Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ACTINOMYCEE FRADIAE 119

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ACTINOMYCEE FRADIAE 119"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕН Л ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А.Н.БАХА

На правах рукописи

ДОЛИДЗЕ Джема ли Аквсентьевич

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ АсМпотусев ^гжИве 119

03.00,04 - биологическая химия

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кгмщииата биологических наук

Москвл - 1973

АК№И!М НАУК СССР ОРДЕНА ШШШ ИНСТИТУТ БЙОХШШ и«. Д.¡{»БАХА

ils правех рукотоий

Долидэз Двеиам Лквсецгьдвач

ПРОКШШТИЧЕСй1В ФВРНЩШ Actlttomyoea fradtao 119

ОЗ.GO.04 - биологическая хиикя

Автореферат дассартадаи на соисканиз ученой степени кандидата биологических наук

г-"" ; '7-""-

Йоиквв, Î973

Работа выполнена в Лаборатория фэриенгвых препаратов фдена Левина Института биохикии кн. А.Н.Баха КI СССР под руководством доктора биологичзсяих наук, профессора Р.В.ФШЙСО-ВОЙ и кандидате биологических наук И.С.ПЕТРОВОЙ,

Официальные оппоненты:

доктор химических наук КАВЕРЗНЕВА В.Л.

кандидат биологических наук ЮСОЛШ В.В.

На официальный охаю работа направлена на кафедру биопшип растений Оноло го-почвенного факультета ИГУ.

Автореферат разослан 1978 г.

Занята диссертации состоится " "_• I97S г.

на заседании Ученого совета Ордена Лепняа института бяохвшя ■я. А.Н.Баха АЫ СССР Щоеква, B-7I, Ленинский проспект, 33).

С дяссвртацаей можно ознакоиитъся в библиотека Института.

УЧШШ» СЕКРЕТАРЬ канд.баол.наук

Ш.Н.ДЫЩС8)

ВВЕДЕНИЕ

Иротсомтичесаво ферменты микроорганизма правде и вм в послалндр крона пристальное вяикенке ученых. Янтарео и сед е деятелей к микробным протеаэаи сб-олсннются их чрзэаычайно высокое es* тненоспш и необычный многообразие«, широкий использованием в яачастзе удобного объекте для »вученан первичной, вторичной н третичной структуры белков. Сущеотаеынш сгииулоы изучения про to одитичвснях фериентсв является растувде пзропеятнвы их использования в лицевой я легкой прошгаленноста, в сельской хозяйство я медицина, .

Следует otifsrm, что в качестве продуцентов протеаа чаша в с польз унт грибы и бактерии* Актмнотацеты изучены в значительно неньиеИ степени, во и среди них обнаружены представители, синте-аирувщиа очень активные нротеазы. Протеолитичаскна ферменты ак-тиноинцетов особенно интересна тем, что как правило они обладай« иирокмц спектром действии и интенсивно гидролиэувт рввя^чше del m. Наиболее известны и исследованы препараты протеолк^ическпх ферментов.из -актиношщетов st г.grte eue (.проназа, проталин), Azt„ . rlmoetia (римоэин), Act. albus И Act. fradla« птаниы 3739 tKfl-ратлказа) и B5S5.

Активный продуцеигок протеса является также Act. fmdl а 4 шт* 119. При кудьтинировгшии на специально подобранной среде этот sятино«ицет синтезировал активные прчтеээи, гидрол»зовв»»»е различные глобулярные белки, эластин и I иен ее интенсивно) в омеге н и яар<;ть. Болов глубоко комплекс протеза, содлр«вэдхся »

препарате* на Act.fradiao 119, не изучался, хотя па свой*

свойствен сротеазы этого микроорганизма представляют без у tí оь ни

больной интерес, а препараты протеаз, как показала проведенпыа ) -

исследования, могут быть использогзны ¿ легкой промышленности для обезвояоиявания напененного сиръя, в «¡icuoH про мышление-с ад &яя иягчеяид мяса и утилизации кератннсодержащих отходов, т? wo-дипкне при лечении неврозов.

В свяэя с втим целью нашей работы было: получение очияенно-то sucoKoscTHBHoro препарата яротеаа из глубинной культурн Act, frailee 119, разделение и исследование комплекса протзпдиуичее-них ферментов, содерзащихся s препарате; получение дезных о продуктах гидролиза казеина» альбумина сои и алактива протеаназевд act.frailee яэ.

i. материалы и методу исследования

В качества продуцента протевэы Сил взят Ac tj подсев íVa-dtae 11S, полученный на коллекции отдела октибаоттсов Инстатута кикробкомгки АН СССР.

Актяноиицет выращивали глубинным сетодо» ив среде следующего со став я 1в Я>): крахмал растворимый - 4» соевая мука - I; (ИН4)г S04 - 0,C05í ЮуК>4 « 0,045t ZaSO^ - 0,002; FeSO^-O.OO I; ■ЙрС1г - 0,001) CsCOj - 0,3.

.Скровдивокка актияорицета проводяли з 750 ил t голбах, содер-аащш: Г;00 мл среди tía качалках, д е л сю щеЙ 180-200 об/ш я, при температуре ¿8-2Э°С в течение 120 часов. Гнделекяе ферментов ис куль тура дььоЙ ксдкости проводили путем осаждения их 3,5 сбъечп-«I охлажденного до>4° экаиола,

Протеолятическуь еятудатег.;, определяли no мете/г At'con а,

в модификации JarpasoS .и Вявцюнвйта (1966). Ажтмвиосгь протеинааы определяли по холи ч ест в j тирозина в пептидах, обравувиихся пооав 10-мвау1яого:про?ео1Ш8а 2$ раствора казеина пра pH 8,0 к температуре 87°С. < ■ ' i ■

Активность влвотааы определяла по .иктансшщости овресги, лоторуо даст с биуратовыи рвактввш растворит« пвптвдн, обра-ауюциеся пра действии фермента на препарат аластвна [Петровк, •8/бва, 1968).

Трирсиаоаув еатавнооть определили na иатодх Язерта-Такеавжа I3nhw«rtt talteineke,l955)- В качества субстрата использовала вталошЯ эфир N - бенаоил - ь - аргинина (БАЭЭ)«

Активвость аиотрипсина определяй го.рвсвиплвия» втилового афира к - ацетил - L — тирозина (АТЭЭ), (Schwert et »1.,19.

ДвШщааиивопвптядеанув активность определяли по действии фермента не субстрат t - лвКцил - ß - нвфгаленид (Ш), (?*••«-cott, ИЦква, 19б6;Рассудин, Каверзневе, 1968). Карбсхсвпепта-давную ектавность определяли по расцепление суботрата КБЗ - гля-цжл-лвйцвна, которое контролировали № интеасаваости охраекн продуктов реакции с нингидрином (Рассудив, Каверзнева, 1968}*

Белок определял« метода Лоуря I Lowry «t »1.,I35ti я я« спектрофотометра при £80 ни .. „

Комплекс белка«, лродуцируг аыг Act.rradi«« 119, фракциояи-рояеди на .KU-цедявлоэе в гредиенте'яавной сиди ш яа б ко геле P-IO.

Аминокислотный состав белков определяли на автоматической' анализатора аи:гноиислот kla - 8 фирмы * Hitachi V

Определение молекулярных весов ферментов проводил« по катоду Летермана (.1970), исполь уя гедь-фнл&трецио на сефадексе о-100. Исследование гомогенности протеолнтивеских Ферментов про во-

диет с помощь» электрофорезе в полиекрилеиидном геле lometeti», IS64j Devle, ISS9/ в модификации Гельмановв ЧЭ67).

Для обнаружения глякопротеидов в по ли ек ри л еми динх гелях поел» электро{ореэа исследувных ферментов исполгвовали метод Кейаера I Квузег, 1S64).

Иэоелехтраческоо фокуспрование протеолитичесяиг ферментов Aot.irodjfl«. 119 проводил* по метод? Вестерберга о сотр. terberg et el., 0€7 ).

Отделение свободных t,jaнокислот от леп гидов в фермоетягвв-вых гидролизвтах разных белков провидили на ДЭАЭ-цвлявлозе. ( TonuMl et el., 1968 >.

Ц. РАЙДЕШШВ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕОЛИИЧЕШХ ^ . «ЕРИЕКТСЙ ACTMOMYCES ГЯА01АЕ 119

X. Получение препарата протеаз Aot.fradias 119 я его хврвхтеристиха

Дая получевия препаратов протеев ектиномицет выращивали при S8-29°C на ходкой среде в колоахиакачалке в течение 120 часов, эетеи культуру фильтровый и протеазы, содержащиеся в фильтрате, осаждали 3,5 объемами этанола. Осадок собирали, растворяла в неводы ом объеме водыи сушили лио£"*льно. Дальней!" у® очистку препарата проводили на ДЭАЭ-целлюлозе в О.С3 И фосфатной буфере рН 7,0. Протеазы ее сорбировались на ЛЭАЭ-аеллюаозо и вымывались хэ колонки начальным буфере и. Собранный элюет содержал про-теолитичесиую в эластеэну» активности и около 50£ г елка препарата, взятого дли очистки. Элват сушили лиофилъно. Полученный препарат, очицевный в 4,5 раза, содержал £5$ белке; основная при-

мэсь веса врасорате) состоим «а полисахаридов, поем

гмдргииаа которых был» обнаружены гг. лактоз а, ыаняоза, гиокоза ■ следы геясозаииши

Кроме яротеолиткческой в аласгазяой активности па действие на специфические субстраты в препарате обааружевы активности! «Йцинамиаоаоатпдааы, карбокеппаптидазы, трипсиноваа в хниотркп-сивовеа.

Электрофоретическое исследование препарата показало налячив я ней четырёх белковых компонентов, движуияхеи к катоду в электродном буфере рН 1*3 (.рис Л). Протеолитичэохая активное« была обнаружена во всех четырех аоявх содержащих белок; эластаакув активность проявляла самая нижняя, четвертая полоса.

2* Разделение препарата прогеаз на 'КИ-целллдьзе

Частично очищенные на ДЭАЭ-целлюлозв препараты протоояитн-чвеких ферментов были подвергнуты хроматография на колонка с КЦ-цълшолоэоЙ К-33. При актировании 0,05 II фоофатныи буфером рН 6,0 в градиенте Ы«С1 0-0,2 Ц четко обозначаюсь четыре белковых пика, в которых обнир"\Илм 95-100% белка и 'проти лита ческой активности препарата, нанесенного ва колонку Iрас,2,табл.I). Из таблицы видно, что активности по фракциям распределены неравномерно. Однако удельные активности ферме я то в даже в тел. фракциях, в которых они содержались в наибольшем количестве, уваличж* лясь прж разделении ферментсп не более, чем в 1,5 раза (.протеин аза фракций П-И, эстероэы фракций 1-1У) и только удельная активность эластеэы во фрикции 1 возросла в 10 раз. Трипсииовая активность фракция И и и близка к активности вмоокоо чиненного кристаллического трипсина Набл.Ю.

Pao»!»

Электрофорез в полиакралаивдвов' гелаг протеолитичвсквх Феркевтов AefluovToee-fradia» 119.

Препарат про rear

№

ж

>А

ЛгГ -

те ■.

Вэоэаек£рачесиое фокусирование

Лейцинаааво-пептидаза

lilfiiii Um ,

I.» »■!*

- I -M +

//W

Р* г а*д < i е в а е на Ю1Ц

Г.

Трипсинопо-доЗкаа про-тепнааа

К&рбсвси-пептядаза

Протавквэа П в

¿7 О

Рис.2. Хроматографии препарата протоодитичвских ферментов Ао1.Ггай1а» 119 ва КИ-целлюлозе К-32. I. Балок; Л* .Протеиыаза; 8* Элаотаза.

Таблице I.

Относительное содержание отдельных фракций в препарата протеаз по белку а по активности^

{ . , Активность %

Фракции ¡Белок [просео-1трип6в-1хиио-' 1 ¿дастаз-1 лэицкн > кароок-I а ¡литичдс|новая |трипси-1 Н8Я , |амино-|сипев-

!

»

I

1№лтн-1тидаа-

!лазная1аая

I 2-12 35,0 24,0 1,2 10,0. 0,0 100 100

П 18-32 40,5 СО,0 2,«! 14,0 13,0 0,0 0,0

. « 33-39 7,0 9,0 36,2 * 50,0 82,0 0,: 0,0

1У 40*44 II,5 7,0 60,0 26,0 0,0 0,0 0,0

За 10С>* принято общем количество белка и активности в навеске препарата, взято» для фракционирования.

Таблица 2

Удельше активности протеаз » препарата Ао1;. :г*в41ае 119 я полученных из наго фракциях

Фракции

4-05

Iпротвола-1трлпсино-| Ждчотря п-^лестаэ-Гтическая { вая ¡синоьая \ пая \ 11

Удельна^ активность

|-Лтп'лпсино-1 Хааот ояп-.ъла

■у оэлка)

4-

(

-4-

лоацина-|11ар-ыянопеп-!бок-тидазяая ¡сипея-

{1-й ДЭЗ -

_1аая_

х л

в .

иг Препарат

.II ХЙ '7 4

1

400 600 8100 12300

еооо

27

ж

■ 125 65 93

О

до

157 "О 16

0,3

о о о

0,15

0,2

О

О

о 0,2

Таким образон, хроиатографвя на КМ-целлялоэе показала, что в препарате, выделенной из глубинкой культуры Лег. fradi.ee 119 в очвденнои на ДЭАЭ-целлвлоэе, содержатся смесь нескольких прс-теяиаа в пептидаа.

Электрофоретяческое исследование полученных фракций при рН 4,8 и 8,доказало (рис,1), чго наиболее гетерогейва фрав-Ц1Н I; во фракции П наяли два белковых компонента, белок фракции П я 17 гомогенен при двух испытанных значениях рЯ.

Для разделения белков фракции И использовали бяогел* >

Как видно из рис.З, после вдеции 0,013 (1 борятнцм буфером рН 7,0 О 0,1 Ц ИеС1 подучили два белковых компонента, один кс пэнент IПа) оказался вротеиназой, второй (.Ш) имел протео^тическу» и аластазяуп активности. Электрофорез подтвердил однородность полученного фериеата Па 1рисЛ).

- и -

Рдс.8. Рвхроиатогрйфия на биогеда F-IO фракции П.

X. Бедок} Z* Протеиноэа; 3. блаотаза.

Ддя подтверждения чиотогы белков фракции На, В « 1Í нх ро-цюиатографировали Яв бяогедэ Р-10. fice ферменты внходнди од кип пиком о одинаковое удельной активностью во всех фракциях, что указывало на отсутствие принеси посторонних белков.

Определенна молекулярного веса белков, содержащихся в препарата и во фракциях Па, Ш н 17, гельфнльтрациеЯ через сефндеко 0-100 показало, чго оаи имеют величину порядка IIOOO, 6000, 9200 я XOGOO соответственно.

Прь вычиолеяяи молекулярных весов ферментов фракция На в ■ ио их аиииокисдотаому сос- isy подучили сходные аехячякц (.табл.З).

- 1Z -

Таблице 3

Амиаоккслотаый состав нротеолитнчаских ферментов Aot.frmdlee 119

I число остатков на молекулу) Аминокислот,, |аГиУ

Лмаин X 2

Гистидия .2 .1

Аммиак à)

Аргинин 5 4

Аспарагивовая к-та . 8 3

Треония 6 S

Свирин 10 10

Глутамиаоваа к-та 5 ?

Пролик 4 3

Глицин И 17

Алании е 9

Цистин 0 0

Ваши 3 3

Метионин \ s I

Изолойция 2 3

ЛвИциа 4 5

Тирозин г 2

Фенилаланин i 7

___2£его_остатков _ jï z _ i 11

Молекулярный вес 7200 BISO

9. Иэозлектрячвское фокусярование препарата протааз к выделенной иа кого фракции I

Для изучения комплекса протеолятических ферментов АвЬ. Гга<11вв 119 к для разделения фраздии I мы использовали метод жаомектрического фокусирования в радианта рН от 10,0 до 3,0.

Результаты показали (,ряо,4)^ что препарат аротваэ содержи не мэвее девяти белковых компоненте' о иеоалактрическими точками (р!) при рН от 10,0 до 3,7. Протеолатическая активное» обнаружена у белков с р! 10,0} 8,Х{ 7*0; 6,В;5,6» Однако основные является компонент с р! 10,04 В этом пикенайдева больная честь активности протаи^азн и воя эластазяая активность. Содержание в препарате белков, лишенных ферментативной активности,

Aet.frad1.ae 119.

X. Белок; 2. Протеиназа; Э. Злаотаэа; Ч. рН.

Ори хроматографии препарата протеев -за КЫ-целлплоээ карбох-«к- ш лейциначинопаптидаавы.» активности были обнаружены в первое фракции; р езда лить эти активности рехроаатографией на КМ- и * ДЗАЭ-целлалозах на удалось, поэтому для разделения белков фракции 1> бил использован метод иэоэл.жтраческого фокусирования.

Как видно va рио.5, во фракция I содержатся шесть балковах компонентов о pi о? 7,0 до 3,7, причем кривая элвцки этих белков точно (воспроизводит соответзтзующщ отрезок кривой рис.4.

Рис.5. Иаоалектрйчаское фочусирезание фракции I*

I. Белок; 3» Протеида?а; 8. ЛеНцинамяаолептидаэа, Е-400 ни; 4. Карбоаоипептидаза» Е-536 ни; S. рН.

Ч

Лвйциыаминооептидаза и к арбо к си rte птй даэ а после нэоалектрк* чаского фокусирования раадслились и Оказались индивидуальными ферментами гоиогенныни пря алектрофозере при двух 44,3 и 6,9) ■спитаяhuí значениях рН (ряс.1). Их иэоэлектричаские точки находятся при рН 7,0 и 6,3 соответственно* Протеиназа о pi 5,6 дава-жа дао белковые полосы во враия электрофореза как при рК 4,3, тая я лря рН 3,9. Три белковых компонента с pi 4,4; 4,1 и 3,7 оиавалкФЬ неактивными пркивсями. Сопоставление результатов вэо-

электрического фокусирования продана Ло^./гасице 119 в результат о»ш их фракционирования Но КМ-целлюлоза позволяет сделать вывод, что в 0,05 М фосфатном буфере рН С,0 на КМ-целлилоэе К-ВЗ сорбируйтсв только „.елочные белки с р1 гыив 7«О, т.е. беляя фракции П-1У, все более кислые белки здвирувтоя начальный буфером образуя фракци» I. ,

, , "'I *

Аналогичные результаты получили Робероте и Лобба ( Коъвугог-гв, ЬоЪЬв, 1369)* которые методой Иаоэлектричеокого фокусирования в грв'лвнто рй 10,0-3,0 разделяли препараты йротвеэ иэ бея-терии, гриба и аатияшдщета. В препаратах бактериальной протее-эы и проназы авторы наши по 7-8 Сеякогня компонентов с р1 01 0,9 до 4,а. Характерно, что в обоих препаратах кислые белел с рХ 4)8-4)9 так Ев,как и в случае о препаратом протеев Лег.Гга-А1й« 119, ферментативной активнооти не-«мели.

4* Некоторые свойстае лротеолитических ферментов Ас«, ?гв<11в«> 11?

Изучена некоторые свойства препарата протеев г.ферментов« содержащихся во фракциях, получен низе прирэздвлении аре пер «те не КМ-целлюлоэв* '. .

а) Влияние разлитых 'соетонен^а на активность '■'.'. препарата протее^ иего фракций V.

Исследование действия некоторых ингибиторов на протеазы препарата в фракции 1-1У дало слсд^дцие результаты 1тзбл*4): ' . добавление пГОШ не изменяло активности протеолатвчаских ферментов препарата н фракция 1-у» поэтому мояно считать, ч то протеин азы не являются сульфгидрильными ферментами.

Таблица 4

Влияние некоторые ингибиторов на ектийиость препарата проте,аз Áet, fradtee пэ и его фракций

{' Остаточяая ектквкооть й i _

Кояцен-j ¡тРОТео,и:тичбСкап ¡^толити-

■namr«' г' ^ f■ ■ .........-i.. ■ i. i ческан

трацяя. пре-i Зрокики i _

i tía- I ¡ I !препа-!фрак-

|рата; X { П j U J 1У )рата !цаи u

Ингибитор

I.I0-3M 95 90 92 93 95 100 100

$оо|мРШф1ГР" 3.'lO"5M ' 36 100 35 4 2 0,0 0,0

Этилендиаииноте- "' _c¡ ■ 1 _

траацетат 1ЭДТА) I.IO^ÍÍ S2 37 10 82 100 Б,С 0,0

Ингибитор протзаз ¿г1ин-иа соевых бобов г и бито р, (,ИП0Б> иГ балка

5:1 92 91 100 7S 16 89 100

Ингибитор проте- 1

аз из картофеля ■ _

Йпк) Sil '45 100 100 42 16 17 0,0

Протеолитичвекая активность фракции I не изменялась ори добавлении ДПФФ, но ЭДТА ингибировала ее на 6С$. Это дает основание считать, что в этой фракции со-ержатся иетеллофериенты.

На основании полного ингибитпзания ДПФФ протеолитической -активности фракции П-1У и отсутствия какого-либо влияния на них 8ДТА протеиназы фракции И-1У можно отнести к цепочный протеииа-ssu серинового типа,

Нротеолитическая активность препарата протееа я фракций суде«ваяно не менялась при добавлении двухвалентных катионов Саг+, н«г+ и Сог+, Эластезную активность препарате и фракции В сильно внгибировали zns", Сиг+ и cd2+.

Изучение влияния солей не активность протеав показало« что активность властаэы в значительна большей степени, чей еативиость протевнвзы, зависела от концентрации солеР в смеси фермента о субстратом* Если при 0,5 Н' NaCl сохранялось 9С$ протеоляти-ческой активности препарата, то властазная активность падала г.о

однако, фермент при этой не и активировался'и по мере уиень-пения концентрации соли происходило восстановление эластазиой активности» Ингибируюций солевой вф'ект ыокно объяснить на ооно-ве со?ременных представлений о механизме зластолизв, в соответствии е которыми присутствие солей* мешает адсорбции фермента на субстрате ва первой стадии ферментативного катализа эластина 1Gertler, 1871). Кочевала в концентрации 0,75-3'Ытзкхе подавляла аластолиз, однако, ингибирование фермента'также было обрата-мым.

б) рддииум рЦ. температурный оптимум и тегмоствбиль-ность препарата поотэаз и его фракций

vi

Препарат протеав имел оптимум pH от 8,0 до 10,5; максимальную протеолигическув активность фракции Па проявляла при pH 9,0; для фракции I и 17 оптимальным было рЦ 10,0, для фракции 0 - 9,0 - 10,0.

Оптимум эластазной активности препарата к фрекцй*1 Ш'находился при pH 9,0 и 8,5 соответственно, это соответствие оптимуму pH "истивных" эластаэ, таких как панкреатическая ахастаэа.Г » зластаза Plarobaeterlum eleetolytieum (lewle et al., 1959) Mandl, Cohen, 1960 ),

. Оптимальной температурой для действия протеолитичееких ферментов является темп ература^ 45-50°С, только фракция 17 имеет температурный оптимум при 6сРс. Для эластазной активности препарата

- и -

в фрмцлк Е1 температурный оптимум при 40°С. Ны» солее термосте-

балыш&ш оказалась протеьзц фракции I, которые после ЗО-иинутно-

о *

го прогреванип раствора фермента при 60 С сохраняли 60£ первоначальной активности.

5. Содержание угловодонв препарате прогеьз и в его фрр:циях

При описания препарата протеаэ было указано, что в ней содержится 50(5 полисахаридов. При Фракционировании препарата на КМ-целлюлозе углэвэди не отделялись, л неравномерно распределялась по фракциям 1-1У, вслед ст* из чогэ холячеств'* углеводов 1мг), приходящихся ко иг белка, я полученных фракциях было различным ж колебалось от 0,5 до 6,1. При электрофорезе в поляахрилемидвом геле углеводы сопутствовали белку н их можно было обнаружить по окраске с фу к сип серии о 1-ой кислотой в гех же областях, где находился белок. Все это дает возможность предположить, что лротениа-вы ид, подобно некоторым ферментам других микроор-

ганизмов (.Рагиг ег в1., 1903,1965; Андреешсо, Струкоаа, 1966; Ооалихпна и др., 1971), также являются гликспротемдами,

В. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПШ'ОШЗА КАЗЁНКА, АДДОШи СШ И ЭЛАСТИНА ШЮТЙКШ^АКИ-'АСТ. РнтлЕ 119

Глубина гидролиза различных белков ферментами Лсигга^иао ■ обраэувциевя продукты протеолиза не исследованы. Поэтому мы изучали способность препарата Лс<;.Гга31аа 119 и выделенных на наго протекнаэ гидролизовать некоторые белка (казеин, альбумин ив соевых бобов и эластин) в исследовали продукты гидролиза этих белков.

Определение глубины гидролиза белков препаратом про те аз пикаэало (.та<3л.5), что етакуекость казеина при продолжит ел ьво ста прогеолиэа 0,5-4 часа в четыре ряза лшо ствкуемости ояьбумина сои. После 4d-4acovnro ярогаолиза казеина ги дро лиз о d а лоеь64% пептидных связей и иолакуле белка, а посла 72 часов протеиявза альбумина - только 45»5$. Колкчесио растворимых продуктов влас-тоднэе бистро нарастало в первые 4фса действия фериеита я достигало максимума к 24 часам при глубже гидролиза SS,5£. 3 атй же сроки визуально отмечено полное растворение алвстина.

Продукты прогеол^аа исследуемых белков фракционмрозели па се) а дек се с-ю. Было установлено, что при действии препарата яротееэ Ac t.fredtae m образуются в «сковном соединения о мол. весом от 100 до 700, являющиеся,-по-видимому, смеси* олягопепти-дов и свободных аминокислот. 'Е

, Таблица 5

Глубина гидролиза казенна, альбумина сои и элостино препаратом протевэ -Act.fradlfle 119

Субстрат протеолиза

Глубина гидролиза <.£) при продолжительности ггчдролип^ 1часы/

_i_ ггчдролип^ \часы) - ^

0,5 { 1,0 } 4,0 { 12 | 24 } 48 j 72 f -1--U--1-i-1-1-U

95

Казеин 12,6 19,6 SI,О 32,4 34,5 64,1 64,S

Альбумин соя 2,7 3,5 8,0 13,3 20,0 32,0 45,5 45,5 эластин 5,1 9,5 24,0 29,5 35,5 35,5

Для подтверждения наличия свободных аминокислот в ферментативных гидролизахэх казеина, альбумина сои и эластина, и для отделения аминокислот от пептидов, продукты гидролиза хромато-графироваля но /ЛАЭ-целлплоэе в кол л и дин-ацетат ном буфере.

Резуштаты показали, что свободные аминокислоты содержатся ло всех жсодадозааных ферментативных гидролиэетах белков и только^ л продуктах 1-часовогйпротеод*за альбуаинэ соя свободные амн немолоты не .обнаружены 1табя*5). ••

Таблица 6

Количество свободных аминокислот, образующихся при гидродазе казеине, аг&буииаа сок » эластина препгчатои" притааа aou fradin* л\ъ

¿убстрат ' ¡.Свобо^аыв аминокислоты при цротеохиза Г гроколжительиосте пгютеолиэа/часы) | X } 4 1 24 | , 48 | 7Й

Казеин 5,8 - 8,4 17,2 . -

Альбуюш сон. 0,0 - 2,4 '8,3 12,4 . Эластин 10,4 15,9 28,8 -' .

8а 100 приникали содержание аминокислот в uktl в тех же ферыентативных гидролизвтах после их дополнительного гидролиза € a НИ.

SO фракциях свободных аминокислот и пептидов (после кислотного гидролиза последних), опрег^дяли наличие отдельных амино-кисют. йз результатов анализа вид;.о табл.7), что в продуктах 72-часовога лроуеолиза альбумина сои и 43-часового - казеина содержатся почти все аминокислоты. Аминокислотный состав фракции свс^двфх аминокислот и фракции пептидов после 24-часового эда-стодрва отражает как некоторые особенности аминокислотного соо-Ttpft пластина (.отсутствие гиствдина, цистина. следы метионииа), так, по-видимому и некоторые особенности действия ферментов на »»астцн.

' 'Таблица 7

Ашгаокислотннй со стат. гмдрога: затов белков, получении:: при действии препарата протеаэ Aot.rredi.ee /119 (,'jr/i белка) "

¡^войидиые giiкoaijiс лсгы (лызяоьисдоты, входяйче"*

1в ферментативных гидро- 1в состав пептидов и ш-Í лизвтпх Глушенные посла догопии-

íla'.uio кис лота t Сильного кислотного гяд-

!каза- J ¡иуа*/ { Аллбуш+ на соя | Эластине { Казенна игьбутт-{ ¡на сон •}здас-j тиаа

Аязни;» 5,45 4,50 32,0« 0,08 2,И 228,0;

0,0 следу з,е# следы следи следы:'

¡IcuapariJKoiaa хкол^тз 0,0 о д<?' 0,0' П,42 11,70 - /

Вали:! 13,32 4,13 S3,4i 2?,23 3,93 223,62

1\;стндин Í3.32 0,0 0,0 С, 0 0,43 0,0

Гтготэяиповап кислота 0,0 7,30 ' 0,0 64,57 37,90 S3 ,73

гляцин с,« 2,03 15,SO s,co 5. .05. SI7,n

Изолзйцин 3,75 3,72 13,12 15,06 3,51 ó3,I2

Лейциа 51,31 В,03 55,42 8,91 6,43 75,5 С

Лизни 9,73 14,60 9,06 10,22 5,16

Нвтаонин 2. CD 1,23 с в еды следы следи следи

Прсляя 0,0 , 0,22 п,о И, Сб 0,81 108^10

Свргк 1,43 2,34 12,31' 2,62 ХЗ,Н

Tupo?!!« С, 70 0.4Э £17,71 14,94 'Я, К гя»4о

Трмнаа. 2, К: слзди 12,14 Я,£7 . 12,83

«еяаяаяакаа" К,W 5,43 " у,03 "SG,SX

Цлстил ■ 13,следи 0,0 ' 0,'j t',0 0,0

'*/ . . ародоюШ^ШЛмсГЙ» 'гндррлки.) каэй'шл, зльбушша сои и плэотч-. . на и чсса'сзответстег/мя;.

- 2й -

Исследование соединений, обрааующихс цри гидролизе власти -Вв цедочноК аластодктической протеанаэой фракции I, показало, что« несмотря но одинаковые условия проведения аластолиза препаратом и фракцией, глубина гидролиза эластина фракцией И в .2-2,5 раза вике и составляет после 48 часов только I5JS при полном растворении субстрата. Ори этсм образуются фрагменты о молекулярным весом от 5S00 до 73000; свободные аминокислоты не найдены.

Мсхно считать, что эластолихаческая фракция, выделенная из комплекса npoieaaAat, fradiae 119, является зндопептидазоЯ, гидролизушчаЗ относительно неб«лыпов число пептидных связей субстрата - эластина о образованием высокомолекулярных растворимых пептидов.

Однако, та &е адастолптичеекая лротеияез^ фракция ш гкдроли-вовала казеин после 48 часов на 47j&, т.е. почти так же, (,50-64%), как в Другие протеинаэы ферментного комплекса Aot, fra<Hae 119. Woxho полагать, что щелочная зластолитичесиая протеиназа обладает достаточно широкой специфичность» к гидролизу емш связям, однако, она по-разному атакует зластин и казеин, которые сильно раавичептск по аминокислотному составу и строении.

выводи

1. Из культура Act¿ fradiae 119 выделен препарат протееэ о высокой протеояитической активностью, в котором по дейотви» на специфические субстраты установлено наличие активности элас-тазы, лейцинамино- и карбонсипептидаз, зстеразных активностей трипсина и хммотрипсина.

2. При хромагограями на Kil-Целлюлозе препарата протеаз и дополнительного разделения одной tas полученных Фракций на биоге-

- 3>Э -

пе Р-ХО получили три го«огенных фермента: трипсиноподобную лро-тениаяу, эластаэу и протеиназу Па. Гомогенность полученных ферментов подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле при двух значениях рК рехроматографизй на биогеле Р-ХО.

Е. Молекулярный нее трипсиноподобной протеиназы - 10.600; эласта^ы - $.200; протеиназы фракции П - 8.000, препарата про-теаэ Ц.ООО.

»

4. Оптимальным для протеолитической к элаотазной активности препг^ата н гомогенных протеинаэ. являлся интервал рН 8,010,5 и температура 40-50^0,

5. Трипскноподобная протекназа и эзастаза являются серкно-зыкн протеинаэагч, так как они нкгибиров елись Д1Ш> к растительными ингибиторами протеинаа. ЭДТА на их активность не влиял.

- \ б* Йзозлектрическов фокусирование подтвердило множественность протеаэ, содержащихся в препарате. Обнаружено 9 белковых компонентов с нзоэлектрическими точками (.р!) от 10,0 до 8,7. Это влэстеаа {рХ 10,0), являющаяся основным компонентом комплексе, гомогенные лейцинаминопептмдаза м кврбоясипептидазв(.р1 7,0 и 6,3) и три протеиназы о р1 0,6, 6,1 я 5,6. Количество кислых инертные белков в препарате с р1 меньше 5,0 не превышало 10^;

7. Препарат протеев АсиГгасНав 119 гндролиэовал в казеине, альбумине сои к эластине 64,0, 45,5 и 35,5% обаего числа пептидных связей с образованней шгзкомолекулярных пептидов, состо щит в среднем из 3-6 аминокислотных остатков; количество свободных аминокислот в гидролизатак колебалось от до 29$.

8. Гомогенная элсстаза растворяла эластин, гидро лизун его до соединений с молекулприем весом 73.000 и 5.500; свободных аминокислот не найден».

■гЗ.

ШССК РАБОТ/ onj aseste at в их во иатериелп да осе рт аз»

I, Пот рота И.С., Долш# Д.*., биноме P.E. 1972, иооладова-нкв методой rsib-ipüuáiorpaínii продуктов гвдроыэа Иа~ авчаа к «льОиина sou прочеиимаи« Acting с ъа fr«j\a» ПЭ. Прквл. биъхяи, а ианроб. 46t. S. Ямрова If.С,, ДО'.идэа Д. a, IS72. раздела я ив аа аяиопаозмьаяиЯ цвлдслоаа тоЗохних янияохямот я лчпглдов ха фвривигй-тивиих гвжрсииэмов хаэбкча к елъйуыина сок. блохам. я uiapüd. ¿t SIC.

3. Дохвд»в Д.А., Погрова Я.С. IP7E. Гидрол«а влаотйка препаратом *

протеев aatlnowjo»» fra-ílaa 119 и вгэ аласмдимчаовов фракцией. Соовлоаия АН Грузикокой ССР. (¿g, I, Ш. _

4. Петров« ¡I.C., Íoims» Д.А., Фвяикй^ва P.E.. 13ТЭ. Некоторые

оаойома и да Потаив аа аласгиа nporeoj*tuчвскил Фзрмен-тол Ао tin о»jo «в fraila* 11Э. Ярши. ввохии. а мнкрОв.;2» £28.

5. Пэтрма Я.С., ВиицлавШа U.M., Доладав Д.А., Фвннксола Р.В. -

ХЭ73..Влмпаво,соет0ва ш»т»,1о1Ч-виХ средва tijpaaoíaHaa протеи«as в муЭикиоЙ Kjifttjpe Aotinomyc« fr«<n« '••••:'• ■ вх CBOioTea. Фермент* шгк.гоорганиэио». И ад-so "йл/яа", it,, 05.

6. Даичэв Л.А., Оатрэвв И,С. 1373. Раздагжив п("0{заз Aotmo-

Bjon frsau» тиеюдои маоэлвктричаского фокусирований. ЛАЯ СССР. £¿0, £34. ,

•а?

7. 4)лида« Д.Д,, Пзтроаа Ji.ií.»"Феикксоаа Р.В. 1973. И ее л едой а-

311« HQtttUOKoa npt>TeO*«tn чэ йкик фвриантов Actlnomyc«" frail** 119. Бюхлияя i« пачагк).

8. петрове и.с., ел» 1973. йрамяеяае ивтодо» *оа<ю<3-

«енноВ кронамграфик в «зоадвктрячееког» фокусирования д*я характеристики кочплекса tipo те ai ас ti поящее* fr»-diss Тезяcu дОклала на Все сова нои енкпоэкуие по

хшгяи протеояитических ферненто«. Вильнос.

Заказ * 1684 подл, к пеаати 26.1У 7Эг.тир.250 Ротапринт ИГТПЗ АМН СССР