Восходящая экспериментальная герпесвирусная инфекция семенников и разработка способа восстановления сперматогенеза

Малолина, Екатерина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Восходящая экспериментальная герпесвирусная инфекция семенников и разработка способа восстановления сперматогенеза
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Восходящая экспериментальная герпесвирусная инфекция семенников и разработка способа восстановления сперматогенеза"

На правах рукописи

МАЛОЛИНА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

ВОСХОДЯЩАЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ГЕРПЕСВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ СЕМЕННИКОВ И РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВОССТАНОВЛЕНИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

г 1 ноя 2013

005538498

Москва-2013

005538498

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

Официальные оппоненты: Маныкин Анатолий Анатольевич

доктор биологических наук, профессор, вед. науч. сотр. ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России

Куханова Марина Константиновна

доктор биологических наук, главный научный сотрудник ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «//>> декабря 2013 г. в 12-00 часов на заседании диссертационного совета (Д 208.131.01) ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Д.И. Ивановского» Минздрава России

Автореферат разослан «ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

ФГБУ «НИИ вирусологии

Е.И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время бесплодие в браке является важной проблемой фундаментальной биологии и практической медицины. В мире бесплодием страдают около 16% пар, приблизительно в половине случаев причиной оказывается снижение мужской фертильности. Мужское бесплодие может быть вызвано многими факторами, среди которых инфекции и воспалительные процессы мочеполового тракта занимают одно из первых мест [Тер-Аванесов Г.В., 2004]. Широко распространенными инфекционными агентами в человеческой популяции являются представители семейства Herpesviridae - вирусы простого герпеса (ВПГ) 1 -го и 2-го типа, передающиеся половым путем. Присутствие ВПГ в эякулятах показано во многих исследованиях, однако его влияние на мужскую фертильность до конца не выяснено [Kaspersen М., Hollsberg Р., 2013]. Ряд данных [Бочарова Е.Н. и др., 2007; Науменко В.А. и др., 2011] позволяет предположить, что ВПГ может воздействовать на яички человека и повреждать сперматогенную ткань. Однако прямых доказательств этого пока не получено, что в значительной степени связано с недостатком адекватных моделей инфицирования семенников ВПГ in vivo. В результате крайне ограничены данные о путях проникновения вируса в яички, о степени поражения спер-матогенной ткани, об общем ходе течения инфекции и об ее исходе.

В то же время известно, что вирусные инфекции могут вызывать развитие хронического орхита [Dejucq N., Jégou В., 2001]. Орхит является одной из причин тяжелой формы мужского бесплодия, при которой в яичках отсутствуют зрелые гаметы, а значит, традиционные методы восстановления фертильности неэффективны. В настоящее время успехи в лечении таких форм бесплодия связывают с развитием клеточных технологий [Aponte Р. et al., 2013]. Один из перспективных новых подходов для восстановления мужской фертильности предполагает трансплантацию в поврежденные яички половых и поддерживающих их развитие соматических клеток Сертоли. Источником аутологичных клеток для трансплантации могут быть клетки, выделенные из поврежденных яичек и размноженные в культуре, или клетки, полученные в результате трансдифференцировки соматических клеток пациента; доказательства принципиальной возможности такого подхода недавно появились в литературе [Zhu Y. et al., 2012; Buganim Y. et al, 2013]. Пока способ восстановления сперматогенеза путем трансплантаций клеток находится на стадии разработки и неизвестно, окажется ли он эффективным при клеточной терапии инфекционной патологии яичек человека. Использование трансплантаций клеток для восстановления сперматогенной функции на экспериментальной модели, имитирующей вирусную инфекцию яичек человека, может дать ответ на этот вопрос.

Цель исследования: Изучить воздействие ВПГ на сперматогенез мыши на модели восходящей инфекции и разработать способ восстановления сперматогенной функции после вирусной инфекции семенников. Задачи работы:

1. Разработать модель восходящего пути инфицирования семенников мыши ВПГ.

2. Изучить динамику ВПГ-инфекции семенников и определить локализацию вирусных маркеров в сперматогенной ткани.

3. Оценить воздействие ВПГ на структуру сперматогенного эпителия и дифференцировку половых клеток.

4. Изучить влияние ВПГ на проявление клеточного иммунитета в инфицированных гонадах.

5. Провести экспериментальный анализ эффективности трансплантации клеток семенников неонатальных мышей для возобновления сперматогенеза на примере химически поврежденных гонад.

6. Использовать метод клеточной трансплантации для восстановления сперматогенной функции мышей после заражения семенников ВПГ и оценить его эффективность.

Научная новизна

Разработана модель ВПГ-инфекции семенников половозрелой мыши, имитирующая восходящий путь инфицирования. С помощью этой модели впервые выявлена способность ВПГ инфицировать половые и соматические клетки семенников половозрелых животных ш vivo и установлено, что герпесвирусная инфекция приводит к необратимым нарушениям структуры сперматогенной ткани, гибели половых клеток и остановке продукции мужских гамет. Впервые показано, что восходящая ВПГ-инфекция вызывает развитие воспалительного процесса в семенниках. На модели ВПГ-инфекции семенников мыши впервые разработан способ восстановления сперматогенной ткани с помощью клеточных технологий: показана эффективность использования трансплантаций клеток семенников неонатальных животных для восстановления сперматогенеза. Научно-практическая ценность

Модель ВПГ-инфекции семенников, созданная в ходе выполнения работы, раскрывает возможные пути влияния ВПГ на мужскую фертильность и может быть использована для изучения механизмов развития мужского бесплодия вирусной этиологии. Показана принципиальная возможность использования клеточных технологий для терапии мужского бесплодия вирусной этиологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана модель ВПГ-инфекции семенников половозрелой мыши, имитирующая восходящий путь инфицирования мужских гонад.

2. Вирусные ДНК, белки, а также капсиды и вирионы обнаружены как в половых, так и в соматических клетках семенных канальцев. Установлено, что инфекционная активность и маркеры ВПГ появляются в семенниках уже на 3 сут после заражения, инфекционный процесс достигает максимума на 6 сут и снижается к 10 сут после заражения. На поздних стадиях инфекционная активность вируса не выявляется, но ДНК и белки ВПГ присутствуют в некоторых клетках семенников.

3. Показано, что ВПГ негативно влияет на сперматогенную функцию: в ходе инфекции происходит дегенерация сперматогенного эпителия, гибель половых и соматических клеток семенных канальцев, остановка сперматогенеза; деструктивные изменения необратимы.

4. Доказано, что ВПГ-инфекция семенников приводит к развитию орхита: в интерстиции, начиная с ранних сроков инфекции, наблюдаются проявления воспалительного процесса, накапливаются СВ4+ и СБ8+ Т-лимфоциты и макрофаги.

5. На модели необратимого химического нарушения сперматогенеза показана эффективность способа восстановления сперматогенной функции путем трансплантации клеток семенников неонатальных мышей.

6. Установлено, что трансплантация клеток неонатальных мышей в семенники взрослых животных, необратимо поврежденные в ходе ВПГ-инфекции, приводит к восстановлению сперматогенной ткани и образованию высоко дифференцированных половых клеток.

Апробация результатов исследования

Основные положения работы были представлены на 5-й междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2012); на 11-м Российском научно-образовательном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2013); на 23-й ежегодной конференции Общества вирусологов (Киль, 2013) и на 5-м конгрессе Европейского общества вирусологов (Лион, 2013). В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России 26 сентября 2013 г. Публикации

По материалам исследования опубликовано 7 работ, из них 3 - в журналах, рекомендуемых ВАК России.

Личный вклад автора

Основные результаты получены лично автором. Ультраструктурные исследования проведены автором совместно со ст. науч. сотр. к.м.н. Науменко В.А. и вед. науч. сотр. к.б.н. Гущиной Е.А. (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России). Конфокальная микроскопия и цитофлуориметрический анализ проведены автором совместно с науч. сотр. к.б.н. Кулибиным А.Ю. (ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН).

Объем и структура диссертации

Материал диссертации изложен на 128 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 25 рисунками, содержит 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 144 источника (11 отечественных и 133 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе использовали половозрелых 2-3-месячных самцов мышей линии С57В1/6 из питомника лабораторных животных «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН, а также 2-5-суточных мышей мужского пола линии Rosa26, полученных на основе С57В1/6 и экспрес-сирующих во всех клетках трансген LacZ. Мыши линии Rosa26 были любезно предоставлены докт. биол. наук А.Н. Томилиным (Институт цитологии РАН).

Вирус. В работе использовали штамм F ВПГ 1-го типа, полученный из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. ВПГ пассировали на культуре клеток почечного эпителия зеленой мартышки линии Vero, полученной из лаборатории культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Для определения инфекционного титра ВПГ в лунки 96-луночного планшета на монослой клеток Vero наносили последовательные десятикратные разведения ВПГ. Через 24 ч с помощью микроскопа подсчитывали количество очагов инфицированных клеток (бляшек) в тех лунках, которые были инфицированы наибольшим разведением ВПГ, еще проявляющим цитопатическое действие. Инфекционный титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Инфицирование семенников мышей ВПГ. Для инфицирования семенников половозрелых мышей ВПГ использовали методику, описанную Ogawa Т. et a!. (1997), с модификациями. Животное наркотизировали путем внутрибрюшинного введения хлорал гидрата (400 мг/кг), в надрез кожи и брюшины в нижней абдоминальной части тела выводили семенники. В стеклянный капилляр (толщина кончика 60 мкм), соединенный с поршневым инъектором, набирали 15 мкл вируссодержащей жидкости: среды Игла MEM, в которой

находилось либо 102, либо 104 БОЕ ВПГ (низкая и высокая дозы). Под контролем стереоскопического бинокулярного микроскопа МБС-10 (РФ) кончик капилляра вводили в выносящий каналец семенника и продвигали в сеть семенника - rete testis. По капилляру жидкость инъецировали в rete testis, откуда она расходилась в семенные канальцы. Точность и степень заполнения канальцев контролировали с помощью подкрашивания инъецируемой жидкости витальным красителем трипановым синим (0,02%). Необходимо отметить, что обе используемые в эксперименте дозы вируса были небольшими. Так, в случае инфицирования высокой дозой ВПГ на каждую клетку семенных канальцев приходилось только около Ю 3 БОЕ, в случае инфицирования низкой - около 10 s БОЕ. В качестве контроля использовали мышей, которым в семенники инъецировали среду без ВПГ.

Гибридизация in situ. Семенники мышей на 2, 3, 6 и 45 сут после заражения низкой дозой ВПГ (по 3 образца на срок) фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФА) 24 ч, затем после стандартной гистологической проводки заключали в парафин и готовили срезы (4 мкм). Для проведения гибридизации in situ использовали зонд ДНК ВПГ и систему детекции фирмы Enzo Life Sciences (США) согласно протоколам производителя, а также гибридайзер Biometra Thermocycler TI (Германия). Окрашенные срезы анализировали с помощью микроскопа Keyence BZ-9000 (Япония).

Шшунофлуоресцентный анализ. Семенники мышей на 3, 6, 10, 14, 21 и 45 сут после инокуляции ВПГ (по 3-5 образцов на срок) заключали в криосреду и замораживали. С помощью криостата Leica СМ 1900 (США) готовили срезы толщиной 4 мкм для эпифлуорес-центной микроскопии, и 25 мкм - для конфокальной. Срезы фиксировали в 4% ПФА 10 мин и проводили иммунофлуоресцентную окраску по стандартным методикам. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела (МКА) к белку ВПГ-1 gB, полученные в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского; кроличьи поликлональные антитела (ПКА) Anti-HSVl (Abeam, Великобритания) и кроличьи ПКА к маркеру клеток Сертоли Wtl (LifeSpanBiosciences, США); в качестве вторичных антител - кроличьи антимышиные ФИТЦ-конъюгированные (Dako, Дания); ослиные антикроличьи ФИТЦ- и Alexa Fluor 594-конъю-гированные антитела (Jackson ImmunoResearch, США). Ядра клеток докрашивали DAPI или пропидия йодидом. Препараты анализировали на эпифлуоресцентном микроскопе Leica DM-RXA2 и конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 STED. Конфокальную микроскопию осуществляли на базе центра коллективного пользования (центр оптических методов исследований) при ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. На 3 срезах с каждого семенника подсчитывали общее количество семенных канальцев, количество семенных канальцев, окрашивающихся на gB ВПГ и на Wtl клеток Сертоли.

Электронная (ЭМ) и иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Для ЭМ фрагменты семенников (2-3 мм3) и осадки эпидидимальных сперматозоидов мышей на 3 и 6 сут после инокуляции ВПГ фиксировали 24 ч в 2,5% глутаровом альдегиде с постфиксацией в 1% 0s04 в течение 40 мин и заключали в смолу Ероп-812 по стандартной методике. Для ИЭМ образцы фиксировали в смеси 0,1% глутарового альдегида и 4% ПФА 40 мин и заключали в смолу LR White. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3 (Швеция). Для ИЭМ срезы окрашивали кроличьими ПКА к белку ВПГ-1 VP 16 (Abeam) и Anti-HSVl, следуя протоколу фирмы-производителя, в качестве вторичных антител использовали ослиные антикроличьи антитела, конъюгированные с частицами коллоидного золота (Abeam). Срезы контрастировали в уранил ацетате и цитрате свинца и анализировали с помощью электронного микроскопа JEM-100 S (Япония). Ультраструктурные исследования проводили на базе лаборатории структуры и морфогенеза вирусов (руководитель лаборатории - профессор, академик РАМН Клименко С.М.).

Быстрый культуральный метод (БКМ). Гомогенаты семенников мышей на 3, 6, 10, 14, 21, 45 и 100 сут после инокуляции ВПГ (по 3-5 образцов на срок) наслаивали на монослой клеток Vero и инкубировали 1 ч при 37°С в атмосфере 5% С02. Затем клетки промывали и культивировали в течение 24 ч, далее фиксировали ацетоном 30 мин и проводили реакцию иммунофлуоресценции с помощью первичных МКА к gB и вторичных кроличьих антимышиных ФИТЦ-конъюгированных антител. Анализ препаратов проводили на микроскопе Olympus ВХ51 (Япония). О присутствии инфекционно-активного вируса судили по положительному окрашиванию клеток и бляшек на gB ВПГ.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦРрв). ДНК выделяли из гомо-генатов семенников мышей на 3, 6, 10, 14, 21, 45 и 100 сут после инокуляции ВПГ (по 3-5 образцов на срок) с помощью комплекта реагентов ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ Роспотребнадзора), следуя рекомендациям производителя. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали комплект реагентов АмплиСенс® HSV I, II-FL (ЦНИИЭ). Амплификацию и учет результатов проводили с помощью прибора QIAGEN Rotor-Gene Q5 (Германия).

Гистологический анализ. Семенники мыщей на 3, 6, 14, 21,45 и 100 сут после инокуляции ВПГ (по 3-5 образцов на срок) фиксировали в модифицированном фиксаторе Дэвидсона 24 ч, после стандартной гистологической проводки заключали в парафин и готовили гистологические срезы (7 мкм). Срезы депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты анализировали с помощью микроскопа Keyence BZ-9000. На 3 срезах с каждого семенника подсчитывали общее количество семенных канальцев и определяли долю морфологически нормальных семенных канальцев.

Проточная цитофлуориметрия. Использовали по 5-8 семенников мышей на 10 и 21 сут после заражения низкой дозой ВПГ и по 3-4 семенника контрольных мышей.

Суспензию интерстициальных клеток получали путем 15-минутной инкубации семенников в коллагеназе IV (0,7 мг/мл) при 37°С. Супернатант осаждали центрифугированием (400 g, 10 мин), лизировали эритроциты с помощью инкубации в буфере 160 мМ NH4C1 170 мМ Tris-НС1 (рН 7.2), подсчитывали число клеток и окрашивали в течение 40 мин при 4°С фикоэритрин-конъюгированными антителами к белкам-маркерам CD8+ (CD8a), CD4+ Т-лимфоцитов (CD4) и макрофагов (F4/80) (BioLegend, США). Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре CellLabQuanta SC (Beckman Coulter, США). Цитофлуориметрический анализ осуществляли на базе центра коллективного пользования (центр клеточных технологий) при ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Получение суспензии клеток семенников для трансплантаций. В качестве источника клеток для трансплантаций использовали семенники 2-5-суточных мышей линии Rosa26. Семенники инкубировали в растворе коллагеназы IV (0,7 мг/мл) с ДНКазой I (0,04%) в течение 15 мин, затем в растворе трипсина (0,25%) с 1 мМ ЭДТА - 15 мин. Полученную клеточную суспензию осаждали центрифугированием (400 g, 10 мин). Осадок ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 2,5% сыворотки, ДНКазу I (2мг/мл), 0,02% трипановый синий; концентрация клеток в суспензии составляла 4,3 х 107кл./мл.

Трансплантация клеток в семенники мышей, нарушенные в результате действия химических агентов. Для нарушения сперматогенеза мышам линии С57В1/6 внутрибрюшинно вводили бусульфан (45 мг/кг), а затем, через 30 сут, в их семенные канальцы через rete testis инъецировали по 15 мкл раствора сульфата кадмия (0,46 мг/мл). Через 14 сут в семенники мышей-реципиентов вводили по 25 мкл суспензии клеток семенников мышей линии Rosa26. Клетки вводили либо в интерстициальную ткань семенника, либо в семенные канальцы; каждым способом было инъецировано по 5 семенников. Отбор материала проводили через 45 сут после трансплантации.

Трансплантация клеток в семенники мышей, зараженные ВПГ. В качестве реципиентов использовали мышей на 21 сут после заражения низкой дозой ВПГ. Начиная с 3 сут до трансплантации и в течение 3 сут после трансплантации, части мышей-реципиентов вместе с питьевой водой давали ацикловир (АЦ) в дозе 170 мг/кг в сутки, рассчитанной по методике [Field H.J., De Clercq Е., 1981]. Для проверки действия АЦ часть животных забивали на 3 сут после трансплантации, их семенники анализировали БКМ и иммунофлуоресцентным методом. Остальных мышей, не получавших АЦ, забивали на 30 сут; отбор материала у мышей, получавших АЦ, проводили на 30, 60 и 150 сут после трансплантации.

Анализ результатов трансплантаций. Для идентификации клеток донора в семенниках мышей-реципиентов проводили окраску на продукт трансгена LacZ фермент р-галактозидазу. Для этого семенники 1,5 ч фиксировали в 4% ПФА при 4°С, промывали 3 раза по 30 мин в

буфере: 40 мМ NaH2P04 х Н20, 170 мМ Na2HP04, 2мМ MgCl2, 0,02% игепал, 0,01% диок-сихолат натрия (рН 8.3), затем переносили в смесь, состоящую из отмывочного буфера, 5 мМ K3Fe(CN)6,5 мМ K4Fe(CN)6 х ЗН20 и 1 мг/мл 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactoside (x-Gal), и инкубировали в ней в темноте при 37°С 24-36 ч. В результате клетки доноров окрашивались в синий цвет. Далее семенники фиксировали в 4% ПФА 1-2 сут, заключали в парафин по стандартной методике и готовили срезы (7 мкм), которые окрашивали 1% раствором нейтрального красного и анализировали с помощью микроскопа Keyence BZ-9000. На 10 срезах с каждого семенника подсчитывали число семенных канальцев реципиента и число новых семенных канальцев, образованных клетками доноров.

Статистический анализ результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ STATISTICA 8.0. Для сравнения количественных данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Герпесвирусная инфекция семенников половозрелых мышей in vivo

По данным экспериментов на мышах [Tebourbi L. et al., 2001; Burgos J. et al, 2005] гемато-тестикулярный барьер, находящийся в семенниках половозрелых животных на границе семенных канальцев и интерстиция, препятствует проникновению герпесвирусов к половым клеткам со стороны кровеносных сосудов. Это позволило предположить, что наиболее вероятный путь заражения семенников вирусом - не через кровь, а восходящий, через семявынося-щие пути, далее эпидидимис и сеть семенника rete testis. Для проверки этого предположения в работе была разработана модель инфекции семенников мыши ВПГ, имитирующая восходящий путь инфицирования.

1.1. Локализация ВПГ в инфицированных семенниках

С помощью метода гибридизации in situ было показано, что первые сигналы ДНК ВПГ появлялись в семенниках на 2 и 3 сут инфекции в небольшом количестве семенных канальцев, они локализовались в ядрах сперматоцитов, некоторых округлых сперматид (рис. 1а) и клеток Сертоли. Более сильные сигналы вирусной ДНК детектировали на 6 сут инфекции в ядрах клеток у базальной мембраны семенных канальцев - клеток Сертоли и сперматогониев, и в ядрах сперматоцитов (рис. 16). ДНК ВПГ была выявлена также в отдельных удлиняющихся сперматидах (рис. 1в). В поздний период инфекции (45 сут) вирусная ДНК присутствовала в ядрах некоторых клеток Сертоли и интерстициальных клеток. Гибридизационная метка никогда не выявлялась в семенниках контрольных мышей.

Окраска срезов семенников на 6 сут инфекции ПКА к поздним белкам ВПГ (антитела АгШ-Н5У1) показала, что вирусные белки в семенниках располагаются исключительно в семенных канальцах. Часто на вирусный белок окрашивались целые группы клеток у базальной мембраны семенных канальцев (рис. 2а), в состав групп входили клетки Сертоли, спермато-гонии и сперматоциты. В большинстве инфицированных семенных канальцев белки ВПГ выявляли во всех слоях сперматогенного эпителия (рис. 26), но, как правило, более яркая окраска наблюдалась в клетках у базальной мембраны. В семенниках контрольных мышей вирусные белки детектированы не были.

С помощью ЭМ в семенных канальцах инфицированных ВПГ мышей были обнаружены вирусные частицы (капсиды типов А, В и С и полные вирионы, плотные тельца). Капсиды ВПГ находились в ядрах клеток Сертоли (рис. За, б), сперматоцитов (рис. За, в), сперматогониев и в цитоплазматических каплях удлиняющихся сперматид (рис. Зг, д). По данным ИЭМ, антиген ВПГ выявляли в капсидах, плотных тельцах и полных вирионах, находящихся в семенных канальцах. В семенниках контрольных мышей ВПГ на ультраструктурном уровне не был обнаружен.

Таким образом, первыми клетками, которые инфицировал ВПГ в семенных канальцах, были сперматоциты, далее вирус перемещался к базальной мембране канальцев и заражал сперматогонии и клетки Сертоли. Кроме того, ВПГ оказался способен инфицировать и гаплоидные половые клетки. На ранние сроки инфекции ВПГ не обнаруживали в интерстициальной ткани, что свидетельствует о непроницаемости гемато-тестикулярного барьера для ВПГ. 1.2. Динамика ВПГ-инфекции в семенниках

По данным БКМ инфекционно-активный вирус присутствовал в семенниках мышей, зараженных низкой и высокой дозами ВПГ, с 3 по 10 сут инфекции, редко выявлялся на 14 сут инфекции (в 1 из 3 проанализированных семенников, инфицированных низкой дозой ВПГ) и отсутствовал на 21,45 и 100 сут после заражения. В то же время ДНК ВПГ, по данным ПЦРрв, выявляли в семенниках мышей, инфицированных обеими дозами ВПГ, на всех сроках инфекции - от 3 до 100 сут. В семенниках контрольных мышей инфекционную активность и ДНК ВПГ не обнаруживали.

Развитие ВПГ-инфекции было прослежено с помощью подсчета семенных канальцев, окрашивающихся МКА к вирусному белку §В, на срезах семенников на разные сроки после инъекции ВПГ. Оказалось, что динамика инфекции сходна как для низкой, так и для высокой дозы ВПГ (рис. 4). В обоих случаях первые семенные канальцы, в сперматогенном эпителии которых выявлялся вирусный белок §В, появлялись уже на 3 сут после инокуляции ВПГ и составляли 4,4% для низкой дозы ВПГ и 5,4% для высокой дозы. Их процент по отношению к общему числу семенных канальцев на гистологический срез достигал максимума на 6 сут

(а) А * '№

-Г' •¿. Г ЩШ <к \

Г - М к jp ^ Ш /

ш Щ 1

*Г

(в) j " ' /

* •

JB • -. .

• *

Рис. 1. Локализация ДНК ВПГ в семенниках на 3 (а) и 6 сут (б, в) ВПГ-инфекцин.

Гибридизация in situ. Коричневая окраска -гибридизационный сигнал, ядра клеток докрашены гематоксилином. Головки стрелок — сперматоциты, стрелки — округлые сперматиды, звездочки —удлиняющиеся спер-матиды. Масштаб: 20 мкм.

Рис. 2. Локализация белка ВПГ в семенниках на 6 сут инфекции. Белок ВПГ в группах клеток у базальной мембраны (а) и во всех слоях сперматогенного эпителия (б). Иммунофлу-оресцентная окраска ПКА АпИ-Н5У1 (зеленый). Ядра клеток докрашены пропидия йодидом (красный). Конфокальная микроскопия. Масштаб: 40 мкм для (а), 100 мкм для (б).

Рис. 3. Вирусные частицы в базалыюм (а-в) и адлюминальном (г, д) компартментах спер-матогенного эпителия. Электронная микросокпия. Стрелки - капсиды ВПГ; 1 - базальная мембрана, 2 - интерстиций, 3 - клетка Сертоли, 4 - сперматоцит, 5 - удлиняющаяся спер-матида. Масштаб: 5 мкм для (а, г), 1 мкм для (б, в, д).

Рис. 4. Динамика распространения ВПГ в семенниках. По оси ординат: доля канальцев, содержащих вирусный белок g£, %. По оси абсцисс: время после заражения, сутки. * - отличие от более раннего и более поздних сроков инфекции статистически значимо (р<0,05).

Сутки

Рис. 5. Общий план инфицированного семенника на пике ВПГ-инфекции. Высокая доза ВПГ, 6 сут инфекции. Иммунофлуоресцентная окраска МКА против вирусного белка gB (зеленый). Ядра клеток докрашены ИАР1 (синий). Масштаб: 300 мкм.

Рис. 6. Морфологические изменения в семенниках при ВПГ-инфекции. Срезы семенников мышей на 3 (а), 6-10 (б), 14-21 (в) и 45-100 (г) сут инфекции; (д) - срез семенника контрольной мыши. Д - клеточный дебрис, ДСЭ - дезорганизация сперматогенного эпителия, М - гигантские многоядерные сперматиды, П - пикнотические ядра, головки стрелок -поврежденные клетки Сертоли. Окраска: гематоксилин и эозин. Масштаб: 40 мкм для (а), 20 мкм для (б), 100 мкм для (в-д).

■•.'.'••У''

РАР1__\У11

(а) ' ' ' -г - ■ , '. 'у- ' к - С---- (б) "

(В) - •у--. , (I)

Рис. 7. Гибель клеток Сертоли в семенниках при ВПГ-инфекции. Срезы семенников контрольных мышей (а, б) и мышей на 14 сут инфекции (в, г). Иммунофлуоресцентная окраска против маркера клеток Сертоли №И (зеленый). Ядра клеток докрашены йАР1 (синий). Масштаб: 200 мкм.

Рис. 8. Макрофаги на 6 сут ВПГ-инфекции семенников. Срез семенника (а) и содержимое эпидидимиса (б). Электронная микроскопия. 1 - базаль-наямембрана, 2- интерстиций, 3-макрофаги, 4 - головки сперматозоидов. Масштаб: 20 мкм для (а), 5 мкм для (б). 15

а о н

<ч

Ьй

о ч

гг

8 6 4 2 -

С04+

Контроль I 10 сут инфекции 121 сут инфекции

}

СР8+

макрофаги

лимфоциты

Рис. 9. Количественный цитофлуориметрический анализ Т-лимфоцитов и макрофагов при воспалении в ВПГ-инфицированном семеннике мыши. * - отличие от контроля статистически значимо (р<0,05), # — отличие от 10 сут инфекции статистически значимо (р<0,05).

Рис. 10. Результаты трансплантации клеток семенников неонатальиых мышей в семенники половозрелых животных с химически нарушенным сперматогенезом. Новые канальцы (НК) (а), сперматогенный эпителий в НК (б). КС ~ клетки Сертоли, СП - сперматоциты, УС - удлиняющиеся сперматиды. Гистохимическая окраска на продукт гена Ьас! (синий); срезы докрашены нейтральным красным. Масштаб: 100 мкм для (а), 25 мкм для (б).

(а)

(б)

■' * * в

Рис. 11. Локализация белка ВПГ в семенниках на 3 сут после трансплантации клеток.

Срезы семенников мышей, не получавших (а) и получавших (б) ацикловир. * - семенные канальцы с ВПГ-меткой. Иммунофлуоресцентная окраска ПКА Anti-HSV] (зеленый). Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Масштаб: 200 мкм.

Рис. 12. Результаты трансплантации клеток семенников неонатальных мышей в семенники половозрелых животных, нарушенные ВПГ. Новые канальцы в канальцах реципиента (а) и в интертиции (б), сперматогенный эпителий в них (в, г). ОС - округлые, УС- удлиняющиеся сперматиды, СП - сперматоциты. Гистохимическая окраска на продукт гена ЬасХ (синий); срезы докрашены нейтральным красным. Масштаб: 100 мкм для (а, б), 50 мкм для (в), 10 мкм для (г).

инфекции (18,0 и 23,5%) (рис. 4, 5), снижался на 10 сут (3,8 и 5,5%) и продолжал оставаться на низком уровне на 14 сут (5,8 и 5,4%). Через 21, 45 и 100 сут после начала инфекции gB в семенниках не обнаруживался.

В то же время использование для окраски ПКА к комплексу белков ВПГ (антитела Anti-HSV1) позволило выявить слабые флуоресцентные сигналы в некоторых семенных канальцах и в небольшом количестве интерстициальных клеток на 21 и 45 сут. По-видимому, белки ВПГ присутствовали в инфицированных семенниках на протяжении всего эксперимента, но на поздних сроках инфекции - в очень небольшом количестве. Вирусная ДНК, по данным ПЦРрв и гибридизации in situ, также оставалась в семенниках до конца эксперимента, однако инфекционная активность исчезала через 14—21 сут после заражения.

Таким образом, можно заключить, что на поздних сроках после заражения ВПГ-инфекция в семенниках переходила в абортивную форму: вирусная ДНК по-прежнему находилась в ядрах некоторых клеток семенников, с нее продолжала экспрессироваться часть вирусных генов, но инфекционно-активные вирусные частицы не образовывались, и дальнейшего распространения вируса не происходило. Нужно отметить, что на поздних сроках инфекции в интерстиции выявляли в небольших количествах вирусные ДНК и белки. Это указывает на то, что к этому периоду гемато-тестикулярный барьер семенных канальцев был уже сильно поврежден действием ВПГ.

1.3. Воздействие ВПГ-инфекции на сперматогенную ткань

Все мыши, инфицированные ВПГ в низкой и высокой дозе, оставались живыми на протяжении всего эксперимента и не проявляли никаких видимых клинических признаков ВПГ-инфекции. Однако у семенников инфицированных животных появлялись различные макроскопические признаки нарушения, в том числе снижалась их масса по сравнению с контролем. Начиная с 14 сут инфекции, показатели массы семенников инфицированных и контрольных мышей различались статистически значимо (р<0,05), в итоге на 100 сут после заражения масса семенников, инфицированных низкой и высокой дозой ВПГ, была равна 35,2 и 33,2 мг соответственно, против 151,0 мг в контроле. На 14 и 45 сут инфекции масса семенников, зараженных низкой дозой ВПГ, была выше массы семенников, зараженных высокой дозой (р<0,05), что свидетельствует о дозозависимом негативном эффекте вируса.

С 3 по 14 сут инфекции в канальцах придатков семенников - эпидидимисов практически не встречались морфологически нормальные подвижные сперматозоиды, но присутствовало много незрелых половых клеток с явными признаками дегенерации. Начиная с 21 сут, из эпидидимальной жидкости исчезали сперматозоиды и не обнаруживались до конца эксперимента. У контрольных мышей, напротив, подвижные сперматозоиды выделяли из эпидидими-са на протяжении всего эксперимента.

Гистологический анализ показал, что первые деструктивные изменения - слущивание половых клеток в просвет семенных канальцев, блок сперматогенеза, дезорганизация спер-матогенного эпителия (рис. 6а) - появлялись на 3 сут после введения ВПГ. К 6-10 сут инфекции деструкция семенных канальцев усиливалась, многие половые клетки и клетки Сертоли были повреждены, в канальцах встречались клетки с пикнотическими ядрами и гигантские многоядерные сперматиды (рис. 66). На 14 и 21 сут инфекции большая часть семенных канальцев была атрофирована, во многих семенных канальцах отсутствовали не только половые клетки, но и клетки Сертоли, просветы канальцев заполнялись клеточным дебрисом (рис. 6в). На 45 и 100 сут инфекции сперматогенная ткань была почти полностью заменена соединительной (рис. 6г), в редких оставшихся семенных канальцах сперматогенез был блокирован на разных стадиях. В семенниках контрольных животных подобных нарушений выявлено не было (рис. 6д).

По данным количественного анализа доля морфологически нормальных канальцев в инфицированных ВПГ семенниках статистически значимо (р<0,05) снижалась с 67% и 76% (для высокой и низкой доз ВПГ соответственно) на 3 сут после заражения до 6% и 15% - на 14 сут. В дальнейшем этот показатель продолжал оставаться на низком уровне. В случае инфицирования высокой дозой ВПГ снижение числа нормальных канальцев на 3 и 6 сут после заражения происходило быстрее, чем при инфицировании низкой дозой ВПГ (67% и 23% против 76% и 55%,р<0,05).

Для того чтобы оценить влияние ВПГ на клетки Сертоли было проведено иммунофлуо-ресцентное окрашивание срезов семенников на маркер клеток Сертоли \УИ (рис. 7). Показано, что в контроле клетки Сертоли присутствуют во всех семенных канальцах, в то время как на 14 сут после заражения ВПГ только 48,8% канальцев в случае низкой дозы вируса и 59% в случае высокой - содержат клетки Сертоли.

Таким образом, ВПГ-инфекция семенных канальцев вызвала широкий спектр морфологических нарушений сперматогенного эпителия, семенные канальцы атрофировались и замещались соединительной тканью, полностью прекращалась продукция сперматозоидов. Все дегенеративные изменения были необратимы, о чем свидетельствует и значительное сокращение в ходе инфекции невозобновимой популяции клеток Сертоли. 1.4. Развитие орхита в ходе ВПГ-инфекции

По данным гистологического и ЭМ анализов, начиная с 3 сут инфекции, в интерстици-альной ткани рядом с поврежденными семенными канальцами появлялись обширные лейкоцитарные инфильтраты. Макрофаги располагались непосредственно у базальной мембраны поврежденных семенных канальцев (рис. 8а), некоторые из них начинали проникать в канальцы. Кроме того, большое количество макрофагов обнаруживали при анализе эпидидимальной

жидкости, до 20% сперматозоидов в эпидидимисе находилось внутри фагосом макрофагов (рис. 86).

С помощью проточной цитофлуориметрии оценивали содержание лейкоцитов в семенниках, зараженных низкой дозой ВПГ. По данным, представленным на рис. 9, видно, что на 10 сут инфекции число СБ4+, СБ8+ Т-лимфоцитов и макрофагов в инфицированных семенниках в десятки раз выше, чем в контрольных. На 21 сут число СБ8+ Т-лимфоцитов снижается до контрольного уровня, число С04+ Т-лимфоцитов также значительно снижается, в то же время содержание макрофагов продолжает оставаться высоким.

Можно предположить, что к снижению иммунологической толерантности семенников и развитию в интерстиции активного воспалительного процесса привели нарушение баланса про-и противовоспалительных цитокинов, продуцируемых Т-клетками, и повреждение клеток Сертоли в ходе ВПГ-инфекции. Однако на ранние сроки инфекции гемато-тестикулярный барьер еще не был поврежден, и часть клеток Сертоли продолжала нормально функционировать. Поэтому лейкоциты не могли пройти внутрь семенных канальцев, где находился вирусный антиген. В результате ВПГ продолжал беспрепятственно реплицироваться, уничтожая сперма-тогеннный эпителий. Когда гемато-тестикулярный барьер был разрушен из-за действия ВПГ, лейкоциты подавили активную вирусную инфекцию, но нарушения сперматогенной ткани были уже необратимы.

2. Восстановление необратимо поврежденного сперматогенеза с помощью трансплантации клеток

ВПГ-инфекция семенников мыши может рассматриваться как модель мужского бесплодия, обусловленного развитием вирусного орхита, и может быть использована для разработки новых способов восстановления сперматогенеза на основе клеточных технологий. В семенных канальцах существуют две популяции клеток, необходимые для регенерации сперматогенного эпителия: стволовые сперматогониальные клетки - предшественники всех дифференцированных половых клеток, и клетки Сертоли, необходимые для формирования структуры семенных канальцев и поддержания дифференцировки половых клеток. Совместные трансплантации этих двух типов клеток в поврежденные семенники - один из наиболее перспективных новых подходов.

2.1. Восстановление сперматогенеза, нарушенного действием химических агентов

Эффективность способа восстановления сперматогенеза с помощью трансплантации клеток была первоначально изучена на модельной системе химического нарушения семенников, описанной в работе БЫпоЬага Т. е! а!. (2003). В семенники половозрелых мышей, поврежденные введением бусульфана и сульфата кадмия, трансплантировали суспензии

клеток семенников 2-5-суточных трансгенных мышей линии Яо$а26, содержащие стволовые

сперматогониальные клетки и клетки Сертоли. Через 45 сут после трансплантации клетки доноров идентифицировали с помощью окраски на продукт трансгена Ьас2.

В случае внутриканальцевой трансплантации клетки доноров обнаруживали во множестве семенных канальцев реципиентов. Клетки Сертоли доноров формировали новые семенные канальцы (НК) (рис. 10а). В большей части НК присутствовали половые клетки доноров. Структура сперматогенного эпителия в НК была схожа с той, что наблюдается у семенных канальцев в норме: на базальной мембране располагались сперматогонии, во втором ярусе находились сперматоциты, далее следовали округлые и удлиняющиеся сперматиды (рис. 106). При трансплантации в интерстициальную ткань клетки Сертоли доноров также формировали НК, однако они не содержали половых клеток.

2.2. Восстановление сперматогенеза, нарушенного действием ВПГ

После экспериментальной апробации метода восстановления сперматогенеза с помощью трансплантации клеток на модели химического нарушения сперматогенной ткани тот же подход был применен для модели, более близкой к реальным патологиям человека, включающей повреждения семенника, вызванные восходящей ВПГ-инфекцией.

Таблица. Количественный анализ результатов трансплантаций клеток семенников мышей-доноров в семенники мышей, поврежденные в ходе ВПГ-инфекции

Трансплантции проведены Число семенников с Т (%) Число КР Число НК (%)* Число НК с ПК (%) Число НК с ОС (%)

без ацикловира 6 из 11(55) 11979 466 (3,6) 149 (32) 24(5)

с ацикловиром 12 из 13(92) 13015 2280(17,8)** 1462 (64)** 552 (24)**

Г - трансплантат, КР - проанализированные канальцы реципиентов, ПК - половые клетки, ОС - округлые сперматиды. * - число НК внутри КР и в интерстициы суммировано и представлено в % от общего числа проанализированных канальцев, т.е. суммы КР и НК. **- отличие от трансплантаций без АЦ статистически значимо.

Так как ранее в работе было показано, что ВПГ полностью не исчезает из семенников, для подавления его возможной реактивации был использован АЦ. На 3 сут после трансплантации в семенниках мышей, не получавших АЦ, с помощью иммунофлуоресцентной окраски был выявлен белок ВПГ (рис. 11а), на срез семенника приходилось около 22 участков, окрашивающихся на вирусный антиген. В семенниках мышей, получавших АЦ, белок ВПГ был найден в очень небольших количествах (рис. 116), на срез семенника приходилось только около 4 участков, положительных на антиген ВПГ. Таким образом, АЦ эффективно блокировал экспрессию вирусных генов.

Через 30 сут после трансплантации в группе мышей, не получавших АЦ, клетки доноров были найдены только в 6 из 11 проанализированных семенников. В случае инъекции клеток в семенные канальцы и в случае введения в интерстиций трансплантированные клетки занимали небольшую площадь в семенниках реципиентов. Клетки Сертоли доноров формировали НК, но половых клеток в них было немного, и они редко доходили до гаплоидных стадий (таблица).

В группе мышей, получавших АЦ, клетки доноров выявили в 12 из 13 проанализированных семенников. При трансплантации в канальцы трансплантированные клетки были найдены во многих канальцах реципиентов, большей частью по периферии семенника. При трансплантации в интерстиций клетки доноров располагались компактно, формируя структуру, напоминающую по форме и строению новый семенник и часто занимающую большую часть семенника реципиента.

В обоих случаях клетки Сертоли доноров формировали в семенниках реципиентов множество НК (рис. 12а, б). В большей части НК происходило развитие половых клеток донора, причем сперматогенный эпителий имел нормальную организацию, а дифференцировка половых клеток доходила, по крайней мере, до стадии сперматоцитов, а во многих случаях - и до стадии округлых сперматид (рис. 12в, таблица).

Анализ семенников мышей-реципиентов, получавших АЦ, на отдаленные сроки после трансплантации - 60 и 150 сут — показал, что во многих НК дифференцировка половых клеток доходила до стадии удлиняющихся сперматид (рис. 12г). Зрелые сперматозоиды в эпидидимальной жидкости обнаружить не удалось, что, скорее всего, связано с обструкцией канальцев семенника и эпидидимиса в ходе ВПГ-инфекции. В то же время присутствующие в семенниках удлиняющиеся сперматиды являются практически зрелыми половыми клетками, которые в настоящее время используются для лечения бесплодия, вызванного отсутствием сперматозоидов в эякуляте, с помощью вспомогательных репродуктивных технологий.

выводы

1. Разработана модель ВПГ-инфекции семенников половозрелой мыши через rete testis, которая имитирует восходящий путь инфицирования мужских гонад.

2. Впервые установлена динамика ВПГ инфекции половых и соматических клеток семенных канальцев. Вирусные маркеры (ДНК, белки, капсиды и вирионы) и инфекционная активность ВПГ обнаруживаются через 3 суток и достигают максимума к 6 суткам после заражения. Начиная с 21 суток, инфекционная активность вируса не выявляется, но ДНК и белки ВПГ присутствуют в части клеток семенника.

3. Впервые определено, что ВПГ-инфекция семенников приводит к необратимому нарушению структуры сперматогенного эпителия, аномалиям в сперматогенном процессе, повреждению и гибели половых клеток и клеток Сертоли, прекращению продукции сперматозоидов, атрофии семенников.

4. Впервые показано, что в результате ВПГ-инфекции семенника развивается орхит: в интер-стициальной ткани накапливаются CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты и макрофаги.

5. Экспериментально показано, что сперматогенная ткань, поврежденная в результате химического воздействия, может быть восстановлена путем трансплантации клеток семенников неонатальных мышей в семенники половозрелых животных.

6. Впервые установлено, что трансплантация генетически маркированных клеток семенников неонатальных мышей в семенники ВПГ-инфицированных животных приводит к возобновлению сперматогенеза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Малолина Е.А., Кулибин А.Ю., Маршак Т_Л., Захидов С.Т. Регенеративный потенциал трансплантированных клеток Сертоли взрослых мышей // Бюл. эксп. биол. и мед. - 2011. - Т. 151. - № 5. - С. 585-588.

2. Малолина Е.А., Кулибин А.Ю. Повышение регенерационного потенциала клеток Сертоли вследствие теплового воздействия // Молекулярная медицина. - 2012. -№4.-С. 49-57.

3. Малолина Е.А., Кулибин А.Ю., Тюленев Ю.А., Кущ А.А. Орхит и дегенеративные изменения в семенниках как следствие ретроградного пути заражения вирусом простого герпеса на модели инфицирования семенников мыши // Материалы 5-й междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (6-7 июня 2012 г.). - Санкт-Петербург, 2012. - С. 54-56.

4. Малолина Е.А., Кулибин А.Ю., Тюленев Ю.А., Кущ А.А. Деструктивные изменения в семенниках мыши при ретроградном пути их заражения вирусом простого герпеса // Урология. - 2013. - № 4. - С. 55-59.

5. Малолина Е.А., Науменко В.А., Тюленев Ю.А., Кулибин А.Ю., Кущ А.А. Нарушение сперматогенеза и снижение фертильности при экспериментальной герпесвирусной инфекции // Материалы 11-го Российского научно-образовательного форума «Мужское здоровье и долголетие» (19 - 20 февраля 2013г.). - Москва, 2013. - С. 44.

6. Naumenko V., Malolina Е., Kulibin A., Tyulenev Y., Kushch A. Testicular herpes simplex virus infection and impairment of blood testis barrier // Abstracts of the 23rd Annual Meeting of the Society for Virology, Kiel, 6-9 March 2013. - 2013. - P. 525.

7. Naumenko V., Tyulenev Y., Malolina E., Kulibin A., Gushchina E., Kushch A. Investigation of herpes simplex virus influence on male fertility: different approaches for different challenges // Abstracts of the 5,h European Congress of Virology, Lyon, 11-14 September 2013. - Virologie, 2013.-V. 17. - Suppl. 2. - S. 142.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ АЦ - ацикловир

БКМ - быстрый культуральный метод ВПГ - вирус простого герпеса ИЭМ - иммуноэлектронная микроскопия МКА - моноклональные антитела

НК - новые семенные канальцы, образованные клетками доноров ПКА - поликлональные антитела ПФА - параформальдегид

ПЦРрв - полимеразная цепная реакция в реальном времени ЭМ - электронная микроскопия

Для заметок

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малолина, Екатерина Андреевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. Ивановского Минздрава России

На правах рукописи

04201450231

МАЛОЛИНА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

Восходящая экспериментальная герпесвирусная инфекция семенников и разработка способа восстановления сперматогенеза

03.01.03. - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор A.A. Кущ

Москва-2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ 10

Глава 1. ВПГ: общая характеристика 10

1.1. Таксономия 10

1.2. Строение вириона ВПГ 10

1.3. Репликация ВПГ ' 11 Глава 2. Развитие мужских половых клеток млекопитающих 15

2.1. Строение мужских половых желез - семенников 15

2.2. Сперматогенез. Общие положения 16

2.3. Периоды сперматогенеза 20

2.3.1. Период размножения 20

2.3.2. Период роста и созревания 22

2.3.3. Спермиогенез 23

2.4. Особенности регуляции иммунного ответа в семенниках. 25

2.5. Механизмы развития орхита 28

)

2.5.1. Иммунологические аспекты воспаления 28

2.5.2. Особенности инфекционных процессов в семенниках 32

2.5.3. Инфекции и воспаления мужского полового тракта как фактор снижения фертильности 33

Глава 3. Влияние ВПГ на мужскую фертильность 34

3.1. Герпесвирусная инфекция мужской половой системы 34

3.2. Экспериментальное изучение воздействия ВПГ на

сперматогенез 36 Глава 4. Биотехнологические подходы к лечению мужского

бесплодия 39

4.1. Получение гаплоидных половых клеток in vitro 39

4.2. Трансплантации клеток в семенники с нарушенным

сперматогенезом 42

ДАННЫЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 48

Глава 5. Материалы и методы 48

5.1. Основные реактивы 48

5.2. Животные 50

5.3. Вирус 50

5.4. Инфицирование семенников мышей ВПГ 51

5.5. Анализ локализации ВПГ и его влияния на сперматогенез 52

5.5.1. Быстрый культуральный метод 52

5.5.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 52

5.5.3. Гибридизация in situ 53

5.5.4. Иммунофлуоресцентный анализ 54

5.5.5. Электронная и иммуноэлектронная микроскопия 55

5.5.6. Гистологический анализ 56

5.5.7. Проточная цитофлуориметрия 5 7

5.6. Трансплантации клеток семенников 58

5.6.1. Получение суспензии клеток семенников для трансплантаций 58

5.6.2. Трансплантация клеток в семенники мышей со сперматогенезом, нарушенным в результате действия химических агентов 59

5.6.3. Трансплантация клеток в семенники мышей со сперматогенезом, нарушенным в результате действия ВПГ 59

5.6.4. Анализ результатов трансплантаций 60

5.7. Статистический анализ результатов 61 Глава 6. Герпесвирусная инфекция семенников половозрелых

мышей in vivo 62

6.1. Инфекционная активность ВПГ из инфицированных гонад 62

6.2. Распространение ДНК ВПГ в организме инфицированных мышей 62

6.3. Локализация ДНК ВПГ в инфицированных семенниках 63

6.4. Локализация белка ВПГ в семенниках на ранних стадиях

инфекции 65

6.5. Динамика ВПГ-инфекции в семенниках 65

6.6. Электронно-микроскопическая локализация ВПГ в семенниках 69

6.7. Воздействие ВПГ-инфекции семенников на внешний вид мышей, макроскопические показатели гонад и эпидидимальные

сперматозоиды 72

6.8. Воздействие ВПГ-инфекции семенников на структуру сперматогенного эпителия 73

6.9. Развитие орхйта в ходе ВПГ-инфекции 78 Глава 7. Восстановление сперматогенеза, нарушенного действием

химических агентов, с помощью трансплантации клеток 82

7.1. Нарушение сперматогенеза в результате последовательного действия бусульфана и сульфата кадмия 82

7.2. Восстановление сперматогенеза, нарушенного действием

бусульфана и сульфата кадмия 83

Глава 8. Восстановление сперматогенеза, нарушенного действием

ВПГ, с помощью трансплантации клеток 88

8.1. Выявление ВПГ в семенниках после трансплантации клеток. Воздействие ацикловира 88

8.2. Восстановление сперматогенеза, нарушенного ВПГ, на ранний срок после трансплантации клеток 91

8.3. Восстановление сперматогенеза, нарушенного ВПГ, в отдаленные сроки после трансплантации клеток 97

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 99

ВЫВОДЫ 113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БКМ - быстрый культуральный метод ВПГ - вирус простого герпеса

ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

МКА - моноклональные антитела

ПФА - параформальдегид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ССК - стволовые сперматогониальные клетки

ТРФ - трансформирующий ростовой фактор

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

PBS - фосфатно-солевой буфер

TLR - Толл-подобные рецепторы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время бесплодие в браке является важной медицинской проблемой. Подсчитано, что в мире бесплодием страдает около 16% пар, причем приблизительно в половине случаев причиной оказывается снижение мужской фертильности. Мужское бесплодие может быть вызвано многими факторами, среди которых инфекции и воспалительные процессы мочеполового тракта занимают одно из первых мест [10]. Широко распространенными инфекционными агентами в человеческой популяции являются представители семейства Herpesviridae - вирусы простого герпеса (ВПГ) 1-го и 2-го типа, передающиеся половым путем. Присутствие ВПГ в эякулятах показано во многих исследованиях, однако его влияние на мужскую фертильность до конца не выяснено, в частности, из-за противоречий в результатах, получаемых разными исследовательскими группами [64]. Ряд косвенных данных [3; 9] позволяет предположить, что ВПГ может воздействовать непосредственно на яички человека и повреждать сперматогенную ткань. Однако прямых доказательств этого пока не получено, что в значительной степени связано с отсутствием адекватных моделей инфицирования семенников ВПГ in vivo. В результате крайне ограничены данные о путях проникновения вируса в яички, о степени поражения сперматогенной ткани, об общем ходе течения инфекции и об ее исходе.

В то же время известно, что вирусные инфекции могут вызывать развитие хронического орхита [35], который в большинстве случаев не диагностируется, так как не имеет явных симптомов [106]. Орхит является одной из причин тяжелой формы мужского бесплодия, при которой в яичках отсутствуют зрелые гаметы, а значит, традиционные методы восстановления фертильности, в том числе вспомогательные репродуктивные технологии, неэффективны. В настоящее время успехи в лечении таких форм бесплодия связывают с развитием клеточных технологий [14]. Один из наиболее перспективных новых подходов для восстановления мужской фертильности предполагает транс-

плантацию в поврежденные яички половых и поддерживающих их развитие соматических клеток Сертоли. Источником аутологичных клеток для трансплантации могут быть уцелевшие клетки, выделенные из поврежденных яичек и размноженные в культуре, или клетки, полученные в результате трансдиффе-ренцировки любых соматических клеток пациента; доказательства принципиальной возможности такого подхода недавно появились в литературе [23; 123; 124; 144]. Пока способ восстановления сперматогенеза путем трансплантаций клеток находится на стадии разработки. Его эффективность продемонстрирована в случае экспериментального химического повреждения семенников лабораторных животных [111], но неизвестно, окажется ли он эффективным при клеточной терапии инфекционной патологии яичек человека. Использование трансплантаций клеток для восстановления сперматогенной функции на экспериментальной модели, имитирующей вирусную инфекцию яичек человека, может дать ответ на этот вопрос.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в изучении воздействия ВПГ на сперматогенез мыши на модели восходящей инфекции и в разработке способа восстановления сперматогенной функции после вирусной инфекции семенников. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать модель восходящего пути инфицирования семенников мыши ВПГ.

3. Оценить воздействие ВПГ на структуру сперматогенного эпителия и диф-ференцировку половых клеток.

4. Изучить влияние ВПГ на проявление клеточного иммунитета в инфицированных гонадах.

6. Использовать метод клеточной трансплантации для восстановления спер-матогенной функции мышей после заражения семенников ВПГ и оценить его эффективность.

Научная новизна и практическая значимость:

1. Разработана модель ВПГ-инфекции семенников половозрелой мыши, имитирующая восходящий путь инфицирования.

2. Впервые выявлена способность ВПГ инфицировать половые и соматические клетки семенников половозрелых животных in vivo, которая приводит к необратимым нарушениям структуры сперматогенной ткани, гибели половых клеток и остановке продукции мужских гамет.

3. Впервые установлено, что ВПГ-инфекция вызывает развитие воспалительного процесса в семенниках.

4. Впервые показана эффективность использования клеточных технологий для восстановления сперматогенеза в семенниках, поврежденных в результате инфицирования ВПГ.

Основные положения, выносимые на защиту:

4. Доказано, что ВПГ-инфекция семенников приводит к развитию орхита: в интерстиции, начиная с ранних сроков инфекции, наблюдаются проявления воспалительного процесса, накапливаются СЭ4+ и СЭ8+ Т-лимфоциты и макрофаги.

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ВПГ: общая характеристика 1.1. Таксономия

Согласно современной классификации [131] ВПГ-род Simplexvirus -относится к порядку Herpesvirales, семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae. В род Simplexvirus входят два вируса, вызывающие патологии у человека: вирус простого герпеса человека 1 типа (Human herpesvirus 1, ВПГ-1) и вирус простого герпеса человека 2 типа (Human herpesvirus 2, ВПГ-2).

1.2. Строение вириона ВПГ

Вирион ВПГ состоит из четырех структурных элементов: электронно-плотной сердцевины, содержащей вирусную ДНК, икосаэдрического капсида, окружающего сердцевину, аморфного белкового слоя, называемого тегумент, и оболочки - двухслойной липидной мембраны с выступами, пепломерами (рис. 1).

Диаметр вириона ВПГ составляет в среднем 186 нм, а вместе с длиной пе-пломеров - 225 нм; нуклеокапсид расположен не в центре вириона, а смещен к периферии; в тегументе имеются филаменты, примыкающие к наружной мембране [50]. Сердцевина ВПГ представляет собой вирусную ДНК, свернутую в тороидальную структуру. Икосаэдрический капсид имеет диаметр 100 нм и состоит из 162 капсомеров, которые формируются 4 вирусными белками: VP5, VP26, VP23, VP19C. В тегументе находятся, по крайней мере, 20 вирусных белков, в том числе активатор транскрипции VP 16, эндорибонуклеаза VHS, главной функцией которой является деградация клеточных и вирусных мРНК, VP22, регулирующий локализацию и экспрессию ряда клеточных и вирусных белков, и VP 1-2, играющий важную роль в процессе созревания вирионов. Оболочка вируса представляет собой цитоплазматическую мембрану клетки-хозяина, в которую интегрированы вирусные белки: гликопротеины gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gL, gM, а также несколько негликозилированных белков [42].

Геном ВПГ представлен двухцепочечной линейной ДНК размером 152 kb, содержание ГЦ (гуанин-цитозин) пар равно 68% для ВПГ-1 и 69% для ВПГ-2. Геном ВПГ подразделяется на два ковалентно связанных компонента, обозначаемые как L (long) и S (short). Каждый компонент состоит из уникальной последовательности (UL и US соответственно), ограниченной инвертированными повторяющимися последовательностями. Благодаря этим повторяющимся последовательностям осуществляются структурные перестройки генома ВПГ, и он существует в виде 4 изомеров, отличающихся друг от друга ориентацией UL и US. В ДНК ВПГ закодировано около 90 генов, с 84 из них экспрессируются белки. Среди транскриптов, не кодирующих белки, необходимо отметить так называемые latency-associated transcripts (LAT), синтезирующиеся в ходе латентной инфекции ВПГ. За несколькими исключениями каждый вирусный транскрипт кодирует только один белок. Многие рамки считывания перекрываются. [42].

1.3. Репликация ВПГ

Репликативный цикл ВПГ протекает по схеме, характерной для всех герпесвирусов (рис. 2). Инфицирование клетки начинается с прикрепления вириона к цитоплазматической мембране клетки [42]. Вирусные гликопроте-

Рис. 2. Репликативный цикл ВПГ

1 - прикрепление вирусной частицы к рецепторам на поверхности клетки; 2 - проникновение вируса в клетку; 3 - продвижение нуклеокапсида к ядру клетки; 4 - проникновение ДНК вируса в ядро через ядерную пору; 5 - пустые капсиды снаружи ядерной оболочки; 6 - распространение белков тегумента по цитоплазме и ядру клетки; 7 - закольцовыва-ние вирусной ДНК; 8 - транскрипция и трансляция сверхранних генов (а); 9 - транскрипция и трансляция ранних генов ф); 10 -репликация вирусной ДНК; 11 - транскрипция и трансляция поздних генов (у); 12 - сборка новых нуклеокапсидов; 13 - выход нуклеокап-сидов из ядра; 14 - формирование в аппарате Гольджи везикул с вирусными белками на мембране; 15 - сборка вирусной частицы; 16 - выход вирионов из клетки.

ины gC и gB присоединяются к гликозаминогликанам на поверхности клетки. Затем gD связывается с одним из специфических клеточных рецепторов (например, с нектином), в результате чего меняет конформацию и вместе с gB, gH и gL обеспечивает слияние оболочки вируса с мембраной клетки.

Нуклеокапсид, окруженный тегументом, оказывается в цитоплазме. По сети микротрубочек он транспортируется к ядру клетки, ДНК ВПГ выходит из капсида и через ядерные поры попадает в ядро, где быстро закольцовывается. Белки тегумента, за исключением УР16, как и пустые капсиды, остаются в

цитоплазме; УР16 мигрирует в ядро. В ядре происходят транскрипция вирус-

ного генома, репликация и инкапсидация вирусной ДНК.

Транскрипция генов ВПГ осуществляется клеточной РНК-полимеразой II при участии вирусных факторов. Транскрипция осуществляется в несколько этапов. Сначала экспрессируются сверхранние гены (а), причем их транскрипция активируется тегументным белком УР16. Вирусные мРНК выходят в цитоплазму, где происходит их трансляция на рибосомах клетки. Синтез белка с клеточных мРНК ингибируется, в частности, за счет фосфорилирования вирусными белками клеточного фактора инициации трансляции еПЧЕ. Белковые продукты сверхранних генов активируют транскрипцию ранних генов ((3), кодирующих белки, необходимые для репликации вирусной ДНК и метаболизма нуклеотидов [42].

ДНК ВПГ реплицируется по механизму «катящегося кольца» с образованием конкатемеров, которые расщепляются на мономеры при сборке ну-клеокапсидов. Сначала вирусная ДНК реплицируется в небольших компарт-ментах, которые постепенно объединяются и, в конце концов, заполняют все ядро, оттесняя хроматин к периферии, транскрипция клеточных генов ингибируется.

Вместе с репликацией вирусной ДНК начинается экспрессия поздних генов (у), которые кодируют структурные белки ВПГ. Затем происходит сборка новых вирионов ВПГ. В ядре образуются капсиды, в которые упаковывается вирусная ДНК [42]. Вновь образованные нуклеокапсиды отпочковывают-

ся от внутренней ядерной мембраны, а затем сливаются с внешней ядерной мембраной.

В результате нуклеокапсиды оказываются в цитоплазме, где они окружаются белками тегумента и покрываются мембраной аппарата Гольджи, модифицированной вирусными гликопротеинами. Полноценные инфекционные вирионы выводятся в межклеточное пространство путем экзоцитоза [31]. В пермиссивной культуре клеток весь процесс репл

Информация о работе

Малолина, Екатерина Андреевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Восходящая экспериментальная герпесвирусная инфекция семенников и разработка способа восстановления сперматогенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы