Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на мужские половые клетки и сперматогенез при экспериментальной инфекции in vitro и in vivo

Тюленев, Юрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на мужские половые клетки и сперматогенез при экспериментальной инфекции in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на мужские половые клетки и сперматогенез при экспериментальной инфекции in vitro и in vivo"

ВЛИЯНИЕ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА И ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА НА МУЖСКИЕ ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И СПЕРМАТОГЕНЕЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO И IN VIVO.

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

1 5 НОЯ 2012

Москва - 2012

005054798

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития РФ Научный руководитель:

доктор биологических наук , профессор Кущ Алла Александровна

Официальные оппоненты: Маныкин Анатолий Анатольевич

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник ФГБУ НИ вирусологии им. Д.И. Ивановско1 Минздравсоцразвития РФ Брагина Елизавета Ефимовна доктор биологических наук, старший научны сотрудник НИИ физико-химической биологи им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.1 Ломоносова

Ведущее учреждение:

ФГБУ "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.1 Мечникова" Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « » декабря 2012 года в 12-00 часов на заседании диссертационного совета (Д208.131.01) ФГБУ «НИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ по адрес; 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологи

им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального

развития РФ }

Автореферат разослан « ' » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Е.И. Бурцев

Актуальность проблемы

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) широко распространены в человеческой популяции, способны передаваться половым путем и вызывать широкий спектр заболеваний [Mocarski E.S., 2007; Roizman В., 2007]. Воспалительные заболевания органов репродуктивной системы являются одной из главных причин бесплодия в браке -проблемы, имеющей не только медицинское, но и социальное значение. Присутствие маркеров герпесвирусов в органах и тканях мужской репродуктивной системы [Neofytou Е., 2009], а также данные о повышенной частоте обнаружения ВПГ в эякуляте бесплодных мужчин [Брагина Е.Е., 2000; Бочарова E.H., 2008; Климова P.P., 2010] указывают на возможную связь ВПГ-инфекции с нарушением фертильности. Сведений о влиянии ЦМВ на репродуктивную функцию мужчины крайне мало и они противоречивы. Существует представление, что семенники могут являться резервуаром возбудителей вирусных инфекций в организме, так как гемато-тестикулярный барьер (ГТБ), с одной стороны, препятствует попаданию патогенов в семенник, с другой стороны -ограничивает доступ иммунокомпетентных клеток в уже зараженный орган [Gazzaz F.S., 2012].

Многие проблемы, связанные с участием герпесвирусов в формировании мужского бесплодия, остаются невыясненными. Несмотря на имеющиеся сведения о негативном влиянии нарушений в структуре хроматина зрелых половых клеток на фертильность [Арифулин Е. А., 2012; Boitrelle F., 2012], данных о влиянии ВПГ и ЦМВ на мужские половые клетки недостаточно. Практически отсутствуют сведения о воздействии герпесвирусов на процесс сперматогенеза, не установлена чувствительность неонатальных половых клеток к герпесвирусам и неясны последствия заражения в препубертатном периоде для репродуктивного здоровья в половозрелом возрасте. Решение перечисленных проблем необходимо для раскрытия патогенетических механизмов герпесвирусного инфицирования гамет, для выяснения вклада этих патогенов в формирование мужского бесплодия, для разработки эффективных средств диагностики, профилактики и лечения бесплодия, а также для предотвращения горизонтального и вертикального распространения герпесвирусов через мужские гаметы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования заключалась в экспериментальной оценке влияния ВПГ и ЦМВ на мужские половые клетки и на сперматогенез в модельных системах in vitro и in vivo. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать модель герпесвирусной инфекции (ГВИ) семенника мыши и яичка человека in vitro.

2. Проследить динамику репликации вирусной ДНК и инфекционной активности ВПГ и ЦМВ в мужских гонадах in vitro.

3. Выявить половые и соматические клетки мужских гонад, чувствительные к герпесвирусам, определить интратестикулярную локализацию вирусных маркеров.

4. Изучить влияние герпесвирусов на структуру популяции, дифференцировку и пролиферацию половых клеток в семеннике мыши и яичке человека.

5. Изучить влияние ВПГ на репродуктивные потенции половозрелых мышей-самцов, инфицированных в препубертатном периоде.

Научная новизна и практическая значимость:

1. Разработана модель ГВИ мужских гонад in vitro.

2. Доказана возможность и эффективность использования модели для изучения ГВИ половых и соматических клеток семенника в экспериментах in vitro.

3. Определена локализация вирусных маркеров в половых клетках, находящихся на разных стадиях сперматогенеза в семеннике мыши и в яичке человека.

4. Впервые показана способность ВПГ инфицировать половые клетки семенника мыши в неонатальном периоде.

5. Показано, что герпесвирусы подавляют пролиферацию сперматогониев, вызывают остановку мейоза и гибель сперматогенного эпителия.

6. Установлено снижение репродуктивных потенций у мышей-самцов при заражении их ВПГ в препубертатном периоде.

7. Выявленная в работе чувствительность половых клеток к ВПГ в препубертатном периоде указывает на необходимость своевременной диагностики и проведения профилактических противовирусных мероприятий у детей, начиная с раннего неонатального периода.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определена динамика инфекционного процесса в органной культуре мужских гонад на двух моделях: 1 - заражение ВПГ клеток семенника мыши и 2 -заражение ВПГ и ЦМВ клеток яичка человека.

2. В мужских половых клетках, находящихся в семенниках на различных стадиях дифференцировки, обнаружены и локализованы белки и морфологические структуры ВПГ и ЦМВ.

3. Установлено снижение индекса сперматогенеза в зараженных герпесвирусами мужских гонадах половозрелых особей.

4. Показана высокая чувствительность к ВПГ незрелых половых клеток в семенниках неонатальных животных и ингибирующее влияние вируса на сперматоцитогенез и мейоз половых клеток при заражении в препубертатном периоде.

5. Установлено негативное влияние ВПГ на репродуктивную функцию половозрелых мышей-самцов при инфицировании в раннем неонатальном периоде.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на 5-м конгрессе Всемирной ассоциации репродуктивной медицины (10 октября 2010г., Москва), на 27-й ежегодной конференции Европейского Общества Репродукции и Эмбриологии Человека (3 июля 2011г., Стокгольм), на 14-й ежегодной конференции Европейского Общества Клинической Вирусологии (22 сентября 2011г., Фуншал) и на 10-м Российском научно-образовательном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (15 февраля 2012г, Москва). В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии, отдела общей вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России от 27 сентября 2012 г.

Публикации

По материалам исследования опубликовано 10 работ, из них 3 - в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 1 - в реферируемом зарубежном журнале. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 31 рисунком, содержит 9 таблиц. Список литературы включает 229 источников (16 отечественных и 213 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты. Для получения органной культуры яичка человека был использован постоперационный материал от трех пациентов (возраст - 62, 65 и 67 лет) с раком простаты, которым выполняли радикальную простатэктомию с орхэктомией: 2 пациента ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА и 1 пациент ГКБ №50 г. Москвы. Для введения в культуру отбирали фрагменты органа, не содержащие атипичных клеток. От всех пациентов получено информированное согласие на использование материала в исследовательских целях.

Животные. В работе использовали мышей лини DBA из питомника лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН, филиал «Столбовая», общей численностью 278 мышей. В том числе половозрелых самок на 14 день гестации — 32, половозрелых небеременных самок - 32, половозрелых самцов (5-6 мес) - 3 особи. От беременных самок было получено 152 мыши, в том числе 81 самец. Новорожденные самцы были использованы: 1. для получения органной культуры семенника мыши на 9-й (2 самца) и 17-й (3 самца) дни жизни; 2. для внутрибрюшинного заражения ВПГ (50 самцов), а также 10 самцов вошли в контрольную группу в этих экспериментах; 3. для оценки фертильности при ВПГ-инфекции были использованы 8 зараженных и 8 контрольных самцов. Зараженные новорожденные самки (71 особь) наряду с зараженными самцами были использованы для расчета 50%-ой летальной дозы (ЛД50) для мышей-сосунков. Половозрелых самцов использовали для получения органной культуры семенников мыши. Половозрелых небеременных самок использовали для спаривания с зараженными и контрольными самцами в опытах по оценке фертильности зараженных самцов. В опыте по спариванию было получено 59 мышей, которые были использованы для оценки вертикальной передачи ВПГ.

Клеточные культуры. В работе использовали культуру клеток диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и культуру клеток почечного эпителия зеленой мартышки линии Vero, которые были получены из Лаборатории культур тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.

Вирусы. В работе использовали референс штамм AD-169 ЦМВ человека, любезно предоставленный профессором D. Emanuel (США) и штамм F ВПГ типа 1, любезно предоставленный профессором L. Pereira (США).

Определение инфекционной активности ЦМВ проводили в 96-луночных планшетах модифицированным методом «черных бляшек» с использованием моноклональных антител (МКА) [Макарова Н.Е., 1996]. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 100 мкл в лунки с монослоем

клеток ФЛЭЧ. Панели с материалом инкубировали в течение 5 суток при 37°С. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси МКА к белкам 1Е-р72 и Е-рр65. Инфекционный титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл).

Определение инфекционной активности ВПГ-1 проводили в 96-луночных планшетах классическим культуральным методом. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 100 мкл в лунки с монослоем клеток Vero. Панели с материалом инкубировали в течение 1-2 суток при 37°С. При помощи светового микроскопа обнаруживали цитопатическое действие в наивысшем разведении вируса и осуществляли подсчет бляшек. Инфекционный титр вируса выражали в БОЕ/мл.

Получение органной культуры мужских гонад. Для получения органной культуры мужских гонад модифицировали метод V. Roulet (2006). В органную культуру вводили: 1. яички человека; 2. семенники половозрелых мышей; 3. семенники 9-дневых мышей; 4. семенники 17-дневых мышей. Фрагменты органа размером 3 мм3, культивировали в 6-луночных планшетах со вставками, содержащими полупроницаемую мембрану с диаметром пор 0,4 мкм. В каждую лунку планшета вносили по 1,5 мл обогащенной среды ДМЕМ, включающей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1 ммоль/л пирувата натрия, 4 ммоль/л L-глутамина, 100 нг/мл витамина А, 200 нг/мл витамина Е, 50 нг/мл витамина С, 10 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл трансферрина, 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование производили в атмосфере 5% СОг со сменой среды через каждые 2 дня при двух температурных режимах: 33°С (органная культура семенника мыши) и 37°С (органная культура яичка человека). Длительность культивирования эксплантов составляла 16 дней (органная культура яичка человека и семенников половозрелых мышей) и 6 дней (органная культура семенника 9- и 17-дневных мышей).

Заражение органной культуры мужских гонад производили путем наслаивания 0,025 мл инокулята ВПГ (для эксплантов семенника мыши и яичка человека) или 0,025 мл инокулята ЦМВ (только для эксплантов яичка человека) на фрагмент органа с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37°С. Множественность инфицирования ЦМВ составила - 0.0001-0.001 БОЕ/кл, ВПГ - 0,01-0,1 БОЕ/кл. На контрольные фрагменты органа наслаивали 0,025 мл среды ДМЕМ, после чего инкубировали в аналогичных условиях. После трехкратной промывки в 1 мл ДМЕМ зараженные и контрольные фрагменты органа помещали на полупроницаемые мембраны в лунки с обогащенной средой и культивировали от 2 до 6 дней (культуры неполовозрелых гонад) либо от 2 до 16 дней (культуры половозрелых гонад). Вирусную нагрузку в культуральной среде

оценивали сразу после заражения (до начала репликации вируса), затем каждые 48 ч методами ПЦР в реальном времени и быстрым культуральным методом. В каждой изученной точке анализировали образцы культуральной среды от 3 фрагментов органа. Гистологический, иммуногистохимический и ультраструктурный анализ зараженных эксплантов осуществляли каждые 48 ч. В каждой исследуемой точке анализировали по 2-3 фрагмента органа, в качестве отрицательного контроля использовали неинфицированные экспланты до введения в культуру, а также неинфицированные экспланты того же срока культивирования, что инфицированные фрагменты органа.

Заражение лабораторных животных. Новорожденным мышам на 8 день жизни внугрибрюшинно вводили 100 мкл инокулята вируса в различной концентрации: 105-106 (Группа I, п=7), 103 -104 (Группа II, п=29) и Ю'-Ю2 БОЕ/мл (Группа III, п=22). ЛД50 для мышей сосунков рассчитывали по- формуле Рида-Менча. Оптимальной считали инфицирующую дозу, при которой получали наиболее высокий показатель ВПГ-инфекции семенников при наибольшем проценте выживаемости в группе. Контрольным животным (п=10) вводили внугрибрюшинно 100 мкл ДМЕМ. На 3, 8, 18 и 28 дни после инфекции проводили убой 2-3 самцов путем дислокации шейных позвонков. Кроме того, ежедневно оценивали состояние зараженных мышей и при наличии выраженных признаков поражения ЦНС проводили убой и вскрытие вне зависимости от сроков инфекции. В ходе вскрытия извлекали семенники, почки, головной мозг. Семенники изучали гистологическим, ультраструктурным, иммуногистохимическим методами, а также методом ПЦР.

Спаривание и оценка фертильности. 8 самцов из группы II, зараженных ВПГ на 8 день после рождения, по достижении ими половозрелости (на 54-56 дни жизни) спаривали с неинфицированными самками. Для этого каждого самца помещали на 2 дня с двумя неинфицированными самками. Контролем служили 8 незараженных самцов, которых спаривали в тех же условиях. После спаривания обследовали самок на наличие вагинальной пробки, что расценивали как свидетельство контакта. В группах самок после спаривания с инфицированными и неинфицированными самцами, оценивали количество наступивших беременностей, их длительность, общее число приплода, экстерьер и жизнеспособность новорожденных животных.

Оценка возможности вертикальной передачи ВПГ. После спаривания все самцы были убиты, семенники извлечены, взвешены и отправлены на гистологический и иммуногистохимический анализ, а также на определение ДНК ВПГ с парафиновых срезов методом ПЦР. Вирусную ДНК определяли также в гомогенатах следующих органов, измельченных в 1000 мкл ДМЕМ: эпидидимис, почки, головной мозг. Все новорожденные

мыши, полученные от самок, спаривавшихся с инфицированными самцами, а также 5 самцов, рожденных от самок контрольной группы, были забиты на 3-й день жизни и обследованы на наличие ДНК ВПГ в клетках крови, а также следующих органах: семенниках, почках, селезенке, головном мозге.

Быстрый культуральный метод (БКМ). Для выявления инфекционной активности ЦМВ исследуемый материал (культуральная среда от зараженных фрагментов яичек человека) вносили в объеме 0,2 мл в предварительно высаженную культуру клеток ФЛЭЧ, инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. После двукратной отмывки добавляли среду ДМЕМ, содержащую 2% ЭТС и культивировали в течение 48 часов. На препаратах, фиксированных в охлажденном метаноле проводили идентификацию белков ЦМВ с помощью моноклональных антител к белкам Е-рр65 и 1Е-р72 ЦМВ [Макарова Н.Е., 1996] методом иммунопероксидазной окраски. Подсчет окрашенных клеток проводили в инвертированном световом микроскопе «Motic АЕ21».

Для выявления инфекционно активного ВПГ исследуемый материал (культуральная среда от зараженных фрагментов яичек человека или семенников мыши) вносили в культуру клеток Vero, инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. После двукратной отмывки добавляли поддерживающую среду и культивировали в течение 24 ч. Клетки фиксировали ацетоном в течение 30 мин и на цитологических препаратах проводили идентификацию белков ВПГ с помощью моноклональных антител к сверхраннему и позднему белкам ВПГ методом иммунофлюоресценнции [Климова P.P., 2010]. Подсчет окрашенных клеток проводили в микроскопе «Olympus ВХ51».

ПЦР в реальном времени. Выделение ДНК ЦМВ и ВПГ из культуральной жидкости проводили с помощью набора «AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA miniprep Kit», в соответствии с рекомендациями производителя. Выделение ДНК ВПГ и ЦМВ из гомогенатов органов и с парафиновых срезов проводили с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-В». Для ПЦР-амплификации использовали комплекты реагентов: «Амплисенс® CMV-CKpnn/M0inn0p-FL» и «Амплисенс® HSVI,II-FL». Амплификацию и учет результатов проводили с использованием прибора «Rotor-Gene 6000». Нормирование вирусной нагрузки производили: 1. на 1 мл при исследовании культуральной среды; 2. на 1 мг исследуемого образца при исследовании гомогенатов; 3. на 1 мг исследуемых срезов семенника.

Гистологический анализ. Семенники, извлеченные из зараженных и незараженных мышей, а также зараженные и контрольные фрагменты яичка человека и семенника мыши

фиксировали в течение 24 часов в 10% формалине. После фиксации фрагменты органа промывали, проводили через восходящий градиент спиртов и заключали в парафин. Для гистологического анализа срезы толщиной 4 мкм помещали на стекла, депарафинизировали и окрашивали гематоксилином Караччи. Анализ проводили с использованием микроскопа «Jenalumar». Для интегральной оценки изменений рассчитывали индекс сперматогенеза (ИС) по следующей формуле: (^nm т)/100, где т -число генераций половых клеток (сперматогониев, сперматоцитов, сперматид, сперматозоидов в различных сочетаниях от 1 до 4), обнаруженных в каждом канальце, nm - количество канальцев, содержащих определенное количество генераций. Также подсчитывали количество канальцев, содержащих: 1. гибнущие половые клетки; 2. пролиферирующие половые клетки; 3. сперматогонии; 4. сперматоциты; 5. сперматиды (круглые и вытянутые); 6. сперматозоиды. Данная часть работы выполнялась совместно со ст. н. с. лаборатории генетики нарушений репродукции Медико-генетического научного центра РАМН, к.б.н., Шилейко JI.B. (руководитель лаборатории - профессор Курило Л.Ф.).

Илшунопероксидазную окраску проводили для иммуногистохимического выявления белков ЦМВ и ВПГ на гистологических срезах. Инкубацию с первичными антителами к вирусу проводили при 4°С в течение ночи. После 4-кратной промывки в фосфатно-солевом буфере наносили реагенты из набора UltraVision LP Large Volume Detection System, следуя протоколу фирмы-производителя.

Электронная микроскопия. Фрагменты семенников мыши и яичка человека объемом 2-3 мм3 помещали на 24 часа в 2,5% глютаровый альдегид с последующей 40-минутной фиксацией в 1% OsC>4. После дегидратации в восходящем градиенте спиртов материал заключали в Ероп-812 по стандартной методике. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3, докрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в микроскопе JEM-100 S. Ультраструктурные исследования проводили совместно с научным сотрудником лаборатории структуры и морфогенеза вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, к.м.н., Науменко В.А. (руководитель лаборатории - академик РАМН Клименко С.М.).

Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ «STATISTICA 6,0» и «BIOSTAT». Межгрупповые различия относительных показателей анализировали с помощью критерия хи-квадрат. Для сравнения количественных данных использовали критерий Стьюдента. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВИГ- и ЦМВ-инфекция яичка человека in vitro.

1.1. Динамика ВПГ- и ЦМВ-инфекции в органной культуре яичка человека.

Эффективность заражения органной культуры ВПГ была подтверждена выявлением ДНК и инфекционной активности вируса в культуральной жидкости. Нарастание концентрации инфекционно активного ВПГ отмечали в течение первой недели после заражения, с максимумом на 8-й день (4130 БОЕ/мл), после чего вирусная нагрузка снижалась вплоть до 16 дня. Накопление ДНК ВПГ в культуральной жидкости происходило на протяжении всего срока культивирования, при этом до 8 дня отмечали быстрое увеличение концентрации вирусной ДНК, после чего скорость прироста ДНК оставалась на одном уровне. Максимум концентрации ДНК ВПГ составил 7х 105копий/мл.

Описанная динамика вирусных маркеров свидетельствует о том, что активная репликация вируса и распространение инфекции в экспланте происходит в первые 8-10 дней. Отставание профиля кривой ДНК относительно кривой инфекционной активности связано, по-видимому, с сохранением стабильности ДНК в течение некоторого времени в эксплантах яичка.

По сравнению с ВПГ-инфекцией увеличение инфекционной активности и концентрации ДНК ЦМВ начиналась позже - на 8 день, и максимальные концентрации вирусных маркеров - на 13-16 дни - оказались значительно ниже (60 БОЕ/мл и 51900 копий ДНК/мл). Возможно, это связано с различиями в стратегии вирусного генома указанных вирусов.

1.2. Локализация ВПГ и ЦМВ в органной культуре яичка человека.

Для выявления локализации ВПГ в инфицированной культуре были использованы методы иммуногистохимии и электронной микроскопии. Иммуноокрашенными оказались около 20% клеток яичка, при этом вирусные антигены, в основном, были выявлены в клетках интерстиция, в прилежащих к базальной мембране сперматогониях и клетках Сертоли, а также в единичных сперматоцитах и сперматидах (рис. 1). Аналогичная динамика была выявлена при ультраструктурном анализе зараженных эксплантов. Вирусные капсиды в ядрах половых и соматических клеток, а также полные вирионы в межклеточном пространстве выявляли, начиная с 4-го дня инфекции (рис. 4).

Для выявления клеток яичка, содержащих ЦМВ, изучали локализацию вирусных белков в зараженной органной культуре. На 4 день инфекции вирусные антигены были обнаружены в интерстициальных клетках, а также в единичных сперматидах. При этом очаги инфекции располагались в поверхностных участках культуры, непосредственно контактирующих с вирусом при заражении. К 8 дню отмечали распространение

инфекционного процесса по соединительнотканным прослойкам в более глубокие участки фрагмента органа (Рис. 2). На этом этапе наряду со сперматидами инфицированными оказались также сперматоциты и сперматогонии. На 16 день инфекции в интерстиции выявляли гигантские окрашенные клетки с характерными для ЦМВ-инфекции цитоплазматическими включениями и бобовидными ядрами. На поздних сроках инфекционного процесса отмечали увеличение числа окрашенных сперматид, сперматоцитов и сперматогониев, а также появление единичных сперматозоидов, содержащих вирусные антигены. Ультраструктурный анализ подтвердил возможность инфицирования незрелых половых клеток ЦМВ (рис.5). В интактной органной культуре яичка человека антигены и морфологические структуры герпесвирусов не были обнаружены.

Полученные результаты убедительно свидетельствуют в пользу присутствия ВПГ и ЦМВ не только в соматических клетках, но и в клетках-предшественниках сперматозоидов (сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах). Нам не удалось выявить инфицированные сперматозоиды на ранних стадиях заражения, что согласуется с ранее полученными данными о невосприимчивости зрелых мужских гамет к ГВИ. Однако исключительно важным представляется выявление ЦМВ в сперматозоидах на поздних сроках инфекции (рис. 3). У человека для образования сперматозоидов из ранних сперматид требуется около 2 недель, при этом неоднократно сообщалось, что т \itro созревание половых клеток происходит быстрее [Сгетаёев N.. 1999; Тевапк .Г., 1998]. Наличие маркеров вируса в сперматидах с первых дней инфекции позволяет предположить, что инфицированные клетки продолжают осуществлять спермиогенез, и это приводит через 14 дней к формированию сперматозоидов, содержащих вирус. Следует отметить, что количество вирусных частиц в клетках интерстиция значительно превышает вирусную нагрузку в половых клетках. Возможно, относительно низкий уровень содержания герпесвирусов в герминативных клетках позволяет им завершить последующие этапы созревания.

1.3. Влияние ВПГ и ЦМВ на половые клетки человека.

Для оценки воздействия герпесвирусов на половые клетки человека проводили морфологический анализ зараженных и интактных фрагментов семенника.

На 16-й день инфекции ИС в интактной культуре (3,19) оказался значительно выше, чем в случае заражения экспланта ВПГ (2,67, р<0.05) и ЦМВ (2,99, р<0.05). Для подтверждения предположения о различной чувствительности генераций половых клеток

Рис. 1. Выявление антигенов ВПГ в инфицированном экспланте яичка человека

А - увеличение х100, Б - увеличение х400. Специфическое иммунопероксидазное окрашивание ВПГ-инфицированных половых клеток в образце органной культуры.

Рис. 2. Выявление белка рр65 ЦМВ в инфицированной органной культуре яичка человека. Стрелками обозначены: А - инфицированный сперматоцит, Б -инфицированные сперматогонии. Увеличение х400.

• • •' —

. V

Рис. 3. Выявление антигенов ЦМВ в сперматозоидах человека, 16 день культивирования органной культуры.

Увеличение: х400. Вставка: х2000.

Рис. 4. Выявление полных вирионов и капсидов ВПГ в сперматидах инфицированных фрагментов яичка человека. 1 - полные вирионы ВПГ в межклеточном пространстве, 2 - плотные тельца, 3 — вирусные капсиды в ядре клетки, 4 - формирующаяся акросома сперматиды . Увеличение х 6000.

Рис.5. Выявление капсидов и полных вирионов ЦМВ в сперматогонии инфицированного экспланта яичка человека на 16 день инфекции.

Полные и пустые капсиды (вставка С) и полные вирионы (вставка В).

Рис. 6. Выявление антигенов ВПГ в органной культуре семенника мыши, полученной от 9-дневных (А, Б) и 17-дневных (В, Г) мышей.

Иммунохимическая реакция на гистологических срезах инфицированных (А, В) и контрольных (Б, Г) фрагментов семенника: коричневая окраска (А, В) соответствует локализации белков ВПГ. Увеличение х400.

Рис. 7. Выявление капсидов и вирионов ВПГ в спермаюгониях и клетках Сертоли в органной культуре семенников препубертатных мышей.

Ультратонкие срезы органной культуры семенника 9-дневной мыши через 4 дня после заражения ВПГ: (А) вирионы в цитоплазме (на вставке слева) и вирусные капсиды в ядре (на вставке справа) клеток Сертоли, увеличение х10.ООО, вставка х25. ООО; (Б) вирусные капсиды в ядре сперматогония (вставка) и вирион в межклеточном пространстве (стрелка), увеличение х10.000, вставка хЗО.ООО.

Рис. 8. Тотальное поражение семенника на 3 день после внутрибрюшинного заражения ВПГ 8-дневной мыши. Гистологический срез семенника 8-дневной мыши. Инфицирующая доза ВПГ -1 ЛДц>. Коричневая окраска - белки ВПГ, выявленные МКА. А - увеличение х400, Б - увеличение х1 ООО.

Рис. 9. Локализованные очаги инфекции семенника мыши на 8 день после внутрибрюшинного заражения ВПГ 8-дневной мыши. Инфицирующая доза 1 ЛД50. А -увеличение х100, Б - увеличение х400.

шяямшшшшш

V V

• •

Рис. 10. Индивидуальные клетки семенника, окрашенные МКА на 18 день после внутрибрюшинного заражения ВПГ 8-дневной мыши. Инфицирующая доза - 1 ЛД ¡о-

Стрелками обозначены клетки, содержащие белки ВПГ в цитоплазме. Увеличение х400.

к вирусу, наряду с ИС, отражающим долю канальцев с различным числом клеточных генераций, оценивали отдельно количество сперматогониев, сперматоцитов, ранних и поздних сперматид и сперматозоидов на 8-й и 16-й дни инфекции относительно соответствующих исходных значений. Полученные результаты подтвердили прогрессивный вирусспецифический литический эффект ВПГ и ЦМВ на половые клетки, находящиеся на различных стадиях цитодифференцировки: в первую очередь сперматоцитов и ранних сперматид, в меньшей степени - сперматогониев (табл. 1). 100%-ая сохранность сперматозоидов в инфицированной культуре на протяжении всего срока культивирования позволяет предположить, что зрелые половые клетки мало чувствительны или резистентны к изучаемым герпесвирусам.

Таблица 1

Сравнительный анализ популяции мужских половых клеток в зараженной ВПГ и в

незараженной органной культуре яичка человека

Клетки герминативного эпителия Продолжительность культивирования in vitro

8 день 16 день

Контроль Опыт Контроль Опыт

Сперматогонии 100* 52,1 82,2 35,6

р<0.001** pO.OOl

Сперматоциты 100 1 26,6 51,5 1 16,7

р<0.001 р<0.001

Ранние сперматиды 104 1 36,5 70,4 1 20

р<0.001 р<0.001

Поздние сперматиды 96 1 62,3 65,7 1 59,1

р<0.001 р>0.05

Сперматозоиды 106,3 1 100 106,3 1 100

р>0.05 р>0.05

Индекс сперматогенеза 3,34 1 3,09 3,19 1 2,67

р<0.05 р<0.05

* - данные представлены в процентном отношении числа клеток к соответствующему

значению до начала культивирования; ** - критерий Стьюдента 2. ВПГ-инфекция семенника мыши in vitro.

Опыты проводили на мышах 3-х возрастных групп: 9-дневных (группа I), 17-дневных (группа И) и 5-месячных (группа III). Выбор возрастных групп был обусловлен временем появления различных стадий половых клеток мыши в онтогенезе. Так, на 9-й день жизни (группа I) половые клетки представлены исключительно сперматогониями, что удобно для изучения их пролиферации и дифференцировки в сперматоциты. На 17-й день сперматоциты готовятся к вступлению в мейоз, поэтому заражение на данном сроке (Группа II) позволяет исследовать влияние вируса на формирование сперматид. Группа половозрелых мышей (группа III) была включена в эксперимент для оценки

чувствительности гонад препубертатных мышей к ВПГ по сравнению с гонадами взрослых особей. В отличие от предыдущих экспериментов осуществляли кратковременное культивирование эксплантов семенников (до 6 дней) для определения воздействия ВПГ на конкретные этапы созревания половых клеток.

2.1. Динамика ВПГ- инфекции в органной культуре семенника мыши.

Исходными уровнями ВПГ считали показатели инфекционной активности вируса и

содержания ДНК ВПГ, обнаруженные в культуре через 1 час после заражения - до начала репликации ВПГ. В образцах, полученных на данном сроке, концентрация ДНК ВПГ и инфекционная активность во всех исследуемых группах не превышали 104 копий/мл и 65 БОЕ/мл, соответственно. В процессе культивирования концентрация вирусных маркеров увеличивалась в 10-1000 раз в зависимости от исследуемой группы, что свидетельствует об активной репликации ВПГ в условиях эксперимента.

Было показано, что концентрация вирусной ДНК в группе III ниже, чем в группах I и II, которые по данному показателю не отличаются между собой. В то же время содержание инфекционно активного вируса в группах II и III оказалось ниже по сравнению с группой I. В группе I вирусная нагрузка, по данным БКМ, нарастала в течение 6 дней культивирования, в группе II достигала максимума на 4-й день и затем снижалась. В группе III концентрация инфекционно активного вируса уменьшалась уже после 2-го дня культивирования. Обнаруженные различия в динамике между накоплением ДНК и концентрацией вируса можно объяснить более длительным сохранением ДНК в органной культуре по сравнению с полноценными вирионами, обладающими инфекционной активностью.

Интересно также отметить, что несмотря на отсутствие существенных различий в концентрации вирусной ДНК в культуре семенника мыши, полученной на 9-й и 17-й дни жизни, в последнем случае отмечены значительно более низкие показатели по количеству инфекционно активных вирусных частиц. Возможно, полученные данные объясняются тем, что формирование защитного барьера на 17-19 дни жизни приводит к снижению эффективности сборки вирусных частиц или других морфогенетических процессов.

2.2. Локализация ВПГ в органной культуре семенника мыши.

Для выявления локализации ВПГ в инфицированной культуре были использованы методы иммуногистохимии и электронной микроскопии. Как видно на рис. 6А, в препаратах, полученных от мышей группы I, были выявлены обширные локусы окраски семенных канальцев, при этом вирусные антигены были обнаружены в сперматогониях и в клетках Сертоли. При окраске препаратов от животных группы II в среднем 20% клеток

герминативного эпителия (в основном, сперматогонии), содержали вирусный антиген (Рис. 6В). В контрольных образцах вирусные белки не были выявлены (рис. 6Б и 6Г). Ультраструктурные исследования подтвердили присутствие ВПГ в инфицированной органной культуре семенников препубертатных мышей (рис. 7).

2.3. Влияние ВПГ на половые клетки мыши.

В группе I на 4-й день культивирования семенников (13-й день онтогенеза in vivo), мы наблюдали появление сперматоцитов in vitro, при этом количество канальцев, содержащих данные клетки в зараженной культуре, оказалось в 2,5 раза меньше, чем в контроле (табл. 2). Учитывая сохранность сперматогониев на данном сроке, полученные данные можно объяснить нарушением их цитодифференцировки под влиянием ВПГ.

Таблица 2

Сравнительный гистологический анализ эксплантов семенника мыши, введенных в культуру на 9-й день и 17-й день после рождения

Дни инфекции/ дни после рождения Количество канальцев (в %), содержащих клетки:

Сперматогонии Сперматоциты Круглые сперматиды Клетки Сертоли

Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль

Группа I

4/13 100 100 8а 19a - - 100 100

6/15 16b 50" 0 0 - - 16е 50 е

Группа II

4/21 100 100 40" 100" 60 е 100 е 100 100

6/23 30г 1001 0g 80 g 0 h 60" 30' 100'

а-р<0.05,

ь, с, а, е, f, g, h, i _ р<о оо 1 (критерий хи-квадрат)

В группе II на 4-й день культивирования (21-й день жизни) отмечали появление круглых сперматид в 100% канальцев контрольной культуры и только в 60% канальцев в зараженных эксплантах (табл. 2). Указанные различия могут быть связаны как с гибелью сперматоцитов, так и с частичным блоком мейоза при ВПГ-инфекции. На 6-й день

культивирования была показана гибель сперматогониев, сперматоцитов и сперматид под влиянием вируса, а также впервые описана гибель клеток Сертоли при ВПГ-инфекции.

3. ВПГ-инфекция мужских гонад in vivo.

3.1. ВПГ-инфекция мужских гонад при заражении животных in vivo в препубертатном периоде.

В следующей серии экспериментов проводили внутрибрюшинное заражение ВПГ неполовозрелых мышей (на 8 день после рождения). Три группы мышей-самцов были сформированы в зависимости от количества ВПГ в 100 мкл инокулята при внутрибрюшинном введении: группа I (105-106 БОЕ/мл, п= 7), группа II (103 -104 БОЕ/мл, п=29) и группа III (10'-102 БОЕ/мл, п=22). Заражали также 8-дневных самок указанными дозами вируса, чтобы установить ЛД50 ВПГ для данной возрастной группы мышей DBA. В соответствии с полученными данными указанные концентрации ВПГ для групп I, II и III составили соответственно 10 ЛД50, 1 ЛД50 и 0,1 ЛД5о-

Динамику вирусной инфекции в семенниках оценивали в группе II, так как у данных животных, по сравнению с группами I и III, наблюдали наилучшее соотношение между эффективностью инфицирования семенников (100%) и выживаемостью (59%). По данным ПЦР-анализа вирусная нагрузка в тестикулярной ткани постепенно снижалась с 8-го по 28-й дни инфекции. Интересно, что частота выявления ВПГ в левом семеннике была значительно выше, чем в правом, что, вероятно, связано с особенностями кровоснабжения левого и правого семенников (97% против 66%, р=0,008).

Иммуногистохимическая окраска подтвердила тенденцию, выявленную при помощи ПЦР. Максимальное количество вирусного антигена в половых клетках выявляли на 3-й день инфекции, при этом окрашенные клетки располагались диффузно по всей площади среза (Рис. 8). В дальнейшем происходило снижение количества окрашенных клеток, и на 8-й день были обнаружены очаги инфекции, охватывающие несколько семенных канальцев, при этом в остальной части семенника окрашенные клетки отсутствовали (Рис. 9). На 18-й день инфекции окрашенными оказались единичные клетки или группы клеток внутри канальца - в основном, сперматогонии и сперматоциты (Рис. 10). На 28-й день не было выявлено окрашенных клеток. Таким образом, можно заключить, что in vivo к 36 дню жизни (28 день после заражения) очаги инфекции были локализованы и активная репликация вируса в семеннике подавлена.

Эксперимент in vivo в целом подтвердил негативное влияние ВПГ на мужские половые клетки, а также позволил обнаружить особенности воздействия вируса на сперматогенез в естественных условиях. Кроме того, было показано, что в основе

гаметотоксического эффекта ВПГ лежат два различных механизма - гибель половых клеток и снижение их пролиферативной активности. Как и в предыдущих экспериментах, сперматоциты и сперматиды оказались наиболее чувствительными к вирусу. Если гибель сперматогониев наблюдали только при высокой инфицирующей дозе, сперматоциты и сперматиды погибали также и при средней дозе, а при низкой дозе не было выявлено различий в количестве канальцев, содержащих гибнущие половые клетки в контроле и в опыте. Прямого воздействия ВПГ на сперматозоиды не было выявлено.

3.2. Влияние ВПГ-инфекции на фертильность самцов мышей, зараженных в препубертатном периоде.

Для оценки влияния ВПГ на фертильность мышей-самцов линии DBA проводили спаривание 16 самцов, возрастом 56 дней (8 инфицированных из группы II и 8 неинфицированных), с 32 неинфицированными самками (по 2 самки на каждого самца). Подсадка самок к самцам длилась 2 суток, после чего осуществлялся забой самцов для изучения морфологии семенников, ПЦР-анализа и иммуногистохимического исследования. Основные параметры, которые были изучены для оценки фертильности самцов, представлены в Таблице 3.

Таблица 3

Оценка фертильности самцов мышей, инфицированных ВПГ в препубертатном периоде.

Параметры Группы животных

Неинфицированные самки +неинфицированные самцы Неинфицированные самки +инфицированные самцы

Средний вес семенников, г 0,094* 0,081*

Число родившихся детенышей, гол. 55 4

Доля фертильных самцов в группе, % 87,5** 12,5**

*р=0,01; * *р=0,012 (критерий Стьюдента)

Было показано, что у самцов, которых заражали ВПГ в возрасте 8 дней, полтора месяца спустя фертильность оказалась снижена по сравнению с контролем. Об этом свидетельствует как низкая частота наступивших беременностей, так и меньшее число новорожденных, полученное в сравниваемых группах.

Таким образом, впервые получены прямые данные, свидетельствующие о негативном влиянии вируса на фертильность. Интересно, что у большинства бесплодных самцов (6/7), обследованных после спаривания, вирус был выявлен в урогениталыюм тракте - в семенниках и почках. Гистологический анализ семенников в данной группе животных позволил выявить снижение пролиферативной активности половых клеток, а

также дееквамацию герминативного эпителия в просвет канальца. Несмотря на описанные гистологические изменения в большинстве канальцев у инфицированных животных сперматогенез завершался образованием сперматозоидов. В то же время фертильность самцов в данной группе оказалась значительно снижена по сравнению с контролем, что указывает на необходимость дальнейших экспериментов, которые позволят раскрыть механизмы, лежащие в основе нарушения фертильности при ВПГ-инфекции.

Выводы

1. Разработана модель герпесвирусной инфекции мужских половых клеток in vitro на основе органной культуры семенника мыши и яичка человека, которая является информативной экспериментальной системой для изучения сперматогенеза.

2. Доказана репликация ВПГ и ЦМВ в органной культуре мужских гонад мыши и человека.

3. В инфицированной органной культуре мужских гонад выявлены прямые маркеры герпесвирусов (антигены, вирусные капсиды и вирионы) в половых клетках, находящихся на разных стадиях цитодифференцировки: сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах, сперматозоидах.

4. Установлено, что негативное влияние герпесвирусов на сперматогенез проявляется в подавлении дифференцировки половых клеток, блокировании мейоза и гибели сперматогенных клеток.

5. Впервые показано, что экспериментальное заражение мышей-самцов в препубертатном периоде приводит к снижению фертильности в половозрелом возрасте.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Тюленев Ю.А., Науменко В.А., Климова P.P., Курило Л.Ф., Шилейко JI.B., Сегал А.С., Ковалев В.А., Кущ А.А. Разработка органной культуры мужских гонад для вирусологических исследований // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Том 5, №4. - С. 66-69.

2. Науменко В.А., Тюленев Ю.А., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Ковалев В.А., Сегал А.С., Климова P.P., Кущ А.А. К патогенезу мужского бесплодия: гаметотоксический эффект вируса простого герпеса и цитомегаловируса человека // Материалы 9-го Российского научно-образовательного форума «Мужское здоровье и долголетие» (16-17 февраля 2011 г.). - Москва, 2011. - С. 54.

3. Tyulenev Y., Naumenko V., Kurilo L., Shileyko L., Segal A., Klimova R., Kushch A.. Herpes simplex virus infection is a risk factor for male infertility // Hum. Reprod. Abstracts of the 27th Annual Meeting of ESHRE, Stokholm, Sweden, 3-6 July 2011. - 2011. - V. 26. - Suppl. 1. - il 23.

4. Naumenko V.A., Tyulenev Yu.A., Yakovenko S.A., Kurilo L.F., Shileyko L.V., Segal A.S., Zavalishina L.E., Klimova R.R., Tsibizov A.S., Alkhovskii S.V., Kushch A.A. Detection of human cytomegalovirus in motile spermatozoa and spermatogenic cells in testis organotypic culture // Herpesviridae. - 2011, 2:7, doi: 10.11868/2042-4280-2-7.

5. Науменко B.A., Тюленев Ю.А., Сегал A.C., Пушкарь Д.Ю., Ковалев В.А., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Климова Р.Р, Альховский С.В., Кущ А.А. Влияние вируса простого герпеса на сперматогенез // Урология. - 2011. - №6. - С. 32-36.

6. Тюленев Ю.А., Науменко В.А., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Кущ А.А. Нарушения сперматогенеза при заражении вирусом простого герпеса в препубертатном периоде // Материалы 10-го Юбилейного Российского научно-образовательного форума «Мужское здоровье и долголетие» (15-16 февраля 2012 г.). — Москва, 2012. — С. 97.

7. Тюленев Ю.А., Науменко В.А., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Гущина Е.А., Альховский С.В., Кущ А.А. Нарушения сперматогенеза при заражении вирусом простого герпеса в препубертатном периоде: исследование на модели органной культуры семенника мыши // Андрология и генитальная хирургия. - 2012. - №3. -С.33-37.

8. Tyulenev Y.A., Masalova O.V., Naumenko V.A., Shileyko L.V., Klimova R.R., Kurilo L.F., Kushch A.A. Herpes simplex virus in the testis of prepuberal and adult mice: in vivo and in vitro models // Abstracts of the 22nd ЕССМШ, London, 31 March-3 April 2012, J. Clinical Microbiology and Infection, V.18(s3).

9. Тюленев Ю.А., Науменко В.А., Гущина Е.А., Кущ А.А. Вирус простого герпеса в клетках Сертоли, сперматогониях и перитубулярных клетках // Тезисы докладов XXIV Российской конференции по электронной микроскопии (29 мая - 1 июня 2012г). -Черноголовка, 2012. -С.498.-Р. 188.

10. Tyulenev Yu. A., Naumenko V.A., Shileyko L.V., Kurilo L.F., Kushch А.А. Herpes simplex virus induces apoptosis of mouse spermatocytes and spermatids, but not spermatogonia // Abstract book «Programmed cell death in biology and medicine», 4-5 June 2012. - Moscow, 2012.-P. 57.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БКМ - быстрый культуральный метод

ВПГ - вирус простого герпеса

ГВИ - герпесвирусная инфекция

ГТБ - гемато-тестикулярный барьер

ИС - индекс сперматогенеза

МКА - моноклональные антитела

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

ЦМВ - цитомегаловирус

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

Заказ № 127-А/10/2012 Подписано в печать 26.10.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тюленев, Юрий Александрович

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика герпесвирусов.

1.1. Таксономическое положение семейства Herpesviridae

1.2. Структура вириона герпесвирусов

1.3. Репликативный цикл герпесвирусов

Глава 2. Общие понятия о сперматогенезе.

2.1. Строение мужских гонад

2.2. Мужские половые клетки

2.3. Кинетика сперматогенеза

2.4. Апоптоз во время первой волны сперматогенеза

2.5. Органотипическая культура мужских гонад как модель для изучения сперматогенеза in vitro

Глава 3. Герпесвирусная инфекция мужских гонад.

3.1 .Частота встречаемости герпесвирусов в эякуляте

3.2. Влияние герпесвирусов на показатели спермограммы

3.3. Изучение влияния герпесвирусов на сперматогенез на экспериментальных моделях

3.4. Внутригаметная герпесвирусная инфекция

3.5. Выявление герпесвирусов в подвижных сперматозоидах

3.6. Возможность оплодотворения яйцеклетки инфицированным сперматозоидом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на мужские половые клетки и сперматогенез при экспериментальной инфекции in vitro и in vivo"

Актуальность проблемы.

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) широко распространены в человеческой популяции, способны передаваться половым путем и вызывать широкий спектр заболеваний [141; 165]. Воспалительные заболевания органов репродуктивной системы являются одной из главных причин бесплодия в браке - проблемы, имеющей не только медицинское, но и социальное значение. Присутствие маркеров герпесвирусов в органах и тканях мужской репродуктивной системы [150], а также данные о повышенной частоте обнаружения ВПГ в эякуляте бесплодных мужчин [3;8; 9] указывают на возможную связь ВПГ-инфекции с нарушением фертильности. Сведений о влиянии ЦМВ на репродуктивную функцию мужчины крайне мало и они противоречивы. Существует представление, что семенники могут являться резервуаром вирусных инфекций в организме ввиду наличия гемато-тестикулярного барьера, который, с одной стороны, препятствует попаданию патогенов в семенник, с другой стороны -ограничивает доступ иммунокомпетентных клеток в уже зараженный орган [57].

Многие проблемы, связанные с участием герпесвирусов в формировании мужского бесплодия, оставались невыясненными. Недостаточно данных о влиянии ВПГ и ЦМВ на мужские половые клетки, практически отсутствуют сведения о воздействии герпесвирусов на процесс сперматогенеза, не установлена чувствительность неонатальных половых клеток к герпесвирусам и неясны последствия заражения в препубертатном периоде для репродуктивного здоровья в половозрелом возрасте. Решение перечисленных проблем необходимо для раскрытия патогенетическиех механизмов герпесвирусного инфицирования гамет, для выяснения вклада этих патогенов в формирование мужского бесплодия, для разработки эффективных средств диагностики, профилактики и лечения бесплодия, а также для предотвращения горизонтального и вертикального распространения герпесвирусов (ГВ) через мужские гаметы.

Цель и задачи исследования:

1. Разработать модель герпесвирусной инфекции (ГВИ) семенника мыши и яичка человека in vitro.

2. Проследить динамику репликации вирусной ДНК и инфекционной активности ВПГ и ЦМВ в мужских гонадах in vitro.

4. Изучить влияние герпесвирусов на структуру популяции, дифференцировку и пролиферацию половых клеток в семеннике мыши и яичке человека

Научная новизна и практическая значимость:

1. Разработана модель ГВИ мужских гонад in vitro.

4. Впервые показана способность ВПГ инфицировать половые клетки семенника мыши в неонатальном периоде.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определена динамика инфекционного процесса в органной культуре мужских гонад на двух моделях: 1 — заражение ВПГ клеток семенника мыши и 2 - заражение ВПГ и ЦМВ клеток яичка человека.

5. Установлено негативное влияние ВПГ на репродуктивную функцию половозрелого мужского организма при инфицировании вирусом в раннем неонатальном периоде.

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тюленев, Юрий Александрович

Выводы:

1. Разработана модель герпеевирусной инфекции мужских половых клеток in vitro на основе органной культуры семенника мыши и яичка человека, которая является информативной экспериментальной системой для изучения сперматогенеза.

2. Доказана репликация ВПГ и ЦМВ в органной культуре мужских гонад мыши и человека.

3. В инфицированной органной культуре мужских гонад выявлены прямые маркеры герпесвирусов (антигены, вирусные капсиды и вирионы) в половых клетках, находящихся на разных стадиях цитодифференцировки: в сперматогониях, в сперматоцитах, в сперматидах, в сперматозоидах.

Заключение.

Данные предыдущих исследований о высокой частоте выявления ВПГ в эякуляте мужчин с бесплодием, ухудшении показателей качества спермы, изменении состава популяции незрелых половых клеток у ВПГ-инфицированных лиц, в совокупности с продемонстрированными в настоящей работе негативным влиянием на сперматогенез, а также гаметотоксическим воздействием вируса в экспериментальных модельных системах, указывают на то, что ВПГ играет определенную патогенетическую роль в формировании мужского бесплодия.

Вопрос об этиологической роли ЦМВ в развитии бесплодия у мужчин остается спорным. Для установления связи ЦМВ-инфекции с репродуктивной функцией человека требуются как дальнейшие клинические исследования с привлечением больших контингентов обследованных лиц, так и изучение механизмов взаимодействия ЦМВ с мужскими половыми клетками на предложенных нами моделях.

Изучение действия ВПГ на сперматогенез при заражении в препубертатном периоде, проведенное в настоящей работе, показало опасность заражения детей в неонатальном периоде, которое может происходить, в том числе, и через молоко матери при грудном вскармливании. На важное значение данного результата указывают также имеющиеся данные о том, что заражение ВПГ может происходить у человека во время беременности [45] и родов [43]. Нарушения сперматогенеза, выявленные на ранних стадиях постнатального онтогенеза, могут в дальнейшем оказывать негативное влияние на мужскую фертильность.

Новые результаты, полученные в настоящей работе, имеют значение для фундаментальной вирусологии и теоретической медицины. Они важны также для практического здравоохранения. Своевременная постановка диагноза и начало лечения в неонатальном периоде позволит предотвратить развитие заболевания и формирование мужского бесплодия в половозрелом возрасте. Установление связи между ГВИ эякулята и бесплодием у мужчин указывает на необходимость включения исследования эякулята на маркеры герпесвирусов (методом ПЦР, БКМ) в алгоритм диагностики мужского бесплодия. Выполнение данного вида исследования может быть рекомендовано также при использовании ВРТ, а также при естественном планировании беременности для предотвращения риска вертикальной передачи герпесвирусов с мужскими гаметами. Этиологическая расшифровка диагноза при мужском бесплодии открывает перспективы использования специфической противовирусной терапии в лечении данных пациентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тюленев, Юрий Александрович, Москва

1. Абдулмеджидова А.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В. и соавт. Бессимптомная форма генитального герпеса и бесплодие у мужчин // Урология. 2007. - №3. - С.56-59.

2. Барановская Е.И., Жаворонок C.B., Супрун Л.Я. и соавт. Особенности течения беременности и родов у больных с герпесвирусными инфекциями // Акушерство и гинекология. — 2004. №5. — С. 49-50.

3. Бочарова E.H., Брагина E.H., Гусак Ю.К. и соавт. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов // Андрол и генит хирургия. 2006. - № 1. - С. 59-65.

4. Бочарова E.H. Климова P.P., Завалишина Л.Э. и соавт. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека методом гибридизации in situ // Материалы Всерос науч-практ конф «Медицинская микробиология XXI век»; Саратов, 2004. - С. 44-45.

5. Бочарова E.H., Абдумаликов P.A., Брагина Е.Е. и соавт. Обнаружение белков и капсидов ВПГ в сперматозоидах человека // Докл. Акад. Наук (клеточная биология). 2003. - №6. - С. 836-841.

6. Брагина Е.Е. Закономерности нарушений сперматогенеза человека при некоторых генетических и инфекционных заболеваниях. Автореф. дис . докт. биол.н.; М, 2001. 53 с.

7. Брагина Е.Е., Абдумаликов P.A. Руководство по сперматологии. М.: Сорек-ролиграфия, 2002. - 108 с

8. Брагина Е.Е., Абдумаликов P.A., Курило Л.Ф. и соавт. Выявление сперматозоидов, инфицированных вирусом простого герпеса // Вестн. дерм, венер.- 2000.-№ 5.-С. 18-22.

9. Марданлы С.Г., Кирпичникова Г.И., Неверов В.А. Герпетическая инфекция (простой герпес). Этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика, лечение. Электрогорск: Изд-во «Эколаб», 2005. - 48 с.

10. Науменко В.А., Тюленев Ю.А., Сегал А.С. и соавт. Влияние вируса простого герпеса на сперматогенез // Урология 2011. - №6. — С. 32-36.

11. Нишлаг Э., Бере Г.М. Андрология. Мужское здоровье и дисфункция репродуктивной системы. -2005.

12. Серебренникова К.Г. «Современные возможности диагностики и лечения женского бесплодия» // Ж. Качество жизни. М., Медицина. — 2004.- №3(6). -С.55-59.

13. Тер-Аванесов Г.В. Андрологические аспекты бесплодного брака //. Болезни репродуктивной системы. 2004. - №3. - С. 60-65.

14. Фролова О.Г. Репродуктивное здоровье женщин // Ж. Качество жизни. М., Медицина. 2004. - №3(6). - С.9-12.

15. Aiman J., Brenner P.F., MacDonald P.C. Androgen and estrogen production in elderly men with gynecomastia and testicular atrophy after mumps orchitis // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1980. - V. 50. - P. 380-654.

16. Aizawa S, Nishimune Y. In vitro differentiation of type A spermatogonia in use cryptorchid testis.// J. Reprod. Fertil. -1979.-V.56.- P. 99-104.

17. Alastalo T.P., Lonnstrom M., Leppa S. et al. Stage-specific expression and cellular localization of the heat shock factor 2 isoforms in the ratseminiferous epithelium. //Exp. Cell Res.-1998.-V.240.-P. 16-27.

18. Al-Shawi R., Burke J., Wallace H. et al. The herpes simplex virus type 1 thymidine kinase is expressed in the testes of transgenic mice under the control of a cryptic promoter.// Mol. Cell Biol.- 1991.-V. 11.- P. 4207-4216.

19. Althaus F.A. An ounce of prevention STDs and women's health // Fam Plann Perspect. -1991.- V.23. P. 173-177.

20. Asher Y., Heller M., Becker Y. Incorporation of lipids into herpes simplex virus particles.-1969.- J. Gen. Virol.- V.4. P. 65-76

21. Aslam H., Rosiepen G., Krishnamurthy H. et al. The cycle duration of the seminiferous epithelium remains unaltered during GnRH antagonist-induced testicular involution in rats and monkeys.// J. Endocrinol.-1999.-V.161. — P. 281-288.

22. Barton S., Munday P., Patel R. Asymptomatic shedding of herpes simplex virus from the genital tract: uncertainty and its consequences for patient management. The herpes simplex virus advisory panel // Int. J. STD AIDS. -1996. V.7. - P. 229-232.

23. Bascar J.F., Stanat S.C., Huang E-S. Cytomegalovirus infection of murine testicular interstitial Leydig Cells // Infection and Immunity. 1983. - V. 40,- №2.-P. 726-732

24. Baskar J.F., Furnari B., Huang E.S. Demonstration of developmental anomalies in mouse fetuses by transfer of murine cytomegalovirus DNA-injected eggs to surrogate mothers // J. Infect. Dis. 1993. - V. 167. — P. 1288-1295.

25. Baskar J.F., Stanat S.C., Huang E.S. Murine cytomegalovirus infection of mouse testis // J. Virol. 1986. - V. 57. - P. 1149-1154.

26. Baskin G. B. Disseminated cytomegalovirus infection in immunodeficient rhesus monkeys // Am. J. Pathol. 1987. - V. 129. - P. 345-352.

27. Bellve A.R. et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization // J. Cell Biol. 1977. - V. 74. - P. 68

28. Bezold G., Politch J.A., Kiviat N.B. et al. Prevalence of sexually transmissible pathogens in semen from asymptomatic male infertility patients with and without leukocytospermia // Fertil Steril. 2007. - V. 87. -P. 1087-1097.

29. Bezold G., Schuster-Grusser A., Lange M. et al. Prevalence of human herpesvirus types 1-8 in the semen of infertility patients and correlation with semen parameters // Fertil. Steril. 2001. - Vol. 76. - P. 416-418.

30. Biggar R.J., Adersen H.K., Ebbesen P. et al. Seminal fluid excretion of cytomegalovirus related to immunosupression in homosexual men // Br. Med. J. 1983. -V. 286. - P. 2010-2012.

31. Biswal N., Murray B.K., Benyesh-Melnick M. Ribonucleotides in newly synthesized DNA of herpes simplex virus. //Virology.- 1974,- V.61. P. 8799.

32. Boitani C, Politi MG, Menna T. Spermatogonial cell proliferation in organ culture of immature rat testis.// Biol. Reprod. -1993. V.48.- P. 761-767.

33. Borghese E, Venini MA. Culture in vitro de gonades embryonnaires de Mus musculus. //Symp. Genetica. -1956,- V.5. P.69-83.

34. Boue A., Loffredo V. Abortion caused by type II Herpesvirus. Isolation of virus from cultures of zygotic tissues // Presse Med. 1970. - V. 78. - P. 103-106.

35. Braun R.E., Lo D., Pinkert C.A. et al. Infertility in male transgenic mice: disruption of sperm development by HSV-tk expression in postmeiotic germ cells. //Biol. Reprod. 1990. -V. 43. -P. 684-693.

36. Braun R.E. Temporal control of protein synthesis duringspermatogenesis.//Int. J. Androl. 2000.- V. 2. - P. 92-94.

37. Bresson J.L., Clavequin M.C., Mazeron M.C. et al. Risk of cytomegalovirus transmission by cryopreserved semen: a study of 635 semen samples from 231 donors // Hum. Reprod. 2003. -V. 18. -P. 1881-1886.

38. Brinkworth M.H., Weinbauer G.F., Bergmann M., Neischlag E. Apoptosis as a mechanism of germ cell loss in elderly men. Int. J. Androl.-1997.-V. 20.- P. 222-228.

39. Brooks A. Within- and between-subject variation in semen parameters in infertile men and normal semen donors // Fértil. Steril. 2006. — V. 85. — P. 128-134.

40. Brown Z.A. et al. Neonatal herpes simplex virus infection in relation to asymptomatic maternal infection at the time of labor // N. Engl. J. Med. — 1991. V. 324. - P. 1247-1252.

41. Bunting L., Boivin J. Development and preliminary validation of the fertility status awareness tool: FertiSTAT// Hum Reprod. 2010. - V.25. - P.1722-1733.

42. Burgos J.S., C. Ramirez , F. Guzman-Sanchez et al. Hematogenous vertical transmission of herpes simplex virus type 1 in mice // J. Virol. — 2006. — V. 80 (6).-P. 2823-2831.

43. Burgos J.S., Ramirez C., Sastre I. et al. Herpes simplex virus type 1 infection via the bloodstream with apolipoprotein E dependence in the gonads is influenced by gender // J Virol.- 2005. V.79. - P.1605-1612.

44. Caia L-Y., Katob T., Nakayamaa M. et al. HSV type 1 thymidine kinase protein accumulation in round spermatids induces male infertility by spermatogenesis disruption and apoptotic loss of germ cells // Reprod. Tox. 2009.-V. 27.-P. 14-21.

45. Cassai E.N., Sarmiento M, Spear P.G. Comparison of the virion proteins specified by herpes simplex virus type 1 and 2.// J. Virology.-1975.-V. 16.-P. 1327-1331.

46. Chairussyuhur A, Sa'nchez-Partida LG, Maddocks S et al. Quail yolk and coconut extract in diluents for storage of ram semen at 30 C and 5 C. Proceedings of the 25th Annual Conference of the Australian Society for Reproductive Biology; 1993.

47. Champy C. Quelques re'sultats de la me'thode de culture des tissus. Arch.Zool. Exp. Gen.-1920. -V.60. -P. 461-500.

48. Charny, C.W. and Meranze, D.R. Pathology of mumps orchitis.// J. Urol.-1948.- V. 60.- P. 140.

49. Chrystie I. L., Mullen J. E., Braude P. R. et al. Assisted conception in HIV discordant couples: evaluation of semen processing techniques in reducing HIV viral load // J. Reprod. Immunol. 1998. - V. 41. - P. 301-306.

50. Clermont Y, Leblond CP, Messier B. Dure'e du cycle de Perithelium se'minal du rat.// Arch. Anat. Microsc. Morphol. Exp. -1959.-V.48.- P. 3756.

51. Clermont Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man. //Am. .J Anat.- 1963.- V.112. -P. 35-51.

52. Courtot A.M., Pallier C., Testart J. Viral transmission and medically assisted procreation: the Herpesviridae case // Gynecol. Obstet. Fertil. 2004. — V. 32.-P. 233-240.

53. Cremades N., Bernabeu R., Barros A. and Sousa M. In vitro maturation of round spermatids using coculture on Vero cells.// Hum. Reprod.- 1999.- V. 14.-P. 1287-1293.

54. Csata S., Kulcsar G. Virus-host studies in human seminal and mouse testicular cells // Acta Chir. Hung. 1991. - V. 321. - P. 83-90.

55. Dalton A.D., Harcourt-Webster J.N. The hystopathology of the testis and epididymis in AIDS. A post-mortem study // J. Pathol. 1991. - V. 163. - P. 47-52.

56. Davidson A.J. Evolution of herpesviruses // Vet Microbiol. 2002. — V.86. -P. 69-88.

57. Davison A.J., Wilkie N.M. Location and orientation of homologous sequences in the genomes of five herpes viruses.// J. Gen. Virology.-1983.-V.64.-P. 1927-1941.

58. De Kretser D., Kerr J. The cytology of the testis. // In book: The physiology of reproduction. Knobil E., Neill J. et al. (eds). Raven press, Ltd New York, 1988.-P. 837-932.

59. De Paepe M.E., Guerrieri C., Waxman M. Opportunistic infections of the testis in the acquired immunodeficiency syndrome // Mt. Sinai J. Med. -1990.-V. 57.-P. 25-29.

60. De Paepe ME, Waxman M. Testicular atrophy in AIDS: a study of 57autopsy cases // Hum Pathol.- 1989.-V.20(3).- P.210-214.69. de Rooij D.G. Stem cells in the testis. //Int. J. Exp. Pathol.-1998.-V.79.-P. 67-80.

61. Dejucq N, Jegou B. The testicular antiviral defence system: I. Interferon and interferon-induced proteins expression in the testis. //Andrologia. .-1999.-V.31(5). -P.306.

62. Dejucq N., Jegou B. Viruses in the mammalian male genital tract and their effects on the reproductive system // Microbiol. Mol. Biol., 2001. — V. 65. — P. 208-231.

63. Deture F.A., Drylie D.M., Kaufman H.E. et al. Herpesvirus type 2: isolation of seminal vesicle and testes // Urol. 1976. - V.7. - P. 541-544.

64. Deture F.A., Drylie D.M., Kaufman H.E. Herpesvirus type 2: study of semen in male subjects with recurrent infections // J Urol. 1978. - V. 120. -P. 449- 451.

65. Dolyniuk M., Pritchett R., Kieff E. Proteins of Epstein-Barr virus. I. Analysis of the polypeptides of purified enveloped Epstein-Barr virus.// J.Virology.-1976.- V.17.- P. 935-949.

66. Dutko F. J., Oldstone M. B. Murine cytomegalovirus infects spermatogenic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. - V. 76. - P. 2988-2991.

67. Dux C. Recherches sur les cultures de testicule hors de l'organisme. Action de l'hormone gonadotrope. Arch Anat Microsc (Paris). 1939. V.35. - P. 391.

68. Ellison A.R, Bishop J.O. Initiation of herpes simplex virus thymidine kinase polypeptides // Nucleic Acids Res. 1996. - V.24. - P.2073-2079.

69. Ellison A.R., Wallace H., Al-Shawi R. et al. Different transmission rates of herpesvirus thymidine kinase reporter transgenes from founder male parents and male parents of subsequent generations // Mol Reprod Dev. — 1995. — V. 41. — P. 425-434.

70. Erles K., Rohde V., Thaele M. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples // Hum Reprod. — 2001. — V.16. -P.2333-2337.

71. Falke D., Siegert R., Vogell W. Electronenmicroscopische Befunde zur Frage der Doppelmembranbildung des Herpes simplex virus. Arch. Ges. Virusforsch.-1959.- V. 9. -P. 484-496.

72. Fawcett W. The mamallian spermatozoon. 1975. - V. 44. - P. 394-436.

73. Fong C.K.Y., Tenser R.B., Hsiung G.D., Gross P.A. Ultrastructiral studies of the envelopment and release of guinea pig herpes-like virus in cultured cells. //Virology.- 1973.- V. 52. P. 468-477.

74. Freeman R., Hambling M. H. Serological studies on 40 cases of mumps virus infection // J. Clin. Pathol. 1980. - V. 33. - P. 28-32.

75. Frenkel N., Locker H., Vlazny D.A. Studies of defective herpes simplex viruses.// Ann. NY Acad. Sci. -1980.- V. 354. P. 347-370

76. Furlog D., Swift H., Roizman B. Arrangement of herpesvirus deoxyribonucleic acid in core.// J. Virol.- 1972.- V.10. P.1071-1074

77. Gaillard PJ, Varossieau WW. The structure of explants from different stages of development of the testis on cultivation in media obtained from individuals of different stages.// Acta Neerl Morphol. -1938.- V.l. P. 313.

78. Gall A.E. The histopathology of acute mumps orchitis // Am. J. Pathol. —1940. -V. 23.-P. 637-642.

79. Gerber P., Pritchett R.F., Kieff E.D. Antigens and DNA of a chimpanzee agent related to Epstein-Barr virus. //J. Virol.-1976.-V.19.- P. 1090-1099.

80. Ghatnekar R, Lima-de-Faria A, Rubin S, Menander K. Development of human male meiosis in vitro. //Hereditas.- 1974.-V.78. P. 265-272.

81. Gribencha S.V., Bragina E.E., Abdumalikov R.A et al. Detection of type 2 herpes simplex virus in cells of spermatogenic epithelium in infected testis of guinea pigs // Bull. Exp. Biol. Med. 2007. - V. 144. - P. 73-76.

82. Guazzone, V. A., Jacobo, P., Theas, M. S. & Lustig, L. Cytokines and chemokines in testicular inflammation: a brief review.// Microsc. Res. Tech.-2009. V.72. - P. 620-628.

83. Hall CB, Caserta MT, Schnabel K. Chromosomal integration of human herpesvirus 6 is the major mode of congenital human herpesvirus 6 infection // Pediatrics. 2008. - V. 122(3). - P. 513-20.

84. Hamparian V.V., Hilleman M.R., Ketler A. Contributions to characterization and classification of animal viruses. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1963.-V. 112.-P. 1040-1052.

85. Haneji T, Maekawa M, Nishimune Y. Vitamin A and follicle-stimulating hormone synergistically induce differentiation of type A spermatogonia in adult cryptorchid testes in vitro.// Endocrinology. -1984. V.114.- P. 801— 805.

86. Hayward S.D., Nogee L., Hayward G.S. Organization of repeated regions withing the Epstein-Barr virus DNA molecule. //J. Virology.-1980.-V.33. -P. 507-521.

87. Heine J.W., Roizman B., 1973, Proteins specified by herpes simplex virus. //J. Virol.-V.ll.-P. 810-813.

88. Heller M., Gerber P., Kieff E. DNA of herpesvirus PAN, a third member of the Epstein-Barr virus-herpesvirus papio group.// J. Virol.-1982.-V.41. — P. 931-939.

89. Hirose T. Alpha-herpes virus infection male genital herpes // Nippon Rinsho. - 2000. - V. 58. - P.877-882.

90. Hirtsch I., Vonka V. Ribonucleotides liked to DNA of herpes simplex type 1. //J. Virology.-1974.- V.13.-P. 1162-1168.

91. Huber, S. A., J. Kupperman, and M. K. Newell. Hormonal regulation of CD4 T-cell responses in coxsackievirus B3-induced myocarditis in mice.// J. Virol.- 1999.- V.73. P. 4689-4695.

92. Huttner K. M., Pudney J., Milstone D. S. et al. Flagellar and acrosomal abnormalities associated with testicular HSV-tk expression in the mouse // Biol Reprod. 1993. - V. 49. - P. 251-261.

93. Inhorn M.C. Global infertility and the globalization of new reproductive technologies: illustrations from Egypt // Soc Sci Med. — 2003. V.56. — P.1837-1851.

94. Johnson L, Blanchard T. L., Varner D. D. et al. Factors affecting spermatogenesis in the stallion // Theriogenology. 1997. - V. 48. - P. 1199-1216.

95. Johnson L. A new approach to study the architectural arrangement of spermatogenic stages revealed little evidence of a partial wave along the length of the human seminiferous tubules. //J. Androl.-1994.-V.15. P. 435441.

96. Johnson L., McKenzie K.S., Snell J.R. Partial wave in human seminiferous tubules appears to be a random occurrence. //Tissue Cell.-1996.-V.28. P. 127-136.

97. Jordan M. C., Rousseau W. E., Noble G. R. et al. Association of cervicalcytomegaloviruses with venereal disease // N. Engl. J. Med. 1973. - V. 288.-P. 932-934.

98. Kapranos N., Petrakou E., Anastasiadou C. et al. Detection of herpes simplex virus, cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus in the semen of men attending an infertility clinic // Fértil Steril. 2003. - V. 79: Suppl 3. - P. 1566-1570.

99. Kieff E.D., Bachenheimer S.L., Roizman B. Size, composition and structure of the DNA of subtypes 1 and 2 herpes simplex virus.// J. Virol. -1971.- V. 8.-P. 125-129.

100. Kieff E.D., Hoyer B., Bachenheimer S.L., Roizman B.Genetic relatedness of type 1 and type 2 herpes simplex virus.// J. Virol. -1971.- V. 9. P. 738-745.

101. Kotronias, D., Kapranos N. Detection of herpes simplex virus DNA in human spermatozoa by in situ hybridization technique // In Vivo. — 1998. — V. 12.-P. 391-394.

102. Krishnamurty H., Weinbauer G.F., Aslam H., Yeng C.H., Nieschlag E. Quantification of apoptotic testicular germ cells in normal and methoxyacetic acid-treated mice as determined by flow cytometry.// J. Androl.-1998.-V. 19.-P. 710-717.

103. Kulcsar G., Csata S., Nasz I. Investigations into virus carriership in human semen and mouse testicular cells // Acta Microbiol Hung. 1991. - V. 38. -P. 127-132.

104. Kundsin R. B., Falk L., Hertig A.T. et al. Acyclovir treatment of twelve unexplained infertile couples // Int. J. Fértil. 1987. - V. 32. - P. 200-204.

105. Kyo S., Inoue M., Koyama M. et al. Detection of high-risk human papillomavirus in the cervix and semen of sex partners // J. Infect. Dis. — 1994.-V.170.-P. 682-685.

106. Lai Y. M., Yang F. P., Pao C. C. Human papillomavirus deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid in seminal plasma and sperm cells // Fértil. Steril. -1996. V. 65. - P. 1026-1030.

107. Lai Y.M., Lee J.F., Huang H.Y. et al. The effect of human papillomavirus infection on sperm cell motility // Fértil. Steril. 1997. - V. 67. - P. 11521155.

108. Lang D.J., Kummer J.F. Demonstration of cytomegalovirus in semen // N. Engl. J. Med. 1972. -V. 287. - P. 756-758.

109. Lang D J., Kummer J.F., Hartley D.P. Cytomegalovirus in semen // N. Engl. J. Med. 1974. -V. 291. - P. 121-123.

110. Levy R., Najioullah F., Keppi B. et al. Detection of cytomegalovirus in semen from a population of men seeking infertility evaluation // Fértil. Steril. 1997. - V.68. - P. 820-825.

111. Lo JC, Schambelan M. Reproductive function in human immunodeficiency virus infection. //J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001.- V. 86. - P. 2338-2343.

112. Lopez, C. Genetics of natural resistance to herpesvirus infections in mice. //Nature. 1975. — V.258. — P.152—153.

113. Lostroh AJ. In vitro response of mouse testis to human chorionic gonadotropin. //Proc. Soc. Exp. Biol. N.Y. 1960. - V.103.-P. 25.

114. Ludwig H.O., Biswal N., Benyesh-Melnick M. Studies on the relatedness of herpesviruses through DNA-DNA hybridization. //Virology.-1972.-V.49. -P. 95-101.

115. Macasaet F.F., Holler K.E., Smith T.F. et al. Cytomegalovirus studies of autopsy tissue. Incidence of inclusion bodies and related pathologic data // Am. J. Clin. Pathol. 1975. - V. 63. - P. 859.

116. MacGowan M.P., Haye K., Kovacs G.T. et al. Prevalence of cytomegalovirus and herpes simplex virus in human sperm // Int. J. Androl. 1983. — V. 6.-P. 331-336.

117. Mansat A., Mengelle C., Chalet M. et al. Cytomegalovirus detection in cryopreserved semen samples collected for therapeutic donor insemination // Hum. Reprod. 1997. -V. 12. - P. 1663-1666.

118. Martinovitch PN. Development in vitro of the mammalian gonad. //Nature.-1937.-V.139.-P.413.

119. Mastroianni A., Coronado O., Manfredi R. et al. Acute cytomegalovirus prostatitis in AIDS // Genitourin. Med. 1996. - V. 72. - P. 447-448.

120. Matthews R.E.F., 1982, Classification and nomenclature of viruses. Forth report of the Internaiional Commite on Taxonomy of Viruses, Intervirology, 17, 1-199

121. McCombs R., Brunschwig J.P., Mirkovic R., Benyesh-Melnick M. Electron microscopic characterization of a herpes-like virus isolated from tree shrews.// Virology. 1971.- V. 45. - P. 816-820.

122. Meistrich M.L., van Beek M.E. Spermatogogial stem cells. Oxford University Press, New York.-1993.-pp 266-295.

123. Melaine N., Ruffault A., Dejucq- Rainsford N. et al. Experimental inoculation of the adult rat testis with Sendai virus: effect on the adult leucocyte population. //Human Reproduction. 2003. - V.18. (8). -P. 15741579.

124. Mertz G., Benedetti J., Asbley R. et al. Risk factors for the sexual transmission of genital herpes // Ann. Intern. Med. 1992. - V. 116. - P. 197-202.

125. Michailow W. Experimentell-histologische Untersuchungen u'ber die Elemente der Hodenkanalchen. //Z. Zellforsch.-1937.-V.26. P. 174.

126. Miller C.S., R. J. Danaher, R. J. Jacob. Molecular aspects of herpes simplex virus I latency, reactivation, and recurrence. //Crit Rev Oral Biol Med.-1998. -V. 9.-P. 541-562.

127. Mocarski E. S. Jr., Shenk T., Pass R.F. Cytomegaloviruses. In book: Fields Virology, 5th Ed. by D. Knipe, P. Howley. — Philadelphia: Lippincott,

128. Williams & Wilkins, 2007. P. 2702-2772.

129. Morales A., Mohamed F., Cavicchia J.C. Apoptosis and blood-testis barrier during the first spermatogenic wave in the pubertal rat.// The Anatomical Record.-2007.- V.290.- P. 206-214.

130. Moreno, R. D., Lizama, C., Urzua, N., Vergara, S. P. & Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.// Cell Tissue Res. -2006. -V. 325.- P. 533-540. (doi:10.1007/s00441-006-0186-4)

131. Morgan C., Rose H., Holden M., Jones E. Electron microscopic observations on the development of herpes simplex virus.// J. Exp. Med.-1959.- V. 110.— P. 643-656.

132. Moustafa M.H., Sharma R.K., Thornton J. et al. Relationship between ROS production, apoptosis and DNA denaturation in spermatozoa from patients examined for infertility //Hum Reprod. -2004, V.19, P. 129-3 8

133. Naumenko V.A., Tyulenev Yu.A., Yakovenko S.A. et al. Detection of human cytomegalovirus in motile spermatozoa and spermatogenic cells in testis organotypic culture // Herpesviridae. 2011. - 2:7 doi: 10.11868/20424280-2-7.

134. Nazerian K. DNA configuration in the core of Marek's disease virus. //J. Virol.-1974.-V. 13.-P. 1148-1150.

135. Neighbour P.A., Fraser L.R. Murine cytomegalovirus and fertility: potentional sexual transmission and effect of this virus on fertilization in vitro // Fertil. Steril. 1978. - V. 20. - P. 216-222.

136. Neofytou E., Sourvinos G., Asmarianaki M. et al. Prevalence of human herpes virus types 1-7 in the semen of men attending an infertility clinic and correlation with semen parameters // Fertil. Steril. -2009. V. 91. - P. 24872494.

137. Nunes JF. Utilization of the coconut water as extender for the semen of domestic animals and man. //Rev Bras Reprod Anim. -1998.-V.22. P. 109112.

138. Nuovo, G. J., Becker J., Simsir A.et al. HIV-1 nucleic acids localize to the spermatogonia and their progeny. A study by polymerase chain reaction in situ hybridization. //Am. J. Pathol.- 1994.- V.144. P. 1142-1148.

139. Oakberg EF. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. //Am J Anat. -1956. V. 99. -P. 507-516.

140. Oliver, R. T. 1990. Atrophy, hormones, genes and viruses in aetiology germ cell tumours. //Cancer Surv. V.9. - P. 263-286.

141. Overall J.C. Jr. Herpes simplex virus infection of the fetus and newborn // Pediatr. Ann. 1994. - V.23. - P. 131-136.

142. Pallier C. Tebourbi L., Chopineau-Proust S. et al. Herpesvirus, cytomegalovirus, human sperm and assisted fertilization // Hum. Reprod. — 2002.-V. 17.-P. 1281-1287.

143. Perdue M.L., Kemp M.C., Randall C.C., O'Callaghan D.J. Studies on the molecular anatomy of the L-M strain of equine herpes virus type 1: Proteins of the nucleocapsid and intact virion. //Virology.- 1974.- V.59. P. 201-216.

144. Pineau C., McCool S., Glucksman M.J., Pierotti A.R. Distribution of thimet oligopeptidase (B.C. 3.4.24.15.) in human and rat testes. //J.Cell Sei.-1999.-V.112. — P. 3455-3462.

145. Rand T.H., Ben-Porat T. Distribution of sequences homologous to the DNA of herpes simplex virus type 1 and 2, in the genome of pseudorabies virus. // Intervirology.-1980.-V.13. P. 48-53.

146. Rasmussen L., Morris S., Hamed K. et al. Human cytomegalovirus DNA is present in CD45+ cells in semen from human immunodeficiency virus-infected patients // J. Infect. Dis. 1995. - V. 171. - P. 432-436.

147. Rinaldo C.R. Jr,. Kingsley L.A., Lyter D.W. et al. Excretion of cytomegalovirus in semen associated with HTLV-III seropositivity in asymptomatic homosexual men // J. Med.Virol. 1986. - V. 20. - P. 17-22.

148. Roizman B., 1982, The family of Herpesviridae. General description taxonomy and classification. In: The Viruses, Vol. I; ed. By B. Roizman pp 1-23, Plenum Press, New York

149. Roizman B., Carmichael L.E., Deinhardt F., de The G., Nahmias A J., Plowright W., Rapp F., Sheldrick P., Takanashi M., Wolf K., Herpesviridae. Definition, provisional nomenclature and taxonomy. //Intervirology. 1981. -V. 16.-P. 201-217.

150. Roizman B., Furlong D. The replication of herpesviruses. In: Comprehensive Virology.- 1974.- V. 3.- P.229-403.

151. Roizman B., Knipe D.M., Whitley R.J. Herpes Simplex Viruses. // In book: Fields Virology, 5th Ed. by D. Knipe, P. Howley. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins. - 2007. -P. 2502-2601.

152. Rosiepen G., Chapin R.E., Weinbauer G.F. The duration of the cycle of the seminiferous epithelium is altered by administration of 2,5-hexanedione in the adult Sprague-Dawley rat.//J. Androl.-1995.-V.16. P. 127-135.

153. Roulet V., Denis H., Staub C. et al. Human testis in organotypic culture: application for basic or clinical research // Hum. Reprod. 2006. - V.21. -P. 1564-75.

154. Roulet V., Satie A.-P., Ruffault A. et al. Susceptibility of Human Testis to Human Immunodeficiency Virus-1 Infection in Situ and in Vitro // Am. J. Path. 2006. - V. 169. - P. 2094-2103.

155. Russell L. D., Chiarini-Garcia H., Korsmeyer S. J., Knudson C. M. Baxdependent spermatogonia apoptosis is required for testicular development and spermatogenesis. //Biol. Reprod. -2002. V.66. - P. 950-958. (doi: 10.1095/biolreprod66.4.950)

156. Sarkar O., Bahrainwala J., Chandrasekaran S., Kothari S., Mathur P. P., et al., Impact of inflammation on male fertility.// Front Biosci (Elite Ed). -2011.-V. 1(3).-P. 89-95.

157. Satie A. P.Excess type I interferon signaling in the mouse seminiferous tubules leads to germ cell loss and sterility. // J Biol. Chem.- 201 l.-V. 286. -P. 23280-23295.

158. Saunders P.T., Gaughan J., Saxty B.A., Kerr L.E., Millar M.R. Expression of protamine P2 in the testis of the common marmoset and man visualized using non-radioactive in situ hybridization. //Int.J. Androl.-1996.-V.19. — P. 212-219.

159. Schlatt S., Weinbauer G.F. Immunohistocamical localization of proliferating cell nuclear antigen as a tool to study cell proliferation in rodent and primate testes.// Int. J. Androl.-1994.-V. 17. P. 214-222.

160. Schluze W., Render U. Organization and morphogenesis of the human seminiferous epithelium. //Cell Tissue Res.-1984.-V.237. P. 395-407^

161. Schwartz J., Roisman B. Similarities and differences in the development of laboratory strains and freshly isolated strains of herpes simplex viruses in Hep-2 cells: Electron microscopy. // J. Virol.-1969.- V.4. P. 879-889.

162. Sellmeyer D.E., Grunfeld C. Endocrine and metabolic disturbances in human immunodeficiency virus infection and the acquired immune deficiency syndrome.// Endocr. Rev. 1996. - V. 17. - P. 518-532.

163. Shaha C. Germ cell apoptosis: relevance to infertility and contraception. // Immunol. Endocr. Metab. Agents Med. Chem.- 2008. V.8. -P. 66-78.

164. Sharpe R. Regulation of spermatogenesis. The physiology of reproduction. Raven, New York.-1994.- P. 1363-1434.

165. Sherman J.K., Morgan P.N. Effect of human semen on herpes-simplex virus2 // Fertil Steril. — 1989.-V.51.-P. 186-189.

166. Shukla K.K. et al. Apoptosis, spermatogenesis and male infertility // Front Biosci. 2012. - V. 4. - P. 746-754.

167. Sinha Hikim A.P., Swerdloff R.S. Hormonal and genetic control of germ cell apoptosis in the testis. //Rev. Reprod.-1997.-V.4. P. 38-47.

168. Sofikitis, N., Giotitsas, N., Tsounapi, P. et al. Hormonal regulation of spermatogenesis and spermiogenesis. //J. Steroid Biochem. Mol. Biol.-2008. V.109. - P. 323-330. (doi:10.1016/j.jsbmb.2008.03.004)

169. Sparrow AH, Pond V, Kojan S. Microsporogenesis in excised anthers of Trillium erectum grown on sterile media.// Am. J. Botany. -1955. — V.42. — P. 384-394.

170. Spear P.G. Glycoproteins specified by herpes simplex viruses. In: The Herpesviruses.-1984.- Vol.3, ed. by Roizman B., Plenum press, New York.

171. Spear P.G. Membrane proteins specified by herpes simplex virus. I. Identification of four glycoprotein precursors and their products in type 1 -infected cells.// J. Virology.- 1976.-V.17. P. 991-1008.

172. Spear P.G., Keller J.M., Roizman B. The proteins specified by herpes simplex virus. II. Viral glycoproteins associated with cellular membranes. //J. Virology.-1970.- V.5. -P. 123-131.

173. Spear P.G., Roizman B. Proteins specified by herpes simplex virus. V. Purification and structural proteins of the herpesvirion.// J. Virol.-1972.-V.9.-P. 431-439.

174. Spector S.A., Hirata K.K., Newman, T. Identification of multiple cytomegalovirus strains in homosexual men with acquired immunodeficiency syndrome // J. Infect. Dis. 1984. - V. 150. - P. 953956.

175. Spring S.B., Roizman B. Herpes simplex virus products in productive and abortive infection.// J.Virol.-1968.- V.2. P. 979-985.

176. Stanberry L.R. Asymptomatic herpes simplex virus shedding and Russianroulet // Clin. Infect.Dis. 2000. - V. 30. - P. 268-269.

177. Staub C. A. Century of Research on Review Mammalian Male Germ Cell Meiotic differentiation In Vitro.//Journal of Andrology.-2001. V. 22(6). -P. 911-926

178. Steger K. Transcriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids. //Anat. Embriol.-1999.-V.199. P. 471-487.

179. Steinberger A, Steinberger E, Perloff WH. Mammalian testes in organ culture. //Exp. Cell Res. 1964. - V.36. - P. 19-27.

180. Steinberger A, Steinberger E. Differentiation of rat seminiferous epithelium in organ culture.// .J Reprod. Fertil. 1965. - V.9. - P. 243-248.

181. Steinberger A, Steinberger E. Stimulatory effect of vitamins and glutamine on the differentiation of germ cells in rat testes organ culture grown in chemically defined media. //Exp. Cell Res. 1966. - V.44. - P.429-435.

182. Steinberger E, Dixon WJ. Some observations on the effect of heat on the testicular germinal epithelium. //Fertil. Steril.- 1959. V.10. - P. 578-595.

183. Steinberger E, Nelson WO. The effect of hypophysectomy, cryptorchidism, estrogen and androgen upon the level of hyaluronidase in the rat testis. // Endocrinology. -1955. V.56. - P. 429-444.

184. Steinberger E. Maintenance of adult human testicular tissue in culture.// Anat. Rec. 1967. -V. 157. - P. 327-328.

185. Stephan J.P., Seyd V., Jegou B. Regulation of Sertoli cell IE-I and IL-6 production in vitro.// Mol. Cell Endocrinol.-1997.-V. 134. P. 109-118.

186. Sterz H., Ludwig H., Rott R. Immunoloogic and genetic relationship between herpes simplex virus and bovine herpes mammilitis virus. // Intervirology.-1974.-V.2. P. 1-13.

187. Strand B.C., Aurelia L. Proteins of herpesvirus type 2. I. Virion, nonvirion and antigenic polypeptides in infected cells.// Virology.-1976.-V.69. P. 438-452.

188. Strangeways TSP, Fell HB. Experimental studies on the differentiation ofembryonic tissues growing in vivo and in vitro. I. The development of the undifferentiated limb bud.// Proc. R. Soc. Biol. Sci. Ser. B. 1926. - V. 99. -P. 340.

189. Tabrizi S.N., Skov S., Chandeying V. et al. Prevalence of sexually transmitted infections among clients of female commercial sex workers in Thailand // Sex. Trans. Dis. 2000. - V. 21. - P. 358-362

190. Tebourbi L., Courtot A.M., Duchateau R. et al. Experimental inoculation of male mice with murine cytomegalovirus and effect on offspring // Hum. Reprod. 2001. - V. 16. - P. 2041 -2049.

191. Tebourbi L., Testart J., Cerutti I. et al. Failure to infect embryos after virus injection in mouse zygotes // Hum. Reprod. 2002. - V. 17. — P. 760-764.

192. Tjiam K.H., van Heijst B.Y., Polak-Vogelzang A.A. et al. Sexually communicable micro-organisms in human semen samples to be used for artificial insemination by donor // Genitourin Med. 1987. - V. 63. - P. 116-118.

193. Trowell OA. The culture of mature organs in a synthetic medium.// Exp. Cell Res. -1959. V.16. - P. 118-147.

194. Tung, K. S. Elucidation of autoimmune disease mechanism based on testicular and ovarian autoimmune disease models. //Horm. Metab. Res. -1995. -V. 27. -P. 539-543. (doi:10.1055/s-2007-980021)

195. Uzal F.A., Woods L., Stillian M. et al. Abortion and ulcerative posthitis associated with caprine herpesvirus-1 infection in goats in California // J. Vet. Diagn. Invest. 2004. - V. 16. - P. 478-484.

196. Venables J., Eperon I. The roles of RNA-binding proteins in spermatogenesis and male infertility. // Curr. Opin. Genet. Dev.-1999.-V.9.1. P. 346-354.

197. Wald A., Matson P., Ryncarz A. et al. Detection of herpes simplex virus DNA in semen of men with genital HSV-2 infection // Sex Transm Dis. — 1999.-V. 26.-P. 1-3.

198. Weibauer G.F., Neischlag E. Testicular physiology of primates. In: Weibauer G.F., Kurte R (eds) Reproduction in nonhuman primates. -1999. -P. 13-26.

199. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple" WHO, 3th ed., Cambridge university press, 2000.

200. Wildy P., Watson D.H. Electron microscopic studies on the architecture of animal viruses, Gold Spring Harbor Symp., Quant. Biol 1963., 27, 25-47.

201. Wilkie N.M. The synthesis and substructure of herpesvirus DNA: The distribution of alkali labile single strand interruptions in HSV-1 DNA. // J. Gen. Virol. 1973.- V. 21. - P. 525-533.

202. Willey S., Roulet V., Reeves D. Human Leydig cells are productively infected by some HIV-2 and SIV strains but not by HIV-1. //AIDS.-2003.-V.17.-P. 183-188.

203. Witz C.A., Duan Y., Burns W.N. et al. Is a risk of cytomegalovirus transmission during in vitro fertilization with donated oocytes? // Fertil. Steril. 1999. -V. 71. - P. 302-307.

204. Wolff E, Haffen K. Germ cells and gonads. In: Willmer EN, ed. Cells and Tissues in Culture. Methods. // Biology and Physiology. 1965-V. 2. — P. 697-743.

205. Wolff E. Sur la différenciation sexuelle des gonades de souris explantees in vitro. Paris: Se'ance de l'Acade'mie des Sciences; 1952:234.

206. Wrathall A.E., Simmons H.A., Van Soom A. Evaluation of risks of viral transmission to recipients of bovine embryos arising from fertilisation with virus-infected semen // Theriogenology. 2006. - V. 65. - P. 247-274.

207. Wu K.H., Zhou Q.K., Huang J.H. et al. Infection of cytomegalovirus and herpes simplex virus and morphology of the infected spermatogenic cells in infertile men // Zhonghua Nan Ke Xue. 2007. - Vol. 13. - P. 1075-1079.

208. Yoshikawa Y., Truong L. D., Fraire A. E., Kim H. S. The spectrum of histopathology of the testis in acquired immunodeficiency syndrome. // Mod. Pathol. 1989.- V.2. - P. 233-238.

209. Zheng S., Turner T. T., Lysiak, J. J. Caspase 2 activity contributes to the initial wave of germ cell apoptosis during the first round of spermatogenesis.// Biol. Reprod. 2006. - V. 74. - P. 1026-1033. (doi: 10.1095/biolreprod. 105. 044610)

210. Zhengwei Y., McLachlan R.I., Bremner W.J., Wreford N.G. Quantitative (stereological) study of the normal spermatogenesis in the adult monkey (Macacafascicularis). //J.Androl. -1997.-V.18. P. 681-687.

Информация о работе

Тюленев, Юрий Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на мужские половые клетки и сперматогенез при экспериментальной инфекции in vitro и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы