физико-химических способов стимуляции сперматогенеза на свободно-радикальные процессы организма экспериментальных животных

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние физико-химических способов стимуляции сперматогенеза на свободно-радикальные процессы организма экспериментальных животных"

На правах рукописи

005536868

Новикова Яна Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СПОСОБОВ СТИМУЛЯЦИИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА НА СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ОРГАНИЗМА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.03.01 физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 ОКТ 2013

Нижний Новгород - 2013

005536868

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» Министерства образования и науки Российской Федерации на кафедре биомедицины биологического факультета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щербатюк Татьяна Григорьевна Официальные оппоненты: Успенский Александр Николаевич

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, заведующий кафедрой акушерства, зоогигиены и разведения сельскохозяйственных животных

Любин Николай Александрович

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, заведующий кафедрой морфологии, физиологии и фармакологии

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», г. Уфа

Защита состоится 12 ноября 2013 года в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 220.047.01 при ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 603107, г. Нижний Новгород, пр-т Гагарина, 97

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия».

Автореферат разослан 11 октября 2013 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Р'/чгр&о. М.Н. Иващенко

1. ОК1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Генерация активных форм кислорода (АФК) и свободно-радикальное окисление происходят во всех тканях живых организмов в процессе нормального метаболизма (Козлов Ю.П., 1973; Бурлакова Е.Б., 1998). Умеренные количества АФК необходимы для физиологической регуляции функций сперматозоидов, гиперактивации и акросомальной реакции (Зоркин С.Н. и др., 2009; Божедомов В.А. и др., 2012; Aitken R.J., 1998; Lombardo F. et al., 2011).

В публикациях последнего десятилетия фактором, снижающим мужскую фертильность, ученые считают гиперпродукцию АФК (Божедомов В.А. и др., 2008. 2009, 2010, 2012; Торопцева М.В., 2009; Agarwal A. et al., 2006; Tremelleñ К., 2008). Лишшмый состав плазматической мембраны сперматозоидов существенно отличается ог состава липидов соматических клеток. Мембрана мужских половых клеток содержит большие количества насыщенных и полинепасыщенпых жирных кислот, фосфолипидов и стеринов - основных субстратов для окисления, поэтому сперматозоиды особенно чувствительны к повреждающему действию АФК (Sanocka D., Kurpisz М., 2004). Избыточная продукция свободных радикалов вызывает нарушение митохондриальной цепи переноса электронов, повреждает мембраны и ДНК хромосом половых клеток, а также запускает каскад реакций, инициирующих ario птоз (Kemal Duru N. et al., 2000; Villegas J. et al.. 2005; Aitken R.J. et al., 1998, 2010). В результате этих событий снижается подвижность и оплодотворяющая способность гамет; что, в конечном счете, приводит к бесплодию (Божедомов В.А. и др., 2008; Торопцева М.И.. 2009; '1 remellen К., 2008).

Актуальность поиска способов стимуляции сперматогенеза обусловлена тенденцией снижения показателей спермограммы. Согласно популяционным исследованиям, скорость падения концентрации сперматозоидов в сперме (доровых мужчин составляет около 2% в год при параллельном уменьшении доли подвижных н морфологически полноценных форм гамет (Рыжаков Д.И., Аршфексов С.Б., 2002; Камилов Ф.Х. и др., 2007; Delbes G. et al., 2010). Кроме юго, с начала XX века по настоящее время произошли беспрецедентные изменения общепринятых стандартов фертильной концентрации снермаюзоидов - с 60-100 млн/мл до 40, а затем и до 15 млн/мл (Cooper T.G. et al.. 2010; WHO. 2010). Происходящее снижение активности сперматогенеза дикт>ет необходимость его стимуляции не только при различных патологических состояниях, но и при нормальной, согласно критериям ВОЗ 2010 года, продукции половых клеток.

В связи с этим, актуальным является поиск физико-химических воздействий, способных стимулировать сперматогенез путем нормализации свободно-радикального баланса спермы, мужских репродуктивных органов и организма в целом.

Согласно концепции мембранного механизма стимулирующего действия низконнтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), порфирины, поглощая световую энергию НИЛИ, индуцируют фотосенсибилизированные свободно-радикальные реакции (Клебанов Г.И. и др., 1997, 1998, 2000). Термоактивация

воды приводит к изменению ее кислотно-основных свойств и появлению в ней микродоз АФК (Домрачев Г.А. и др., 2001; Черников A.B., 2005; Калниньш К.К., 2010; цит. по Зайцева О.В. и др., 2013). Сообщается, что в присутствии аргона происходит более интенсивная диссоциация воды и в ней увеличивается концентрация АФК (Селивановский Д.А., 2006).

Дальнейшее изучение влияния свободных радикалов на генеративную функцию самцов является актуальным вопросом физиологии, а возможность немедикаментозной стимуляции сперматогенеза посредством модуляции про-антиоксидантной системы организма НИЛИ и активированными водами представляет значительный интерес.

Цель работы — изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения, аргонированной и термоактивированной воды на баланс про-антиоксидантной системы организма самцов белых нелинейных крыс и сперматогенез экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Изучить изменения водородного показателя (pH) и окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) воды после воздействия НИЛИ, аргонирования и термоактивирования.

2. Проанализировать состояние про-антиоксидантной системы организма самцов белых нелинейных крыс при действии НИЛИ, аргонированной и термоактивированной воды.

3. Исследовать характер изменений в спермограмме экспериментальных животных при действии НИЛИ, аргонированной и термоактивированной воды.

4. Разработать оптимальные режимы воздействия НИЛИ, аргонированной и термоактивированной водой для стимуляции сперматогенеза.

5. Определить наличие и выраженность взаимосвязей между параметрами свободно-радикального баланса организма экспериментальных животных и функциональными показателями эякулята самцов белых нелинейных крыс.

Научная новизна

Впервые установлено, что действие НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты), аргонированной и термоактивированной воды in vitro увеличивает время сохранения подвижности половыми клетками.

Показано, что воздействие НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм, аргонированной и термоактивированной водой в относительной физиологической норме приводит к изменениям активности свободно-радикальных процессов. Общими эффектами для изучаемых физико-химических воздействий являются повышение общей антиоксидантной активности (ОАА) организма и снижение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эякуляте экспериментальных животных. Установлено, что воздействие НИЛИ увеличивает подвижность сперматозоидов (патент «Способ стимуляции сперматогенеза в эксперименте» № 2481132), в то время как употребление активированных вод положительно влияет на

активность половых клеток. Комбинация воздействий позволила добиться стимуляции как подвижности, так и активности сперматозоидов.

Показана важность выбора режима воздействия для стимуляции сперматогенеза, а именно: употребление активированных вод экспериментальными животными в течение 2 недель увеличивало количество и активность половых клеток, в то время как более длительное воздействие, напротив, приводило к угнетению сперматогенеза.

Выявлена высокая корреляционная взаимосвязь между параметрами свободно-радикальной активности организма, количеством и подвижностью половых клеток. Показано, что эякулят и семенники, по сравнению с плазмой крови, являются более чувствительными к изменению свободно-радикальной активности организма.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выявлен эффект стимулирующего сперматогенез действия НИЛИ и активированных вод, заключающийся в корригирующем влиянии НИЛИ и активированных вод на основные показатели про- и антиоксидантного статуса эякулята, тестикул, крови и печени экспериментальных животных.

Полученные сведения о взаимосвязи свободно-радикального баланса с функциональными параметрами сперматозоидов могут быть включены в образовательные программы по биологии, физиологии и биохимии при подготовке специалистов медико-биологического и ветеринарного профиля.

Результаты работы позволяют дать физиологически обоснованные рекомендации по применению НИЛИ и активированных вод в качестве немедикаментозных средств, улучшающих метаболизм и стимулирующих сперматогенез. Показана важность выбора режима воздействия и подобран безопасный эффективный режим для стимуляции сперматогенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Барботация воды аргоном (аргонирование) и обработка водопроводной воды при повышенной температуре (термоактивирование) приводят к повышению водородного показателя и снижению окислительно-восстановительного потенциала воды.

2. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты), аргонированной и термоактивированной воды in vitro увеличивает время сохранения подвижности половыми клетками.

3. Воздействие НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты, курс - 10 суток), аргонированной и термоактивированной водой (длительность — 2 недели) в относительной физиологической норме приводит к изменениям активности свободно-радикальных процессов. Общими эффектами для изучаемых физико-химических воздействий являются повышение ОАА организма и снижение содержания продуктов ПОЛ в эякуляте экспериментальных животных. На фоне повышения антиоксидантного статуса организма происходит стимуляция сперматогенеза.

4. Облучение семенников НИЛИ увеличивает подвижность сперматозоидов, в то время как употребление активированных вод положительно влияет на активность половых клеток. Комбинация воздействий позволяет добиться стимуляции как подвижности, так и активности сперматозоидов.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на 17 научных форумах различного уровня: X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2011); 16-ой и 17-ой Нижегородской сессии молодых учёных (Н. Новгород, 2011, 2012); И международной научной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2011); I международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности» (Пенза, 2011); XI ежегодной международной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2011); VII региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012); XVI научной школы молодых ученых «Нелинейные волны - 2012» (Н. Новгород, 2012); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2012); XVIII конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); VII международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2012); IV съезде биофизиков России «Физика - медицине и экологии» (Н. Новгород, 2012); II Всероссийском фестивале науки (Н. Новгород, 2012); X международной научной конференции «Физика и радиоэлектроника в медицине и экологии» ФРЭМЭ'2012 (Владимир, 2012); X международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2012); Всероссийской научной сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2013); IV international symposium «Topical Problems of Biophotonics - 2013» (N. Novgorod, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 2 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, главы собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 257 источников, из которых 157 зарубежных. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 20 таблицами.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность к.ф.-м.н., с.н.с. отдела нелинейной динамики ИПФ РАН В.В. Чернову за помощь в обсуждении

результатов, предоставление экспериментальной модели источника НИЛИ и аргонированной воды, ведущему научному сотруднику ЗАО «Крионорд» В.В. Борискину за предоставление термоактивированной воды, д.м.н., проф., зав. каф. патологической физиологии НижГМА Т.Е. Потеминой за консультативную помощь при освоении метода функционального исследования сперматозоидов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России на кафедре биологии.

В соответствии с целью и задачами работы были выделены два экспериментальных этапа - in vitro и in vivo. Эксперименты выполнены на 240 белых нелинейных крысах массой 215±35 г, которые содержались на стандартном пищевом рационе в виварии. Объектами исследования in vitro послужили 233 образца эякулята половозрелых самцов белых нелинейных крыс. Оценивалось время сохранения подвижности сперматозоидами при различных видах воздействия на эякулят. Проведено 125 измерений pH и ОВП активированных вод и 40 измерений про- и антиоксидантных параметров эритроцитов при воздействии НИЛИ.

Эксперименты in vivo выполнены на 178 половозрелых самцах и 30 самках белых нелинейных крыс. Основные этапы исследования, количество экспериментальных животных и измерений представлены на рисунке 1.

В качестве источника излучения использовался экспериментальный генератор НИЛИ (ИПФ РАН, г. Нижний Новгород) со следующими характеристиками: номинальный ток потребления - 350 мА, выходная мощность — 10 мВт, световой поток — 20 лм. Мы облучали семенники, брюшко экспериментальных животных или образцы эякулята источником лазерного излучения с длинами волн 475 и 405 нм в течение 1 минуты на расстоянии 1 см от поверхности, при этом разовая доза воздействия составляла 0,6 Дж/см2. Для подопытных животных контрольной группы использовали источник видимого света с длиной волны 630 нм.

Аргонированную воду получали путём барботации водопроводной воды аргоном в течение 5 минут (ИПФ РАН, г. Нижний Новгород). Использовали термоактивированную воду «Аква Форте термо» ТУ 0131-001-35482840-10, разработанную ЗАО «Крионорд» по экологически чистой технологии, включающей обработку питьевой водопроводной воды при повыщенной температуре (СПбГУНиПТ, г. Санкт-Петербург).

Определение величины водородного показателя и окислительно-восстановительного потенциала исследуемых образцов воды, крови и гомогенатов органов проводили с использованием рН-метра-милливольтметра рН-410 производителя «Аквилон» (г. Москва) по принципу измерения разности потенциалов в электродной системе.

В экспериментах in vitro оценивалось время сохранения подвижности половыми клетками при добавлении к эякуляту различных количеств

изотонического 0,9% водного раствора хлорида натрия (физиологического раствора производителя ОАО НПК «ЭСКОМ») и активированных вод, активации физиологического раствора, облучении эякулята источником НИЛИ и комбинации этих воздействий.

Рис. 1. Продолжение

Эякулят получали методом внутрибрюшинного введения окситоцина в дозе 1 мл/кг массы тела животного. Осуществляли подсчет количества сперматозоидов в камере Горяева и функциональное исследование половых клеток (Артифексов С.Б., 1981; Рыжаков Д.И. и др., 1984; Makler А et al., 1979, 1980). Среди сперматозоидов принято различать подвижные и неподвижные формы. В свою очередь, среди подвижных половых клеток одни колеблются на месте - колеблющиеся, а другие активно передвигаются в пространстве - активные. Нами раздельно учитывались клетки с активным поступательным движением, совершающие колебательные движения, и неподвижные сперматозоиды (Кузнецова С.В., 2006).

Для изучения особенностей окислительного гомеостаза в организме экспериментальных животных были применены биохимические методы,

отражающие интенсивность свободно-радикального окисления и состояние антиоксидантной системы защиты организма. Исследованию подвергались эякулят, плазма крови, эритроциты и гомогенаты органов - семенников и печени. Гомогенизацию органов осуществляли в жидком азоте. Для измерения активности свободно-радикальных процессов методом индуцированной хемилюминесценции гомогенаты разводили в фосфатном буфере, рН 7,4 (концентрация 0,33 г/мл), активности СОД и каталазы - в трис-НС1, рН 8,0 (концентрация 0,1 г/мл), молекулярных продуктов ПОЛ - в трис-НС1, рН 7,4 (концентрация 0,5 г/мл). Методы исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1

Методы исследования_

Этапы исследования Методы исследования

Исследование физико-химических воздействий in vitro 1. рН и окислительно-восстановительный потенциал исследуемых образцов (Биологическая, физическая и коллоидная химия, 2007). 2. Оценка времени сохранения подвижности сперматозоидами (WHO laboratory manual..., 2010). 3. Метод индуцированной хемилюминесценции (Кузьмина Е.И. и др., 1983). 4. Определение активности супероксиддисмутазы (Fried R., 1975). 5. Определение активности каталазы (Leff J.A. et al.. 1992V

Исследование физико-химических воздействий in vivo 1. рН и окислительно-восстановительный потенциал исследуемых образцов (Биологическая, физическая и коллоидная химия, 2007). 2. Подсчет количества сперматозоидов в камере Горяева и функциональное исследование половых клеток (Артифексов С.Б., 1981; Makler A. et al., 1979, 1980). 3. Метод индуцированной хемилюминесценции (Кузьмина Е.И. и др., 1983). 4. Определение активности супероксиддисмутазы (Fried R., 1975). 5. Определение активности каталазы (Leff J.A. et al., 1992). 6. Молекулярные продукты перекисного окисления липидов: диеновые конъюгаты, триеновые коньюгаты, малоновый диальдегид (Арутюнян А.В. и др., 2000). 7. Определение общих липидов (Folch J. et al., 1957). 8. Определение степени окислительной модификации белков (Дубинина Е.Е., 1995; Levine R.L. et al, 1990). 9. Определение эндогенной интоксикации (Оболенский C.B., Малахова М.Я., 1993). 10. Оценка оплодотворяющей способности самцов крыс (Малашенко A.M., Суркова Н.И., 1973).

Для оценки оплодотворяющей способности экспериментального самца помещали в одну клетку с интактной самкой. Через неделю самца отсаживали. После родоразрешения производили подсчет потомства. В течение 1 месяца после рождения наблюдали за состоянием потомства, определяли динамику массы тела и выживаемость крысят (Малашенко А.М., Суркова Н.И., 1973).

Полученные данные обрабатывались с использованием программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Оценка статистической значимости различий изучаемых показателей проводилась с использованием t-критерия Стьюденга при нормальном распределении данных для независимых выборок. Результаты исследований представлены в виде М±т , где М - среднее арифметическое, m -ошибка среднего. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Степень согласованности изменений исследуемых параметров определялась по коэффициенту корреляции Пирсона г (Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2002).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Действие НИЛИ и активированных вод in vitro

Основной задачей в серии экспериментов in vitro явился подбор режима воздействия НИЛИ, обладающий наибольшей эффективностью по отношению к сперматозоидам. Выбор длины волны базировался на данных, представленных в работах К.В. Кулаковой и соавторов. Авторами было показано, что действие НИЛИ синей области спектра (А,=475 нм) влияет на уровень свободно-радикальной активности плазмы крови и высказано предположение о том, что под действием лазерного излучения происходит повышенное образование АФК (Кулакова К.В. и др., 2006, 2012). Мы установили, что максимальное увеличение времени сохранения подвижности половыми клетками наблюдалось при облучении образцов эякулята источником НИЛИ синего диапазона в течение 1 минуты — сперматозоиды сохраняли подвижность на 79% дольше по сравнению с изучаемым параметром интактного эякулята (р<0,05). При этом не было отмечено статистически значимых отличий времени сохранения подвижности половыми клетками при облучении проб эякулята разными длинами волн (475 и 405 нм).

7

. 6

4

Ф 5

X

5 4

1 3

I 2

° 1

о

интактные контроль НИЛИ 475 нм НИЛИ 405 нм

способ воздействия

Рис. 2. Общая антиоксидантная активность (ОАА) эритроцитов, облученных источником НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм; * - статистически значимые различия по сравнению с показателем интактных эритроцитов, р<0,05

Известно, что наиболее интенсивной полосой в спектре поглощения гемоглобина является полоса Соре (X в интервале 405-430 нм), принадлежащая порфириновой части его молекулы (Шейко Л.М., 2011). Облучение семенников экспериментальных животных in vivo предполагает активное поглощение энергии НИЛИ компонентами крови, поэтому использование излучения с длиной волны 405 нм будет более эффективным. В предварительной серии

экспериментов in vitro мы установили, что однократное облучение эритроцитов источником НИЛИ с длиной волны 475 нм в течение 1 минуты привело к более значимому увеличению максимальной интенсивности хемилюминесценции эритроцитов, чем воздействие лазером с длиной волны 405 нм. В первом случае измеряемая величина достигала 2,13±0,03 мВ, во втором - 1,42±0,03 мВ, в то время как интенсивность свечения интактных эритроцитов составила 1,19±0,01 мВ. ОАА и активности СОД и каталазы, наоборот, были выше в эритроцитах, облученных НИЛИ с длиной волны 405 нм (рис. 2, табл. 2).

Таблица 2

Активность ангиоксидантных ферментов в эритроцитах, облученных

источником НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм

Группа Активность фермента

СОД, ед. акт./г НЬ Каталаза, ед. акт./мг НЬ сек

Интактные эритроциты 104,09±4,22 20,80±2,20

Контроль 102,99±3,36 26,29±4,47

НИЛИ 475 нм 321,32±15,20* 45,75±3,38*

НИЛИ 405 нм 414,82±11,32* 67,40±1,80*

* - статистически значимые различия по сравнению с показателями интактных эритроцитов, р<0,05

При активации воды различными способами происходят механо-химические реакции гемолитического распада ее молекул, в результате которых генерируются водородные и гидроксильные радикалы. Свободные радикалы, гидратируясь, существуют значительное время и образуют химически активные ионы и другие радикалы, включая АФК, что может приводить к различным биологическим эффектам (Фаткуллина Л.Д. и др., 2003).

Известно, что рН и ОВП определяют характер химических и биологических реакций, протекающих в воде, и являются основными параметрами для оценки её качества. Нами установлено статистически значимое изменение рН аргонированной и термоактивированной вод до 8,29±0,02 и 8,98±0,04 единиц, соответственно, по сравнению с водородным показателем водопроводной воды (7,79±0,02 единиц) (рис. 3).

Т777Л рн

—ф—ОВП

ДВ ВВ АВ ТВ

образец воды

Рис. 3. Изменение рН и ОВП воды после активации; * - статистически значимые различия по сравнению с показателями водопроводной воды, р<0,05

ОВП аргонированной и термоактивированной вод достигал -75,03±1,49 и -103,32±2,38 мВ, соответственно, в то время как ОВП водопроводной воды составлял -2,70±1,55 мВ (рис. 3). Отрицательный редокс-потенциал активированных вод указывает на преобладание в них восстановителей. Также исследователями установлено, что даже незначительное подщелачивание водной среды сопровождается активизацией обмена веществ. В частности, изменение рН на 0,5 единицы заметно стимулирует деление растительных клеток (Аксенов С.И. и др., 2000; Nuccitelli К., Heiple J.M., 1982).

Нами было установлено, что наибольшее увеличение времени сохранения подвижности половыми клетками наблюдалось при инкубировании эякулята в среде, содержащей физиологический раствор и активированную воду в соотношении 2:1. Время сохранения подвижности сперматозоидами в среде, содержащей аргонированную воду, составило 81±2 мин, термоактивированную - 69±1 мин. При этом добавление эякулята в раствор, содержащий водопроводную воду, снижало время сохранения подвижности половыми клетками до 7±1 мин.

Время сохранения подвижности половыми клетками в физиологическом растворе без воздействий составило 102±2 мин, в аргонированном - 152±4 мин, в термоактивированном — 132±3 мин. Однако наибольшую эффективность на изучаемый параметр оказало облучение проб эякулята НИЛИ - сперматозоиды сохраняли свою подвижность в течение 176±7 мин. При комбинации воздействий самым значимым положительным эффектом на сперматозоиды обладал комплекс из аргонированного физиологического раствора и НИЛИ. При данном воздействии время сохранения подвижности половыми клетками составило 214=Ы> мин, что в 2,1 раза превышало значение изучаемого параметра в интактном эякуляте (р<0,05).

Таким образом, в экспериментах in vitro мы эмпирическим путем установили режим воздействия НИЛИ, обладающий наибольшей эффективностью по отношению к сперматозоидам. Было показано, что изменение рН и ОВП воды после термической активации и аргонирования приводят к биологическим эффектам и, вероятно, являются определяющими факторами в увеличении времени сохранения подвижности половыми клетками. Также известно, что термоактивация и аргонирование воды приводят к появлению в ней микродоз АФК (Селивановский Д.А., 2006; Калниньш К.К., 2010), выполняющих важные функции в организме. Полученные in vitro результаты послужили основой использования изучаемых физико-химических способов воздействия для стимуляции сперматогенеза in vivo. 3.2. Действие НИЛИ и активированных вод на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез самцов белых нелинейных крыс 3.2.1. Эффект действия НИЛИ на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных

Ежедневное облучение семенников экспериментальных животных источником НИЛИ в течение 1 минуты на протяжении 10 суток обладало наибольшей эффективностью по отношению к модуляции свободно-радикальных процессов в организме самцов крыс и сперматогенезу. При этом действие НИЛИ не приводило к статистически значимому усилению процессов пероксидации в семенниках, однако в день отмены воздействия НИЛИ

статистически значимо повышало свободно-радикальную активность эякулята по сравнению с показателями интактных животных (р<0,05). Концентрация продуктов ПОЛ в эякуляте, наоборот, была снижена. У животных контрольной группы в день отмены воздействия источником видимого света также наблюдалась интенсификация процессов пероксидации по сравнению с крысами интактной группы - на 40%. Через 7 суток после отмены воздействия источником видимого света и НИЛИ показатели максимальной интенсивности хемилюминесценции эякулята статистически значимо не отличались от параметров животных интактной группы. В плазме крови НИЛИ снижало максимальную интенсивность хемилюминесценции, однако концентрации продуктов ПОЛ и ОМБ статистически значимо не отличались от параметров интактных самцов. Печень синтезирует тестостерон-эстрадиол-связывакяций глобулин, влияющий на сперматогенез, поэтому повреждение печени токсинами или АФК может отражаться на сперматозоидах. Облучение семенников источником НИЛИ интенсифицировало прооксидантные процессы в печени экспериментальных животных (табл. 3).

Таблица 3

Изменение показателей прооксидантных систем организма экспериментальных

животных на фоне воздействия НИЛИ и активированными водами

Группа Параметр свободно-радикального окисления

I тах*10, мВ Концентрация продуктов ПОЛ* 100, отн. ед.

семенники/ эякулят/ плазма/ печень семенники/ эякулят/ плазма/ печень

Ин-такт-ные 8,1 ±0,4 9,1 ±0,1 37,8 ±0,8 15,3 ±0,4 ДК: 5,5±0,6 ТК: 4,2±0,5 МДА: 3,7±0,4 ДК: 4,0±0Д ТК: 7,6±0,4 МДА: 6,1±0,5 ДК: 8,1±0,5 ТК: 2,4±0,3 МДА: 3,4±0,6 ДК: 8,5±0,5 ТК: 3,0±0,2 МДА: 2,8±0,3

НИЛИ 8,6 ±0,4 13,4 ±0,6 * 31,1 ±0,5 * 19,1 ±0,5 * ДК: 5,9±0,5 ТК: 3,8±0,2 МДА: 4,6±0,7 ДК: 1,4±0,2* ТК: 1,9±0,1* МДА: 1,9±0,2* ДК: 7,9±0,5 ТК: 2,2±0,1 МДА: 3,6±0,2 ДК: 7,3±0,9 ТК: 2,7±0,3 МДА: 3,3±0,5

АВ 10,3 ±0,9 * 11,3 ±0,1 * 36,4 ±1,0 19,9 ±0,5 * ДК: 7,3±0,7* ТК: 4,4±0,3 МДА: 3,6±0,2 ДК: 2,0±0,2* ТК: 5,0±0,4* МДА: 2,8±0,5* ДК: 11,6±1,5* ТК: 5,3±0,9* МДА:19,1±0,4* ДК: 8,5±0,2 ТК: 2,8±0,4 МДА: 3,2±0,4

ТВ 6,3 ±0,9 * 7,7 ±0,1 * 31,6 ±0,4 * 15,0 ±0,1 ДК: 5,7±0,2 ТК: 3,4±0,8 МДА: 4,5±0,7 ДК: 2,2±0,2* ТК: 3,9±0,1* МДА: 2,5±0,3* ДК: 7,1 ±0,4 ТК: 2,4±0,3 МДА: 3,8±0,4 ДК: 8,0±0,4 ТК: 2,9±0,1 МДА: 3,0±0,4

НИЛИ +АВ 10,4 ±0,5 * 15,1 ±0,4 * 32,8 ±0,7 * 23,6 ±0,8 * ДК: 7,2±0,5* ТК: 4,3±0,4 МДА: 3,6±0,3 ДК: 1,2±0,2* ТК: 1,4±0,1* МДА: 1,2±0,3* ДК: 11,1±0,9* ТК: 4,6±0,6* МДА:16,3±0,7* ДК: 8,3±0,5 ТК: 2,8±0,2 МДА: 3,2±0,3

НИЛИ +ТВ 6,2 ±0,7 * 10,6 ±0,7 * 30,4 ±0,7 * 18,5 ±0,5 * ДК: 5,4±0,4 ТК: 3,6±0,2 МДА: 4,4±0,6 ДК: 0,6±0Д* ТК: 0,8±0,2* МДА: 0,5±0,2* ДК: 8,0±0,8 ТК: 2,4±0,4 МДА: 3,3±0,5 ДК: 7,8±0,3 ТК: 2,4±0,3 МДА: 3,3±0,2

* — статистически значимые различия по сравнению с показателями группы интактных самцов крыс, р<0,05

Увеличение уровня веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) в крови является универсальным метаболическим ответом организма на любой агрессивный фактор (Малахова М.Я., 1995). Учитывая этот факт, мы оценивали уровень эндогенной интоксикации в плазме крови экспериментальных животных после воздействия НИЛИ и установили, что данный вид воздействия не влияет на уровень ВНСММ

Облучение семенников источником НИЛИ статистически значимо повысило уровень ОАА, активности СОД и каталазы в семенниках крыс относительно показателей интактных самцов. Интегральный показатель ОАА эякулята крыс, подвергавшихся облучению НИЛИ и источником видимого света, повысился в день отмены воздействия, однако через 7 суток после отмены облучения он был сопоставим с параметрами интактных животных. Также нами было установлено, что облучение тестикул источником НИЛИ приводило к повышению активности СОД и каталазы в семенной жидкости экспериментальных животных. В плазме крови и печени воздействие НИЛИ повысило ОАА, в эритроцитах - активность СОД (р<0,05; табл. 4).

Таблица 4

Изменение интегрального показателя общей ангиоксидангной активности (ОАА) и активности антиоксидантных ферментов в организме экспериментальных животных на фоне воздействия НИЛИ и активированными

водами

Группа Параметр антаоксидантной активности

ОАА* 100, ота. ед. Активность СОД, ед. акг./г НЬ (ткани) Активность каталазы, ед. акт./мг НЬ (ткани) сек

семенники/ эякулят/ плазма/ печень семенники/ эякулят/ эритроциты/ печень семенники/ эякулят/ эритроциты/ печень

Ингакг-ные 9,5± 0,7 10,4± 0,2 3,6± 0,1 7,4± 0,1 17±1 20±1 110±8 15±2 16±2 9±1 32±3 17±1

НИЛИ 13,6± 0,5* 16,2± 0,2* 4,1± 0,1* 8,8± 0,2 44±2* 54±2* 265± 5* 13±2 126± 6* 89± 3* 32±6 20±3

АВ 12,1± 0,4* 14,6± 0,1* 3,8± 0,1 7,8± 0,2 32±1* 32±1* 107±4 15±2 51± 3* 51± 2* 28±2 20±3

ТВ 12,5± 0,2* 14,3± ОД* 6,4± 0,1* 7,6± 0,3 28±2* 29±1* 193± 20* 16±1 54± 5* 42± 2* 32±3 17±3

НИЛИ +АВ 16,8± 0,2* 17,7± 0,4* 4,0± 0,1* 8,8± 0,3* 48±1* 64±3* 235± 10* 16±2 157± 7* 129± 3* 30±3 18±1

НИЛИ +ТВ 17,8± 0,5* 21,8± 1,0* 6,5± 0,1* 8,9± 0,4* 49±2* 60±3* 352± 13* 15±1 166± 6* 127± 8* 35±4 19±2

* - статистически значимые различия по сравнению с показателями группы интактных самцов крыс, р<0,05

Количество сперматозоидов в пробах эякулята интактных животных составило 3,25±0,02 млн. Облучение семенников источником НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм привело к увеличению количества сперматозоидов в семенной жидкости крыс в день отмены воздействия до 4,57±0,18 млн и 5,30±0,12 млн, соответственно (рис. 4). Было показано, что облучение семенников источником НИЛИ стимулирует подвижность сперматозоидов на 6% при облучении 475 нм, и на 13% при облучении 405 нм. 3.2.2. Эффект действия аргонированной воды на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных

Употребление аргонированной воды самцами белых крыс в течение двух недель привело к интенсификации свободно-радикальных процессов в семенниках и эякуляте. Максимальная интенсивность хемилюминесценции плазмы крови животных, пивших аргонированную воду, не отличалась от параметров интактных самцов, однако концентрация продуктов ПОЛ

повышалась, а уровни ОМБ и ВНСММ не отличались от показателей подопытных самцов без воздействия. В печени животных, которые пили аргонированную воду в течение двух недель, набл вдалось усиление хемилюминесцентного свечения на 30%, уровень продуктов ПОЛ оставался неизменным относительно показателей свободно-радикальной активности интактных самцов (табл. 3).

Употребление аргонированной воды в течение двух недель привело к статистически значимому повышению ОАА, активности СОД и каталазы в семенниках и эякуляте экспериментальных животных относительно параметров самцов, пивших водопроводную воду (р<0,05). ОАА плазмы крови, эритроцитов и печени самцов, пивших аргонированную воду, не отличались от параметров интактных животных (табл. 4).

Употребление аргонированной воды в течение двух недель привело к увеличению количества гамет до 3,73±0,04 млн (рис. 4). При этом активность сперматозоидов увеличилась на 10%, однако подвижность половых клеток оставалась сопоставимой с параметрами интактных самцов.

Рис. 4. Изменение количества половых клеток в эякуляте экспериментальных животных при действии НИЛИ и активированных вод; * - статистически значимые различия по сравнению с показателями группы интактных самцов, р<0,05

Было установлено, что длительное воздействие аргонированной водой на здоровых самцов в течение 1,5 месяцев приводило к ухудшению функциональных свойств половых клеток: снижению количества (на 12%), подвижности (на 12%) и активности (на 10%) сперматозоидов. 3.2.3. Эффект действия термоакгивированной воды на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных

Употребление термоактивированной воды экспериментальными животными снижало активность свободно-радикальных процессов в семенниках, эякуляте и плазме крови относительно параметров интактных самцов (табл. 3). Данный вид воздействия не вызывал статистически значимых отличий уровней ОМБ и ВНСММ в плазме крови по сравнению с параметрами интактных животных.

Воздействие термоактивированной водой в течение двух недель статистически значимо повышало ОАА, активность СОД и каталазы в тестикулах, семенной жидкости и плазме крови по сравнению с показателями животных без воздействия (р<0,05). Также при употреблении

интактные контроль НИЛИ НИЛИ АВ 475 нм 405 нм

группы животных

ТВ НИЛИ НИЛИ +АВ +ТВ

термоактивированной воды повышалась активность СОД в эритроцитах, при этом активность каталазы статистически значимо не отличалась от показателей интактных животных. Воздействие термоактивированной водой не приводило к статистически значимым изменениям активности ангиоксидантных ферментов в печени экспериментальных животных (табл. 4).

Употребление термоактивированной воды в течение двух недель привело к увеличению количества гамет до 3,61±0,02 млн (рис. 4). При этом активность сперматозоидов увеличилась на 5%, однако подвижность половых клеток оставалась сопоставимой с параметрами интактных самцов.

При длительном употреблении термоактивированной воды здоровыми животными в течение 2 месяцев статистически значимых отличий функциональных параметров эякулята от показателей самцов, пивших водопроводную воду, установлено не было.

3.2.4. Эффект комплексного действия НИЛИ и активированных вод на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных

При комбинированном действии НИЛИ и активированных вод наблюдался аддитивный эффект на прооксидантные системы организма экспериментальных животных. Так, комбинированное действие НИЛИ и аргонированной воды приводило к усилению максимальной интенсивности хемилюминесцентного свечения эякулята и печени по сравнению с показателями животных, подвергавшихся моновоздействию НИЛИ или аргонированной водой. Комбинация НИЛИ и термоактивированной воды приводила к максимальному снижению уровня продуктов ПОЛ в эякуляте. Результаты представлены в таблице 3. Также при комплексном действии НИЛИ и активированных вод мы наблюдали аддитивный эффект стимуляции активности антиоксидантных ферментов организма экспериментальных животных (табл. 4).

При комбинированном действии НИЛИ и аргонированной воды количество сперматозоидов в пробах эякулята увеличилось до 4,76±0,04 млн, подвижность и активность повысились на 7% по сравнению с параметрами интактных самцов. При данной комбинации чрезмерная интенсификация прооксидантных процессов в организме животных не привела к аддитивному эффекту стимуляции сперматогенеза, которого мы ожидали на основании результатов, полученных при исследовании моновоздействий. При совместном воздействии НИЛИ и термоактивированной воды наблюдалось максимальное увеличение количества половых клеток - до 5,61±0,04 млн, подвижность и активность сперматозоидов были выше на 10% и на 7%, соответственно, по сравнению с показателями интактных крыс.

Установлено, что облучение семенников источником НИЛИ, воздействие аргонированной и термоактивированной водой в режимах стимуляции сперматогенеза не снижают оплодотворяющуюспособностьэкспериментальных самцов. Рождаемость, выживаемость и прирост массы тела потомства, полученного от животных, подвергавшихся стимуляции половой функции, сопоставимы с аналогичными параметрами потомства интактных самцов.

Нами была выявлена высокая отрицательная корреляционная взаимосвязь между показателями свободно-радикальной активности эякулята

экспериментальных животных и функциональными параметрами половых клеток: максимальная интенсивность хемилюминесценции / количество сперматозоидов (г=-0,93), подвижность сперматозоидов (г=-0,85) (р<0,05). Корреляционный анализ показал высокую степень взаимосвязи между параметрами прооксидантной активности в семенниках экспериментальных животных и функциональными параметрами половых клеток: максимальная интенсивность хемилюминесценции / количество сперматозоидов (г=-0,9), подвижность сперматозоидов (г=-0,75); уровень продуктов ПОЛ - ДК, ТК и МДА / количество сперматозоидов (г,=-0,9, г2=-0,91, г3=-0,83), подвижность сперматозоидов (г,=-0,9, г2=-0,84, г3=-0,8) (р<0,05). При этом показана умеренная степень корреляции между максимальной интенсивностью хемилюминесцентного свечения плазмы крови экспериментальных животных и количеством и подвижностью половых клеток (ri=-0,38, г2=-0,35, р<0,05). Таким образом, можно сделать предположение, что эякулят и семенники являются более чувствительными к изменению свободно-радикальной активности, чем плазма крови, так как между параметрами свободно-радикального окисления эякулята и семенников и функциональными показателями сперматозоидов выявлена более сильная корреляционная взаимосвязь.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ собственнных результатов показал, что эффект НИЛИ и аргонированной воды на организм в относительной физиологической норме схож - происходит активация процессов свободно-радикального окисления. Термоактивированная вода «Аква Форте термо», наоборот, снижает интенсивность процессов окисления в организме экспериментальных животных. Однако общими эффектами для всех изучаемых видов воздействий являются повышение уровня общей антиоксидантной активности, активностей СОД и каталазы в организме и снижение концентрации продуктов ПОЛ в эякуляте экспериментальных животных. Повышение антиоксидантного статуса организма и снижение перекисного повреждения сперматозоидов сопровождается стимуляцией сперматогенеза. При воздействии НИЛИ с длиной волны 405 нм установлена самая высокая активность антиоксидантных ферментов на фоне которой наблюдается наибольший стимулирующий сперматогенез эффект (рис. 7).

На клеточном уровне действие активированных вод более паллиативно, в то время как стимуляция сперматогенеза с помощью НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм является более мощным воздействием. Об этом свидетельствуют как данные, полученные на этапе in vitro, демонстрирующие более значимое увеличение времени сохранения подвижности сперматозоидами при действии НИЛИ, так и экспериментальные результаты in vivo, в которых показано, что среди изучаемых физико-химических воздействий НИЛИ обладает наибольшей стимулирующей сперматогенез способностью. НИЛИ увеличивает подвижность сперматозоидов, в то время как употребление активированных вод положительно влияет на активность половых клеток. Комбинация воздействий позволяет добиться стимуляции как подвижности, так и активности сперматозоидов.

В экспериментах in vitro установлено, что воздействие НИЛИ на воду не влияет на её водородный показатель и редокс-потенциал. В свою очередь,

аргонирование и термоактивирование приводят к повышению водородного показателя и снижению окислительно-восстановительного потенциала воды. Вероятно, биологические эффекты, выявленные нами в результате многоэтапного экспериментального исследования обьясняются тем, что активация воды путем барботации аргоном и обработки при повышенной температуре сопровождается интенсификацией её диссоциации, в результате которой генерируются АФК. Основная концентрация этих АФК в дальнейшем участвует в реализации сигнальных и метаболических путей. Преобладание восстановителей определяет отрицательный редокс-потенциал активированных вод и делает их более физиологичными и легко усвояемыми. Биологические эффекты НИЛИ реализуются не через изменение физико-химических свойств воды, а посредством прямого действия на акцепторы лазерного излучения в биологических объектах. Так, было установлено, что облучение эритроцитов источником НИЛИ приводит к увеличению показателя максимальной интенсивности хемилюминесцентного свечения и активности антиоксидантных ферментов в эритроцитах, вероятно, за счет поглощения энергии лазерного излучения порфиринами гемоглобина. Хромофоры, поглощая световую энергию НИЛИ, индуцируют свободно-радикальные реакции и тем самым влияют на про-антиоксидантный баланс организма.

Рис. 7. Схема влияния НИЛИ и активированных вод на сперматогенез путем модуляции про- и антиоксидантных процессов

Таким образом, воздействие НИЛИ и активированными водами поддерживает физиологический уровень АФК, выполняющих сигнальные функции и активирующих ядерные факторы транскрипции. Транскрипционный фактор NF-kB запускает синтез белков: СОД, каталазы, ¡NOS и др. (Клебанов Г.И., 2000; Zamora, Z.B. et al., 2005). Происходит повышение антиоксидантного статуса организма, что приводит к снижению концентрации продуктов ПОЛ в эякуляте и усилению пролиферации клеток. Кроме того, увеличение количества и качества сперматозоидов при применении изучаемых физико-химических воздействий можно объяснить нормализацией микроциркуляции в семенниках за счет действия оксида азота, являющегося предшественником фактора EDRF, расслабляющего эндотелий сосудов (Снайдер С.Х., Бредт Д.С., 1992). Оксид азота - продукт функционирования NO-синтазы, которая индуцируется в клетках при участии фактора NF-kB.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что барботация воды аргоном (аргонирование) и обработка водопроводной воды при повышенной температуре (термоактивирование) приводят к повышению водородного показателя и снижению окислительно-восстановительного потенциала воды, причем более значимые изменения исследуемых параметров наблюдаются при термоактивировании.

2. Воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ) с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты, курс - 10 суток), аргонированной и термоактивированной водой (длительность — 2 недели) в относительной физиологической норме приводит к изменениям активности свободно-радикальных процессов. Общими эффектами для всех изучаемых видов воздействий являются повышение ОАА организма и снижение концентрации продуктов ПОЛ в эякуляте экспериментальных животных.

3. Облучение семенников источником НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм (в течение 1 минуты, курс - 10 суток) и воздействие активированными водами (длительность - 2 недели) приводят к увеличению количества сперматозоидов. НИЛИ повышает подвижность половых клеток, в то время как употребление активированных вод положительно влияет на их активность.

4. Выявлена высокая корреляционная взаимосвязь между параметрами свободно-радикальной активности эякулята (максимальной интенсивностью хемилюминесценции) и количеством (г=-0,93) и подвижностью половых клеток (г=-0,85).

5. При сравнении эффективности моновоздействий в условиях относительной физиологической нормы наибольшей стимулирующей сперматогенез способностью обладает НИЛИ с длиной волны 405 нм, при комбинации воздействий — сочетание НИЛИ и термоактивированной воды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты работы позволяют дать физиологически обоснованные рекомендации по применению НИЛИ и активированных вод в качестве немедикаментозных средств, стимулирующих сперматогенез.

2. Для повышения антиоксидантного статуса организма и стимуляции сперматогенеза рекомендуется ежедневное облучение семенников НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм в течение 1 минуты, курсом 10 суток, а также употребление аргонированной и термоактивированной воды в течение двух недель.

3. Полученные в работе данные о взаимосвязи свободно-радикального баланса с функциональными параметрами сперматозоидов могут быть включены в образовательные программы по физиологии, биологии и биохимии при подготовке специалистов медико-биологического и ветеринарного профиля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в рецензируемых изданиях рекомендованных ВАК РФ:

1. Новикова, Я.С. Взаимосвязь свободнорадикальных процессов и

морфофункциональных характеристик сперматозоидов экспериментальных

животных при действии аргонированной воды / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк,

Т.Е. Потёмина, Е.С. Клинцова, В.В. Чернов // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2011. - №2(2). - С. 202-207.

2. Карпова, И.Ю. Изучение влияния хронической гипоксии на течение беременности и развитие потомства в эксперименте / И.Ю. Карпова, В.В. Паршиков, A.A. Миронов, Т.И. Соловьева, Е.В. Кочкурова, Е.С. Стулова, Я.С. Новикова // Медицинский альманах. - 2011. - №6 (19). — С. 55-57. Патент:

3. Пат. 2481132 Российская Федерация, МПК A61N5/06. Способ стимуляции сперматогенеза в эксперименте / Т.Г. Щербатюк, Я.С. Новикова, В.В. Чернов -№2011147987/14; заявл. 24.11.2011; опубл. 10.05.2013, Бюл. № 13.-6 с. Публикации в научных журналах, сборниках статей, материалах конференций:

4. Новикова, Я.С. Влияние аргонированной воды на сперматогенез самцов белых крыс с лимфосаркомой Плисса / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк // Труды одиннадцатой ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». - Москва. - 2011. - С. 174-178.

5. Новикова, Я.С. Морфо-функционапьные и свободнорадикальные параметры сперматогенеза самцов белых нелинейных крыс на фоне воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк, В.В. Чернов // Материалы I Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области». - Пенза. - 2011. - С. 634-637.

6. Новикова, Я.С. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматогенез самцов нелинейных крыс / Я.С. Новикова, В.В. Чернов, О.С. Турутина, Т.Г. Щербатюк // Материалы докладов IV Съезда биофизиков России. Симпозиум III «Физика - медицине и экологии». - Нижний Новгород. -2012.-С. 177.

7. Новикова, Я.С. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматозоиды белых нелинейных крыс in vitro и in vivo / Я.С. Новикова // Журнал Российской ассоциации по спортивной медицине и реабилитации больных и инвалидов. Специальный выпуск. - 2012. - №2 (34). - С. 25-26.

8. Новикова, Я.С. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения синего диапазона на сперматогенез самцов белых нелинейных крыс / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк, В.В. Чернов // Материалы VII Международного симпозиума «Актуальные проблемы биофизической медицины». - Киев. - 2012. - С. 98-99.

9. Новикова, Я.С. Изменение параметров семенной жидкости самцов белых крыс на фоне опухолевого роста / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк // Сибирский онкологический журнал. Приложение №1. - 2012. - С. 113.

10. Новикова, Я.С. Изменение параметров семенной жидкости самцов белых нелинейных крыс на фоне воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк, В.В. Чернов // Тезисы докладов II Всероссийского фестиваля науки. - Нижний Новгород. - 2012. - С. 25-29.

11. Новикова, Я.С. Изучение влияния аргонированной воды на репродуктивную систему интактных самцов белых крыс и опухоленосителей / Я.С. Новикова // Материалы XVIII межгородской конференции молодых

ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург. - 2012. - С. 93-94.

12. Новикова, Я.С. Количественные и качественные показатели сперматогенеза самцов белых крыс на фоне воздействия низкоиитенспвным лазерным излучением / Я.С. Новикова // Материалы Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Проблемы медицины и биологии». - Кемерово. - 2012. - С. 243-244.

13. Новикова, Я.С. Метод стимуляции сперматогенеза низкоинтенсивным лазерным излучением / Я.С. Новикова, Т.Г. Щербатюк // 'Грулы X Международной научной конференции «Физика и радиоэлектроника в медицине и экологии» с элементами научной молодежной школы ФРЭМЭ'2012. Книга 1.-Владимир. - 2012. - С. 102-107.

14. Новикова, Я.С. Низкоинтенсивное лазерное излучение и репродуктивная функция самцов крыс / Я.С. Новикова, В.В. Чернов, Т.Г. Щербатюк // Тезисы докладов XVI научной школы молодых ученых «Нелинейные полны - 2012». -Нижний Новгород. - 2012. - С. 99-100.

15. Новикова, Я.С. Влияние термоактивированной воды па сперматогенез интактпых самцов белых крыс и опухоленосителей / Я.С. Новикова /7 Медиаль. -2013. -№1 (6).-С. 124.

16. Новикова, Я.С. Действие термоактивированной воды на спермаючоиды самцов белых крыс in vitro / Я.С. Новикова, В.В. Борискин // Медиаль. - 2013. -№1 (6).-С. 123-124.

17. Novikova, Y.S. Impact of low-intensity laser radiation with wavelengths of 405 and 475 nm on spermatogenesis of male rats / Y.S. Novikova, V.V. Chernov, T.G. Scherbatyuk // Proceedings of the fourth International Symposium «Topical problems ofbiophotonics-2013». - Nizhnv Novgorod, Russia. - 2013. - P. 269-270.

Список сокращении

AB - аргонированная вода

АФК - активные формы кислорода

АФР - аргонированный физиологический раствор

ВВ - водопроводная вода

ВНСММ - вещества низкой и средней молекулярной массы

ДВ - дистиллированная вода

ДК - диеновые конъюгаты

МДА - малоновый диальдегид

НИЛ И - низкоинтенсивное лазерное излучение

ОАА-общая антиоксидантаная активность

ОВП- окислительно-восстановительный потенциал

ОМБ - окислительная модификация белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

ТВ - термоактивированная вода

ТК - триеновые конъюгаты

ТФР - термоактивированный физиологическим раствор ФР - физиологический раствор ХЛ - хемилюминесценция

Подписано в печать 10.10.2013 Формат 60x84 1/16. Печать офсетная Печ.л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 167 Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия 603107, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, 97

Типография НГСХА

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новикова, Яна Сергеевна, Нижний Новгород

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

На правах рукописи

04201364379

Новикова Яна Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СПОСОБОВ СТИМУЛЯЦИИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА НА СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ОРГАНИЗМА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность: 03.03.01 физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.Г. Щербатюк

Нижний Новгород 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................13

1.1. Роль активных форм кислорода в процессе сперматогенеза..............................13

1.2. Основные подходы и современные способы стимуляции сперматогенеза............................................................................................................................................21

1.3. Механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения....................26

1.4. Биологические эффекты активированных вод..................................................................35

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................41

2.1. Материалы исследования....................................................................................................................42

2.2. Методы исследования............................................................................................................................45

2.2.1. Определение величины водородного показателя и окислительно-восстановительного потенциала........................................45

2.2.2. Определение свободно-радикальной активности

методом индуцированной хемилюминесценции....................................46

2.2.3. Метод определения концентрации диеновых и

триеновых конъюгатов....................................................................................................47

2.2.4. Метод определения концентрации малонового диальдегида... 48

2.2.5. Метод определения общих липидов....................................................................49

2.2.6. Метод определения окислительной модификации белков

по уровню карбонильных производных..........................................................49

2.2.7. Метод определения активности супероксиддисмутазы....................51

2.2.8. Метод определения активности каталазы......................................................52

2.2.9. Метод определения эндогенной интоксикации..........................................52

2.2.10. Подсчет количества сперматозоидов в камере Горяева

и функциональное исследование половых клеток................................53

2.2.11. Оценка времени сохранения подвижности сперматозоидами... 54

2.2.12. Оценка оплодотворяющей способности самцов крыс........................55

2.2.13. Методы статистической обработки данных......................... 55

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..... 58

3.1. Действие НИЛИ и активированных вод in vitro.............................. 58

3.2. Действие НИЛИ и активированных вод на свободно-радикальный

баланс организма и сперматогенез самцов белых нелинейных крыс ... 69

3.2.1. Эффект действия НИЛИ на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных........ 70

3.2.2. Эффект действия аргонированной воды на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных........................................... 83

3.2.3. Эффект действия термоактивированной воды на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных........................................... 89

3.2.4. Эффект комплексного действия НИЛИ и активированных вод на свободно-радикальный баланс организма и сперматогенез экспериментальных животных........................................... 93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................... 101

ВЫВОДЫ.................................................................................. 106

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................. 108

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ АВ - аргонированная вода АДНФГ - альдегиддинитрофенилгидразоны АО - антиоксиданты АТФ - аденозинтрифосфат АФК - активные формы кислорода АФР - аргонированный физиологический раствор ВВ - водопроводная вода

ВНСММ - вещества низкой и средней молекулярной массы

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДВ - дистиллированная вода

ДК - диеновые конъюгаты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КДНФГ - кетондинитрофенилгидразоны

ЛО - лазерное облучение

ЛПС - липополисахариды

МДА - малоновый диальдегид

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма

НИЛИ - низкоинтенсивное лазерное излучение

ОАА - общая антиоксидантаная активность

ОВП - окислительно-восстановительный потенциал

ОМБ - окислительная модификация белков

ПМ - плазматическая мембрана

ПМЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РНК - рибонуклеиновая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

ТВ - термоактивированная вода

ТК - триеновые конъюгаты

ТФР - термоактивированный физиологический раствор

ФР - физиологический раствор

XJI - хемилюминесценция

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

cNOS - конституционная NO-синтаза

EDRF - фактор, расслабляющий эндотелий сосудов

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

NF-kB - ядерный фактор транскрипции

NOS - NO-синтаза

TNFa - фактор некроза опухоли

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Генерация активных форм кислорода (АФК) и свободно-радикальное окисление происходят во всех тканях живых организмов в процессе нормального метаболизма (Козлов Ю.П., 1973; Бурлакова Е.Б., 1998). Умеренные количества АФК необходимы для физиологической регуляции функций сперматозоидов, гиперактивации и акросомальной реакции (Зоркин С.Н. и др., 2009; Божедомов В.А. и др., 2012; Aitken R.J., 1998; Lombardo F. et al., 2011).

В публикациях последнего десятилетия фактором, снижающим мужскую фертильность, ученые считают гиперпродукцию АФК (Божедомов В.А. и др., 2008, 2009, 2010, 2012; Торопцева М.В., 2009; Agarwal A. et al., 2006; Athayde K.S. et al., 2007; Tremellen К., 2008). Липидный состав плазматической мембраны сперматозоидов существенно отличается от состава липидов соматических клеток. Мембрана мужских половых клеток содержит большие количества насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов и стеринов - основных субстратов для окисления, поэтому сперматозоиды особенно чувствительны к повреждающему действию АФК (Sanocka D., Kurpisz М., 2004). Избыточная продукция свободных радикалов вызывает нарушение митохондриальной цепи переноса электронов, повреждает мембраны и ДНК хромосом половых клеток, а также запускает каскад реакций, инициирующих апоптоз (Kemal Duru N. et al., 2000; Villegas J. et al., 2005; Aitken R.J. et al., 1998, 2010). В результате этих событий снижается подвижность и оплодотворяющая способность гамет, что, в конечном счете, приводит к бесплодию (Божедомов В.А. и др., 2008; Торопцева М.В., 2009; Tremellen К., 2008).

Актуальность поиска способов стимуляции сперматогенеза обусловлена тенденцией снижения показателей спермограммы. Согласно популяционным исследованиям, скорость падения концентрации сперматозоидов в сперме здоровых мужчин составляет около 2% в год при параллельном уменьшении доли подвижных и морфологически полноценных

форм гамет (Рыжаков Д.И., Артифексов С.Б., 2002; Камилов Ф.Х. и др., 2007; Delbes G. et al., 2010). За последние годы удельный вес мужского фактора в бесплодии супружеских пар увеличился с 30% до 50% и продолжает расти (Мазо Е.Б., Силуянов К.А., 2008; Siddiq F., Sigman М., 2002; Jequier A.M., 2010; Haidl G., 2011). Кроме того, с начала XX века по настоящее время произошли беспрецедентные изменения общепринятых стандартов фертильной концентрации сперматозоидов - с 60-100 млн/мл до 40, а затем и до 15 млн/мл (Cooper T.G. et al., 2010; WHO, 2010). Происходящее снижение активности сперматогенеза диктует необходимость его стимуляции не только при различных патологических состояниях, но и при нормальной, согласно критериям ВОЗ 2010 года, продукции половых клеток.

В связи с этим, актуальным является поиск физико-химических воздействий, способных стимулировать сперматогенез путем нормализации свободно-радикального баланса спермы, мужских репродуктивных органов и организма в целом.

Согласно концепции мембранного механизма стимулирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), порфирины, поглощая световую энергию НИЛИ, индуцируют фотосенсибилизированные свободно-радикальные реакции (Клебанов Г.И. и др., 1997, 1998, 2000). Термоактивация воды приводит к изменению ее кислотно-основных свойств и появлению в ней микродоз АФК (Домрачев Г.А. и др., 2001; Черников А.В., 2005; Калниньш К.К., 2010; цит. по Зайцева О.В. и др., 2013). Сообщается, что в присутствии аргона происходит более интенсивная диссоциация воды и в ней увеличивается концентрация АФК (Селивановский Д.А., 2006).

Дальнейшее изучение влияния свободных радикалов на генеративную функцию мужчин является актуальным вопросом физиологии, а возможность немедикаментозной стимуляции сперматогенеза посредством модуляции про-антиоксидантной системы организма НИЛИ и активированными водами представляет значительный интерес.

Цель работы - изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения, аргонированной и термоактивированной воды на баланс про-антиоксидантной системы организма самцов белых нелинейных крыс и сперматогенез экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Изучить изменения водородного показателя (рН) и окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) воды после воздействия НИЛИ, аргонирования и термоактивирования.

2. Проанализировать состояние про-антиоксидантной системы организма самцов белых нелинейных крыс при действии НИЛИ, аргонированной и термоактивированной воды.

3. Исследовать характер изменений в спермограмме экспериментальных животных при действии НИЛИ, аргонированной и термоактивированной воды.

4. Разработать оптимальные режимы воздействия НИЛИ, аргонированной и термоактивированной водой для стимуляции сперматогенеза.

5. Определить наличие и выраженность взаимосвязей между параметрами свободно-радикального баланса организма экспериментальных животных и функциональными показателями эякулята самцов белых нелинейных крыс.

Научная новизна. Впервые установлено, что действие НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты), аргонированной и термоактивированной воды in vitro увеличивает время сохранения подвижности половыми клетками.

Показано, что воздействие НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм, аргонированной и термоактивированной водой в относительной физиологической норме приводит к изменениям активности свободно-радикальных процессов. Общими эффектами для изучаемых физико-

химических воздействий являются повышение общей антиоксидантной активности (ОАА) организма и снижение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эякуляте экспериментальных животных. Установлено, что воздействие НИЛИ увеличивает подвижность сперматозоидов (патент «Способ стимуляции сперматогенеза в эксперименте» № 2481132), в то время как употребление активированных вод положительно влияет на активность половых клеток. Комбинация воздействий позволила добиться стимуляции как подвижности, так и активности сперматозоидов.

Показана важность выбора режима воздействия для стимуляции сперматогенеза, а именно: употребление активированных вод экспериментальными животными в течение 2 недель увеличивало количество и активность половых клеток, в то время как более длительное воздействие, напротив, приводило к угнетению сперматогенеза.

Выявлена высокая корреляционная взаимосвязь между параметрами свободно-радикальной активности организма, количеством и подвижностью половых клеток. Показано, что эякулят и семенники, по сравнению с плазмой крови, являются более чувствительными к изменению свободно-радикальной активности организма.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выявлен эффект стимулирующего сперматогенез действия НИЛИ и активированных вод, заключающийся в корригирующем влиянии НИЛИ и активированных вод на основные показатели про- и антиоксидантного статуса эякулята, тестикул, крови и печени экспериментальных животных.

Полученные сведения о взаимосвязи свободно-радикального баланса с функциональными параметрами сперматозоидов могут быть включены в образовательные программы по биологии, физиологии и биохимии при подготовке специалистов медико-биологического и ветеринарного профиля.

Результаты работы позволяют дать физиологически обоснованные рекомендации по применению НИЛИ и активированных вод в качестве немедикаментозных средств, улучшающих метаболизм и стимулирующих сперматогенез. Показана важность выбора режима воздействия и подобран безопасный эффективный режим для стимуляции сперматогенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Барботация воды аргоном (аргонирование) и обработка водопроводной воды при повышенной температуре (термоактивирование) приводят к повышению водородного показателя и снижению окислительно-восстановительного потенциала воды.

2. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты), аргонированной и термоактивированной воды in vitro увеличивает время сохранения подвижности половыми клетками.

3. Воздействие НИЛИ с длинами волн 475 и 405 нм (облучение в течение 1 минуты, курс - 10 суток), аргонированной и термоактивированной водой (длительность - 2 недели) в относительной физиологической норме приводит к изменениям активности свободно-радикальных процессов. Общими эффектами для изучаемых физико-химических воздействий являются повышение ОАА организма и снижение содержания продуктов ПОЛ в эякуляте экспериментальных животных. На фоне повышения антиоксидантного статуса организма происходит стимуляция сперматогенеза.

4. Облучение семенников НИЛИ увеличивает подвижность сперматозоидов, в то время как употребление активированных вод положительно влияет на активность половых клеток. Комбинация воздействий позволяет добиться стимуляции как подвижности, так и активности сперматозоидов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на 17 научных форумах различного уровня: X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2011); 16-ой и 17-ой Нижегородской сессии молодых учёных (Н. Новгород, 2011, 2012); II международной научной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2011); I международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2011); XI ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2011); VII региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012); XVI научной школы молодых ученых «Нелинейные волны -2012» (Н. Новгород, 2012); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2012); XVIII межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); VII международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2012); IV съезде биофизиков России «Физика - медицине и экологии» (Н. Новгород, 2012); II Всероссийском фестивале науки (Н. Новгород, 2012); X международной научной конференции «Физика и радиоэлектроника в медицине и экологии» с элементами научной молодежной школы ФРЭМЭ'2012 (Владимир, 2012); X международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2012); Всероссийской научной сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2013); IV

international symposium «Topical Problems of Biophotonics - 2013» (N. Novgorod, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 2 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 1 патент.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность к.ф.-м.н., с.н.с. отдела нелинейной динамики ИПФ РАН В.В. Чернову за помощь в обсуждении результатов, предоставление экспериментальной модели источника НИЛИ и аргонированной воды, ведущему научному сотруднику ЗАО «Крионорд» В.В. Борискину за предоставление термоактивированной воды, д.м.н., проф., зав. каф. патологической физиологии НижГМА Т.Е. Потеминой за консультативную помощь при освоении метода функционального исследования сперматозоидов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль активных форм кислорода в процессе сперматогенеза

Изучению процессов генерации и роли активных форм кислорода (АФК) в функционировании живых организмов посвящены многочисленные литературные обзоры отечественных и зарубежных исследователей (Осипов А.Н. и др., 1990; Владимиров Ю.А., 1998; Зенков Н.К. и др., 1993, 2001; Дубинина Е.Е., 2006; Halliwell В., 1994; Meier В., 2001). Известно, что АФК обл�