Морфологический анализ сперматогенеза при действии новых противоопухолевых препаратов и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора

Макарова, Наталья Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологический анализ сперматогенеза при действии новых противоопухолевых препаратов и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфологический анализ сперматогенеза при действии новых противоопухолевых препаратов и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора"

На правах рукописи

МАКАРОВА Наталья Петровна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СПЕРМАТОГЕНЕЗА ПРИ ДЕЙСТВИИ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ И НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ КАК РАДИОПРОТЕКТОРА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Курило Л.Ф.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Болтовская М.Н. доктор медицинских наук, проф. Астраханцев А.Ф.

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится ««&» 2006г. в_час

на заседании Диссертационного Совета Д.001.004.01 в ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека

РАМН

Автореферат разослан «

2006г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Михайлова Л.П.

3393

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов в организме млекопитающих животных и человека, связанных с клеточной пролиферацией и дифференцировкой. Он протекает под контролем специфических генов и регулируется совокупностью гормонов, цитокинов и факторов роста [Быков, 2000]. Исследователи занимаются проблемой защиты и сохранения половых клеток от негативных влияний различных факторов в силу уникальной роли половых клеток в онтогенезе и в связи с необходимостью развития профилактических мер, направленных на сохранение здоровья потомства. Так, например, основная практическая задача, стоящая перед радиобиологией: выяснение не только механизмов влияния повреждающего фактора (ионизирующей радиации), но и поиск способов предотвращения или ослабления побочных эффектов с помощью природных или искусственных радиопротекторов [Круглова, Карнаухов, 2001]. Разрабатываются новые средства защиты биологических систем от различных типов воздействий и видов излучений при острых и отдаленных последствиях облучения.

Основная задача лекарственного лечения опухолей - разработка способов увеличения эффективности действия противоопухолевых средств и ослабления их побочного повреждающего воздействия. Продолжается поиск лекарственных средств, обладающих большей эффективностью поражать опухолевые клетки, не повреждая при этом здоровые органы и ткани (в том числе репродуктивную систему). Задача сохранения репродуктивного здоровья особенно актуальна для детской онкологии. За последние годы детские онкологи добились значительных успехов относительно терапии заболеваний, которые раньше считались неизлечимыми. Правильное лечение приводит к выздоровлению ребенка. В настоящее время в мире живут многие тысячи людей, излеченных от онкологических заболеваний в детстве. Однако эти успехи достигаются за счет применения лекарственных препаратов, оказывающих значительное токсическое действие на центральную нервную систему, сердце, печень, почки, иммунную систему, костный мозг и репродуктивную систему. В связи с этим задача снижения побочных эффектов при химиотерапевтическом лечении и лучевой терапии является приоритетной для современной онкологии.

Исходя из вышесказанного возникла необходимость поиска методов защиты половых клеток от:

побочного токсического действия противоопухолевых препаратов цитостатического ряда, применяемых при химиотерапии злокачественных новообразований, с помощью химической модификации антибиотика (заключение в наночастицы с дальнейшей обработкой их поверхностно-активными веществами);

лучевого поражения с помощью профилактического действия низкоинтенсивного лазерного излучения.

Цель работы: провести морфологическое исследование ткани семенника в условиях применения новой наносомальной лекарственной формы доксорубицина и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора:__________

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- Установить характер повреждений сперматогенного эпителия при действии доксорубицина и его наносомальной лекарственной формы на дифференцирующиеся клетки сперматогенного эпителия и интерстициальную ткань.

- Сопоставить характер повреждений дифференцирующихся половых клеток и интерстициальной ткани после введения доксорубицина и его модификаций на разных сроках эксперимента.

- Изучить воздействие наносомальной лекарственной формы доксорубицина на половые клетки крыс с интракраниально перевитой глиомой Сб.

- Определить эффект действия низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого до общего радиационного облучения, на сперматогенез и интерстициальную ткань семенников половозрелых крыс.

Научная новизна

Проведенное комплексное морфологическое исследование семенников крыс с помощью методов световой микроскопии, количественного анализа сперматогенеза и морфометрической оценки состояния тканевых компонентов семенника позволило получить новые данные о характере изменений в семенниках крыс, возникающих в условиях применения новых наносомальных лекарственных форм доксорубицина. Показано, что наносомальная лекарственная форма оказывает сниженное токсическое воздействие на дифференцирующиеся половые клетки, которое выражено в уменьшении количества извитых семенных канальцев с повреждениями половых клеток, явлениями десквамации незрелых половых клеток, атипией собственной оболочки канальцев, расслоениями сперматогенного эпителия по сравнению с животными контрольных групп.

Впервые показан защитный эффект низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого до общего радиационного облучения, на дифференцирующиеся мужские половые клетки и состояние интерстициальной ткани семенников.

Практическая значимость работы

Результаты, полученные в ходе настоящей работы, углубляют и расширяют существующие представления о повреждающем действии антибиотиков антрациклинового ряда на клетки сперматогенного эпителия крыс. Показано профилактическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения как способа коррекции нарушений сперматогенеза, индуцированных ионизирующим облучением, что пополняет знания о действии лазера на биологическую ткань. Это имеет практическое значение для понимания сочетанного действия двух видов излучений: ионизирующего и низкоинтенсивного лазерного.

Известно, что химиотерапия и радиотерапия являются фундаментальными методами лечения онкологических заболеваний, поэтому современные представления о последствиях консервативного лечения на организм млекопитающих, особенно на репродуктивную систему, являются актуальными.

необходимость определения токсичности в отношении репродуктивных функций, что и было сделано в представленной работе.

Положения, выносимые на защиту

1. Новая наносомальная лекарственная форма доксорубицина обладает меньшей токсичностью для дифференцирующихся мужских половых клеток по сравнению с действием свободной формы антрациклинового антибиотика. Как прослежено в динамике (15-е и 30-е сутки) выраженный токсический эффект доксорубицина проявляется во всех экспериментальных группах, при этом в группе крыс, которым вводили антрациклиновый антибиотик в традиционном водном растворе, дегенеративные процессы в сперматогенном эпителии наиболее выражены.

2. По сравнению с интактными животными в сперматогенном эпителии крыс с интракраниально перевитой глиомой С6 в результате лечения доксорубицином и его модификациями происходит более выраженный процесс дегенерации половых клеток, приводящий к полному опустошению извитых семенных канальцев.

3. Использование низкоинтенсивного лазерного излучения перед общим радиационным облучением повышает количество сперматоцитов I, находящихся на стадии метафазы I и II деления мейоза, по сравнению с эффектом ионизирующего облучения.

4. Низкоинтенсивное инфракрасное лазерное излучение, применяемое в импульсном режиме до радиационного облучения в средних дозах, может быть включено в список средств, обладающих резистентным эффектом по отношению к сперматогенезу.

Апробация работы

Материалы работы доложены на конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004г); научной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» (Дубна, 2005г); съезде «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005г); Научной сессии МИФИ (Москва, 2006г); межлабораторной конференции при ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 2006г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано печатных 11 работ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами, 13 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 164 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение наносомальной лекарственной формы доксорубицина

Наносомальную лекарственную форму доксорубицина получали путём эмульсионной полимеризации бутилцианоакрилата в присутствии доксорубицина. Содержание доксорубицина в лиофилизованном препарате составляло 5% мае., средний диаметр наночастиц составлял 220 нм. Средний диаметр частиц, определенный методом лазерного светорассеяния, составлял 170 нм. Модификацию поверхности наночастиц полисорбатом 80 проводили непосредственно перед опытом. Лиофилизованные наночастицы ресуспендировали в воде, затем к водной суспензии при перемешивании прибавляли полисорбат 80 до концентрации 1%. Смесь выдерживали в термостате при 37°С не менее 30 мин и использовали в течение 2 ч Пустые наночастицы (плацебо) получали, используя аналогичную методику приготовления.

Токсикологическое исследование влияния наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему млекопитающих

Объектом исследования были взрослые половозрелые самцы крыс линии Вистар (массой 120-150 г). Животные были случайным образом поделены на 6 групп (по 12 голов), которые получали один из следующих препаратов: 1) наночастицы-плацебо, обработанные полисорбатом 80 (КР+Т\уееп 1%); 2) доксорубицин в водном растворе (Оох); 3) доксорубицин в 1% растворе полисорбата 80 (Бох+Т\уееп1%); 4) немодифицированная наносомальная форма доксорубицина (Бох+МР); 5) наносомальная форма доксорубицина, модифицированная полисорбатом 80 (Оох+ЫР+Т\уееп1%). Препараты доксорубицина вводили в хвостовую вену крыс в режиме 3x1.5 мг/кг с интервалом 72 часа. Использовали также интактных животных в качестве контрольной группы. Выведение животных из эксперимента соответствует этическим нормам, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Приказе МЗ РФ №267 от 19 06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики». По 6 животных в каждой группе были забиты под эфирным наркозом методом декапитации на 15-е сутки после окончания введения препаратов Остальные животные - на 30-е сутки после окончания лечения. Выбранные сроки забоя были обусловлены длительностью сперматогенеза у крыс.

Данная часть экспериментов выполнена при участии сотрудников Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф Гаузе РАМН к.б.н. Переверзевой Э.Р, к.б.н. Трещалина И.Д., и сотрудника ВНЦ молекулярной диагностики и медицины к.х.н. Гельпериной С.Э., которым автор выражает благодарность.

Схема экспериментов по изучению наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему млекопитающих с интракраниально перевитой глиомой С6

Исследование было проведено на нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г, которые были поделены на 4 группы по 5 голов в каждой группе. Для имплантации опухоли суспензию клеток глиомы С6 (4x105 кл/мл) каждой крысе вводили в мозг на глубину 4 мм в область дна правого бокового желудочка. Лечение начинали через

48 ч после трансплантации опухоли. Препараты (2-я группа - Dox, 3-я группа -Dox+NP, 4-я группа - Dox+NP+Tween 1%) вводили в дозе 1,5 мг/кг трехкратно с интервалом 72 ч. В качестве контроля использовали животных с опухолью, не получивших лечения.

Автор искренне благодарит к.б.н. Халанского A.C. (ГУ НИИ морфологии человека РАМН) за помощь в проведении эксперимента по изучению наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему млекопитающих с интракраниально перевитой глиомой Сб.

Схема экспериментов по изучению влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматогенный эпителий до процедуры общего ионизирующего облучения

Работа была выполнена на 14-ти половозрелых нелинейных крысах. Масса крыс составляла 250-280 г.

Было создано три группы животных: группа интактных животных, которых никаким процедурам не подвергали, опытная и контрольная группы. Опытную группу подвергали в течение десяти процедур воздействию низкоинтенсивным лазерным излучением в импульсном режиме. Источником инфракрасного лазерного излучения в экспериментальных исследованиях служил полупроводниковый лазер «ALFA-1M». Его технические характеристики: длина волны 890 нм, длительность импульса 70 не, средняя мощность импульса 2 Вт, диапазон установки частот от 10 Гц до 1000 Гц. Процедуру облучения крыс низкоинтенсивным лазерным излучением проводили в импульсном режиме в область надпочечников контактным способом с частотой 400 Гц (по 1,5 минуты для каждой стороны)

Крысы контрольной группы получали ложные процедуры (без включения аппарата). Затем животных опытной и контрольной группы однократно облучали на установке ГУБЕ (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН) гамма-лучами 60Со в дозе 2 Гр (мощность дозы 0,57 Гр/мин, 3,5 минуты). Забой животных проводили на 62-й день после воздействия ионизирующего облучения методом декапигации.

Данные эксперименты выполнены при участии сотрудников РНЦ восстановительной медицины и курортологии МЗ РФ: проф. Королев Ю.Н., Генниатулина М.С., Никулина Л.А., которым автор выражает признательность.

Гистологическая обработка материала

Для световой микроскопии гистологическую обработку семенников проводили по общепринятой для гонад методике [Курило, 1985].

Депарафинированные срезы семенников толщиной 6-8 мкм окрашивали квасцовым гематоксилином Эрлиха с подкраской 0,1% эозином и заключали в бальзам.

Количественные методы анализа семенников крыс всех экспериментальных групп

Для количественного анализа состава клеток сперматогенного эпителия и интерстициальной ткани использовали следующие параметры:

1. Количество срезов извитых семенных канальцев с 4-мя (сперматогонии, сперматоциты, сперматнды, сперматозоиды), 3-мя (без сперматозоидов),

2-мя (сперматогонии и сперматоциты), 1-й (только сперматогонии) генерацией половых клеток и без половых клеток («только клетки Сертоли») в расчете на 100 канальцев;

2. Индекс сперматогенеза [Ухов, Астраханцев, 1983];

Индекс сперматогенеза был выбран, для того чтобы показать общее состояние сперматогенного эпителия и картину гибели половых клеток при экспериментальных воздействиях. Расчет индекса сперматогенеза проводили следующим образом. Подсчитывали количество срезов извитых семенных канальцев с 4-мя, 3-мя и т.д. до 0 генераций половых клеток на 100 срезов извитых семенных канальцев. По формуле

/ = (а - произведение количества извитых семенных канальцев с г'-й генерацией

на ("; N - число проанализированных канальцев) подсчитывали индекс сперматогенеза, отмечали состояние собственной оболочки канальцев (на 100 канальцев).

3. Количество извитых семенных канальцев с десквамацией незрелых половых клеток в просвет (на 100 канальцев);

4. Количество извитых семенных канальцев с расслоением сперматогенного эпителия, появлением в нем пустот и лакун (на 100 канальцев);

5. Метафазный индекс сперматоцитов I и II;

Метафазный индекс первичных и вторичных сперматоцитов является модификацией показателя, предложенного в 1962г. Мопеэ1 (индекс пролиферативной активности). Метафазный индекс сперматоцитов I и II мы определяли путем подсчета делящихся сперматоцитов на XIV стадии цикла сперматогенного эпителия и отношения их к числу клеток Сертоли, встречающихся на этой же стадии [Мопев^ 1962; Курило и др., 2005]. В расчете принимали участие только сперматоциты, находящиеся на стадии метафазы I или II деления мейоза. Подсчитывали 50 канальцев на гистологическом срезе, что оказалось достаточным для получения статистически достоверного результата.

6. Соотношение площади интерстициальной ткани в семенниках и извитых семенных канальцев по методу Пакенаса [Пакенас, 1968];

Соотношение площади, занимаемой интерстициальной тканью и извитыми семенными канальцами, в семенниках экспериментальных животных определяли по методу СИаШеу [1943] в модификации П.И. Пакенаса [1968]. Использовали планиметрическую сетку Автандилова. Передвигая последовательно гистологический препарат в 40 полях зрения среза семенника для каждого животного, определяли число совпадений точек с элементами интерстициальной ткани и извитыми семенными канальцами. Это соотношение выражали в процентах [Автандилов, 2002].

7. Число клеток Лейдига в интерстициальной ткани в 1000 произвольных полях зрения.

Состояние интерстициальной ткани семенников оценивали на основании подсчета клеток Лейдига в интерстициальной ткани в 1000 произвольных полях зрения для каждого животного при увеличении х500.

Статистическая обработка результатов

Для определения степени достоверности полученных результатов была применена статистическая характеристика малых вариационных рядов [Автандилов,

2002]. Для анализа данных использовали í-критерий Стьюдента с проверкой классических условий применимости 1) результаты наблюдений имеют нормальные распределения; 2) дисперсии результатов наблюдений в выборках совпадают. Проверка гипотезы нормальности была осуществлена с помощью W-критерия. i Равенство генеральных дисперсий в сравниваемых группах проверяли, используя F-

критерий Фишера.

Результаты представляли в виде М±т, где М - среднее значение выборки, а т -ошибка выборки (или стандартная ошибка средней «Standart error on Mean»). Результаты считали достоверными, если уровень значимости не превышал 0,05 (р<0,05). Всю статистическую обработку производили в системе STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование эффекта воздействия доксорубицина на популяцию мужских половых клеток половозрелых крыс

Изучение влияния наиосомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенез половозрелых крыс

Результаты количественного морфологического анализа сперматогенеза (15-е сутки эксперимента) представлены в таблицах 1 и 2.

Группа интактных животных. Морфологический анализ сперматогенного эпителия крыс интактной группы выявил активный сперматогенез в извитых семенных канальцах. Индекс сперматогенеза в интактной группе составил 3,44±0,01. Слущивание незрелых половых клеток в просвет канальцев было выражено незначительно (в 3,3±0,8% проанализированных канальцев). Пустоты и расслоения сперматогенного эпителия обнаружены в 1,8±0,6% извитых семенных канальцев. Атипия собственной оболочки канальцев в семенниках крыс интактной группы составила 29,3±3,4%. Процентное соотношение интерстициальной ткани и семенных канальцев в интактной группе - 18,11±2,4, количество клеток Лейдига на 1000 полей зрения-2962± 140.

Экспериментальные группы Количественный гистологический анализ сперматогенного эпителия у крыс подопытных групп (15-е сутки после окончания ввода препаратов) показал легкую степень нарушения сперматогенеза при действии лекарственных препаратов в используемых комбинациях. Индексы сперматогенеза во всех экспериментальных группах между собой не различались (в пределах вычисленной погрешности), но были снижены по сравнению с крысами интактной группы. При этом в сперматогенном эпителии экспериментальных групп наблюдали вакуолизацию клеток Сертоли, их набухание. Во всех подопытных группах обнаружены дегенеративные изменения собственной оболочки канальцев, ее отслоение от эпителия. Атипия собственной оболочки канальцев наиболее сильно была выражена во 2-й группе (Dox) и составила 59,1±1,9%, что достоверно (р<0,05) превысило таковой показатель у крыс интактной группы приблизительно в 2 раза. Однако нарушения в собственной оболочке канальцев были выявлены не только у животных во второй группе. Во всех остальных экспериментальных группах у животных собственная оболочка извитых семенных канальцев также имела атипичное строение (таблица 2).

Слущивание незрелых половых клеток в просвет канальцев наиболее сильно было выражено также во 2-й группе фох) Данный показатель достоверно (р<0,05) увеличен по сравнению с интактной группой (15,1±2,8% и 3?3±0,8%, соответственно). Слущивание незрелых половых клеток в просвет канальцев также выражено в 5-й группе (13,3±2,4%, р<0,05). В остальных экспериментальных группах доля извитых семенных канальцев, с проявлениями десквамации незрелых половых клеток, была достоверно увеличена по сравнению с интактной группой (6,6±0,9% (р<0,05) - в 1-й группе (ЫР+Т\уееп 1%); 7,8±1,4% (р<0,05) - в 3-й группе (Оох+Т\уееп 1%); 8,1±1,6% (р<0,05) - в 4-й группе (Оох+ИР)).

Количество извитых семенных канальцев, содержащих пустоты и расслоения сперматогенного эпителия, в экспериментальных группах по сравнению с интактной группой было увеличено у животных всех экспериментальных групп кроме 1-й. Число извитых семенных канальцев, содержащих нарушения сперматогенного эпителия, составило во 2-й группе (Эох) 21,8±3,0% (р<0,05), в 3-й группе (Бох+Тмееп 1%) - 25,8±4,9% (р<0,05), в 4-й группе (Оох+ИР) - 27,6±2,6% (р<0,05), в 5-й группе (Оох+№+Т\уееп 1%) - 21,1±2,4% (р<0,05). В 1-й группе (ЫР+Т\уееп 1%) данный показатель также был достоверно увеличен по сравнению с интактом, но не так значительно, как в других экспериментальных группах (9,5±1,6%, р<0,05).

Процентное соотношение интерстициальной ткани во всех экспериментальных группах достоверно не отличалось от такового в интактной группе животных. Количество клеток Лейдига незначительно выросло, однако, также достоверно не отличалось от данного показателя крыс интактной группы.

Таблица 1. Состояние сперматогенного эпителия семенников крыс, подвергшихся

влиянию наносомальных лекарственных форм доксорубицииа (15-е сутки)

Группа животных Число животных в группе Генерации половых клеток в составе сперматогенного эпителия Индекс сперматогенеза, усл.ед.

4 генерации, % 3 генерации, %

Интактная группа 6 44,5±1,2 55,5±1,2 3,44±0,01

1-я группа ОМР+Ти-ееп 1%) 6 35,3±3,7* 64,7±3,7* 3,35±0,03*

2-я группа фох) 6 40,8±2,9 59,2±2,9 3,40±0,02

3-я группа (Оох+Тжееп 1%) 6 38,1±2,9 61,9±2,9 3,38±0,02*

4-я группа 6 41,1±2,1 58,9±2,1 3,41 ±0,02

5-я группа (Бох+№+Т«ееп 1%) 6 42,8±1,7 57,2±1,7 3,42±0,01

*р<0,05

Морфологический анализ сперматогенного эпителия у крыс (15-е сутки) не показал значительных отличий между группами. У всех крыс был снижен индекс сперматогенеза по сравнению с контрольной группой, но между собой по данному показателю группы достоверно не отличались. Данный факт, вероятно, следует связывать с длительностью сперматогенеза у данного вида млекопитающих (51,653,2 дня), за 15 суток после окончания введения препаратов доксорубицин и его модификации не оказали негативных действий.

Однако доксорубицин негативно повлиял на незрелые половые клетки, находящихся на ранних стадиях дифференцировки. На это указывает увеличение количество семенных канальцев с десквамацией незрелых половых клеток в просвет во всех экспериментальных группах по сравнению с животными контрольной группы. Особенно это проявилось в группах, получавших Эох и Оох+№+Т\уееп 1%. Количество извитых семенных канальцев с атипией собственной оболочки и наличием пустот и расслоений эпителия во всех экспериментальных группах достоверно не различались.

Таблица 2. Морфологические характеристики семенника у подопытных животных, подвергшихся влиянию наносомальных лекарственных форм доксорубицина (15-е сутки)

Группа животных Слущивание незрелых половых клеток в просвет канальца, % Пустоты и расслоения сперматогенного эпителия, % Атнпия собственной оболочки канальцев, % Процентное соотношение площади интерстнциальной ткани к семенным канальцам, усл. ед. Количество клеток Лейдига (на 1000 полей зрения)

Интактная группа 3,3±0,8 1,8±0,6 29,3±3,4 18,11±2,4 2962±140

1-я группа (№+Т«ееп 1%) 6,6±0,9* 9,5±1,6* 34,6±3,8 19,49±1,5 2944±645

2-я группа (Бох) 15,1±2,8* 21,8±3,0* 59,1±1,9* 18,92±1,8 2940±377

3-я группа (Оох+Ттеееп 1%) 7,8*1,4* 25,8±4,9* 57,6±3,7* 18,61±3,8 2967±391

4-я группа (Бох+№) 8Д±1,6* 27,6±2,6* 51,6±3,2* 20,71±2,9 3350+466

5-я группа Ттеееп 1%) 13,3±2,4* 21Д±2,4* 49Д±3,3* 20,49±0,9 3473±263

*р<0,05

Следует отметить, что «пустые» наночастицы (плацебо), обработанные Т\уееп 1% (группа ИР+Т\уееп 1%) обладают гаметотоксичностью. Это выражалось в достоверном снижении количества канальцев, содержащих 4 генерации половых клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды), достоверном уменьшении значения индекса сперматогенеза и увеличением количества канальцев

с десквамацией незрелых половых клеток, атипией собственной оболочки, пустот и расслоений эпителия по сравнению с животными интактной группы. Возможно, это связано с влиянием стресса (трехкратное введение препарата в хвостовую вену, взятие на руки, иммобилизация), ведущим, как известно, к нарушению функционирования сперматогенного эпителия. Ранее было показано, что в условиях стресса происходит изменение эндокринной функции семенников (снижение уровня тестостерона) [Кация, 1984]. Другими авторами [Алешин и др., 1982] было установлено не только достоверное снижение концентрации тестостерона, но и уменьшение массы гонад, разрыхление сперматогенного эпителия, блок сперматогенеза на стадии первичных сперматоцитов.

Выявленные признаки деструктивных изменений сперматогенного эпителия и интерстициальной ткани свидетельствуют о негативном влиянии антибиотиков, однако, на данном этапе эксперимента (15-е сутки) не удалось выяснить, какая модификация доксорубицина является наиболее безопасной с точки зрения влияния на половые клетки и интерстициальную ткань.

Результаты второй части эксперимента, когда животных наблюдали в более поздние сроки (30-е сутки эксперимента), представлены в таблицах 3 и 4.

Группа NP+Tween 1%. Картина морфологических изменений у крыс 1-й подопытной фуппы, получавших NP в комплексе с Tween 1%, была существенно изменена по сравнению с таковой у крыс интактной группы. Индекс сперматогенеза у крыс данной группы составил 3,31±0,04, что достоверно (р^О.Об) ниже значения индекса сперматогенеза у крыс интактной группы. Повреждений половых клеток замечено не было. Однако слущивание незрелых половых клеток в просвет канальцев отмечено в 7,8±0,7% канальцах, что достоверно превышает таковой показатель у крыс интактной группы (р<0,05). Пустоты и расслоения эпителия выявлены в 12,1±1,9% проанализированных канальцев. Атипия собственной оболочки извитых семенных канальцев у крыс, которым применяли комбинацию лекарственных препаратов NP+Tween 1%, замечена в 37,3±5,2% канальцев. Клетки Лейдига в интерстициальной ткани семенников крыс 1-й группы не изменены, их число на 1000 случайных полей зрения составило 3776±664. Процентное соотношение интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев не изменено по сравнению с таковым показателем интаюгных животных.

Группа Dox. У крыс 2-й группы, получавших свободный Dox, выявлено резкое снижение индекса сперматогенеза. Он составил 2,66±0,11, что достоверно (р<0,05) отличается от такового показателя крыс интактной группы. По сравнению с интактной группой наблюдали дистрофическое изменение со стороны паренхимы органа. Наблюдали появление извитых семенных канальцев, в которых отсутствуют половые клетки любых клеточных генераций, а присутствуют только клетки Сертоли, которые, как известно, являются самыми устойчивыми при любом виде воздействия. В семенниках крыс 2-й группы (Dox) обнаружили выраженную атипию собственной оболочки канальцев: ее отслоение от пласта сперматогенных клеток и проявление признаков складчатости и «фестончатости». Количество извитых семенных канальцев с нарушением строения собственной оболочки составило 65,5±3,3%. Происходило разрыхление слоев клеток сперматогенного эпителия, опустошение канальцев. Доля извитых семенных канальцев, содержащих пустоты и расслоения эпителия, у крыс 2-й группы (Dox) составила 36,1±2,9%. Наиболее отчетливо по сравнению с

остальными экспериментальными группами была выражена десквамация незрелых половых клеток в просвет канальцев. Данный показатель равен 19,1 ±2,9%, что достоверно (р<0,05) превысило не только значение у крыс интактной группы, но и значения слущивания незрелых половых клеток других экспериментальных групп.

В процессе количественного морфологического анализа выявлено, что наиболее активно слущивались в просвет половые клетки поздних стадий развития (ранние и средние сперматиды). Отмечали сниженное по сравнению с интактной группой число сперматоцитов, вступающих в процесс дифференцировки (стадия прелептотены).

В интерстициальной ткани крыс данной группы наблюдали незначительный отек. Соотношение интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев достоверно (р<0,05) превысило таковой показатель у крыс интактной группы и составило 37,47±5. Количество клеток Лейдига было также достоверно (р<0,05) увеличено по сравнению с интактными животными (4050±299). В целом можно говорить о средней степени нарушений сперматогенеза под воздействием препарата Оох.

Группа йох+Тыееп 1%. У крыс 3-й подопытной группы (Dox+Tween 1%) в некоторых зонах встречались извитые семенные канальцы, которые не содержали генераций половых клеток и состояли только из набухших и вакуолизированных клеток Сертоли. Происходила деформация стенок канальцев, зарастание их просветов. В нескольких канальцах обнаружены дегенерирующие половые клетки.

Также при гистологическом анализе наблюдали извитые семенные канальцы с единичными сперматогониями и клетками Сертоли, сперматоциты в таких канальцах отсутствовали. У крыс 3-й группы фох+Т\уееп 1%) значение индекса сперматогенеза составляет 2,14+0,17, что достоверно (р<0,05) ниже такового показателя крыс интактной группы.

В большинстве проанализированных канальцев у крыс 3-й группы (Оох+Т\уееп 1%) присутсвуют сперматогонии с пикнотическими ядрами. Количество извитых семенных канальцев, содержащих атипию собственной оболочки канальцев, составляет 60,1 ±2,1%. Цитоплазма клеток Сертоли была набухшая, в ней были отдельные вакуоли. Происходила активная десквамация незрелых половых клеток в просвет семенных канальцев (9,6±1,6%).

Отмечен отек интерстициальной ткани, соотношение интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев составило 31,01±3,7, что достоверно выше (р<0,05) такового показателя крыс интактной группы. Происходило увеличение количества клеток Лейдига вокруг семенных канальцев по сравнению с интактной группой.

Группа Бох+ЫР. У крыс 4-й группы, получавших Оох в наночастицах (Бох+НР), были также обнаружены деструктивные изменения паренхимы органа. В сперматогенном эпителии были обнаружены единичные дегенерирующие половые клетки (сперматогоггии), которые также как и клетки Сертоли, располагались у собственной оболочки семенных канальцев. Цитоплазма клеток Сертоли была вакуолизирована и неравномерно окрашена. Вокруг сперматогониев были обнаружены пустоты и вакуоли, что говорит о нарушении контакта первых с клетками Сертоли и о гибели половых клеток. Происходит процесс деформации и зарастания канальцев, в таких канальцах отсутствуют половые клетки. Индекс сперматогенеза составил 2,20±0,26, что достоверно (р<0,05) ниже индекса сперматогенеза у крыс интактной группы.

Собственная оболочка 58,1±5,1% канальцев изогнута и отслоена от половых клеток. В таких канальцах можно было видеть, что половые клетки и клетки Сертоли были расположены на некотором расстоянии от собственной оболочки.

Отмечен процесс активного слущивания сперматоцитов в просвет канальцев у крыс в группе Оох+ИР, многие из слущиваемых клеток имеют пикнотические ядра. Число извитых семенных канальцев с десквамацией незрелых половых клеток составило 10,1±0,9%. Наблюдали появление больших межклеточных щелей и разрыхление клеточных слоев в сперматогенном эпителии (36,8±4,8%), образовавшихся из-за слущивания дегенерирующих половых клеток в просвет канальцев.

Количество клеток Лейдига в данной группе составило 5250+522, что достоверно (р<0,05) превысило таковой показатель крыс интактной группы и остальных групп также. Процентное соотношение площадей ингерстициальной ткани и извтых семенных канальцев составило 42,13+1,4. В ингерстициальной ткани наблюдали отек. Структура клеток Лейдига изменена не была

Группа Оох+ЫР + Ги>ееп 1%. У крыс 5-й группы, получавших Оох в № в комплексе с Т\уееп 1%, в сперматогенном эпителии наблюдали диффузный асперматогенез (наличие канальцев как с типичным сперматогенезом, так и канальцев, не содержащих половых клеток). В 0,3±0,3% канальцев выявлена дезорганизация эпителия с появлением вакуолизированных и набухших клеток Сертоли. Однако, несмотря на присутствие канальцев с дегенерацией половых клеток, существовали зоны, в которых ткань семенника имела нормальное строение: в семенных канальцах наблюдали активный сперматогенез, в интерстициальной ткани - зрелые клетки Лейдига.

Индекс сперматогенеза у крыс данной группы составил 2,71±0,07, что достоверно (р<0,05) выше такового показателя крыс, получавших лекарственную форму доксорубицина (2-я, 3-я, и 4-я группы). Слущивание незрелых половых клеток в просвет канальцев было отмечено в 15,3±1,1% канальцев, что ниже значения, выявленного у крыс, для которых применяли доксорубицин в свободной форме (2-я группа). Пустоты и расслоения эпителия наблюдали в 27,1±4,2% канальцев. Атипия собственной оболочки была выражена не так значительно, как у крыс во 2-й группе (Оох), и составила 57,1±4,8%.

Количество клеток Лейдига в интерстициальной ткани было достоверно (р<0,05) увеличено по сравнению с интактными животными и составило 5188±333. Процентное соотношение ингерстициальной ткани и извитых семенных канальцев составляет 26,56+4,3.

Морфологический анализ сперматогенеза через 30 суток после окончания ввода препаратов показал, что истинный раствор доксорубицина вызывает тяжелую степень нарушения половых клеток. Была обнаружена дегенерация ядер половых клеток, атипия собственной оболочки семенных канальцев, образование пустот и лакун из-за активной десквамации незрелых половых клеток.

При действии препаратов Оох+ЫР и Оох+Т\уееп 1% были также выявлены негативные воздействия антибиотика на половые клетки крыс.

Таблица 3. Состояние сперматогенного эпителия семенников крыс, подвергшихся влиянию наносомальных лекарственных форм доксорубицнна (30-е сутки)

4 генерации, % 3 генерации, % 2 генерации, % 1 генерация, % «только клетки Сертоли»

Интактная группа 6 44,3±0,8 55,7±0,8 0 0 0 3,44±0,008

1-я группа (NP+Tween 1%) 6 32,5±4,2* 66,4±3,7* 1,1±0,8 0 0 3,31 ±0,04*

2-я группа (Dox) 6 14,5±2,7* 50,1±3,6 26,5±4,5* 5,4±2,2* 3,5±1,6 2,66±0,11*

3-я группа (Dox+Tween 1%) 6 7,0±1,4* 33,8±6,0* 28,8±2,1* 27,3±7,6* 3,1±1,9 2,14±0,17*

4-я группа (Dox+NP) 6 8,5±3,3* 35,2±8,9* 30,3±4,4* 19,8±8,4* 6,2±2,3* 2,20±0,26*

5-я группа (Dox+NP+Tween 1%) 6 12,1±2,3* 52,1±3,6 30,8±3,4* 4,7±1,1* 0,3±0,3 2,71 ±0,07*

*р<0,05

Таблица 4. Морфологические характеристики семенника у подопытных животных, подвергшихся влиянию наносомальных лекарственных форм доксорубицина (30-е сутки)

Группа животных Слущивание незрелых половых клеток в просвет канальцев, % Пустоты и расслоения спермато-генного эпителия, % Атипия собственной оболочки канальцев, % Процентное соотношение площадей интерстициаль ной ткани к семенным канальцам, усл. ед. Количество клеток Лейдига (на 1000 полей зрения)

Интактная группа 3,1±0,7 1,3±0,7 24,8±5,4 18,53±1,8 2537+296

1-я группа (ОТ+Ти-ееп 1%) 7,8±0,7* 12,1±1,9* 37,3±5,2 18,54±2,0 3776+664

2-я группа (»ох) 19,1 ±2,9* 36,1±2,9* 65,5±3,3* 37,47±5,0* 4050±299*

3-я группа (Оох+Ти'ееп 1%) 9,6±1,6* 28,8±3,9* 60,1 ±2,1* 31,01±3,7* 3408+139

4-я группа (Оох-^Р) 10,1±0,9* 36,8±4,8* 58,1±5,1* 42,13±1,4* 5250±522*

5-я группа фох+ОТ+ Ти-ееп 1%) 15,3±1,1* 27,1±4,2* 57,1±4,8* 26,56±4,3 5188+333*

*р<0,05

Наносомальная лекарственная модификация доксорубицина Dox+NP+Tween 1% позволяет снизить токсическое действие антибиотика на половые клетки крыс. Несмотря на то, что сами наночастицы и поверхностно-активные вещества являются, как было сказано выше, гаметотоксичными, в сочетании с доксорубицином они не проявляют кумулятивного действия, а даже, наоборот, позволяют снизить негативное влияние антрациклинового антибиотика на сперматогенный эпителий. У крыс, получавших Оох+№+Т\уееп 1% наблюдали диффузный асперматогенез (наличие в сперматогенном эпителии канальцев как с явлениями дегенерации половых клеток, извитые семенные канальцы с наличием только клеток Сертоли, так и нормального строения). Следует отметить, что очаговость поражения извитых семенных канальцев и интерстициальной ткани характерно для слабой или средней степени нарушений сперматогенеза, что еще раз указывает на снижение гаметотоксичности препарата Оох+ЫР+Тшееп1% по сравнению с остальными вводимыми лекарствами.

Таким образом, можно говорить о сниженной гаметотоксичности новой наносомальной лекарственной формы доксорубицина по сравнению с истинным раствором.

Влияние наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий в процессе химиотерапии крыс с интракраниально перевитой глиомой С6

Результаты морфологического анализа сперматогенного эпителия крыс представлены в таблице 5.

Контрольная группа. Морфологический анализ семенников крыс контрольной группы показал, что извитые семенные канальцы были представлены клетками Сертоли и всеми стадиями дифференцирующихся половых клеток. Семенные канальцы с явлениями слущивания незрелых половых клеток в просвет обнаружено не было. Пустоты и расслоения сперматогенного эпителия встречались крайне редко, однако, достаточно сильно была выражена атипия собственной оболочки. Нарушения в ее строении имели 10,4±3,6% канальцев. Индекс сперматогенеза в контрольной группе составил 3,43±0,01 (таблица 5)

Экспериментальные группы Группа Вох. У крыс, получавших препарат Оох, были обнаружены гибнущие сперматоциты на стадиях профазы I мейоза. Именно эти клетки чаще всего слущивались в просвет канальцев. Количество извитых семенных канальцев, содержащих в своем просвете незрелых половых клеток, составляло 0,33±0,3%. Наблюдали активный процесс слущивания не только отдельных дегенерирующих половых клеток, но и большого пласта половых клеток разных клеточных генераций в сперматогенном эпителии крыс, получавших лечение свободным доксорубицином. Число семенных канальцев, содержащих 4 генерации половых клеток, было снижено по сравнению с контрольной группой и составило 37,0±0,8%. Индекс сперматогенеза у крыс в данной группе равен 3,18±0,04, что достоверно снижено по сравнению с таковым показателем крыс контрольной группы (р<0,05). Было обнаружено большое число пустот и лакун в сперматогенном эпителии, особенно в компартменте сперматоцитов, а также вакуолизация цитоплазмы клеток Сертоли. Количество канальцев, содержащих атипию собственной оболочки, составляло 16,1±5,1%. Это указывает на нарушение связи между клетками и собственной оболочкой. В сперматогенном эпителии крыс данной группы (Оох) наблюдали появление извитых семенных канальцев с 2-мя генерациями (сперматогонии и сперматоциты), причем некоторые половые клетки в таких извитых семенных канальцах имели дегенерирующие ядра. Это свидетельствует о гибели половых клеток постмейотических стадий (сперматиды и сперматозоиды), о невозможности пройти половыми клетками мейоз, который, как известно, обеспечивает отбор генетически и структурно полноценных половых клеток.

Группа Эох+ИР При морфологическом анализе клеток сперматогенного эпителия крыс 3-й группы при действии препарата Оох+№ было выявлено нарушение сперматогенного эпителия. Индекс сперматогенеза составил 3,11±0,2. Также был обнаружен активный процесс расслоения сперматогенного эпителия и появления в нем пустот. Имело место атипия собственной оболочки (17,0±2,2%), появление складчатости и «фестончатости». Выявлено наличие 2х и Зх-ядерных клеток. В основном это были сперматиды. Под действием антибиотика нарушен процесс деления клеток (доксорубицин связывается с липидами клеточных мембран), что и приводит к появлению многоядерных клеток. Был отмечен процесс слущивания незрелых половых клеток.

Таблица 5. Состояние сперматогенного эпителия семенников крыс в процессе химиотерапии крыс с нн гракраниалыю перевитой глиомой С6

Группа животных Число животвых в группе Генерации половых клеток в составе сперматогенного эпителия Инд«кс сперматогенеза, усл.ед. Слущивание незрелых половых клеток в просвет семенных канальцев, % Пустоты и расслоения в спермато-генном эпителии, % Изменения в собственной оболочке извитых семейных канальцев, %

4 генерации, % 3 генерации, % 2 генерации, О/ 1 генерация, %

1-группа (контрольная) 5 43,6±1,8 56,4±1,8 0 0 3,43+0,01 0 1,2±1,2 10,4±3,6

2-я группа (Dos) 5 37,0±0,8* 49,6±2,8 8,4±1,1 5,0±1,7 3,18±0,04* 0,33±0,3 10,8±1,6* 16,1±5,1

3-я группа (Dox+NP) S 28,4±9,1 57,4±8,5 И,8±11,3 2,4±2,4 3,11±0,2 11,0±9,5 20,2±4,4* 17,0±2,2

4-я группа (Dox+NP+ Tween 1%) 5 40,6±2,5 56,0±2,3 3,4±1,5 0 3,37±0,03 0,85±0,4 2,4±1,2 17,5±5,8

* р<0,05

Наиболее сильно по сравнению с остальными группами экспериментальных животных у крыс, получавших доксорубицин в наночастицах, было выражено разрыхление пласта дифференцирующихся половых клеток (20,2±4,4%). Данный показатель был достоверно (р<0,05) выше по сравнению с контрольной группой, а также превышал таковое значение всех остальных групп. Изменения в собственной оболочке канальцев у крыс данной группы выражено незначительно по сравнению с другими группами, применяющими доксорубицин (17,0±2,2%).

Группа Dox+NP+Tween 1%. Анализ морфологических изменений сперматогенного эпителия крыс 4-й группы (Dox+NP+Tween 1%) показал нарушения сперматогенного эпителия. Индекс сперматогенеза в данной группе составил 3,37+0,03, что выше индекса сперматогенеза остальных групп (кроме контрольной). Однако в сперматогенном эпителии крыс, получавших Dox+NP+Tween 1%, выявлено наличие 2х и Зх-ядерных клеток (сперматоциты и сперматиды). Наблюдали смещение сперматоцитов к люминарной зоне, отслоение пласта сперматогенных клеток от: собственной оболочки извитых семенных канальцев. Количество семенных канальцев, в которых обнаружена атипия собственной оболочки, составило 17,5±5,8%. Слущивание дегенерирующих половых клеток разных стадий дифференцировки в просвет извитого семенного канальца составляло 0,85±0,4%, а в 2,4±1,2% канальцев обнаружены пустоты и расслоения эпителия. Клетки, уходящие в дегенерацию, слущиваются в просвет канальцев, что и наблюдается при анализе сперматогенного эпителия у животных в 4-й группе. Пустоты в сперматогенном эпителии и слущивание незрелых половых клеток в просвет семенных канальцев свидетельствуют о протекающей гибели половых клеток.

Однако активный сперматогенез встречается в отдельных канальцах, половые клетки и их дифференцировка ничем не отличаются от такового контрольной группы. Морфологический анализ семенников крыс 4-й группы показал, что отдельные канальцы были представлены клетками Сертоли и всеми типами дифференцирующихся половых клеток.

Таким образом, в эксперименте с интракраниально перевитой глиомой С6 было также выявлена уменьшенная гаметотоксичность соединения Dox+NP+Tween 1% по сравнению с остальными вводимыми препаратами на основе доксорубицина. Показано, что доксорубицин в любой модификации проникает через гематотестикулярный барьер, поражая половые клетки. При этом известно, что через гематоэнцефалический барьер свободный доксорубицин не проникает, а вот в составе с наночастицами - способен пройти к клеткам головного мозга, что делает наносомальную лекарственную форму доксорубицина привлекательной для онкологической практики.

Как известно, основной токсический эффект антрациклиновых антибиотиков заключен в нарушении синтеза ДНК. Также было показано, что под действием доксорубицина происходит нарушение кальциевого обмена [Solaini et al., 1994], связывание антрациклинового антибиотика с мембранными липидами, гибель эндотелиальных клеток, апоптоз [Ewer et al., 1997]. Доксорубицин способен ингибировать тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование [Muhammed et al., 1983]. Наряду с этим доксорубицин повреждает митохондрии. Действие доксорубицина на митохондрии приводит к их набуханию, деструкции крист, формированию миелиновых отложений [Olson et al., 1977]. Возможно, что это связано

с угнетающим действием на митохондриальную ДНК. Как следствие, нарушаются функции митохондрий, такие как энергетический обмен и поддержание внутриклеточной концентрации кальция [Revis et al., 1979].

На основании проведенного экспериментального исследования и, зная функции клеток Сертоли, можно предполагать, что доксорубицин в любом состоянии проникает через гематотестикулярный барьер и поражает митоходрии, в большом количестве находящиеся в клетках Сертоли. В результате чего возможно нарушение основной функции поддерживающих клеток - питание половых клеток. Как следствие, половые клетки не способны к дальнейшей дифференцировке в виду недостаточного поступления необходимых веществ, и начинается процесс активного слущивания незрелых половых клеток в просвет, что видно из результатов морфологического анализа сперматогенного эпителия, вследствие чего в нем образуются пустоты и лакуны.

Следует предположить, что клетка Сертоли с нарушениями в митохондриях не может выполнять функцию не только питания половых клеток, но и гормонального контроля дифференцировки созревающих половых клеток. Возможно, что происходят нарушения в синтезе андрогенсвязывающего белка, в результате чего локальная концентрация тестостерона не достигает значения, необходимого для нормального течения сперматогенеза. Деградирующая клетка Сертоли начинает терять связь с базальной мембраной, происходит утолщение собственной оболочки канальца, ее отслоение от половых клеток. Данная картина морфологических изменений неоднократно встречалась при анализе гистологических препаратов.

Нарушения в синтезе андрогенсвязывающего белка приводят к снижению количества зрелых сперматозоидов и увеличению незрелых форм половых клеток. Уменьшение концентрации тестостерона приводит по принципу регуляторной обратной связи к снижению концентраций ЛГ и ФСГ, секретируемых передней долей гипофиза. В итоге сперматогенный эпителий дегенерирует, происходят негативные изменения в его строении.

Однако кроме «митохондриального» пути поражения сперматогенного эпителия возможен и другой механизм токсического действия доксорубицина и его модификаций на половые клетки. Было показано, что токсиканты, такие как радиация, действуют непосредственно на половые клетки [Lee et. al., 1999], в то время как другие (гексанедион) - повреждают клетки Сертоли. Более того, токсические вещества могут вызывать блок дифференцировки сперматогониев, что приводит к нарушению сперматогенеза в целом [Meistrich et. al., 2003].

Результаты проведенных экспериментов позволяют говорить о том, что наносомальная лекарственная форма доксорубицина уменьшает негативные последствия действия доксорубицина на половые клетки половозрелых самцов крыс.

II. Морфофункциональная характеристика ткани семенника при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения перед общим радиационным облучением крыс

Результаты эксперимента представлены в таблицах 6 и 7.

Интактная группа. У крыс интактной группы сперматогенный эпителий состоит из половых клеток всех клеточных генераций. Индекс сперматогенеза у

интактных крыс составил 3,40±0,04. Слущивание незрелых половых клеток составило менее 1%. Количество первичных сперматоцитов по отношению к количеству клеток Сертоли для интактных животных - 2,28±0,2.

Площадь, занимаемая интерстициальной тканью, составляет 18,12±0,5% по отношению к площади, занимаемой извитыми семенными канальцами. Количество клеток Лейдига на 1000 случайных полей зрения составляет 2771±239.

Таблица 6. Состояние сперматогенеза в семенниках подопытных животных, подвергшихся облучению низкоинтенсивным лазерным излучением до процедуры общего радиационного облучения___

Число живот- Генерации половых клеток в составе сперматогенного эпителия Индекс сперматогенеза, усл.ед. Слущивание незрелых половых клеток в

Группа животных ных в группе 4 генерации % 3 генерации % просвет извитых семенных канальцев, %

Интактная 4 40,0+0,4 60,0±0,4 3,40+0,04* 0,25±0,25

Контрольная (лазерное плацебо +ионизирующее облучение) 5 13,8+1,0* 86,2±1,0 3,11±0,01* 11,4±3,0*

Опытная (низкоинтенсивное лазерное излучение + ионизирующее облучение) 5 20,2+0,3* 79,8±0,3 3,20±0,01 3,4±0,7*

* р<0,05 между указанными группами

Контрольная группа При действии ионизирующего излучения у крыс контрольной группы (лазерное плацебо +ионизирующее облучение) в извитых семенных канальцах обнаружили нарушение сперматогенеза (очаговое поражение ткани), также выявлены дегенеративные изменения половых клеток. Индекс сперматогенеза у крыс контрольной группы составил 3,11+0,01 (р<0,05). По сравнению с интакгной группой в семенниках крыс контрольной группы наблюдается снижение количества извитых семенных канальцев, содержащих 3-4 генерации половых клеток. Резко увеличилось количество канальцев с пустотами и расслоениями по сравнению с интактными животными. Вследствие активного слущивания незрелых половых клеток в просвет извитых семенных канальцев возникали пустоты в сперматогенном эпителии, особенно в базальном отделе, вследствие чего происходила дезорганизация клеточных слоев сперматогенного эпителия.

Собственная оболочка семенных канальцев приобрела «фестончатость», в некоторых участках замечено ее отслоение от половых клеток. Количество метафаз сперматоцитов на XIV стадии цикла сперматогенного эпителия по отношению к количеству клеток Сертоли достоверно снижалось, уменьшение составило 35,1% по сравнению с интактными животными (таблица 7). Увеличивалось число канальцев, в просвете которых обнаруживали спущенные клетки, в том числе первичные сперматоциты. Между извитыми семенными канальцами небольшими группами располагались клетки Лейдига. Процентное соотношение площадей, занимаемых интерстициальной тканью и извитыми семенными канальцами, увеличивается на 1,55% по сравнению с интактной группой. Процентное соотношение площадей изменяется за счет возрастания количества самих клеток. Их число растет по отношению к таковому крыс интактной группы приблизительно в 1,25 раза.

Таблица 7. Морфологические характеристики клеток семенника у подопытных животных

Группа животных Пустоты н расслоения сперматогенного эпителия, % Атипия собственной оболочки семенных канальцев, % Процентное соотношение площади интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев, усл. ед. Количество клеток Лейдига (иа 1000 полей зрения) Метафазный индекс, усл. ед.

Интактная 0,5+0,2 1,0±0,01 18,12±0,5 2771+239 2,41+0,15

Контрольная (лазерное плацебо +ионизирующее облучение) 16,4±1,2 14,0±1,0 19,67±1,1 3485+353 1,54+0,05*

Опытная (низкоинтенсивное лазерное излучение + ионизирующее облучение) 3,0±0,7 1,8±0,2 23,00+1,0* 6791+527» 1,92+0,12*

* р<0,05 между указанными группами

В контрольной группе животных, которых подвергали воздействию лазерным плацебо и ионизирующим облучением, было отмечено достоверное снижение индекса сперматогенеза по сравнению с интактной группой. Были выявлены достоверные негативные влияния ионизирующего облучения на клетки сперматогенного эпителия: снижение количества первичных сперматоцитов по отношению к количеству клеток Сертоли, увеличение количества семенных канальцев, содержащих незрелые половые клетки в просвете канальца, в том числе первичных сперматоцитов, появление расслоений и пустот в эпителии. Было отмечено разрастание интерстициальной ткани и значительное увеличение количества клеток Лейдига. Полученные данные говорят о нарушении процесса дифференцировки половых клеток при общем радиационном облучении. Одна из возможных причин патологических изменений сперматогенного эпителия находится в области нарушения гипоталамо-гипофизарной системы. В

контрольной группе облучали весь организм крыс, в том числе и систему гипоталамус - гипофиз - гонады, что также может объяснять негативные влияния ионизирующего облучения на сперматогенез. Было показано [Королев и др., 2000], что после радиационного облучения в клетках паравентрикулярного ядра гипоталамуса развиваются различные ультраструктурные изменения. В нейронах отмечают тенденцию к снижению количества секреторных гранул и везикул, что авторы связывают с более быстрым выведением гормонов из клеток. Были обнаружены признаки дистрофических изменений клеточных органелл, в частности, гранулярного эндоплазматического ретикулума и митохондрий, что способно в той или иной мере негативно сказаться на функциях этих органелл. А, как известно, система гипоталамус - гипофиз - гонады играет принципиальную роль в регуляции дифференцировки половых клеток в составе сперматогенного эпителия

Опытная группа. Применение курса низкоинтенсивного лазерного излучения перед радиационным облучением в опытной группе предотвращало повышение уровня пострадиационных нарушений в семенниках. Индекс сперматогенеза в опытной группе составил 3,20±0,01, что превысило показатель контрольной группы, однако, не достигло такового значения у крыс-самцов интактной группы. Извитые семенные канальцы подвергаются деструктивным изменениям различной степени выраженности, однако, при этом значительно реже встречались пустоты и расслоения эпителия. В данной группе отсутствует резкое увеличение слущивания незрелых половых клеток в просвет канальцев. Атипия собственной оболочки семенных канальцев соответствовала условной норме. Метафазный индекс снижался по сравнению с таковым показателем у интактных животных, однако, был достоверно выше контроля на 20% (р<0,05).

Интерстициальные клетки у крыс опытной группы чаще располагались группами, имели овальную или полигональную форму, эксцентрично расположенное ядро. Процентное соотношение площадей интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев для опытной группы составило 23,00±1,0%, что превысило таковой показатель для остальных групп. Данный результат свидетельствует о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение влияет на интерстициальную ткань, что выражено также в увеличении количества клеток Лейдига у крыс по сравнению с другими группами. Количество клеток Лейдига на 1000 полей зрения составило для крыс данной группы 6791±527.

Курсовое (10 процедур) действие низкоинтенсивного лазерного излучения до общего радиационного воздействия вызвало резистентность ткани семенника животных, облученных как низкоинтенсивным лазерным излучением, так и ионизирующим облучением, по сравнению с крысами, для которых использовали лазерное плацебо. Экспериментально было показано, что профилактическое воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения в область надпочечников повышает количество извитых семенных канальцев, содержащих 4 генерации половых клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды), что ведет за собой достоверное увеличение индекса сперматогенеза по сравнению с контрольной группой. Количество семенных канальцев, содержащих десквамированные незрелые половые клетки в просвете канальца, достоверно снижено по сравнению с контрольной группой, однако, не достигает такового значения интактных животных, что вызвано негативным действием ионизирующего

облучения на процесс дифференцировки сперматогенных клеток. Извитые семенные канальцы с пустотами и лакунами в сперматогенном эпителии животных опытной группы встречаются значительно реже, чем в контрольной группе.

В результате проведенного исследования также было установлено, что использование низкоинтенсивного лазерного излучения перед общим радиационным облучением повышает метафазный индекс сперматоцитов по сравнению с крысами контрольной группы (лазерное плацебо + ионизирующее облучение). Количественный морфологический анализ показал, что происходит также достоверное увеличение площади интерстициальной ткани и численности клеток Лейдига в группах, подвергавшихся профилактическому воздействию низкоинтенсивного лазерного излучения с последующим ионизирующим облучением.

Ранее было показано [Королев и др., 2000], что воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения в область надпочечников приводит к обновлению и увеличению субклеточных структур в гипоталамусе, восстановлению некоторых нейрогуморальных процессов, что в целом создает благоприятные условия для функционирования данного органа, который, как известно, играет роль в активности половых желез. Особое место в регуляции деятельности половой системы имеют не только гипоталамус и гипофиз, но и все системы внутренней эндокринной регуляции.

На основании полученных нами результатов, можно утверждать, что низкоинтенсивное лазерное излучение улучшает состояние сперматогенеза в извитых семенных канальцах, обеспечивая увеличение жизнеспособности генеративных и интерстициальных клеток облученных крыс-самцов.

ВЫВОДЫ

1. Свободная форма доксорубицина вызывает тяжелую степень нарушения сперматогенеза, что выражено в появлении половых клеток с дегенерирующими ядрами, набухании клеток Сертоли, повреждении собственной оболочки канальцев, частичном опустошении извитых семенных канальцев.

2. Новая наносомальная лекарственная форма доксорубицина по сравнению со свободным антибиотиком ослабляет побочное повреждающее действие на сперматогенез. В динамике прослежено улучшение количественных показателей состояния сперматогенеза у крыс, получавших лечение новой наносомальной формой доксорубицина, по сравнению с крысами контрольной группы.

3. Лечение крыс с перевитой глиомой С6 новой наносомальной лекарственной формой доксорубицина показало сниженный гаметотоксический эффект новой формы препарата, что проявляется в уменьшении некротических изменений в паренхиме семенника.

4. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения до общего радиационного воздействия позволило снизить негативные последствия радиации на сперматогенез. Выявлено повреждение сперматогенного эпителия средней тяжести у крыс опытной группы по сравнению с животными контрольной группы. Использование низкоинтенсивного лазерного излучения приводит к увеличению в 2,5 раза количества клеток Лейдига по сравнению с

интактной группой и в 2 раза по сравнению с контрольной, а также к росту площади интерстициальной ткани семенника.

5. Полученные в настоящей работе данные указывают на возможность предотвращения побочного действия ионизирующего облучения и доксорубицина на клетки мужской репродуктивной системы экспериментальных животных (крыс).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Курило Л.Ф., Королев Ю.Н., Гениатулина М.С., Никулина Л.А., Макарова Н.П., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В. Изучение влияния слабых радиопротекторов на процесс деления клеток костного мозга и сперматогенез крыс и подходы к первичной профилактике пострадиационных нарушений, тез.докл.конф. «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты, С-П, Изд-во Фолиант, 2004г., с.249-250.

2. Курило Л.Ф., Королев Ю.Н., Никулина Л.А., Гениатулина М.С., Макарова Н.П., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В. Анализ влияния общего облучения на сперматогенез и систему кроветворения крыс. Подходы к первичной профилактике радиационного облучения, приводящей к коррекции индуцированных нарушений II Андрология и генитальная хирургия, №1-2, 2004г., с.64-66.

3. Макарова Н.П., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В. Современные представления о количественном анализе биоптата яичка пациентов с мужским бесплодием и нарушениями сперматогенеза неясной этиологии, 3-я международная медицинская выставка «Мужское здоровье и долголетие-2005», М., с.87-88.

4 Курило Л.Ф., Королёв Ю.Н., Никулина Л.А., Гениатулина М.С., Шилейко JI.B., Остроумова Т.В., Макарова Н.П. Влияние ионизирующей радиации на величину метафазного индекса сперматоцитов I и II порядка самцов нелинейных крыс поколения F" и F1, материалы конф. «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», Дубна, сентябрь 2005г., с.67-69.

5. Макарова Н.П., Королев Ю.Н., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Никулина Л.А., Гениатулина М.С. Пролиферативная активность сперматоцитов первого порядка при воздействии ионизирующего излучения, Томск, конф. "Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения, 20-21 апреля, 2005г., с.115-117.

6. Королев Ю.Н., Макарова Н.П., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Никулина Л.А., Гениатулина М.С. Адаптационные изменения интерстициальной ткани семенников крыс при профилактическом действии лазерного излучения с последующим радиационным облучением, Томск, конф. "Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения, 20-21 апреля 2005г., с.98-99.

7. Макарова Н.П., Курило Л.Ф., Халанский A.C., Гельперина С.Э , Шилейко Л.В. Влияния наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему самцов крыс // тез конф «Молодые ученые в медицине», 26-27 апреля 2005г, г. Казань, с.203.

8. Макарова Н.П., Королев Ю.Н., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Никулина Л.А., Гениатулина М.С Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на ткань семенника при общем радиационном облучении // Андрология и генитальная хирургия, №1, 2005г.,с.23-25.

9 Курило Л.Ф., Макарова Н.П., Шилейко Л.В. Система оценки состояния сперматогенеза человека и млекопитающих // Андрология и генитальная хирургия, 2005г., №4, с.8-17.

10. Курило Л.Ф., Макарова Н.П., Шилейко Л.В., Королев Ю.Н., Никулина Л.А., Гениатулина М.С., Остроумова Т.В. Низкоинтенсивное лазерное излучение как способ защиты дифференцирующихся мужских половых клеток облученных крыс F0 и их потомства F1 // 4-й сборник научных трудов «Актуальные проблемы радиационной биологии и медицины, 2005г., с.58-59.

11. Макарова Н.П., Курило Л.Ф., Гельперина С.Э., Переверзева Э.Р., Халанский A.C., Трещалин И.Д, Шилейко Л.В., Остроумова Т.В. Снижение гаметотоксического эффекта наносомальной лекарственной формы доксорубицина // тез.конф. «Научная сессия МИФИ-2006», 23 янв-27 янв, 2006г., Москва, с. 160-161.

Подписано в печать 19 04.06 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 218 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН

Соискатель

Н.П. Макарова

115478, Москва, Каширское ш., 24

ZOOQh

93 99

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макарова, Наталья Петровна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Сперматогенез у млекопитающих животных. Особенности дифференцировки клеток семенника (на примере крыс).

1.2. Действие повреждающих факторов на мужские половые клетки и гонады млекопитающих животных.

1.2.1. Экспериментальные и клинические исследования гонадо- и гаметотоксического эффекта противоопухолевых препаратов.

1.2.2. Гонадо- и гаметотоксическое действие ионизирующей радиации.

1.3. Подходы к коррекции деструктивных процессов в сперматогенном эпителии и половых клетках, вызванных действием антибиотиков и ионизирующей радиацией.

1.3.1. Антибиотики группы антрациклинов (доксорубицин): механизм действия и выявленная токсичность. Возможность снижения токсичности противоопухолевых препаратов.

1.3.2. НИЛИ: особенности действия на биологическую ткань и возможность использования в качестве способа защиты сперматогенеза от повреждений, вызванных ионизирующей радиацией.

2. Материалы и методы.

2.1. Схемы экспериментов по введению крысам препаратов цитостатического ряда.

2.1.1. Получение наносомальной лекарственной формы доксорубицина.

2.1.2. Токсикологическое исследование наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему млекопитающих.

2.1.3. Схема эксперимента по изучению наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему крыс с интракраниально перевитой глиомой С6.

2.2. Схема экспериментов по изучению воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматогенный эпителий до процедуры общего ионизирующего облучения.

2.3. Гистологическая обработка материала.

2.4. Количественные методы анализа семенников крыс всех экспериментальных групп.

2.5. Статистическая обработка результатов.

3. Результаты собственных исследований.

3.1. Исследование эффекта воздействия антрациклиновых антибиотиков (доксорубицин) на популяцию мужских половых клеток половозрелых крыс.

3.1.1. Изучение влияния наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий половозрелых крыс.

3.1.2. Влияние наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий в процессе

1 химиотерапии крыс с интракраниалыю перевитой глиомой С6.

3.2. Морфофункциональная характеристика ткани семенника при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения перед общим радиационным облучением крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологический анализ сперматогенеза при действии новых противоопухолевых препаратов и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора"

Актуальность исследования

Сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов в организме млекопитающих животных и человека, связанных с клеточной пролиферацией и дифференцировкой. Он протекает под контролем специфических генов и регулируется совокупностью гормонов, цитокинов и факторов роста. Исследователи занимаются проблемой защиты и сохранения половых клеток от негативных влияний различных факторов в силу уникальной роли половых клеток в онтогенезе и в связи с необходимостью развития профилактических мер, направленных на сохранение здоровья потомства. Так, например, основная практическая задача, стоящая перед радиобиологией: выяснение не только механизмов влияния повреждающего фактора (ионизирующей радиации), но и поиск способов предотвращения или ослабления побочных эффектов с помощью природных или искусственных радиопротекторов [Круглова, Карнаухов, 2001]. Разрабатываются новые средства защиты биологических систем от различных типов воздействий и видов излучений при острых и отдаленных последствиях облучения.

Основная задача лекарственного лечения опухолей -разработка способов увеличения эффективности действия противоопухолевых средств и ослабления их побочного повреждающего воздействия. Продолжается поиск лекарственных средств, обладающих большей эффективностью поражать опухолевые клетки, не повреждая при этом здоровые органы и ткани (в том числе репродуктивную систему). Задача сохранения репродуктивного здоровья особенно актуальна для детской онкологии. За последние годы детские онкологи добились значительных успехов относительно онкологических заболеваний, которые раньше считались неизлечимыми. Правильное лечение приводит к выздоровлению ребенка. В настоящее время в мире живут многие тысячи людей, излеченных от онкологических заболеваний в детстве. Однако эти успехи достигаются за счет применения лекарственных препаратов, оказывающих значительное токсическое действие на центральную нервную систему, сердце, печень, почки, иммунную систему, костный мозг и репродуктивную систему. В связи с этим задача снижения побочных эффектов при химиотерапевтическом лечении и лучевой терапии является приоритетной для современной онкологии.

Исходя из вышесказанного возникла необходимость поиска методов защиты половых клеток от:

1) побочного токсического действия противоопухолевых препаратов цитостатического ряда, применяемых при химиотерапии злокачественных новообразований, с помощью химической модификации антибиотика (заключение в наночастицы с дальнейшей обработкой их поверхностно-активными веществами)

2) лучевого поражения с помощью профилактического действия низкоинтенсивного лазерного излучения;

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- Изучить воздействие наносомальной лекарственной формы доксорубицина на половые клетки крыс с интракраниально перевитой глиомой Сб. Сопоставить полученные результаты с состоянием сперматогенного эпителия крыс без глиомы.

- Определить эффект действия низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого до общего радиационного облучения, на процесс сперматогенеза и интерстициальную ткань половозрелых крыс.

Научная новизна

Практическая значимость работы

Результаты, полученные в ходе настоящей работы, углубляют и расширяют существующие представления о повреждающем действии ® антибиотиков антрациклинового ряда на клетки сперматогенного эпителия крыс. Показано профилактическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения как способа коррекции нарушений сперматогенеза, индуцированных ионизирующим облучением, что пополняет знания о действии лазера на биологическую ткань. Это имеет практическое значение для понимания сочетанного действия двух видов излучений: ионизирующего и низкоинтенсивного лазерного.

Согласно ВОЗ доклинические исследования лекарственных препаратов следует проводить, выполняя требования GLP (Good Laboratory Practice) [Брайцева, 2005]. Среди основных требований, выдвигаемых этим важным документом - GLP, стоит необходимость ф определения токсичности в отношении репродуктивных функций, что и было сделано в представленной работе.

Положения, выносимые на защиту

1. Новая наносомальная лекарственная форма доксорубицина обладает меньшей токсичностью для дифференцирующихся мужских половых клеток по сравнению с ® действием свободной формы антрациклинового антибиотика.

Как прослежено в динамике (15-е и 30-е сутки) выраженный токсический эффект доксорубицина проявляется во всех экспериментальных группах, при этом в группе крыс, которым вводили антрациклиновый антибиотик в традиционном водном растворе, дегенеративные процессы в сперматогенном эпителии наиболее выражены.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Макарова, Наталья Петровна

выводы

1. Свободная форма доксорубицина вызывает тяжелую степень нарушения процесса сперматогенеза, что выражено в появлении половых клеток с дегенерирующими ядрами, набухании клеток Сертоли, повреждении собственной оболочки канальцев, частичном опустошении извитых семенных канальцев.

3. Лечение крыс с привитой глиомой С6 новой наносомальной лекарственной формы доксорубицина показало эффективность применения новой формы препарата, что проявляется в снижении некротических изменений в паренхиме семенника.

4. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения до общего радиационного воздействия в область надпочечников позволило снизить негативные последствия радиации на процесс сперматогенеза. Выявлено изменение сперматогенного эпителия средней тяжести у крыс опытной группы по сравнению с животными контрольной группы. Применение НИЛИ приводит к увеличению в 2,5 раза количества клеток Лейдига по сравнению с интактной группой и в 2 раза по сравнению с контрольной, а также к росту площади интерстициальной ткани.

Особая благодарность за неоценимую помощь в выполнении данной диссертационной работы выражается сотрудникам Лаборатории генетики нарушений репродукции ГУ МГНЦ РАМН: ведущему научному сотруднику, к.б.н. Шилейко Л.В. и Остроумовой Т.В.

5. Заключение

Проведенное исследование экспериментально подтвердило возможность защиты мужских половых клеток крыс при действии на организм доксорубицина за счет его химической модификации (заключение в наночастицы и обработка поверхностно-активными веществами) и с помощью НИЛИ при действии ионизирующего облучения в средних дозах.

Как известно, антрациклиновые антибиотики, в частности доксорубицин, и ионизирующее облучение широко используются в практике лечения онкологических заболеваний как отдельно, так и совместно. Поэтому в дальнейшем целесообразно изучить сочетанное действие этих двух факторов на организм млекопитающих, в частности на репродуктивную систему.

Радиопротективный эффект НИЛИ, выявленный при специфических условиях применения лазера (действие через надпочечники), требует дальнейшего экспериментального подтверждения при других контактных областях (например, органы-мишени). Работа в данных направлениях может обеспечить важные клинические преимущества для пациентов онкологических клиник не только при лечении основного заболевания, но и позволит минимизировать последствия действия антрациклиновых антибиотиков и ионизирующего облучения на репродуктивную систему.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарова, Наталья Петровна, Москва

1. Алексеева М.Н., Зубкова С.М., Миненков А.А., Першин С.Б. Устранение стрессорных изменений в тимусе при действии лазерного излучения на эндокринные железы // Бюлл.экспер.биол.-1993. №10.- с.360-361.

2. Алиев А.А., Бабаев М.Ш. Коррекция некоторыми синтетическими и природными антиоксидатами мутационного процесса, возникающего под воздействием ионизирущей радиации // Цитология и генетика.-1994. №5.- с.9-15.

3. Арав В.И., Сыч В.Ф., Железняк Е.В. и др. Влияние пептидов эпифиза на суточную динамику пролиферации сперматогониев белых крыс // Бюлл.экспер.биол.-2004. №6.-с.678-681.

4. Арав В.И., Сыч В.Ф., Железняк Е.В. Влияние эпифизэктомии на суточную ритмичность сперматогенеза // Бюлл.экспер.биол.-2003. №12.-с.683-685.

5. Ахмерова Л.Г., Свечников К.В., Осадчук А.В. Значение генотипа в становлении гормональной функции клеток Лейдига в постнаталыюм онтогенезе в диаллельных скрещиваниях у лабораторных мышей // Генетика.-2002. т.38. №2.- с. 196-206.

6. Байбеков И.М., Мавлян-Ходжаев Р.Ш., Туманов В.П. и др. Влияние низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на заживление дерматомных ран // Бюлл.экспер.биол.-1995. №2.-с.218-220.

7. Богуш Т.А., Шубина И.Ж., Смирнова Г.Б. и др. Прижизненная количественная оценка внутриклеточного распределения доксорубицина в опухолевых клетках // Бюлл.экспер.биол.-1995. №11.- с.518-520.

8. Боровская Т.Г., Гольдберг Е.Д. Влияние антибиотиков антрациклинового ряда на функциональное состояниерепродуктивной системы крыс // Бюлл.экспер.биол.-2000. №11.-с.527-530.

9. Боровская Т.Г., Гольдберг Е.Д., Абрамова Е.В. и др. Влияние хинина на морфологию семенников мыши // Бюлл.экспер.биол.-2000. №9.-с.353-355.

10. Боровская Т.Г., Гольдберг Е.Д., Абрамова Е.В. и др. Влияние хинина на морфологию семенников мыши // Бюлл.экспер.биол.-2000. №10.-с.445-447.

11. Боровская Т.Г., Пахомова А.В., Фомина Т.И. и др. Влияние платиносодержащих цитостатических препаратов на сперматогенез у крыс // Бюлл.экспер.биол.-2001. Прил.№1.-с.23-26.

12. Боровская Т.Г., Смирнова М.Е., Гольдберг Е.Д. Влияние платинсодержащих цитостатических препаратов на потомство крыс // Бюлл.экспер.биол.-1997. № 11.- с.516-519.

13. Брайцева Е.В. Введение в GLP // Биомедицина.-2005.-№1.-с.122-124.

14. Булдаков JI.A., Калистратова B.C. Радиоактивное излучение и здоровье.-М.: Информ-Атом, 2003.-165 с.

15. Быков B.JI. Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы) // Проблемы репродукции.- 2000. №1.- с.6-13.

16. Варфоломеева С.Р., Добреньков К.Б. Проблема антрациклиновой кардиотоксичности в детской онкологии // Вопр. гематологии.-2004. т.З. №2.-с.81-85.

17. Волкова О.В., Боровая Т.Г. Методы количественного анализа в оценке морфофункционального состояния яичника // Арх. анат.-1990. №11.- с.81-84.

18. Ворник Б.М. Мужское бесплодие: проблемы классификации и диагностики // Проблемы репродукции.- 1996. №3.-с.71-75.

19. Воробцова И.Е. Соматические и генетические последствиядействия радиации (сравнительный аспект) // Радиобиология.-1991. №4. т.31.-с.568-570.

20. Воробцова И.Е. Влияние облучения родителей на физиологическую полноценность и риск канцерогенеза у потомства первого поколения организмов разных видов // автореф.дис.докт.биол.наук.-1988.-43с.

21. Ворожейкин В.М., Назыров Ф.Г., Артыков Ш.Н. и др. Язвы желудка на фоне цирроза печени и воздействие на них низкоинтенсивным лазерным излучением инфракрасного диапазона// Арх. патологии.- 1992. №5- с. 15-21.

22. Гацура С.В., Гладких С.П., Титов М.Н. Влияние низкоэнергетического лазерного излучения на размеры экспериментального инфаркта миокарда, пол и сродство гемоглобина к кислороду // Бюлл.экспер.биол.- 2004. №4.-с. 403405.

23. Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г. Гонадотоксические эффекты противоопухолевых препаратов // Бюлл.экспер.биол.-2003. № 3.-с.244-252.

24. Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., Полуэктова М.Е. Влияние противоопухолевых препаратов на потомство // Бюлл.экспер.биол.-2000. № 4.-С.437-439.

25. Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., Фомина Т.И. и др. Морфофункциональное состояние яичников крыс после введения платидиама // Бюлл. экспер.биол.-1996. №11.- с.571-573.

26. Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., Фомина Т.И. и др. Отдаленные эффекты повреждающего действия антибиотиков антрациклинового ряда на репродуктивную систему крыс // Бюлл.экспер.биол.-1996. №1.- с.55-58.

27. Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., Фомина Т.И. и др. Состояние сперматогенеза у крыс после введения антрациклинового антибиотика фарморубицина // Бюлл. экспер.биол.-1995. №3.-с.308-310.

28. Гольдберг Е.Д., Фомина Т.И., Ветошкина Т.В. и др. Морфология печени в ранние и отдаленные сроки после введения противоопухолевых препаратов // Бюлл.экспер.биол.-1998. № 11.-е.561-565.

29. Данилова JI.B. Ультраструктурное исследование сперматогенеза.-М.:Наука, 1978.- 205 с.

30. Дендеберов Е.С. Состояние гематотестикулярного барьера после аллотрансплантации клеток гипофиза в дистопированный семенник// Бюлл.экспер.биол.-2001. №2.-с.232-236.

31. Дранов А. Л., Дудниченко А.С., Мезин И.А. и др. Эффективность липосомальных форм цитостатиков // Бюлл.экспер.биол.- 1996. №1.- с.85-88.

32. Евдокимов В.В., Ерасова В.И. и др. Влияние однократного общего облучения крыс на репродуктивную систему и содержание витаминов в органах у потомства // Бюлл.экспер.биол.-1998. № 12.-с.652-655.

33. Евдокимов В.В., Коденцова В.М. и др. Витаминный статус и сперматогнез крыс в поздние сроки после облучения разными дозами // Бюлл.экспер.биол.-1999. №7.-с.42-44.

34. Егоров В.Е., Москвин С.В., Ульянов В.И. Лазерная медицина: вчера и сегодня // Кремлевская медицина. Клинический вестник.-1999. №4.-с.22-29.

35. Игнатьева Е.Л., Курило Л.Ф. Гаметотоксическое действие окситетрациклина на ранний антенатальный оогенез мышей в экспериментах in vivo и in vitro // Фармакология и токсикология.-1984. №5.-с.75-77.

36. Игнатьева Е.Л., Курило Л.Ф. Гистологическая оценка репродуктивной функции яичников половозрелых мышей после антенатального воздействия окситетрациклином // Бюлл.экспер.биол.-1984. №97. т.5-с.608-610.

37. Кару Т.И., Пятибрат Л.В., Календо Г.С. Влияние излучения Не-Ne лазера на адгезивные свойства клеточной мембраны // Бюлл.экспер.биол.-1993. № 6.-с.622-623.

38. Кация Г.В., Гончаров Н.П. Взаимодействие систем гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников и гипоталамус-гипофиз-гонады // Вестн. АМН СССР.- 1994. №12.-с.44-47.

39. Качков И.А., Биктимиров Р.Г., Захаров А.В. и др. Глиальные опухоли головного мозга: классификация, иммунопатогенез и иммуногенодиагностика // Вестн. АМН СССР.- 2005. №6.-с.36-40.

40. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Евдокимов В.В. Содержание рибофлавина в спермоплазме мужчин // Бюлл.экспер.биол.-2003. №3.-с.299-302.

41. Королев Ю.Н., Общие закономерности развития ультраструктурных реакций при действии электромагнитных излучений // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры.- 1997. №5.-с.З-7.

42. Курило Л.Ф. Подходы к тестированию гонадо- и гаметотоксического эффекта экзогенных факторов // Тезисы докл. междун. конф. по биоэтике.- Пущино.-ИБФМ РАН. 2527/06.-1998.-С.83-84.

43. Курило Л.Ф., Хилькевич Л.В. Современные подходы к изучению гонадо- и гаметотоксического эффекта экзогенных факторов // Медицинская генетика: экспресс-информация.-1989. №9.- с.1-16.

44. Курило Л.Ф., Хилькевич Л.В., Игнатьева Е.Л. Влияние этилового спирта на популяцию ооцитов плода крыса // Акуш. и геникол.-1984.-№7.-с.54-57.

45. Курносова Т.Р., Райцина С.С. Деструкция и регенерация семенных канальцев после локального рентгеновского облучения семенников половозрелых крыс // Онтогенез.-1987,-т.18.№2.-с. 183-191.

46. Куценко С.А. Основы токсикологии.- С-П: 2002.- с. 156-160.

47. Лушников К.В., Шумилина Ю.В., Якушина B.C. и др., Влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высоких частот на процессы воспаления // Бюлл.экспер.биол,-2004. №4.-с. 412-415.

48. Лысенко А.И., Кирпатовский И.Д. Анализ морфологических классификаций повреждений яичка при мужском бесплодии // Арх. патологии.- 1991. т.53. №12.-с.63-66.

49. Мазо Е.Б., Силуянов К.А. Использование локальной низкоинтенсивной лазерной терапии в лечении больных с идиопатическим бесплодием: Тез. докл. 2-я международная медицинская конференция «Мужское здоровье и долголетие». -М.: 2004.-е.83-84.

50. Мамина В.П. Значение гонадотропных гормонов и состояния тироид-адреналовой системы в реакции семенников на облучение // Пробл. репродукции.- 2001. №5.- с.27-29.

51. Мамина В.П. О механизмах действия малых доз ионизирующей радиации на сперматогенный эпителий // Пробл. репродукции.2003. №2.-c.22-24.

52. Москвин C.B., Азизов Г.А. Внутривенное лазерное облучение крови, М.: НИЦ «Матрикс», 2004, с.4-7.

53. Неворотин А.И., Введение в лазерную хирургию: Учебное пособие.-СПб.: Спецлит, 2000.- 175 с.

54. Непомнящих Г.И., Шойёхет Я.Н., Непомнящих JI.M. и др. Патоморфология радиационно-индуцированных изменений в бронхах в отдаленные сроки после воздействия // Бюлл.экспер.биол.-1995, №1.- с.91-95.

55. Нефедов И.Ю. Наследственные последствия облучения обоих родителей (экспериментальное исследование на крысах линии Вистар) // автореф. дис. . д-ра биол. наук.- Обнинск.- 1998.-с.11-12.

56. Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии.-2001.-т.121. №5.- с.464-475.

57. Орлов А.И. О применении статистических методов в медико-биологических исследованиях // Вестн. АМН СССР.- 1987. №2.-с.88-94.

58. Остроносова Н.С. Гепариновый механизм действия низкоинтенсивного лазерного излучения при лечении больных бронхиальной астмой // Иммунология.-2004. №6.-с.355-358.

59. Пакенас П.И. Определение процентного соотношения семенных канальцев и интерстициальной ткани в семенниках // Арх.анат.-1968.-т.ЬУ.№7.-с.110-113.

60. Райцина С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих // «Современные проблемы сперматогенеза». М.: Наука, 1982.-е.73-103.

61. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции.- М.: Наука, 1985.-207с.

62. Райцина С.С., Чуич Н.А., Хлыстова З.С. и др. Образование лимфоцитами человека, морских свинок и крыс розеток со сперматозоидами // Бюлл. экспер. биол.-1977. №4.-с.464-467.

63. Раманаускайте Р.Ю., Абронина И.Ф., Карасева Л.И. и др. Коррекция p-каротином противоопухолевого иммунитета при экспериментальной химиотерапии злокачественных новообразований // Бюлл.экспер.биол.-1994. №9.-с.295-297.

64. Рябчиков О.П., Шмелева С.П., Чуич Н.А. и др. Влияние малых доз радиации на гемопоэз в печени эмбриона и плода человека I триместра беременности // Арх. патологии.- 1995. №2- с.61-63.

65. Сазонов В.Ф. Состояние сперматогенеза и антиспермальный аутоиммунный ответ после кратковременной повторной ишемии семенника у крыс // автореф.канд.биол.наук.-Москва.- 1999.- 24 с.

66. Сергеев П.В., Семейкин А.В., Федотчева Т.А., и др. Исследование комбинированного действия доксорубицина и гестагенов на чувствительные и резистентные к доксорубицину клетки MCF-7 // Бюлл.экспер.биол.-2003. №11.-С.519-522.

67. Ситдикова С.М., Доненко Ф.В., Кабиева А.О., Полоцкий Б.Е., Мороз Л.В. Применение модификаторов множественной лекарственной резистентности для преодоления устойчивости опухолей к цитостатикам в системе in vivo // Бюлл.экспер.биол.- 1996. №4.- с.459-461.

68. Скидан И.Н. Фармакокинетика и химиотерапевтическая активность антрациклиновых антибиотиков, ассоциированных с полимерными наночастицами // автореф. дис. . канд. мед. наук.- Москва.- 2000.- 24с.

69. Скидан И.Н., Гельперина С.Э., Северин С.Е. и др. Повышение активности рифампицина, ассоциированного с наночастицами из полибутилцианоакрилата, в отношении бактерий,локализованных внутри клеток // Антибиот. и химиотер.-2003. т.48. №1.-с.23-26.

70. Субботина Т.И., Хадарцев А.А., Яшин М.А. и др. Влияние высокочастотного низкоинтенсивного облучения на репродуктивную функцию мышей линии C57BI/6 и рандомбредных мышей // Бюлл.экспер.биол.-2004. №12.-с.626-628.

71. СухачеваТ.В., Коломиец O.JL, Лосева Е.Ф. Изучение синаптонемного комплекса мыши после введения камптотецина // Бюлл. экспер.биол.-1998. №1.- с.84-88.

72. Тараховский Ю.С. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия липосом, содержащих ДК-холестерол, с эритроцитами человека // Бюлл.экспер.биол.-1996. т. 122. №7.-с.83-86.

73. Терещенко С.Г., Рогаткин Д.А., Лапаева Л.Г. и др. Дифференциально-диагностическая и лечебная эндоскопия с низкоинтенсивным лазерным излучением на основе биоспектрофотометрии при язвенной болезни //Вестник РАМН.-2005. №5.-с.28-31.

74. Толчева Е.В., Барышников А.Ю., Оборотова Н.А. и др. Анти-С05-иммунолипосомы как транспортная система для направленной доставки лекарственных препаратов к CD5+-клеткам // Росс.биотерапевтич.ж.-2005.т.4. №4.-с.38-43.

75. Туманов В.П., Глущенко Е.В., Серов Г.Г. и др. Влияние лазерного излучения на пролиферативную активность клеток в культуре// Бюлл.экспер.биол.-1994. №3.-с.313-315.

76. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф. Морфометрические методы в оценке функционального состояния семенников //Архив анатомии.- 1983. т.84. №3.-с.66-72.

77. Франкфурт О.С. Клеточные механизмы химиотерапииопухолей.- М.:Медицина, 1976.-390с.

78. Хазанов В.А., Бородина С.А., Смирнова Н.Б. Влияние доксорубицина на окислительное фосфорилирование в митохондриях головного мозга // Бюлл.экспер.биол.-1999. №10.-с.445-447.

79. Хазанов В.А., Соломыкина С.А., Смирнова Н.Б. Влияние доксорубицина in vitro на энергозависимый транспорт кальция митохондриями головного мозга крыс // Бюлл.экспер.биол.-2000. №2.-с.183-185.

80. Хилькевич JI.B. Количественные цитофизиологические подходы к оценке повреждающего воздействия на сперматогенез // Тезисы докладов XII научной конференции болгарских аспирантов в СССР.- М.- 1990.-С.49-50.

81. Хилькевич JI.B., Курило Л.Ф. Гаметотоксический эффект антенатального воздействия тиоТЭФ у мышей // Онтогенез.-1992. №4.т.23-с.401-406.

82. Хилькевич Л.В., Курило Л.Ф. Эффект антенатального воздействия тиоТЭФ на сперматогенез половозрелых мышей линий 101/Н и СВА // Бюлл.экспер.биол.-1992. №9.т.114-С.307-308.

83. Хилькевич Л.В., Курило Л.Ф. Кинетика популяции мужских половых клеток в антенатальном периоде онтогенеза // Онтогенез.-1992.-т.23.№5.-с.506-510.

84. Хилькевич Л.В., Курило Л.Ф., Дубинская В.П. Методы оценки интоксикации в антенатальном периоде развития на сперматогенез // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии».-Купавна.-1990.-c.332.

85. Хилькевич Л.В., Курило Л.Ф., Игнатьева Е.Л. Эффект алкоголя и никотина на мейоз мужских половых клеток в эксперименте //

86. Тезисы докладов II Всесоюзного съезда медицинских генетиков.-Алма-ата.-1990.-c.463.

87. Хилькевич JI.B., Курило Л.Ф., Шевелева Г.А. Эффект антенатального воздействия никотином на мужские половые клетки крыс линии Вистар // Цитология и генетика.-1993. т.27. №2.-с.42-46.

88. Хлусов И.А., Расковалова Т.Ю., Кириенкова Е.В. и др. Влияние надпочечников на кроветворное микроокружение костного мозга // Бюлл.экспер.биол.-1999. №11.-е.586-587.

89. Хлыстова З.С., Шмелева С.П., Калинина И.И. и др. Влияние малых доз радиации на центральные органы эритро- и лимфоцитопоэза плода человека // Бюлл.экспер.биол.-1995. №5.-с.548-551.

90. Цыб А.Ф., Каплан М.А., Ткаченко Н.П. и др. Возможности низкоинтенсивной инфракрасной лазерной терапии атеросклеротических поражений сердечно-сосудистой системы // Вестн. АМН СССР.- 2003. №12.-с.45-52.

91. Черток В.М, Мирошниченко Н.В., Быков Д.В. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на капилляры головного мозга крыс//Бюлл.экспер.биол.-1993. №2.-с.219-221.

92. Черток В.М., Момот Л.М., Каргалова Е.П. Морфофункциональная характеристика капиллярного русла яичника крыс при воздействии низкоинтенсивного лазерного облучения // Бюлл.экспер.биол.-1998. №7.-с.110-112.

93. Чудновский В.М., Леонова Г.Н., Скопинов С.А. и др. Биологические модели и физические механизмы лазерной терапии.- Владивосток: Дальнаука, 2002.- 125с.

94. Шейко Е.А., Шихлярова А.И., Куркина Т.А. Использование низкоинтенсивного красного светового излучения дляповышения противоопухолевой эффективности циклофосфана в эксперименте // Бюлл.экспер.биол.-2004. №12.-с.665-667.

95. Шилин Д. Е., Игнашина Е. В. Использование овариопротекторов при цитостатической терапии у пациенток репродуктивного возраста // Проблемы эндокринологии.- 1999. №6.- с.36-42.

96. Ярмоненко С.П. Новая парадигма комбинированной антиангиогенно-цитотоксической терапии рака // Росс.биотерапевтич.ж.-2005.-т.4.- №4.-с.50-58.

97. Afzelius B. Electron microscopy of the sperm tail. Results obtained with a new fixative // J. Biophys. and Biochem. Cytol.-7.- 959.- 5 (2).-P. 269-278.

98. Allemann E., Gumy R., Doelker E. Drug loaded nanoparticles -Preparation methods and drug targeting issues // Eur. J. Pharm. Biopharrn.-1993.-No.39.-P.173-191.

99. Anderson R., Fassler R., Georges-Labouesse E. et al. Mouse primordial germ cells lacking betal integrins enter the germline but fail to migrate normally to the gonads // Development.- 1999.- vol. 126.- P.1655-1664.

100. Arnon J., Meirow D., Lewis-Roness H. at al. Genetic and teratogenic effects of cancer treatments on gametes and embryos // Hum.Reprod.Update.-2001.-vol.7. No.4.- P.394-403.

101. Baccetti B, Afzelius В A. The biology of the sperm cell // Monogr. Dev Biol.- 1976.-vol.10.- P. 1-254.

102. Ban Y., Asanabe U., Inagaki S., et al. Effect of chlorohydrin on rat sperm motions in relation to male reproductive functions // J.Toxicol.Sci.-1999.-24.-P.407-413.

103. Beck P.H., Kreuter J., Miiller W.E.G. et al. Improved peroral delivery of avarol with polybutylcyanoacrylate nanoparticles // Europ. J. Pharm. Biopharm. -1994.-No.40.-P.134-137.

104. Bendel-Strenzel M.R., Gomperts M., Anderson R et al. The role of cadherins during primordial germ cell migration and early gonad formation in the mouse // Mech Dev.- 2000.- vol. 91.-P. 143-152.

105. Biganzoli L, Piccart MJ: The bigger the better? Or what we know and what we still need to leam about anthracycline dose per course, dose intensity and cumulative dose in the treatment of breast cancer // Ann Oncol.-1997.- vol.8.- P. 1177-1182.

106. Borchard G., Audus K.L., Shi F. et. al. Uptake of surfactant- coated poly (methyl methacrylate)-nanoparticles by bovine brain microvessel endothelial cell monolayers // Int. J. Pharm.-1994.-No.l 10.-P.29-35.

107. Borchard G., Kreuter J. Interaction of serum components with poly(methylmethacrylate) nanoparticles and the resulting body distribution after intravenous injection in rats // J. Drug Target.-1993.-No.l.-P.15-19.

108. Brannon-Peppas L. Recent advances on the use of biodegradablemicroparticles and nanoparticles in controlled drug delivery // Int. J. Pharm.-1995.- No.l 16.-P.1-9.

109. Carreau S. Paracrine control of human Leydig cell and Sertoli cell functions // Folia Histochem Cytobiol.-1996.-vol.34.-P.l 11.

110. Cerelli J.S., Johnson L. Potential daily sperm production, Sertoli cell number, and semineferous tubule characteristics in beef bus fed conventional or gossypol-enriched diet // J.Andrology.-1999.-No4. vol.20.-P.519-528.

111. Chan S., Friedrichs K., Noel D. et al. Prospective Randomized Trial of Docetaxel Versus Doxorubicin in Patients With Metastatic Breast Cancer// J.Clin. Oncol. -1999.- 17.- P.2341-2354.

112. Chan S.Y., Tang LC, Tang G.W. et al. Spermatozoal fertilizing capacity in polyzoospermia: a preliminary study // Andrologia.-1986.- Mar-Apr.-vol. 18(2).-P.208-213.

113. Clermont Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man // Am. J. Anat.-1963.-vol. 112.No. 1 .-P.35-52.

114. Cooke J., Hargreave T. et al. Understading the genes involved in spermatogenesis: a progress report.// Fert. Steril.- 1998.-vol.69.No.6.-P.989-1013.

115. Couvreur P., Dubernet C., Puisieux F. et. al. Controlled drug delivery with nanoparticles: current possibilities and future trends // Eur. J. Pharm. Biopharm.-1995.-No.41.-P.2- 13.

116. Couvreur P., Kante В., Grislain L. et.al. Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles. II. Doxorubicin loaded nanoparticles // J. Pharm. Sci.-1982.-No.71.P.790-793.

117. Couvreur P., Kante В., Lenaerts V. et. al. Tissue distribution of anticancer drugs associated to polyalkylcyanoacrylate nanoparticles //J. Pharm. Sci.-1980.-No.69.-P. 199-202.

118. Couvreur P., Kante В., Roland M. et. al. Adsorption of antineoplastic drugs to polyalkylcyanoacrylate nanoparticles andtheir release in calf serum // J. Pharm. Sci.-1979.-No.68.-P.1521-1524.

119. Couvreur P., Kante В., Roland M. et. al. Polycyanoacrylate nanocapsules as potential lysosomotropic carriers: preparation, morphological and sorptive properties // J. Pharm. Pharmacol.-1979.-No.31.-P.331-332.

120. Couvreur P., Vauthier C. Polyalkylcyanoacrylate nanoparticies as drug carriers: present state and perspectives // J. Controlled Release.-1991 .-No. 17.-P. 187-198.

121. Diemer Т., Desjardins C. Developmental and genetic disorders in spermatogenesis // Hum. Reprod. Updateio-1999.- No.5. vol.2.-P.120-140.

122. Fawcett D.W. The mammalian spermatozoon // Dev Biol.- 1975.-Jun.44(2).-P.394-436.

123. Fawcett D.W., Phillips D.M. The fine structure and development of the neck region of the mammalian spermatozoon//Anal. Rec.- 1969.- 165 (2).-P.153-184.

124. Gabizon R., Catane В., Uziely K. Prolonged circulation time and enhansed accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes // Canser Res. -1994.-54.-P.987-992.

125. Gange J.F., Desormeaux A., Perron S. et. al. Targeted delivery of indinavir to HIV-1 primary reservoirs with immunoliposomes // Biochim. Biophys. Acta.-2002.-vol.1558.-P. 198-210.

126. Gianni L., Vigano L., Locatelli A. et al: Human pharmacokinetic characterization and in vitro study of the interaction between doxorubicin and paclitaxel in patients with breast cancer // J Clin Oncol.-1997.-vol. 15.- P. 1906-1915.

127. Goncharov et al. Testicular endocrine function and spermatogenesis in men after short term radiation exposure in the vicinity of Chernobyl.// Vlth International Congress of Andrology.- Salzburg.j 25-29 May.- 1997.

128. Gorpinchenko et al. Semen parameters of clean-up workers of Chernobyl accident.// Vlth International Congress of Andrology.-Salzburg.- 25-29 May.- 1997.

129. Gordon A.N., Fleagle J.T., Guthrie D. et al. Recurrent Epithelial Ovarian Carcinoma: A Randomized Phase III Study of Pegylated Lyposomal Doxorubicin Versus Topotecan // J. Clin. Oncol.- 2001.19.- P.3312-3322.

130. Gordon A.N., Granai C.O., Rose P.G. et al. Phase II Study of Liposomal Doxorubicin in Platinum- and Paclitaxel-Refractory

131. Epithelial Ovarian Cancer // J. Clin. Oncol. -2000.- 18.- P.30933100.

132. Jassim A. Molecular and ontogenic analysis of the humansperm tail fibrous sheath // Mem.Mus.natn.Hist.nat.- 1995.166.-P.431-436.

133. Jameson J.L. Inherited disorders of the gonadotropin hormones // Mol. Cell Endocrinol.-1996.-vol. 125.-P. 143-149.

134. Jung Т., Kamm W., Breitenbach A. et. al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: Is there a role for polymers to affect mucosal uptake? // Eur. J. Pharm. Biopharm.-2000.-No.50.-P. 147-160.

135. Klauber N, Parangi S, Flynn E, et al: Inhibition of angiogenesis and breast cancer in mice by the microtubule inhibitors 2-methoxyestradiol and Taxol // Cancer Res.-1997.- vol.57.- P.81-86.

136. Kreuter, J. Nanoparticles. in Kreuter, J. (Ed.): Colloidal Drug Delivery Systems // M. Dekker.-New York.- 1994. P.219-342.

137. Kreuter J., Alyautdin R.N., Kharkevich D.A. et. al. Passage of peptides through the blood-brain barrier with colloidal particles (nanoparticles) // Brain Res.-1995.- No.674.-P. 171-174.

138. Kreuter J., Mills S., Davis N. et. al. Polybutylcyanoacrylate nanoparticles for the delivery of 75Se. norcholesterol // Int. J. Pharm.-1983 .-No. 16.-P. 105-113.

139. Lasbet S. Lundsberg, M.B. Bracken at al, Occupationally related magnetic field exposure and male subfertility // Fertil Ster.- 1995.-vol.63.- num.2.- Feb.- P.384-391.

140. Lawson K., Dunn N., Roelen В., Zeinstra L., Davis A., Wright C., Korving J., Hogan В. BMP4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo // Genes Dev.- 1999.-vol.13.- P.424- 436.

141. Lukyanov A.N., Elbayoumi T.A., Torchilin V.P. et. al. Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anti-cancer antibody // J.Control.Release.-2004.-vol.l00.-P.135-144.

142. Miller K.D., McCaskill-Stevens W., Sisk J. et al. Combination

143. Versus Sequential Doxorubicin and Docetaxel as Primary Chemotherapy for Breast Cancer: A Randomized Pilot Trial of the Hoosier Oncology Group // J Clin Oncol.- 1999.- No. 17.- P.3033-3037.

144. Nabholtz JM, Glemon K, Bontenbal M, et al: Multicenter, randomized, comparative study of two doses of paclitaxel in patients with metastatic breast cancer // J Clin Oncol.-1996.- vol. 14.-P.1858-1867.

145. Nakai M., Toshimori K., Yoshinaga K. et al Carbendazim-induced abnomal development of the acrosome // Cell Tissue Res.- 1998. No.294.-P.145-152.

146. Ostro M., Cullls P. R. Use of liposomes as Injectable-drug delivery systems // Amer J of Hospital Pharmacy.- 1989.- No.46.- P. 15761587.

147. Paulson R.B., Shanfeld J, Vorhees Ch.V. et al. Behavioral effects of smokeless Tobacco on the neonate and young Sprague dawley rat // Teratology.-1994.-No.49.-P.293-305.

148. Ramge P, Unger R.E., Oltrogge J.B. et. al. Polysorbate-80 coating enhances uptake of polybutylcyanoacrylate (PBCA)-nanoparticles by human and bovine primary brain capillary endothelial cell // Europ. J. ofNeuroscience.-vol.12 .-No.6.-P.1931.

149. Schafer V., v. Briesen H., Rubsamen-Waigmann H. et.al. Phagocytosis and degradation of human serum albumin microspheres and nanoparticles in human macrophages // J. Microencapsul. -1994.-No.l 1.-P.261-269.

150. Steiniger S.C., Kreuter J, Khalansky AS et. al. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles // Int J Cancer.-2004.-vol. 109(5).-P.759-67.

151. Skidan I., Khalansky A.S., Pereverzeva E.R. et.al. Protection Against Doxorubicin-induced Testicular Toxicity by Poly(butylcyanoacrylate) Nanoparticles // Transact. 31st CRS Meeting.-Honolulu.-2004.-P.591.

152. Steiniger S.C., Kreuter J., Khalansky A.S. et al. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles. // Int J Cancer. -2004,- May l.-vol.l09(5).-P.759-67.

153. Torchilin V.P., Weissig V. Liposomes: A practical approach.-Oxford University Press.-2003.-424P.

154. WylieC. Germ cells//Cell.- 1999.-vol.96.-P. 165-174.

155. Wylie C. Germ cells // Curr Opin Gen Dev.- 2000.- vol.10.-P.410-413.

156. Yaakobi Т., Maltz L., Oron U., Promotion of bone repair in the cortical bone of the tibia in rats by low energy laser (He-Ne) irradiation // Calcif tissue Int.- 1996.- vol.59.- P.297-300.

157. Zambetti M., Moliterni A., Materazzo C. et al. Long-Term Cardiac Sequelae in Operable Breast Cancer Patients Given Adjuvant Chemotherapy With or Without Doxorubicin and Breast Irradiation // J. Clin. Oncol. 2001.- No. 19.- P.37-43.

158. Zimmer A. K., Maincent P., Thouvenot P. et al. Hydrocortisone delivery to healthy and inflamed eyes using a micellar polysorbate 80 solution or albumin nanoparticles // Int. Pharm. -1994.-No.l 10.-P.211-222.

159. Zobel H.P., Kreuter J., Werner D. et. al. Cationic polyhexylcyanoacrylate nanoparticles as carriers for antisense oligonucleotides // Antisense Nucl. Acid Drug Devel.-1997.-No.7.-P.483-493.

Информация о работе

Макарова, Наталья Петровна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Морфологический анализ сперматогенеза при действии новых противоопухолевых препаратов и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы