Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы окрашивания биологических объектов растворами индоцианина зеленого

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Процессы окрашивания биологических объектов растворами индоцианина зеленого"

Кулябина Татьяна Валериевна

ПРОЦЕССЫ ОКРАШИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ РАСТВОРАМИ ИНДОЦИАНИНА ЗЕЛЕНОГО

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов 2007

Работа выполнена на кафедре оптики и биомедицинской физики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Кочубей Вячеслав Иванович

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор

Березин Валентин Иванович

кандидат химических наук, Федоров Евгений Евгеньевич

Ведущая организация

Саратовский государственный медицинский университет, г. Саратов

Защита диссертации состоится 3 апреля 2007г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д. 212.243.05 при Саратовском государственном университет им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410026, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Автореферат разослан «_»_2007г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Дербов ВЛ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В качестве одного из типов оптических индикаторов при диагностике заболеваний в медицинской практике широкое применение нашли органические красители. Одним из таких красителей является индоцианин зеленый (ICG). ICG, применяемый ранее в фотодинамической терапии, в настоящее время активно используется в самых различных областях медицины' онкологии, офтальмологии, определения объема крови, исследования функции печени, ангиографии, а также флуоресцентных исследований ферментов и протеинов, хирургии, диагностики, косметологии и др.

Внедрение органического красителя индоцианина зеленого в медицинскую практику обусловлено значительным коэффициентом поглощения в спектральной области, совпадающей с областью излучения хирургических лазеров, а также близостью спектральных положений максимума его поглощения и изобестической точки для поглощения гемоглобина в районе 800 нм. Важным является также низкая токсичность и быстрое выведение красителя из организма

ICG может вступать во взаимодействие с компонентами биологических тканей и крови. Одним из проявлений такого взаимодействия является смещение положения максимума полосы поглощения красителя Например, при связывании с альбумином крови происходит смещение в длинноволновую область до 805 нм Однако, изменения спектров поглощения ICG, вызванные его взаимодействием с биологическими тканями при их окрашивании, в настоящее время исследованы недостаточно

В спектрах поглощения ICG наблюдаются две полосы поглощения, при этом длинноволновая полоса соответствует поглощению мономера, коротковолновая - димера красителя В водных растворах красителя димеризация наблюдается уже при концентрациях 1x10"' моль/см3. При высоких концентрациях зависимость эффективности поглощения света красителем от его концентрации нелинейна, т.к при больших концентрациях в воде краситель имеет тенденцию к агрегации в крупные частицы, как в водных растворах, так и в плазме человека Более того, интенсивность и положения полос поглощения ICG зависят от используемых растворителей

При использовании ICG часто применяются растворы сложного состава не просто раствор ICG, например, в воде, а с добавлением различных веществ Используемые растворы имеют спектральные характеристики, отличные от характеристик чистых растворов ICG В то же время, исследования эффективности воздействия светового (лазерного) излучения на объект чаще всего проводятся одновременно с оценкой амплитуды и положения спектров поглощения ICG в растворе, или же в исследуемом

объекте. Такие оценки обусловливают необходимость исследований изменений спектров растворов ICG при смене растворителя или же изменении концентрации красителя с последующим изучением взаимодействия применяемого раствора с биологическим объектом Таким образом, возникает необходимость исследования спектральных характеристик красителя в зависимости от его окружения Цель работы

Основной целью настоящей диссертационной работы являются т v/vo и т vitro исследования процессов взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого с биологическими объектами и составляющими их молекулами методами спектрофотометрии и хроматографии.

Для достижения поставленной цели был решен ряд промежуточных задач

- исследование закономерности изменения спектров поглощения растворов индоцианина зеленого в зависимости от метода приготовления раствора- используемого растворителя или смеси растворителей, а также концентрации красителя и метода окрашивания;

- исследование поведения красителя в физиологическом растворе и растворах поваренной соли в разных концентрациях;

- выявление причин изменения спектров поглощения ICG при его взаимодействии с молекулярными компонентами эпидермиса кожи человека или волос при их окрашивании :п vivo или in vitro;

- определение основного механизма, обусловливающего окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем индоцианином зеленым;

- исследование эффективности окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов;

- установление влияния взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации;

- решение вопроса о безопасности растворов индоцианина зеленого для живых организмов,

- экспериментальное определение степени диффузии красителя в различных материалах хроматографическими методами.

Научная новизна

Научная новизна определяется комплексом впервые выполненных исследований и полученных результатов, которые сводятся к следующему

- с целью выяснения механизмов взаимодействия молекул органического красителя индоцианина зеленого с различными типами растворителей получены новые данные о

воздействии на смещение максимума полосы поглощения следующих параметров' влиянии состава растворителя и концентрации красителя, влиянии полярности раствора, связи положения полос поглощения с показателем преломления растворителя, поведении индоцианина зеленого в составе физиологического раствора,

-получены данные об изменении спектров поглощения индоцианина зеленого вследствие взаимодействия молекул красителя с поверхностными слоями эпидермиса, волосами, плазмой и сывороткой крови человека, и их макромолекулами - кератином кожи и волос, меланином, альбумином;

- получены данные об эффективности переноса молекул красителя индоцианина зеленого внутрь ткани биообъекта Практическая значимость результатов

Полученные результаты могут быть использованы при разработке методов лечения и диагностики человека как при использовании индоцианина зеленого, так и, используя полученные закономерности, других красителей. Кроме того, материалы работы могут быть использованы в учебном процессе Достоверность результатов

Достоверность результатов представленных в данной работе экспериментов подтверждается их воспроизводимостью, сопоставлением с экспериментальными и теоретическими данными, опубликованными другими исследователями, использованием стандартных методик регистрации спектральных характеристик исследуемых образцов, а также учетом систематических и случайных погрешностей Основные положения и результаты, выносимые на защиту

1) Растворимость индоцианина зеленого в физиологическом растворе резко снижается по" сравнению с растворимостью в воде, что приводит к агрегации красителя и выпадению осадка при концентрациях от 0 01 до 1 мг/мл

2) Спектральные характеристики окрашенной ткани зависят от взаимодействия красителя с данной тканью и не зависят от используемого растворителя Выбор растворителя влияет только на глубину окрашивания

3) Впервые получены спектры поглощения волос человека, окрашенных растворами индоцианина зеленого При взаимодействии индоцианина зеленого с веществом волос полосы поглощения красителя смещаются в длинноволновую область спектра на 23±5 нм для мономеров и 33±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах

4) Смещение полос поглощения индоцианина зеленого в область больших длин волн при его взаимодействии с меланином составляет 42±5 нм для мономеров и 32±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах. Апробация работы

Результаты диссертационной работы докладывались на российских и международных научных конференциях:

- 5-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (2-5 октября 2001)

- 7-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (7-10 октября 2003)

- 8-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (21-24 сентября 2004)

- Третий международный оптический конгресс «Оптика - XXI век» конференция «Фундаментальные проблемы оптики - 2004», Санкт - Петербург, Россия, (18- 21 октября 2004 г)

- II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика -2005», Москва, Россия (21-24 июня 2005)

- 9-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (27-30 сентября 2005)

Личный вклад соискателя

Личный вклад соискателя представляет собой участие в постановке исследовательских задач, подготовку и проведение экспериментальных работ, обработку и участие в обсуждении и интерпретации полученных результатов Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав и библиографического списка, состоящего из 128 наименований Общий объем текста составляет 156 страниц текста, включающего 9 таблиц и 67 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертационной работы, ее новизна и практическая значимость, определена цель работы, представлены основные результаты, полученные в ходе работы и основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава диссертации носит обзорный характер В ней рассматриваются как характеристики, общие для класса цианиновых красителей, так и специфические особенности и основные физико-химические свойства индоцианина зеленого, благодаря

которым данный краситель получил широкое распространение. Особое внимание уделено процессам агрегации красителя, вследствие того, что эти процессы играют важную роль в формировании смещения максимума положения полосы поглощения растворов красителя Также рассматриваются способы применения индоцианина зеленого в медицинской практике, исходя из которых была поставлена часть исследовательских задач, решаемых в выполняемой работе Рассматриваются существующие разногласия в вопросах поведения спектральных характеристик красителя в растворах различных составов Обосновывается необходимость исследования зависимостей изменения спектральных характеристик растворов индоцианина зеленого при окрашивании ими т vitro и in vrvo биообъектов, таких как кожа, волосы и плазма крови человека, а так же наличие или отсутствие взаимодействия индоцианина зеленого с меланином

Во второй главе приводятся результаты исследований взаимодействия молекул индоцианина зеленого с различными типами растворителей в зависимости от метода приготовления раствора используемого растворителя или сложной смеси растворителей, наличия примесей, а также концентрации красителя в растворе

В разделе 2.1. описывается методика проведения экспериментов, и приводятся основные полученные результаты Из полученных спектров поглощения водного, спиртового и глицеринового растворов индоцианина зеленого следует, что положение, полуширина и соотношение интенсивностей двух полос поглощения растворов различаются в зависимости от типа растворителя. В проведенных экспериментах концентрация красителя в растворах менялась от 0.01 до 1 мг/мл В водных растворах преобладают димеры красителя, причем положение и соотношение амплитуд полос зависит от концентрации Лишь при концентрации 0 01 мг/мл начинает преобладать полоса поглощения мономера.

При использовании в качестве растворителей глицерина или этанола в спектрах растворов с аналогичными концентрациями ICG наблюдается общее смещение полос поглощения в длинноволновую область. При этом поглощение мономера красителя преобладает. При изменении концентрации красителя без добавления воды положение полос и соотношение их амплитуд остается неизменным Разбавление использованных в эксперименте растворителей водой в соотношении 1:1, как правило, снижает коэффициент поглощения этого раствора и смещает максимумы поглощения в коротковолновую область. Амплитуды полос поглощения выравниваются. Исключением является этанол: при разбавлении его водой в соотношении 11 соотношение между амплитудами двух полос поглощения больше, чем для раствора с той же концентрацией красителя, но без добавления воды. При дальнейшем разбавлении исходных растворов водой (с

уменьшением концентрации ICG в растворах до 0 1 мг/мл) форма спектров этих растворов становится похожа на форму спектров водного раствора ICG при аналогичной концентрации красителя.

Из полученных данных следует, что при использовании чистых растворителей зависимость положения спектральных полос от концентрации красителя очень слабая. Степень димеризации красителя в водных растворах увеличивается с ростом его концентрации, в спиртовых растворах такая зависимость отсутствует. Полученные закономерности согласуются с литературными данными, в то время как в водных растворах ICG димеризацшо наблюдали при концентрациях красителя свыше 1x10" 4моль/дм3 (0 075 мг/мл), в спиртовых растворах вплоть до концентраций 2* 10"эмоль/дм3 (1 55 мг/мл) в спектрах преобладает полоса поглощения мономеров. При увеличении концентрации ICG в спиртовых растворах образуются близко расположенные пары молекул красителя: молекулы спирта препятствуют созданию димеров.

Рис. 1. Спектры поглощения ICG, рис 2 Спектр поглощения ICG, растворенного в водных растворах глицерина с растворенного в водных растворах этанола с концентрацией 1,0 1 и 0 01 мг/мл концентрацией 1,0 I и 0 01 мг/мл

Исходя из наших данных, в водно-спиртовых растворах, в зависимости от соотношения концентраций растворителей и ICG, положение полос изменяется сложным образом. Из полученных спектров для смесей растворителей следует, что, если соотношение воды и спирта (или глицерина) не ниже 1/1, определяющим фактором является влияние спиртов. При повышении концентрации воды в смеси происходит смещение полос поглощения в коротковолновую область и резкое увеличение степени агрегации молекул (Рис 1, 2). Таблица 1 демонстрирует все основные полученные в этом разделе результаты

Abs

Ahs

Таблица 1

Зависимость спектральных характеристик растворов индоцианина зеленого от растворителя и концентрации красителя____________

Растворитель Концентрация ICG, мг/мл Коротковолновая полоса Длинноволновая полоса Отношение j амплитуд Ад/Ам

X, нм Амплитуда Ад, отн. ед. нм Амплитуда А„, отн ед

Спирт 0,01 727 0,0086 789 0,027 0,32

од 725 0,056 788 0,19 0,3

1,0 731 0,54 788 1,64 0,33

Вода 0,01 710 0,0073 783 0,0037 197

0,1 697 0,085 779 0,042 2.02

1,0 696 1,04 778 0,3 3 47

Глицерин 0,01 732 0.015 795 0,032 0.47

0,1 729 0,084 795 0,29 0,29

1,0 738 0,667 798 1,31 0,51

Спирт+вода (1/100) 0,01 723 0,012 792 0,014 0,85

Спирт+вода (1/10) 0,1 703 0,11 779 0,08 1,37

Спирт+вода(1/1) 1,0 725 0,62 787 2,26 0,27

Глицерин+вода (1/100) 0,01 716 0,025 786 0,018 1,38

Глицерин+ вода (1/10) 0,1 700 0,079 780 0,051 1,55

Глицерин+ вода (1/1) 1,0 723 0,69 790 1,15 0,63

Раздел 2.2 содержит анализ полученных результатов и включает в себя подразделы, рассматривающие возможные параметры, влияющие на смещение максимумов положения полос поглощения. Оно может происходить вследствие, изменения концентрации красителя в растворе, химического взаимодействия молекул ICG с молекулами растворителей сложных составов (раздел 2.2.1), различной полярности растворителей (раздел 2 2 2), изменения показателя преломления смеси растворителей (раздел 2 2 3), взаимодействия молекул веществ-растворителей между собой (раздел 2 2 4)

Отдельно в Разделе 2.3 рассматриваются особенности поведения индоцианина зеленого в разной концентрации в физиологическом растворе Нами исследована агрегация молекул индоцианина зеленого в водных (Рис. 3) и водно-солевых (Рис. 4.) (физиологических) растворах при различной (от 0.01 до 1 мг/мл) концентрации красителя

«о аю ал iooo

дгиевсгты Х т

Рис 3 Спектр поглощения водных растворов ICG с концентрацией 1 мг/мл Цифрами указан день регистрации спектра, начиная со дня приготовления раствора

400 500 600 700 800 900 1000

дги-аваты im

Рис 4 Спектры поглощения водных растворов индоцианина зеленого с концентрацией 0 5 мг/мл Цифрами без индекса обозначены спектры водного раствора, цифрами с индексом - спектры водно-солевого раствора в соответствии с днем регистрации спектра

В водно-солевой смеси растворимость исследуемого вещества значительно слабее Это

приводит к тому, что агрегация молекул красителя происходит быстрее, что также следует из

спектров. Сам спектр имеет более сложный характер, появляются дополнительные полосы

поглощения. Это вызвано тем, что в водно-солевом растворе на второй день агрегировавшие частицы красителя выпадают в осадок

Нами показано, что в водно-солевых растворах происходит эффективная агрегация индоцианина зеленого, причем эта агрегация имеет место уже на стадии приготовления раствора и при концентрациях красителя значительно меньших, чем используемые в медицинской практике. Вследствие отсутствия исследований влияния таких агрегатов на организм, не исключено, что отмеченные случаи неблагоприятного воздействия индоцианина зеленого на пациентов связаны именно с такой агрегацией.

В третьей главе исследуется взаимодействие индоцианина зеленого с различными биологическими объектами" поверхностными слоями эпидермиса, волосами, плазмой и сывороткой крови человека, и их макромолекулами - кератином кожи и волос, меланином, альбумином Описывается и иллюстрируется определение основного механизма, обусловливающего окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем (раздел 3 1); исследование эффективности окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов (раздел 3.2), установление влияния взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации (раздел 3 4) В разделе 3.3 приводятся результаты исследований по окрашиванию индоцианином зеленым меланина полученного из разных источников (ретины глаза и волос), разными методами и в различных концентрационных соотношениях. На примере взаимодействия меланина с растворами индоцианина зеленого получены данные о существовании различий в результатах окраски меланина, получаемого различными методами из волос или ретины глаза

О 8

г <

-—з

'2

0,1

400 500 <00 700 вООд.лл,

Рис 6 Спектры поглощения кожи окрашенной глицериновым раствором ICG (0 - спектр окрашенной кожи без отрыва, 1 - спектр окрашенной кожи после первого отрыва, 2 - спектр окрашенной кожи после второго отрыва, 3 - спектр окрашенной кожи после третьего отрыва)

Рис 5 Спектры поглощения кожи окрашенной спиртовым раствором ICG после проведения последовательных отрывов (0 - спектр окрашенной кожи без отрыва, 1 - спектр окрашенной кожи после первого отрыва, 2 - спектр окрашенной кожи после второго шрыва, 3 - спекгр окрашенной кожи после третьего отрыва)

OJO 0,85 0,60 OJB 053 í« 0«

Рис

400 SCO 600 700 8СЮ >,ПП1

7 Спектры поглощения кожи не очищенной от защитного жирового слоя 1 - не окрашенная кожа, 2 - кожа окрашенная глицериновым раствором ICG, 3 - кожа окрашенная водным раствором ICG, 4 - кожа окрашенная спиртовым раствором ICG

0,50' 0,45 0.40 0,35 0,30 О,Я 0,200,15

400 500 600 700 600 ^„п,

Рис 8 Спектры поглощения кожи очищенной от защитного жирового слоя 1 - кожа окрашенная водным раствором ICG, 2 - кожа окрашенная спиртовым раствором 1CG, 3 -кожа окрашенная глицериновым раствором ICG

Для определения эффективности окрашивания поверхностных слоев эпидермиса человека индоцианином зеленым нами использовались водный, спиртовой и глицериновый растворы индоцианина зеленого с концентрацией 1 мг/мл После окрашивания, при помощи клейкой ленты, проводилось последовательно по четыре отрыва верхних слоев эпидермиса и, соответственно, после каждого отрыва регистрировались спектры отражения кожи предплечья т vivo. Полученные графики представлены на рисунках 5-8 с представлением данных в форме Abs=log(l/R)

Коэффициент поглощения ткани, окрашенной спиртовым раствором индоцианина зеленого, в области около 650-800 нм уменьшается с каждым последующим отрывом (рис. 5), что, учитывая толщину каждого послойного отрыва, свидетельствует о том, что краситель проникает при таком способе окрашивания на глубину не более 10 мкм Разложение спектра в области 650-800 нм на гауссовы составляющие показывает неизменное положение полос 741 нм для мономеров и 795 нм для димеров индоцианина. Данные значения отличаются от положений максимумов полос в спиртовых и водных растворах (731 и 788 нм, а также 696 и 778 нм, соответственно, см. Гл 1) Данный факт должен свидетельствовать о том, что индоцианин в исследуемом объекте (эпидермисе кожи предплечья) находится в связанном состоянии, т.е. произошло взаимодействие красителя с молекулами эпидермиса. Неизменность положения полос говорит также о том, что краситель находится только в связанном состоянии, т.к, в противном случае, т.е. при изменении концентрационного соотношения связанный/несвязанный краситель, положение полос менялось бы. Как следует из данных главы 1, смещение полос вследствие изменения

концентрации красителя или соотношения спирт/вода не приводит к таким положениям полос поглощения индоцианина.

Для кожи, окрашенной глицериновым раствором индоцианина, такая закономерность не наблюдается Наиболее вероятно, что данные изменения связаны с изменением рассеивания света в зависимости от концентрации в нем глицерина вследствие хорошо известного эффекта просветления. Из сравнения глубины прокрашивания спиртовым и глицериновым растворами, следует, что использование спиртового раствора красителя целесообразнее, т.к. глубина прокраски для него больше, чем для глицеринового раствора такой же концентрации Этот вывод подтверждается и сравнением спектров на рис. 7 и 8.

При рассмотрении разности между спектрами отражения окрашенной и неокрашенной кожи (рис 9-10), очевидно, что различия в спектрах обусловлены не только наличием красителя. Наличие красителя приводит к росту сигнала в области 700-800 нм, причем разность становится положительной. В то же время, практически для всех разностных спектров имеет место общий наклон и отрицательные значения в области 400600 нм. Такие изменения разности могут объясняться только частичным просветлением поверхностных слоев эпидермиса и увеличением, вследствие этого, влияния поглощения света кровью, расположенной в нижележащих слоях кожи Следует отметить, что просветление различно для разных растворителей и слоев эпидермиса, причем наибольшее наблюдается в случае использования спиртового раствора Это может быть объяснено различием в концентрации внедрившегося растворителя.

Основным механизмом, определяющим взаимодействие индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека, по-видимому, является связывание молекул красителя молекулами, содержащимися в коже Такими молекулами могут быть, в первую очередь, молекулы альбумина цитоплазмы клеток эпидермиса Это предположение хорошо согласуется как с литературными данными, так и с тем фактом, что поверхностный слой эпидермиса окрашивается плохо. Хорошо известно, что поверхностный, роговой слой эпидермиса, состоит, в основном, из кератинизированных клеток, а кератин практически не взаимодействует с индоцианином зеленым

Рис 9 Разностные кривые спектров поглощения окрашенной кожи без отрыва поверхностного слоя ! — кожа окрашенная водным раствором ICG, 2 - кожа окрашенная глицериновым раствором ICG, 3 - кожа окрашенная спиртовым раствором ICG

Рис 10. Разностные кривые спектров поглощения окрашенной кожи после первого отрыва. 1 - кожа окрашенная водным раствором ICG, 2 — кожа окрашенная глицериновым раствором ICG, 3 - кожа окрашенная спиртовым раствором ICG

Таким образом, показано, что от чко растворы индоцианина зеленого за время в пределах 30 мин проникают только в поверхностную область рогового слоя эпидермиса Эффективность и глубина окрашивания зависит от используемого растворителя. Тот факт, что окрашивание достаточно эффективно даже для водных растворов, скорость диффузии которых меньше, чем для глицериновых и спиртовых, говорит о том, что проникновение в данном случае происходит в разрыхленную область эпидермиса. Удаление этой области без нарушения остальной части рогового соя приводит к уменьшению эффективности и глубины прокрашивания Максимумы спектров поглощения индоцианина зеленого, связанного с клетками эпидермиса, смещаются относительно максимумов поглощения водных растворов в длинноволновую область на 12-16 нм для мономеров и на 30-40 нм для димеров. Более точные цифры получить невозможно, т.к. положение максимумов в водных растворах зависит от концентрации красителя Кроме того, возможно, что на результаты может влиять рассеяние света кожей. Диффузия растворителя приводит к частичному просветлению верхних слоев эпидермиса в спектральных областях, в которых поглощение красителя отсутствует.

Окрашивание волос (Рис 11 - 12) показало, что эффективность окрашивания зависит, в первую очередь, от целостности поверхности волоса При использовании препаратов, приводящих к нарушению поверхности (щелочи, перекиси водорода) эффективность окрашивания повышается Показано наличие смещений максимумов полос поглощения индоцианина зеленого при окрашивании им волос. Согласно литературному

анализу, такое смешение можно объяснить взаимодействие красителя с материалом волос, наиболее вероятно, с альбумином или меланином.

Показано, что кислотно-щелочные методы получения меланина из волос приводят к частичному разрушению гранул меланина. Уменьшение концентрации красителя в растворе при увеличении концентрации в том же растворе меланина говорит от проникновения ивдоцианина в гранулы меланина, а смещение полос поглощения свидетельствует о наличии взаимодействия индоцианина и меланина.

Рис 11 Спектры пропускания прядей волос, рис. ¡2 Спектры отражения волос и овечьей

окрашенных индоцианином зеленым, в шерсти, окрашенных в спиртовом растворе

зависимости от времени выдержки в растворе индоцианина зеленого красителя 1 - 30 мин ,2-45 мин ,3-60 мин

В процессе исследований не обнаружено изменений структуры кристаллизованной плазмы крови человека, которое свидетельствовало бы об изменении структуры белов плазмы под влиянием индоцианина

Глава 4 содержит сведения об исследованиях процессов переноса красителя е биологический объект методами тонкослойной хроматографии.

Наличие зависимости скорости и эффективности диффузии в биологический объект от типа используемого растворителя, в соответствии с теорией трансдермальной доставки лекарств свидетельствует о том, что в основе переноса красителя в объект лежит увлечение молекул красителя молекулами раствортеля Наряду с учетом зависимости эффективности переноса от взаимодействия красителя и растворителя с самим объектом, перенос красителя может описываться теорией жидкостной хроматографии.

Нами проведены опыты по исследованию эффективности переноса красителя на бумаге, крахмале, казеине, сухой пленке плазмы крови, коллагеновой пленке, тонком слое эпидермиса, полученном как в случае фотоэритемы, так и методом отрыва.

Проведенные опыты по исследованию эффективности переноса красителя от типа биомолекул и их организации в модельной среде, а также от используемого метода хроматографии свидетельствуют, с одной стороны, о возможности использования данного метода для исследования наличия или отсутствия взаимодействия красителя с биологическими молекулами, с другой - о том, что для такого исследования необходима среда — носитель с высокой эффективностью диффузии растворителя и отсутствие взаимодействия с красителем. Наиболее оптимальным представляется использование стандартных пластинок для тонкослойной хроматографии на основе порошка MgO, на поверхность которого наносится исследуемое вещество.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Диссертационная работа посвящена детальному м vrvo и т vitro исследованию процессов взаимодействия органического красителя ицдоцианина зеленого с биологическими объектами и составляющими их молекулами методами спектрофотометрии и хроматографии В работе исследованы закономерности изменения спектров поглощения растворов индоцианина зеленого в зависимости от метода приготовления раствора используемого растворителя или смеси растворителей, а также концентрации красителя и метода окрашивания Исследовано поведение красителя в разных концентрациях растворенного в физиологическом растворе Выявлены причины изменения спектров поглощения ICG при его взаимодействии с молекулярными компонентами эпидермиса кожи человека или волос при их окрашивании in vrvo или т vitro. Определен основной механизм, обусловливающий окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем ицдоцианином зеленым. Исследована эффективность окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного вдета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов. Установлено влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации. Решен вопрос о безопасности растворов индоцианина зеленого для живых организмов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

1. Kulyabina T.V., Drajevsky R.A , Kochubey V.I., Zimnyakov D.A. Coherent optical analysis of crystal-like patterns by human plasma desiccation // Proc SPIE 2001. Vol.4242, P.282-285

2. Кулябина T.B , Кочубей В.И In vivo исследования растворов индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека // Проблемы оптической физики, 2004, книга 1, стр. 68-73.

3 Kulyabina T.V., Kochubey V.I. In vivo investigation of interaction of mdocyamne green solutions with human epidermis // Proc. SPIE. 2004, Vol.5474, P.339-343

4. Кулябина T В. Агрегация индоцианина зеленого в водных растворах И Труды третьей международной конференции «Фундаментальные проблемы оптики», 2004, стр.47-49

5. Кочубей В И, Кулябина Т.В., Тучин В.В, Альтшулер Г Б. Спектральные характеристики индоцианина зеленого при его взаимодействии с биологическими тканями // Оптика и спектроскопия, 2005, том 99, № 4, С. 582-588

6. Кулябина Т.В, Кочубей В И, Прохорова Е Н Спектральные исследования взаимодействия индоцианина зеленого с меланином // Труды II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005», 2005, С. 281-282

7. Kulyabina T.V , Kochubey V.I. Efficiency of staining hair with indocyanine green // Proc SPIE 2005, Vol 5771, P. 372-376

8. Кулябина T В., Кочубей В И. Эффективность окрашивания волос человека растворами индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, 2005, книга 1, стр 68-73

9. Kulyabina T.V , Kochubey V.I. The interaction of indocyanine green with blood plasma and features of crystallization in Saratov Fall Meeting 5005: Optical Technologies in Biophysics and Medicine VII, edited by Valery V. Tuchin, Proceedings of SPIE Vol. 6163 (SPIE, Bellingham, WA, 2006) 6163 IK

10. Кулябина T.B, Кочубей В И Влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови на процесс ее кристаллизации // Проблемы оптической физики, Материалы 9-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, 2006, С. 43^18

11 Кочубей В И, Кулябина Т.В., Тучин В.В, Альтшулер Г.А Исследования индоцианина зеленого в растворах с перспективой создания стандартного образца // Законодательная и прикладная метрология, 2006, № 5, С 43-47

Кулябина Татьяна Валериевна

ПРОЦЕССЫ ОКРАШИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ РАСТВОРАМИ ИНДОЦИАНИНА ЗЕЛЕНОГО

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Подписано в печать 22.02.2007г. Формат 60x84 1/16. Объем 1,25 пл. Тираж 100 экз. Заказ № ^

Типография Издательства Саратовского университета. 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Кулябина, Татьяна Валериевна

Введение.

Глава 1.ктура, свойства и применение индоцианина зеленого.

1.2. Цианиновые красители.

1.2. Индоцианин зеленый.

1.3. Закономерности агрегации и дезагрегации индоцианина зеленого.

1.4. Применение индоцианина зеленого в медицине.

Глава 2. Взаимодействие молекул органического красителя индоцианина зеленого с различными типами растворителей.

2.1 Методика проведения эксперимента и полученные результаты.

2.2. Анализ полученных результатов.

2.2.1. Влияние состава растворителя и концентрации красителя.

2.2.2. Влияние полярности растворителя.

2.2.3. Связь положения полос поглощения с показателем преломления растворителя.

2.2.4. Сдвиги полос электронных спектров согласно теории межмолекулярных взаимодействий.

2.3. Влияние присутствия соли на поведение водных растворов индоцианина зеленого.

Глава 3. Взаимодействие индоцианина зеленого с биологическими объектами и макромолекулами.

3.1. Исследования in vivo и in vitro взаимодействия красителя индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека.

3.2. Взаимодействие индоцианина зеленого с веществом волос человека и шерсти домашних животных.

3.3. Спектральные исследования взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого и меланина.

3.4. Взаимодействие индоцианина зеленого с биообъектами на примере плазмы крови человека.

Глава 4. Исследование процессов переноса красителя в биологический объект.

4.1. Трансдермальные терапевтические системы.

4.1.1. Модели TTC.

4.2. Применение хроматографических методов в исследовании спектральных характеристик взаимодействия индоцианина зеленого с биологическими образцами.

4.2.1. Физико-химические основы тонкослойной хроматографии.

4.3. Экспериментальное определение степени диффузии индоцианина зеленого методом хроматографии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Процессы окрашивания биологических объектов растворами индоцианина зеленого"

Актуальность темы диссертационной работы

В качестве одного из типов оптических индикаторов при диагностике заболеваний в медицинской практике широкое применение нашли органические красители. Одним из таких красителей является индоцианин зеленый (indocyanine green, ICG). ICG, применяемый в фотодинамической терапии [1- ,4, 5], в настоящее время активно используется в самых различных областях медицины: онкологии [6], диагностике [7], хирургии [8, 9], офтальмологии [10, 11, 12]; а так же при определении объема крови [13], исследовании функции печени [14, 15], ангиографии [16, 17, 18, 19] флуоресцентных исследованиях ферментов и протеинов [20, 21] косметологии и др.

Биофизические исследования повсеместно используются при изучении механизмов возникновения болезней человека, разработке новых лекарственных средств, методов лечения и диагностики, а также при создании современной медицинской техники.

Изучение физико-химической основы биологических явлений, протекающих на молекулярном уровне, стало возможным благодаря успехам физики и физической химии в конце 19 - начале 20 в. По мере совершенствования методов физико-химических исследований возможности биофизики значительно расширялись. Интенсивному развитию науки способствовало появление новых физических методов - рентгеноструктурного анализа, радиоспектроскопии, спектрофотометрии и спектрофлуориметрии, электрометрии, оптических измерений, методов, основанных на ядерном магнитном резонансе (ЯМР) и др., а также компьютерной техники. Изучение явления ЯМР и распространения ультразвуковых волн в тканях с применением компьютерной техники привело к созданию новых, перспективных методов диагностики - ЯМР и ультразвуковой томографии. Разрабатываются методы автоматической расшифровки ЭКГ, изучения магнитных полей человека, современные методы лабораторной диагностики, основанные на измерении люминесценции, хемилюминесценции, светорассеяния. Создаются новые аппараты для физиотерапии и диагностики заболеваний, основанные на действии колебаний сверхвысокой частоты в различных диапазонах частот, УФ-излучения в сочетании с хемотерапией; лазерного излучения с различными длинами волн и др.

Внедрение органического красителя индоцианина зеленого в медицинскую практику обусловлено близостью егоспектральных положений максимума полосы поглощения и изобестической точки для поглощения гемоглобина и оксигемоглобина в районе 800 нм, что позволяет использовать его для оценки объема крови [22]. Важным является также предполагаемая низкая токсичность и быстрое выведение красителя из организма (ICG выводится из плазмы почти исключительно паренхиматозными клетками печени и выделяется полностью в желчь) [5].

ICG может вступать во взаимодействие с компонентами биологических тканей и крови. Одним из проявлений такого взаимодействия является смещение положения максимума полосы поглощения красителя. Например, при связывании с альбумином крови происходит смещение в длинноволновую область до 805 нм [23, 24]. Однако изменения спектров поглощения ICG, вызванные его взаимодействием с биологическими тканями при их окрашивании, в настоящее время исследованы недостаточно.

В спектрах поглощения ICG наблюдаются две полосы поглощения, при этом длинноволновая полоса соответствует поглощению мономера, коротковолновая -димера красителя. В водных растворах красителя димеризация наблюдается уже при концентрациях 1><10~7 моль/см3 [5, 25]. При высоких концентрациях зависимость эффективности поглощения света красителем от его концентрации нелинейная, т.к. при больших концентрациях в воде краситель имеет тенденцию к агрегации в крупные частицы как в водных растворах [26], так и в плазме человека [27]. Более того, интенсивность и положение полос поглощения ICG зависят от используемых растворителей.

При использовании ICG часто применяются растворы сложного состава: не просто раствор ICG, например, в воде, а с добавлением различных веществ. Например, при использовании в лазерной хирургии с целью увеличения поглощения лазерного излучения, а также вязкости, в раствор могут добавляться: альбумин, желатин, гиалуроновая кислота [28]. При использовании в косметологии использовался специальный лосьон, в состав которого входят вода, ICG, спирт, глицерин и DMSO [29]. В данном случае добавки вводились с целью увеличения глубины прокрашиваемого слоя кожи. Используемые растворы имеют спектральные характеристики, отличные от характеристик чистых растворов ICG. В то же время исследования эффективности воздействия светового (лазерного) излучения на объект чаще всего проводятся одновременно с оценкой интенсивности и положения полос поглощения ICG как в растворе, так и в исследуемом объекте. Такие оценки обуславливают необходимость изучения поведения спектров растворов ICG при смене растворителя или же изменении концентрации красителя с последующим исследованием взаимодействия применяемого раствора с биологическим объектом. Таким образом, возникает необходимость исследования зависимости спектральных характеристик красителя от его окружения.

Цель работы

Основной целью настоящей диссертационной работы являются in vivo и in vitro исследования процессов взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого с биологическими объектами и составляющими их молекулами методами спектрофотометрии и хроматографии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд промежуточных задач:

- исследовать закономерности изменения спектров поглощения растворов индоцианина зеленого в зависимости от метода приготовления раствора: используемого растворителя или смеси растворителей, а также концентрации красителя и метода окрашивания;

- исследовать поведение красителя в физиологическом растворе и водно-солевых растворах с разными концентрациями;

- выявить причины изменения спектров поглощения ICG при его взаимодействии с молекулярными компонентами волос или эпидермиса кожи человека при их окрашивании in vivo или in vitro;

- определить основной механизм, обусловливающий окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем индоцианином зеленым;

- исследовать эффективность окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов;

- установить влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации;

- решить вопрос о безопасности растворов индоцианина зеленого для живых организмов;

- экспериментально определить эффективность диффузии красителя в различных материалах хроматографическими методами.

Научная новизна

Научная новизна определяется комплексом впервые выполненных исследований и полученных результатов, которые сводятся к следующему:

- с целью выяснения механизмов взаимодействия молекул органического красителя индоцианина зеленого с различными типами растворителей были получены новые экспериментальные данные о зависимости смещения максимума полосы поглощения от состава растворителя, концентрации красителя, полярности раствора; наличия или отсутствия зависимости положения полос поглощения и показателя преломления растворителя; влияние присутствия соли на поведение водных растворов индоцианина зеленого;

- с целью уточнения процессов взаимодействия индоцианина зеленого с биологическими объектами и макромолекулами проведены исследования и получены результаты взаимодействия молекул красителя со следующими биообъектами: поверхностными слоями эпидермиса, волосами, плазмой и сывороткой крови человека; и их макромолекулами - кератином кожи и волос, меланином, альбумином;

- получены данные об эффективности проникновения молекул красителя индоцианина зеленого внутрь ткани биообъекта в зависимости от природы биообъекта, состояния взаимодействующей поверхности, применяемого растворителя.

Практическая значимость результатов

Полученные результаты могут найти применение при разработке методов диагностики и лечения заболеваний человека как при использовании индоцианина зеленого, так и, имея в виду полученные закономерности, других красителей. Кроме того, материалы работы могут быть использованы в учебном процессе.

Достоверность результатов

Достоверность результатов представленных в данной работе экспериментов подтверждается их воспроизводимостью, сопоставлением с экспериментальными и теоретическими данными, опубликованными другими исследователями, использованием стандартных методик регистрации спектральных характеристик исследуемых образцов, а также учетом систематических и случайных погрешностей.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту

1) Растворимость индоцианина зеленого в физиологическом растворе резко снижается по сравнению с растворимостью в воде, что приводит к агрегации красителя и выпадению осадка при концентрациях от 0.01 до 1 мг/мл.

2) Спектральные характеристики окрашенной ткани зависят от взаимодействия красителя с данной тканью и не зависят от используемого растворителя. Выбор растворителя влияет только на глубину окрашивания.

3) Впервые получены спектры поглощения волос человека, окрашенных растворами индоцианина зеленого. При взаимодействии индоцианина зеленого с веществом волос полосы поглощения красителя смещаются в длинноволновую область спектра на 23±5 нм для мономеров и 33±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах. 4) Смещение полос поглощения индоцианина зеленого в область больших длин волн при его взаимодействии с меланином составляет 42±5 нм для мономеров и 32±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы докладывались на российских и международных научных конференциях:

- 5-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (2-5 октября 2001)

- 7-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (7-10 октября 2003)

- 8-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (21-24 сентября 2004)

- Третий международный оптический конгресс «Оптика - XXI век» конференция «Фундаментальные проблемы оптики - 2004», Санкт - Петербург, Россия, (18-21 октября 2004 г)

- II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005», Москва, Россия (21-24 июня 2005)

- 9-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (27-30 сентября 2005).

Список опубликованных работ по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

1. Kulyabina T.V., Drajevsky R.A., Kochubey V.I., Zimnyakov D.A. Coherent optical analysis of crystal-like patterns by human plasma desiccation // Proc. SPIE. 2001. Vol.4242, P.282-285 f

2. Кулябина T.B., Кочубей В.И. In vivo исследования растворов индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека // Проблемы оптической физики, 2004, книга 1, стр. 68-73.

3. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. In vivo investigation of interaction of indocyanine green solutions with human epidermis // Proc. SPIE. 2004, Vol.5474, P.339-343

4. Кулябина T.B. Агрегация индоцианина зеленого в водных растворах // Труды третьей международной конференции «Фундаментальные проблемы оптики»,

2004, стр.47-49.

5. Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Спектральные характеристики индоцианина зеленого при его взаимодействии с биологическими тканями // Оптика и спектроскопия, 2005, том 99, № 4, С. 582588

6. Кулябина Т.В., Кочубей В.И., Прохорова Е.Н. Спектральные исследования взаимодействия индоцианина зеленого с меланином // Труды II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005»,

2005, С. 281-282.

7. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. Efficiency of staining hair with indocyanine green // РГОС. SPIE. 2005, Vol. 5771, P. 372-376

8. Кулябина T.B., Кочубей В.И. Эффективность окрашивания волос человека растворами индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, 2005, книга 1,стр. 68-73.

9. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. The interaction of indocyanine green with blood plasma and features of crystallization in Saratov Fall Meeting 5005: Optical Technologies in Biophysics and Medicine VII, edited by Valery V. Tuchin, Proceedings of SPIE Vol. 6163 (SPIE, Bellingham, WA, 2006) 6163 IK

Ю.Кулябина Т.В., Кочубей В.И. Влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови на процесс ее кристаллизации // Проблемы оптической физики, Материалы 9-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, 2006, С. 43-48.

И. Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.А. Исследования индоцианина зеленого в растворах с перспективой создания стандартного образца // Законодательная и прикладная метрология, 2006, № 5, С. 43-47.

Личный вклад соискателя

Личный вклад соискателя представляет собой участие в постановке исследовательских задач, подготовку и проведение экспериментальных работ, обработку и участие в обсуждении и интерпретации полученных результатов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав и библиографического списка, состоящего из 128 наименований. Общий объем текста составляет 156 страниц текста, включающего 9 таблиц и 67 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кулябина, Татьяна Валериевна

Выводы

Наличие зависимости скорости и эффективности диффузии в биологический объект от типа используемого растворителя, в соответствии с теорией трансдермальной доставки лекарств свидетельствует о том, что в основе переноса красителя в объект лежит увлечение молекул красителя молекулами растворителя. Наряду с учетом зависимости эффективности переноса от взаимодействия красителя и растворителя с самим объектом, перенос красителя может описываться теорией жидкостной хроматографии.

Проведенные опыты по исследованию эффективности переноса красителя от типа биомолекул и их организации в модельной среде, а также от используемого метода хроматографии свидетельствуют, с одной стороны, о возможности использования данного метода для исследования наличия или отсутствия взаимодействия красителя с биологическими молекулами, с другой - о том, что для такого исследования необходима среда - носитель с высокой эффективностью диффузии растворителя и отсутствие взаимодействия с красителем. Наиболее оптимальным представляется использование стандартных пластинок для тонкослойной хроматографии на основе порошка 1^0, на поверхность которого наносится исследуемое вещество.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Кулябина, Татьяна Валериевна, Саратов

1.R., Adams R.L., Higgins A.K., Bartels K.E. Nordquist R.E. Photothermal effects on mammary tumor using indocyanine green and an 808-nm diode laser: in vivo efficacy study // Cancer Lett. - 1996. - V. 98. - P. 169-173.

2. Reindl S., Penzkofer A., Gong S.-H., Landthaler M., Szeimies R.M., Abels C., Baumler W. Quantum yield of triplet formation for indocyanine green // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 1997. - V. 105. - P. 65-68.

3. Abels C., Fickweiler S., Weiderer P., Baumler W., Hofstadter F., Landthaler M., Szeimies R.-M. Indocianine green (ICG) and laser irradiation induce photooxidation // Arch. Dermatol. Res. 2000. - V. 292. - P. 404^ 11.

4. Rogerio A. Costa, Michel E. Farah, Edna Freymu Ller, et al. Choriocapillaris Photodynamic Therapy Using Indocyanine Green // Am. J. Ophthalmology. 2001 -V. 132.-№.4.-P. 557-565.

5. Pass H.I. Photodynamic therapy in oncology: Mechanisms and clinical use // J. Natl. Cancer. Inst. 1993. - V.85. - P.443^56.

6. Green H.A., Bua D., Anderson R.R., Nishioka N.S., Burn depth estimation using indocyanine green fluorescence // Arch. Dermatol. 1992. - V. 128. - P. 43^9.

7. Oz M.C., Johnson J.P., Parangi S., Chuck R.S., Marboe C.C., Bass L.C., Nowygrod R., Treat M.R. Tissue soldering by use of indocyanine green dye-enhanced fibrinogen with the near infrared diode laser // J. Vase. Surg. 1990. - V. 11. - P.718-725.

8. McNally К. M„ Sorg B. S., Welch A. J., Dawes J. M. and Owenk E. R. Photothermal effects of laser tissue soldering // Phys. Med. Biol. 1999. -V. 44. - P. 983-1002.

9. Lim JI, Sternberg P, Capone A, Aaberg TM, Gilman JP. Selective use of indocyanine green angiography for occult choroidal neovascularization // Am. J. Ophthalmol. -1995.-V. 120.-P.75-82.

10. Newsom T., Oetting T. Indocyanine green staining in traumatic cataract // J Cataract. Refract. Surg. 2000. - V. 26. - P. 1691-1693.

11. Goto, Y., Obana, A., Ueda, N., Miki, T. Surgical technique for atopic cataract // Japanese Journal of Clinical Ophthalmology. 1995. - V. 49. №2. - P. 277-282.

12. Picker 0., Wietasch G., Scheeren T.W.L., Arndt J.O. Determination of total blood volume by indicator dilution: A comparison of mean transit time and mass conservation principle // Intensive Care Med. 2001. - V. 27. - P. 767-774.

13. Gottlieb M.W., Stratton H.H., Newall J.C., Strah D.M. Indocyanine green. Its use as an early indicator of hepatic dysfunction following injury in man // Arch. Surg. 1984. -V. 119.-P. 264.

14. Lehmann C., Tymoorian K., Wauer H., Krausch D., Birnbaum J., Kox W.J. Effects of the stable prostacyclin analogue iloprost on the plasma disappearance rate of indocyanine green in human septic shock // Intensive Care Med. 2000. - V. 26. - P. 1557-1560.

15. Guyer D.R., Puliafito C.A., Mones J.M., Friedman E., Chang W., Verdooner S.R. Digital indocyanine-green angiography in chorioretinal disorders // Ophthalmology.1992.-V. 99.-P. 287-291.

16. Guyer D.R. Yannuzzi L.A., Slakter J.S., Sorenson J.A. Orlock D. The status of indocyanine-green videoangiography: Editorial review // Curr. Opin. Ophthalmol.1993.-V. 4.-P. 3-6.

17. Kunihiko Shiraki, Mitsuyasu Moriwaki, Takeya Kohno et al. Age-related scattered hypofluorescent spots on late-phase indocyanine green angiograms // International Ophthalmology. 1999. - V. 23. - P. 105-109.

18. Benson R. C. and Kues H. A. Fluorescence Properties of Indocyanine Green as Related to Angiography // Phys. Xed. Biol. 1978. - V. 23. №1. - P. 169-163.

19. Ketley J.N., Habig W.H., Jakoby W.B. Binding of nonsubstrate ligands to the glutathione S transferases // J. Biol. Chem. 1975. - V. 250. - P. 8670.

20. Sauda K., Imasaka T., Ishibashi N. Determination of protein in human serum by high-performance liquid chromatography with semiconductor laser fluorometric detection // Anal. Chem. 1986. - V. 58. - P. 2649.

21. S.G. Sakka, A. Meier-Hellmann, K. Reinhart. Do fluid administration and reduction in norepinephrine dose improve global and splanchnic haemodynamics? // British Journal of Anesthesia. 2000. - V. 84. № 6. - P. 758-762.

22. PDR For Ophthalmic Medicines entry for IC-Green (Alkorn). http://www.healthand.age.com

23. Fox I.J., Wood E.H. Indocyanine green: physical and physiologic properties // Mayo. Clin. Proc. 1960. - V. 35. - P. 732-744.

24. Lu Y. and Penzkofer A. // Chem. Phys. 1986. - V. 107.-P. 175.

25. Lansman M.L.J., Kwant G., Mook G.A. and Zijlstra W.G. // J. Appl. Physiol. 1976. -N. 40.-P. 575.

26. Baker K.J. Binding of sulfobromophthalein (BSP) sodium and indocyanine green (ICG) by plasma alpha-1 lipoproteins // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1966. - №122. -P. 957.

27. D. Haberthür Use of Lasers in Medicine: Tissue Soldering and Precise Cutting / Diplomarbeit der Philosophisch-naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität. Bern.-2002.-84P.

28. Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей, М.: Химия. 1977.

29. Киприанов А.И. Цвет и строение цианиновых красителей, Киев, Наукова думка. 1979г.

30. Mishra A., Behera R.K., Behera Р.К., Mishra В.К., Behera G.B. Cyanines during the 1990s: A Review // Chem. Rev. 2000. - V. 100. - P. 1973-2011

31. Weigand R., Rotermund F., Penzkofer A. Degree of aggregation of indocyanine green in aqueous solutions determined by Mie scattering // Chemical Physics 1997-№220.-P. 373-384.

32. Sheppard, S. E. Proc. R. Soc. (London) Л 1990, 82, 256. или Shapiro В. I. Molecular assemblies of polymethine dyes // Russ Chem. Rev. 2006. V 75 (5). - P. 433-456.

33. Marchetti, A. P.; Salzberg, C. D.; Walker, E. I. P. // J. Chem. Phys. 1976. - V. 64. -P. 4693.

34. Опубликовано на сайте http://www.organica.ru/ru/icg.html

35. Green F.J. The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators. Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wisconsin. - 1990. - P. 407.

36. Holzer W., Mauerer M., Penzkofer A., Szeimies R.-M., Abels C., Landthaler M., Baumler W. Photostability and thermal stability of indocyanine green // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1998. - V. 47 - P. 155-164.

37. Rotermund F., Weigand R., Holzer W., Wittmann M., Penzkofer A. Fluorescence spectroscopic analysis of indocyanine green J-aggregates in water // J. Photochem. Potobiol. A: Chem. 1997. - V. 110 - P. 75-78.

38. Mauerer M., Penzkofer A., Zweck J. Dimerization, J-aggregation and J-disaggregation dynamics of indocyanine green in heavy water // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1998 - V. 47 - P. 68-73.

39. Rotermund F., Weigand R., Penzkofer A. J-aggregation and disaggregation of indocyanine green in water // Chemical Physics. 1997 - V. 220. - P. 385-392.

40. Philip R., Penzkofer A., Baumler W. et al. Absorption and fluorescence spectroscopic investigation of indocyanine green // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 1996. - V. 96-P. 137-148.

41. Lenhard, J. R.; Hein, B. R. Effects of J-aggregation on the redox levels of a cyanine dye//J. Phys. Chem.- 1996.-V. 100.-P 17287.

42. Zweck J., Penzkofer A. Microstructure of indocyanine green J-aggregates in aqueous solution // Chemical Physics. 2001 - V. 269. - P. 399-409.

43. Guyer D.R., Duker J.S., Puliafito C.A. Indocyanine green angiography and dye-enhanced diode laser photocoagulation 11 Semin. Ophthalmol 1992. - V.7. - P. 172— 6.

44. Bass L.S. Photosclerosis of cutaneous vascular malformations with a pulsed 805nm diode laser // Proc. Biomed. Optics. Soc. 1995. - V. 2395 D-93. - P. 188.

45. J.M. Devoisselle, S. Soulie-Begu, S. Mordon, T. Desmettre. H. Maillols A preliminary study of the in vivo behavior of an emulsion formulation of indocyanine green // Lasers Med Sci. 1998 - № 13. - P. 279-282.

46. Riefke B., Licha K., Semmler W. et al. In vivo characterization of cyanine dyes as contrast agents for near-infrared imaging // Proc. SPIE. 1996. -V. 2927. - P. 199-208

47. Kazuyoshi Motomura, Hideo Inaji, Yoshifiimi Komoike et al. Sentinel node biopsy guided by indocyanine green dye in breast cancer patients // Jpn. J. Clin. Oncol. -1999.-V. 29. -№ 12.-P. 604-607.

48. Gill R. A., Goodman, M. W, Golfus G. R., Oustod G. R, Budrick M. P. Aminopyrine breath test predicts surgical risk for patients with liver disease. // Ann. Surg.- 1983.-V. 198.-P. 701.

49. Ozawa K. Hepatic function and liver resection. // J. Gastroenterol. Hepatol. 1990. -V.5.-P. 296.

50. Leavy, C. M., Smith, F., Longneville, J., Paumgartner, G., and Howard, M. M. Indocyanine green clearance as a test for hepatic function. Evaluation by dichromatic ear densitometry. // J. Am. Med. Assoc. 1967 - V. 200 - P. 236.

51. Imai, T., Takahashi, K., Goto, F., and Morishita, Y. Measurement of blood concentration of indocyanine green by pulse dye densitometry—Comparison with the conventional spectrophotometric method. // J. Clin. Monit. 1998. - V. 14 - P. 477.

52. Osamu Okochi, Tetsuya Kaneko, Hiroyuki Sugimoto, Soichiro Inoue, Shin Takeda, and Akimasa Nakao. ICG Pulse Spectrophotometry for Perioperative Liver Function in Hepatectomy // Journal of Surgical Research. 2002. - V. 103. - P. 109-113.

53. Wilkinson G. R., Shand D. G. A physiological approach to hepatic drug clearance. // Clin. Pharmacol. Ther. 1975. - V. 18 - P. 377.

54. Moody F. G., Rikker L. F., Aldrete J. S. Estimation of the functional reserve of human liver. //Ann. Surg. 1974. - V. 180 - P. 592.

55. Hunton D. В., Bollman J. L., and Hoffman H. N. Studies of hepatic functions with indocyanine green. // Gastroenterology 1960. - V. 39. - P. 713.

56. Masaji Hashimoto, Goro Watanabe. Hepatic Parenchymal Cell Volume and the Indocyanine Green Tolerance Test // Journal of Surgical Research 2000. - V. 92 -P.222-227.

57. Алябьева Ж.Ю., Егоров A.E. Исследование микроциркуляции в офтальмологии // 19 Российский государственный медицинский университет, http://www.rmj.ru/articlesl 515.htm

58. Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшуллер Г.Б. Спектральные характеристики индоцианина зеленого при его взаимодействии с биологическими тканями // Оптика и спектроскопия. 2005 - Т. 99. - № 4. - С. 582-588.

59. Кулябина Т.В. Агрегация индоцианина зеленого в водных растворах // Труды третьей международной конференции «Фундаментальные проблемы оптики», -2004.-С. 47-49.

60. Akira Nishimura, Akira Kobayashi, Mayumi Sakurai, Yasunori Segawa and Yutaka Shirao. Does Precipitation Reduce Tissue Staining by Indocyanine Green Dye Solutions? Опубликовано на сайте http://www.sciencedirect.com

61. Takasuke Imai, KenichirouTakahashi, Fumio Goto, and YasuoMorishita Measurement of blood concentration of indocyanine green by pulse dye densitometry comparison with the conventional spectrophotometric method // J Clin. Monit. 1998. -V. 14.-P. 477-484.

62. Alcohol and Water Don't Mix Опубликовано на сайте http://www.lbl.gov/Science-Articles/Archive/sb-ALS-alcohol-and-water.html

63. Бахшиев H. Г. Спектроскопия межмолекулярных взаимодействий. JI. 1972.

64. Опубликовано на сайте http://www.xumuk.rU/encyklopedia/2/4129.html

65. Karolet М. J., Abboud I. М., Tuft R. W. Linear solvation energy relationships. 12. The d5 term in the solvatochromic equations // Journal of the American Chemical Society- 198 l.-V. 103.-№5.-P. 1080-1086.

66. Опубликовано на сайте http://www.studs.ru

67. Тагер А.А. Физикохимия полимеров. М., Химия. 1978.

68. Райхардт X. Растворители в органической химии. Пер. с нем. Под ред. JI.C. Эфроса. JL, Химия. 1973.74Луценко И.Ф. (ред.) Органические реакции 1963.-т. 10.-С.555.

69. Meyer К.Н. Вег. 1921 - V. 54. - Р. 579.

70. Косовер Э. Молекулярная биохимия. Пер. с англ. под ред. А.Е. Браунштейна и Я.М. Варшавского. М.: Мир. 1964.

71. Rohrschneider L. Fortschr. // Chem. Forsch. 1968. - V. 11. - P. 1968.

72. Hildebrand J.H., Scott R. L. The Solubility of Nonelectrolytes. New-York, Reinhold Publ. Co. 1950.

73. Молодцова Е.Д. Критерии выбора растворителей для полимеров (обзор) // Пластические массы. 1991. - № 8. - С. 47-51.

74. Дринберг С.А., Ицко Э.Ф. Растворители для лакокрасочных материалов. JL, Химия. 1986.

75. Энциклопедия полимеров. 1977. - Т. 3. - С. 535.

76. Нестеров А.Е. Свойства растворов и смесей полимеров. Киев, Наукова думка. 1984.

77. Hansen Ch. M. e.a. // J.Paint Techn, 1967. - V. 39. - № 505. - P. 104; № 511 - P. 511.

78. Vial J.C.R. // Acad. Sei. 1970. - V. 270. - P. 683.

79. Бектуров E.A. Тройные полимерные смеси в растворах.// Алма-Ата. Наука. 1975.

80. Моравец Г. Макромолекулы в растворе. Пер. с англ. Под ред. В.А. Каргина, И.А. Туторского М., Мир. 1967.

81. Dondos A.C. // R. Acad. Sei. 1968 - V. 267. - P. 370.

82. Ляликов Ю.С. Физико-химические методы анализа.// М. 1973.

83. Горбацевич С.К. Спектроскопия межмолекулярных взаимодействий. // Минск, «Электронная книга БГУ». 2004.

84. Дж. Кертисс Ч., Берд Р. Межмолекулярная теория газов и жидкостей.// М.: Иностр. лит. 1961.

85. Фрелих Г. Теория диэлектриков М.: Иностр. лит. 1960.

86. Бахшиев Н.Г. Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их влияние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных растворах. II. Производные фталимида (жидкие растворы) // Опт. и спектр. 1962. - Т. 12. -№3.-С. 350-358.

87. Бахшиев Н.Г. Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их влияние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных растворах.

88. I. Производные нафталина, стильбена, дифенила, анилина, флуорена и пиридина (жидкие растворы) // Опт. и спектр. 1962. - Т. 12. - № 4. - С. 473— 478.

89. Перов А.Н., Бахшиев Н.Г. О некоторых результатах описания сольватохромных явлений путем учета парных вандерваальсовских взаимодействий молекул // Опт. и спектр. 1973. - Т. 34. - № 5. - С. 902-906.

90. Перов А.Н. К вопросу о виде потенциала ориентационных межмолекулярных сил в теории сольватохимии // Опт. и спектр. 1975. - Т. 38. - № 4. - С. 803-805.

91. Abe Т. Clinical studies on thiamine // Zasshi. Journal. Nihon Naika Gakkai. -1965. -V. 54. (9).-P. 989-1006.

92. Перов A.H., Бахшиев Н.Г. О некоторых результатах описания сольватохромных явлений путем учета парных вандерваальсовских взаимодействий молекул // Опт. и спектр. 1973. - Т. 34. -№ 5. - С. 902-906.

93. Перов А.Н. К вопросу о виде потенциала ориентационных межмолекулярных сил в теории сольватохимии // Опт. и спектр. 1975. - Т. 38 -№ 4. - С. 803-805.

94. Шефер Ф.П. (ред.) Лазеры на красителях. Пер. с англ. под ред. Л.Д. Деркачевой М., Мир. 1976.

95. Urbanska К., Romanowska-Dixon В., Matuszak Z., Oszajca J., Nowak-Sliwinska P. and Stochel G. Indocyanine green as a prospective sensitizer for photodynamic therapy of melanomas // Acta Biochimica Polonica. 2002. - V. 49. - № 2 - P. 387-391.

96. Опубликовано на сайте http://omlc.ogi.edu/spectra/

97. Кулябина Т.В., Кочубей В.И. In vivo исследования растворов индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека // Проблемы оптической физики,. 2004. - книга 1. - С 68-73.

98. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. In vivo investigation of interaction of indocyanine green solutions with human epidermis // Proc. SPIE. 2004/ - V. 5474. - P.339-343

99. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. Efficiency of staining hair with indocyanine green // Proc. SPIE. 2005. - V. 5771. - P. 372-376,

100. Кулябина Т.В., Кочубей В.И. Эффективность окрашивания волос человека растворами индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики 2005. -книга 1.-С. 68-73.

101. Кулябина Т.В., Кочубей В.И., Прохорова Е.Н. Спектральные исследования взаимодействия индоцианина зеленого с меланином // II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика 2005», сборник материалов. - С. 281-282.

102. Овчинникова И.В. Мониторинг состояния биотканей методамиполяризационно-отражательной флуоресцентной спектроскопии. Дисс. . канд.физ.-мат. наук. Саратов, 2005. - 160 с.

103. Синичкин Ю. П., Утц С. P. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека. // Саратов. Изд-во Сарат. Ун-та. 2001- С 92 .

104. Генина Э.А., Башкатов А.Н., Кочубей В.И., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. In vivo исследование взаимодействия индоцианина зеленого с эпидермисом человека // Письма в ЖТФ. 2001. - Т. 27. - №.4. - С. 63-67.

105. Борщевская М.И., Васильева С.М. Развитие представлений о биохимии и фармакологии меланиновых пигментов // Вопросы медицинской химии. 1999. -Т. 45.-№ 1.-С. 13-23.

106. Бриттон Г., Биохимия природных пигментов, пер. с анг., М., 1986; Nicolaus R. A., Melanins, Р., 1968; Blois М. S. //Photochemical and hotobiological Reviews. -1978.-V. З.-Р. 115-34.

107. Birbeck M. S. С., Mercer E. H., Barnicot N. A. The structure and formation of pigment granules in human hair II Exp. Gel. Res. 1956. - № 10. - P. 505-514.

108. Bratosin S. Disassembly of melanosomes in detergents // J. Invest. Dermt. 1973-№60.-P. 224-230.

109. Novellino L., Napolitano A., Prota G. Isolation and characterization of mammalian eumelanins from hair and irides // Biohim. Biophys. Acta-Gen. Subj. 2000. - P. 295-306.

110. Опубликовано на сайте http://www.oftalm.ru/archive/0035.htm

111. Ishihara H., Т. Iwakawa, Т. Hasegawa et al. Does indocyanine green accurately measure plasma volume independently of its disappearance rate from plasma in critically ill patients? // Intensive Care Med 1999. - № 25 - P. 1252-1258.

112. Stalmans P., Van Aken E.H., Veckeneer M., Feron E.J., Stalmans I. // Am. J. Ophthalmol. 2002. - V. 134. - № 2. - P. 282-285.

113. Ho J-D, Tsay R. J-F., Chen S-N, Chen H-C. Toxic Effect of Indocyanine Green on Retinal Pigment Epithelium Related to Osmotic Effects of the Solvent // Am. J. Ophthalmol. 2003. - 0002-9394-03. - P. 258.

114. Kulyabina T.V., Drajevsky R.A., Kochubey V.I., Zimnyakov D.A. Coherent optical analysis of crystal-like patterns by human plasma desiccation // Proc. SPIE. 2001. -V. 4242.-P. 282-285.

115. Опубликовано на сайте http://medi.ru/doc/99.htm

116. Львова Л.В. Трансдермальные терапевтические системы. Опубликовано на сайте http://www.provisor.com.ua/archive/2004/Nl 7/art26.htm

117. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов B.C. Физическая химия. М.: Высш.шк.,- 1990.-416с.

118. Хроматография на бумаге под ред. Хайс И.М., Мацек К. //Изд-во иностранной лит-ры, М., 1962.